JP2007078773A - 走査型レーザ顕微鏡及びその制御方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 複数の光学系を備える走査型レーザ顕微鏡において、各光学系が相互に及ぼす影響を排除するとともに、時間的定量性が維持された画像を取得することのできる走査型レーザ顕微鏡及びその制御方法を提供することを目的とする。
【解決手段】 試料１７の画像を得るための第１のレーザ光を２次元的に走査して試料１７に照射する画像用走査光学系１００と、試料の特定部位に刺激を与えるための第２のレーザ光を照射する刺激用走査光学系２００とを備え、刺激用走査光学系２００が、画像用走査光学系１００による第１のレーザ光の帰線期間に、第２のレーザ光を試料１７の特定部位に照射する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、試料面上をレーザ光で走査したときの試料からの透過光や反射光又は試料に発生する蛍光を検出する走査型レーザ顕微鏡及びその制御方法に関するものである。

共焦点走査型レーザ顕微鏡は、レーザ光を試料のＸ軸及びＹ軸方向に走査しながら照射し、試料からの透過光や反射光又は試料に発生する蛍光を検出器で検出して透過光や反射光又は蛍光の二次元の輝度情報を得る顕微鏡である。また、この輝度情報をＸ−Ｙ走査位置に対応させてディスプレイなどに輝度の二次元分布として表示することによって、試料の蛍光像、透過像あるいは反射像を観察することも可能である。

また、共焦点走査型レーザ顕微鏡は、検出光学系の試料と共役な位置に、被測定光の回折限界程度の径を有した絞りを設けることにより、焦点の合っている面の情報のみを検出するものである。この共焦点走査型レーザ顕微鏡では、合焦面の情報だけを検出できるため、試料を傷付けることなく、光学的な断層像、すなわち三次元情報を得ることができ、しかも、非合焦面の情報を排除することによって、非常に鮮明な画像が得られる特徴を有している。

このような共焦点走査型レーザ顕微鏡を用いて、ＦＲＡＰ（Fluorescence Recovery After Photobleaching：フォトブリーチング後の蛍光回復）の実験を行う場合、まずフォトブリーチ実行前の試料画像を取得し、続いてフォトブリーチを実行し、このフォトブリーチの間及びその終了後における蛍光復帰の間の試料画像を取得する手順により実験が行われる。
従来、上記ＦＲＡＰ実験に適した走査型レーザ顕微鏡として、試料画像を取得するための第１のレーザ光を試料に照射するための画像用走査光学系と、フォトブリーチのため（試料の特定部位に対して刺激を与えるため）の第２のレーザ光を試料に照射するための刺激用走査光学系とを備える走査型レーザ顕微鏡が知られている。
この走査型レーザ顕微鏡では、第２のレーザを試料に照射しながら、つまり、フォトブリーチをしながら、第１のレーザを走査して試料に照射することによって、フォトブリーチ開始前、終了後及び蛍光復帰における試料画像を取得する。これにより、フォトブリーチ開始前から蛍光復帰における試料の状態を連続的に観察することが可能となる。

上述のようなＦＲＡＰの実験を行う場合、第１のレーザ光及び第２のレーザ光の走査タイミングを制御することが非常に重要となる。例えば、第１のレーザ光と第２のレーザ光とが同時に同じ位置を照射してしまった場合、第２のレーザ光の光強度は、画像取得のために試料へ照射される第１のレーザ光の強度よりも遥かに大きいため、第２のレーザ光が第１の走査光学系に混入し、混入した点の輝度値が飽和した走査画像が得られてしまうという問題が発生する可能性もある。

これらの問題に対し、特開２０００−２７５５２９号公報（特許文献１）には、画像用走査光学系の帰線期間に刺激用走査光学系を走査させることで、画像用走査光学系からの第１のレーザ光と刺激用走査光学系からの第２のレーザ光とが重なり合うことを回避する方法が提案されている。

特開２０００−２７５５２９号公報

しかしながら、上記特開２０００−２７５５２９号公報に開示されている手法では、画像用走査光学系による第１のレーザ光の帰線期間の間に、刺激用走査光学系による第２のレーザ光の走査が完了している必要がある。従って、例えば、画像用走査光学系により第１のレーザ光が高速に走査されることにより、その帰線期間が極端に短時間であった場合には、その帰線期間内で刺激用走査光学系による第２のレーザ光の走査を完了させることが不可能となるため、第１のレーザ光の走査を待機させる必要が生じる。このため、第１のレーザ光を一定の速度で走査することができず、取得された画像には時間的定量性が失われてしまうという問題があった。

本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、複数の光学系を備える走査型レーザ顕微鏡において、各光学系が相互に及ぼす影響を排除するとともに、時間的定量性が維持された画像を取得することのできる走査型レーザ顕微鏡及びその制御方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、試料の画像を得るための第１のレーザ光を２次元的に走査して前記試料に照射する画像用走査光学系と、前記画像用走査光学系による第１のレーザ光の帰線期間に、刺激用の第２のレーザ光を前記試料の特定部位に照射する刺激用光学系とを備え、前記画像用走査光学系による前記第１のレーザ光の走査を前記刺激用光学系による前記第２のレーザ光の照射よりも優先させる走査型レーザ顕微鏡を提供する。

上記構成によれば、画像用走査光学系による第１のレーザ光の帰線期間に、第２のレーザ光を試料の特定部位に照射するので、各光学系が相互に及ぼす影響を排除することが可能となる。これにより、例えば、第２のレーザ光が画像用走査光学系に混入することにより生ずる取得画像の輝度不良の問題や、第１のレーザ光と第２のレーザ光とが同時に同一位置を照射してしまうことによる蛍光褪色の不具合等を解消することができる。
更に、第２のレーザ光の照射よりも第１のレーザ光の照射を優先させるので、例えば、１回の帰線期間内に第２のレーザ光の照射を終了できなかった場合であっても、第１のレーザ光の走査を停止させることなく連続して行わせることができる。これにより、時間的定量性が維持された画像を取得することが可能となり、精度の高い実験結果を得ることができる。

前記特定部位は、一点（ポイント）でも良いし、所定の面積を有する領域であっても良い。また、刺激用光学系は、試料上の１点に第２のレーザ光を照射させる機能のみを有するものでも良く、また、第２のレーザ光を２次元的に走査して試料上の所定の領域に対して照射する機能を有するものでも良い。更に、第２のレーザ光を照射させる特定部位は、試料上に複数設けられていても良い。また、刺激用光学系は１つに限られず、２つ以上設けられていても良い。

本発明は、試料の画像を得るための第１のレーザ光を２次元的に走査して前記試料に照射する画像用走査光学系と、刺激用の第２のレーザ光を前記試料の特定部位に照射する刺激用光学系とを備え、前記特定部位が設定されている走査ラインに前記第１のレーザ光を照射する共通領域走査期間において、前記第２のレーザ光の照射を前記第１のレーザ光の帰線期間に実施し、且つ、前記第１のレーザ光の照射を第２のレーザ光の照射よりも優先させる走査型レーザ顕微鏡を提供する。

上記構成によれば、特定部位が設定された走査ラインに第１のレーザ光が照射される共通領域走査期間においては、画像用走査光学系による第１のレーザ光の帰線期間に第２のレーザ光を照射するので、各光学系が相互に及ぼす影響を排除することが可能となる。
更に、上記共通領域走査期間において、第１のレーザ光の走査を第２のレーザ光の照射よりも優先させるので、例えば、１回の帰線期間内に第２のレーザ光の照射を終了できなかった場合であっても、第１のレーザ光の走査を停止させることなく連続して行わせることができる。これにより、時間的定量性が維持された画像を取得することが可能となり、精度の高い実験結果を得ることができる。
更に、特定部位が設定されていない走査ラインに第１のレーザ光が照射されている期間においては、第１のレーザ光の走査状態が帰線期間であるか否かにかかわらず、第２のレーザ光を特定部位に照射させることで、第２のレーザ光の照射効率を高めることができる。

なお、刺激用光学系は、特定部位を含み、且つ、上記第１のレーザ光の走査領域よりも小さい領域である照射停止領域が設定された走査ラインに第１のレーザ光が照射される期間において、第２のレーザ光の照射を停止させても良い。
これにより、全ての走査ラインにおいて第１のレーザ光の帰線期間に第２のレーザ光を照射するという照射態様に比べて第２のレーザ光の照射効率を高めることができ、また、上記共通領域走査期間において第１のレーザ光の帰線期間に第２のレーザ光を照射させるという照射態様に比べて、各光学系が相互に及ぼす影響を排除することができる。

本発明は、試料の画像を得るための第１のレーザ光を２次元的に走査して前記試料に照射する画像用走査光学系と、刺激用の第２のレーザ光を前記試料の特定部位に照射する刺激用光学系とを備え、前記画像用走査光学系が前記特定部位に第１のレーザ光を照射する期間において、前記刺激用光学系が前記第２のレーザ光の照射を停止する走査型レーザ顕微鏡を提供する。

上記構成によれば、画像用走査光学系により特定部位に第１のレーザ光が照射されている期間において、刺激用光学系による第２のレーザ光の照射を停止させるため、各光学系が相互に及ぼす影響を排除することが可能となる。更に、画像用走査光学系により特定部位にレーザ光が照射されていない期間においては、第２のレーザ光を特定部位に照射させることにより、第２のレーザ光の照射効率を高めることができる。

本発明は、試料の画像を得るための第１のレーザ光を２次元的に走査して前記試料に照射させるとともに、前記第１のレーザ光の帰線期間に、刺激用の第２のレーザ光を前記試料の特定部位に照射する走査型レーザ顕微鏡の制御方法であって、前記第１のレーザ光の走査を前記第２のレーザ光の照射よりも優先させる走査型レーザ顕微鏡の制御方法を提供する。

上記方法によれば、第１のレーザ光の帰線期間に、第２のレーザ光を試料の特定部位に照射するので、各レーザ光が相互に及ぼす影響を排除することが可能となる。これにより、例えば、第２のレーザ光が第１のレーザ光を走査する画像用走査光学系に混入することにより生ずる取得画像の輝度不良の問題や、第１のレーザ光と第２のレーザ光とが同時に同一位置を照射してしまうことによる蛍光褪色の不具合等を解消することができる。
更に、第２のレーザ光の照射よりも第１のレーザ光の照射を優先させるので、１回の帰線期間内に第２のレーザ光の照射を終了できなかった場合であっても、第１のレーザ光の走査を停止させることなく連続して行わせることができる。これにより、時間的定量性が維持された画像を取得することが可能となり、精度の高い実験結果を得ることができる。

本発明は、試料の画像を得るための第１のレーザ光を２次元的に走査して前記試料に照射させるとともに、刺激用の第２のレーザ光を前記試料の特定部位に照射する走査型レーザ顕微鏡の制御方法であって、前記特定部位が設定されている走査ラインに前記第１のレーザ光を照射する共通領域走査期間において、前記第２のレーザ光の照射を前記第１のレーザ光の帰線期間に実施すし、且つ、前記第１のレーザ光の照射を第２のレーザ光の照射よりも優先させる走査型レーザ顕微鏡の制御方法を提供する。

上記方法によれば、特定部位が設定された走査ラインに第１のレーザ光が照射される共通領域走査期間においては、第１のレーザ光の帰線期間に第２のレーザ光を照射するので、各レーザ光が相互に及ぼす影響を排除することが可能となる。
更に、上記共通領域走査期間において、第１のレーザ光の走査を第２のレーザ光の照射よりも優先させるので、例えば、１回の帰線期間内に第２のレーザ光の照射を終了できなかった場合であっても、第１のレーザ光の走査を停止させることなく連続して行わせることができる。これにより、時間的定量性が維持された画像を取得することが可能となり、精度の高い実験結果を得ることができる。
更に、特定部位が設定されていない走査ラインに第１のレーザ光が照射されている期間においては、第１のレーザ光の走査状態が帰線期間であるか否かにかかわらず、第２のレーザ光を特定部位に照射させることで、第２のレーザ光の照射効率を高めることができる。

本発明は、試料の画像を得るための第１のレーザ光を２次元的に走査して前記試料に照射させるとともに、刺激用の第２のレーザ光を前記試料の特定部位に照射する走査型レーザ顕微鏡の制御方法であって、前記特定部位に第１のレーザ光を照射する期間において、前記第２のレーザ光の照射を停止する走査型レーザ顕微鏡の制御方法を提供する。

上記方法によれば、特定部位に第１のレーザ光を照射している期間において、第２のレーザ光の照射を停止するので、各レーザ光が相互に及ぼす影響を排除することが可能となる。更に、特定部位に第１のレーザ光を照射していない期間においては、第２のレーザ光を特定部位に照射することにより、第２のレーザ光の照射効率を高めることができる。

本発明によれば、複数の光学系を有する場合であっても、各光学系が相互に及ぼす影響を排除するとともに、時間的定量性を維持された画像を取得することができるという効果を奏する。

以下、本発明の実施形態について、図面を参照して説明する。
〔第１の実施形態〕
図１は、本発明の第１の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示すブロック図である。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡は、画像取得用の第１のレーザ光を試料１７の焦点面上に２次元的に走査させて照射する画像用走査光学系１００と、試料１７に刺激を与えるための第２のレーザ光を試料１７の特定部位に照射する刺激用走査光学系２００とを備えている。
画像用走査光学系１００は、第１の光源１、ダイクロイックミラー２、第１の走査光学ユニット３、リレーレンズ４及びミラー５を備えて構成される。上記画像用走査光学系１００のダイクロイックミラー２の分岐光路上には、検出光学系３００が配置されている。この検出光学系３００は、測光フィルタ６、レンズ７、共焦点ピンホール８及び光電変換素子９を備えて構成される。

刺激用走査光学系２００は、第２の光源１０、第２の走査光学ユニット１１、リレーレンズ１２及びダイクロイックミラー１３を備えて構成される。画像用走査光学系１００の光軸と、刺激用走査光学系２００の光軸とは、ダイクロイックミラー１３により合成され、結像レンズ１４、対物レンズ１５に導かれる。また、リレーレンズ４および１２は、焦点位置が結像レンズ１４の焦点位置と一致するように配置されている。試料１７はステージ１８上に載置されている。

ダイクロイックミラー１３は、画像用走査光学系１００からのレーザ光の波長より長い波長の光を透過すると共に、刺激用走査光学系２００からのレーザ光の波長を反射する特性を有している。
第１の走査光学ユニット３は、第１の走査波形発生回路１９からの走査信号に基づいて制御される。第１の走査波形発生回路１９は、第１のクロック発生回路２０から供給される第１のクロックに基づいて上記走査信号を生成する。第１のクロック発生回路２０は、ＣＰＵ２６からの各種指令に基づき第１のクロックの生成を行い、この第１のクロックを第１のデータイネーブル信号発生回路２１に供給する。
第１のデータイネーブル信号発生回路２１は、第１のクロック発生回路２０からの第１のクロック及び第１の走査波形発生回路からの走査波形に基づいて第１のデータイネーブル信号を生成するとともに、生成した第１のデータイネーブル信号を第２のクロック発生回路２３、Ａ／Ｄ変換器２５、及び第１の光源１に供給する。

第２の走査光学ユニット１１は、第２の走査波形発生回路２２からの走査信号に基づいて制御される。第２の走査波形発生回路２２は、第２のクロック発生回路２３から供給される第２のクロックに基づいて上記走査信号を生成する。第２のクロック発生回路２３は、第１のデータイネーブル信号発生回路２４から供給される第１のデータイネーブル信号及びＣＰＵ２６から供給される各種指令に基づいて第２のクロックの生成を行い、第２のクロックを第２のデータイネーブル信号発生回路２４へ供給する。
第２のデータイネーブル信号発生回路２４は、第２のクロック発生回路２３からの第２のクロック及び第２の走査波形発生回路２２からの走査波形に基づいて、第２のデータイネーブル信号を生成し、生成した第２のデータイネーブル信号を第２の光源１０に供給する。

Ａ／Ｄ変換器２５は、光電変換素子９からのアナログ電気信号をディジタル電気信号に変換して、ＣＰＵ２６へ供給する。
ＣＰＵ（中央演算処理装置）２６は、第１のクロック発生回路２０及び第２のクロック発生回路２３に対して走査開始命令、走査停止命令等を適切なタイミングで出力することにより、第１の走査光学ユニット３や第２の走査光学ユニット１１を初めとする、当該顕微鏡が備える各部を間接的に制御するとともに、Ａ／Ｄ変換器２５から供給されるディジタル信号に基づいて画像データを作成し、これをフレームメモリ２９に格納することで、実験結果等を表示装置３０に表示させる。
ＣＰＵ２６は、ＲＡＭ（Random Access Memory）などの主記憶装置２７、ＨＤ（Hard Disk）ＲＯＭ（Read Only Memory）などの補助記憶装置２８などに接続されている。
補助記憶装置２８には、例えば、各種制御アプリケーションプログラムが格納されており、ＣＰＵ２６が補助記憶装置２８から制御アプリケーションプログラムを主記憶装置２７に読み出し、実行することにより、後述するようなＦＲＡＰ等の各種実験を実現させる。なお、ＣＰＵ２６、主記憶装置２７、及び補助記憶装置２８として、一般的なパーソナルコンピュータを利用するようにしても良い。また、ＣＰＵ２６には、キーボードやマウスなどの入力装置が更に接続されていても良い。

このような構成を備える走査型レーザ顕微鏡において、第１の光源１からのレーザ光は、第１の走査波形発生回路１９により走査制御される第１の走査光学ユニット３へ導かれ、任意の方向に偏向走査される。このレーザ光は更に、リレーレンズ４、ミラー５、ダイクロイックミラー１３、結像レンズ１４、対物レンズ１５を介して、試料１７の断面１６上に集光され、断面１６内で二次元に走査される。

試料１７には第１の光源１の波長によって励起される蛍光指示薬が導入されており、断面１６内でレーザ光が２次元的に走査されることにより、蛍光指示薬が励起されて蛍光を生じる。対物レンズ１５により捕らえられた蛍光は、上記レーザ光と同じ光路を逆向きに進み、対物レンズ１５、結像レンズ１４、ダイクロイックミラー１３を透過し、ミラー５、リレーレンズ４、第１の走査光学ユニット３を介してダイクロイックミラー２へ導かれる。ダイクロイックミラー２は、第１の光源１からのレーザ光の波長より長い波長の光を反射する特性となっており、これにより上記蛍光はダイクロイックミラー２により反射され、検出光学系３００へ導入される。

検出光学系３００において、蛍光は、測光フィルタ６により特定の波長の光が選択透過され、さらにレンズ７、共焦点ピンホール８により断面１６からの光のみが選択されて、光電変換素子９へ入射され、電気信号に変換される。光電変換素子９の出力信号は、Ａ／Ｄ変換器２５へ導かれ、第１のデータイネーブル信号発生回路２０から発生する信号に同期してディジタル信号に変換され、ＣＰＵ２６に供給される。ＣＰＵ２６では、Ａ／Ｄ変換器２５からのディジタル信号に基づいて画像データが作成され、この画像データがフレームメモリ２９に格納されることにより、表示装置３０が備えるディスプレイに表示される。この結果、表示装置３０のディスプレイには、断面１６での蛍光画像（蛍光輝度の２次元分布）が表示される。

一方、第２の光源１０からのレーザ光は、第２の走査光学ユニット１１、リレーレンズ１２、ダイクロイックミラー１３を介して画像用走査光学系１００からの光軸と合成される。そして、結像レンズ１４、対物レンズ１５を透過して、試料１７の断面１６上に照射される。このときの断面１６内での照射位置は、第２のクロック発生回路２３、第２の走査波形発生回路２２により第２の走査光学ユニット１１を制御することで、画像用走査光学系１００の走査位置に依存しない任意の位置を選択することができる。

続いて、上述した画像用走査光学系１００及び刺激用走査光学系２００の制御について詳しく説明する。ここでは、図２に示すように、第１のレーザ光の走査領域の一部に、所定の面積を有する特定部位を設け、この特定部位（第２のレーザ光の走査領域）に第２のレーザ光を走査して照射する場合を例に挙げて説明する。
まず、図１に示すように、第１の走査光学ユニット３は、光源１からのレーザ光を試料面上で水平方向に走査するための水平方向スキャナ３ａ、同様に試料面上で垂直方向に走査するための垂直方向スキャナ３ｂを備えている。

第１の走査波形発生回路１９は、図３に示すように、試料１７の任意の断面上において第１のレーザ光を水平方向へ走査するべく、水平方向スキャナ３ａを軸回りに揺動させる水平方向波形、並びに第１のレーザ光を垂直方向へ走査するべく、垂直方向スキャナ３ｂを軸回りに揺動させる垂直方向波形を生成する。
ここで、水平方向スキャナ３ａを軸回りに揺動させるための水平方向波形は、水平方向スキャナ３ａを中心位置Ｏから輝度データサンプリング開始時における揺動角度Ｇまで移動させるＸ帰線期間Ａと、輝度データをサンプリングする輝度データサンプリング期間Ｂと、水平方向スキャナ３ａを輝度データサンプリング終了時における揺動角度Ｈから中心位置Ｏへ戻すＸ帰線期間Ｃとにより構成されている。この水平方向波形において、Ｘ帰線期間ＡとＸ帰線期間Ｃとが第１のレーザ光のＸ帰線期間に相当する。

同様に、垂直方向スキャナ３ｂを軸回りに揺動させるための垂直方向波形は、垂直方向スキャナ３ｂを中心位置Ｏから輝度データサンプリング開始時における揺動角度Ｉまで移動させるＹ帰線期間Ｄと、輝度データをサンプリングする輝度データサンプリング期間Ｅと、垂直方向スキャナ３ｂを輝度データサンプリング終了時における揺動角度Ｊから中心位置Ｏへ戻すＹ帰線期間Ｆとにより構成されている。この垂直方向波形において、Ｙ帰線期間ＤとＹ帰線期間Ｆとが第１のレーザ光のＹ帰線期間に相当する。

また、第１のデータイネーブル信号発生回路２１は、図４に示すように、水平方向データイネーブル信号発生回路２１１、垂直方向データイネーブル信号発生回路２１２、及びデータイネーブル信号演算回路２１３を備えて構成されている。
水平方向データイネーブル信号発生回路２１１は、図３に示すように、Ｘ帰線期間ＡにおいてＯＦＦ、Ｘ輝度データサンプリング期間ＢにおいてＯＮ、Ｘ帰線期間ＣにおいてＯＦＦとなるような水平方向データイネーブル信号を生成する。
同様に、垂直データイネーブル信号発生回路２１２は、図３に示すように、Ｙ帰線期間ＤにおいてＯＦＦ、Ｙ輝度データサンプリング期間ＥにおいてＯＮ、Ｙ帰線期間ＦにおいてＯＦＦとなるような垂直方向データイネーブル信号を生成する。

ここで、水平方向データイネーブル信号は、垂直方向波形の１周期において、複数周期発生される。例えば、５１２画素×５１２画素という解像度のスキャンを行う場合、水平方向データイネーブル信号は、垂直方向波形の１周期において、５１２回発生することになる。

図４に示したデータイネーブル信号演算回路２１３は、図５に示すように、水平方向データイネーブル信号と、垂直方向データイネーブル信号との論理積演算を行い、図６（Ａ）に示すような第１のデータイネーブル信号を生成する。これにより、第１のデータイネーブル信号がＯＮ状態になるのは、第１のレーザ光の照射位置が第１のレーザ光の走査領域上にある期間、換言すると、第１のレーザ光が試料１７上の断面１６に照射される期間となる。

Ａ／Ｄ変換器２５及び第１の光源１は、上記第１のデータイネーブル信号に基づいて制御されるため、第１のレーザ光が試料１７上を走査しているとき以外は第１のレーザの出力は行われず、輝度データのＡ／Ｄ変換も行われないこととなる。また、第１のクロック発生回路２０からのクロックが入力されない限り、データイネーブル信号発生回路２１は動作しない構成となっている。

同様に、図１に示すように、第２の走査光学ユニット１１は、第２の光源１０からのレーザ光を試料面上で水平方向に走査するための水平方向スキャナ１１ａ、同様に試料面上で垂直方向に走査するための垂直方向スキャナ１１ｂを備えている。

第２の走査波形発生回路２２は、図７に示すように、試料１７上において第２のレーザ光を水平方向へ走査するべく、水平方向スキャナ１１ａを軸回りに揺動させる水平方向波形、並びに第２のレーザ光を垂直方向へ走査するべく、垂直方向スキャナ１１ｂを軸回りに揺動させる垂直方向波形を生成する。
ここで、水平方向スキャナ１１ａを軸回りに揺動させるための水平方向波形は、水平方向スキャナ１１ａを中心位置Ｏから刺激光照射開始時における揺動角度Ｇ´まで軸回転させるＸ帰線期間Ａ´と、刺激光を照射させる刺激光照射期間Ｂ´と、水平方向スキャナ１１ａを刺激光照射終了時における揺動角度Ｈ´から中心位置Ｏへ戻すＸ帰線期間Ｃ´とにより構成されている。この水平方向波形において、Ｘ帰線期間Ａ´とＸ帰線期間Ｃ´とが第２のレーザ光のＸ帰線期間に相当する。

同様に、垂直方向スキャナ１１ｂを軸回りに揺動させるための垂直方向波形は、垂直方向スキャナ１１ｂを中心位置Ｏから刺激光照射開始時における揺動角度Ｉ´まで軸回転させるＹ帰線期間Ｄ´と、刺激光を照射させる刺激光照射期間Ｅ´と、垂直方向スキャナ１１ｂを刺激光照射終了時における揺動角度Ｊ´から中心位置Ｏへ戻すＹ帰線期間Ｆ´とにより構成されている。この垂直方向波形において、Ｙ帰線期間Ｄ´とＹ帰線期間Ｆ´とが第２のレーザ光のＹ帰線期間に相当する。

また、第２のデータイネーブル信号発生回路２４は、図８に示すように、水平方向データイネーブル信号発生回路２４１、垂直方向データイネーブル信号発生回路２４２、及びデータイネーブル信号演算回路２４３を備えて構成されている。
水平方向データイネーブル信号発生回路２４１は、図７に示すように、Ｘ帰線期間Ａ´においてＯＦＦ、刺激光照射期間Ｅ´においてＯＮ、Ｘ帰線期間Ｃ´においてＯＦＦとなるような水平方向データイネーブル信号を生成する。
同様に、垂直データイネーブル信号発生回路２４２は、図７に示すように、Ｙ帰線期間Ｄ´においてＯＦＦ、刺激光照射期間Ｅ´においてＯＮ、Ｙ帰線期間Ｆ´においてＯＦＦとなるような垂直方向データイネーブル信号を生成する。

図８に示したデータイネーブル信号演算回路２４３は、図７に示すような水平方向データイネーブル信号と、垂直方向データイネーブル信号との論理積演算を行い、第２のデータイネーブル信号を生成する。これにより、第２のデータイネーブル信号がＯＮ状態になるのは、第２のレーザ光が試料１７上の断面１６内に設定された特定部位に照射される期間となる。
更に、このデータイネーブル信号演算回路２４３は、図１に示した第２のクロック発生回路２３から第２のクロックが入力される期間のみ作動するように構成されている。ここで、第２のクロック発生回路２３は、ＣＰＵ２６からの走査開始命令、走査停止命令に基づいて第２のクロックを発生するとともに、第１のデータイネーブル信号がオフの期間のみ、第２のクロックを発生させる。換言すると、第２のクロック発生回路２３は、図６（Ｂ）に示すように、ＣＰＵ２６により走査開始命令が出力されてから操作停止命令が出力されるまでの期間であって、且つ、第１のデータイネーブル信号がオフの期間にのみ、第２のクロックを発生させる。
これにより、上述したデータイネーブル信号演算回路２４３から出力される第２のデータイネーブル信号は、この第２のクロックが入力されている期間であって、且つ、第２のレーザ光が試料１７上の断面１６内に設定された特定部位に照射される期間のみＯＮ状態となる。

このような第２のデータイネーブル信号は、第２の光源１０に供給され、これに基づいて第２の光源１０が制御される。これにより、画像用走査光学系１００による第１のレーザ光の帰線期間に、第２のレーザ光が試料１７上の断面１６内に設定された特定部位に照射されることとなる。

次に、上記構成からなる走査型レーザ顕微鏡においてＦＲＡＰの実験を行う場合について説明する。
まず、ＣＰＵ２６からの走査開始命令が第１のクロック発生回路２０に供給され、第１のクロック発生回路２０により一定間隔の第１のクロック信号が発せられる。この第１のクロック信号は、第１の走査波形発生回路１９及び第１のデータイネーブル信号発生回路２１に供給される。第１の走査波形発生回路１９では、第１のクロック信号が発せられている期間において、図３に示した水平方向波形、垂直方向波形が生成される。これら生成された水平方向波形及び垂直方向波形は、第１のクロック発生回路２０から入力される第１のクロック信号に同期して第１の走査光学ユニット３へ供給され、内蔵される水平方向スキャナ３ａ、垂直方向スキャナ３ｂが駆動される。

一方、第１のデータイネーブル信号発生回路２１では、図５に示すような水平方向データイネーブル信号、垂直方向データイネーブル信号が生成され、これら信号から、図６（Ａ）に示すような第１のデータイネーブル信号が生成される。
生成された第１のデータイネーブル信号は光源１及びＡ／Ｄ変換器２５に供給され、第１のデータイネーブル信号がＯＮ状態のときに、第１のレーザ光の照射が行われるとともに、Ａ／Ｄ変換器２５が作動する。これにより、図２に示した第１のレーザ光の走査領域に第１のレーザ光が照射されている期間において、Ａ／Ｄ変換器２５による信号変換が行われ、このディジタル信号がＣＰＵ２６に供給されることにより、蛍光観察の結果が表示装置３０のディスプレイに表示されることとなる。

一方、第２のクロック発生回路２３は、ＣＰＵ２６からの走査開始命令を受けて駆動を開始し、上述の第１のデータイネーブル信号発生回路２１から供給される第１のデータイネーブル信号がＯＦＦの期間のみ一定周波数の第２のクロック信号を生成して、第２の走査波形発生回路２２及び第２のデータイネーブル信号発生回路２４に供給する。

第２の走査波形発生回路２２では、図７に示したような水平方向波形、垂直方向波形が生成される。これら生成された水平方向波形及び垂直方向波形は、第２のクロック発生回路２３から供給される第２のクロック信号に同期して第２の光学走査ユニット１１へ供給され、内蔵される水平方向スキャナ１１ａ、垂直方向スキャナ１１ｂが駆動される。

一方、第２のデータイネーブル信号発生回路２４では、図７に示すような水平方向データイネーブル信号、垂直方向データイネーブル信号が生成され、これら信号及び第２のクロックに基づいて、第２のデータイネーブル信号が生成される。
生成された第２のデータイネーブル信号は第２の光源１０に供給され、第２のデータイネーブル信号がＯＮ状態のときに、第２のレーザ光の照射が行われる。
これにより、第１のレーザ光の帰線期間において、試料１７の断面１６上に設定された特定部位に対して、第２のレーザ光が照射されることによりフォトブリーチが実行されることとなる。そして、試料１７の断面１６上に設定された特定部位に対する第２のレーザ光の走査の終了時において、ＣＰＵ２６により走査停止命令が第２のクロック発生回路２３に供給され、第２のクロック発生回路２３は駆動を停止する。これにより、第２の走査光学系１００の動作が停止されてフォトブリーチが終了する。

以上説明したように、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡によれば、図６（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、第１のデータイネーブル信号がＯＦＦ状態の期間においてのみ、第２のクロック発生回路２３から第２の走査波形発生回路２２及び第２のデータイネーブル信号発生回路２４に第２のクロックが供給される。これにより、第１の走査光学系１００による第１のレーザ光の走査期間において、第２の走査光学系２００による第２のレーザ光の走査を実行したとしても、第２の走査光学系２００によるフォトブリーチを画像用走査光学系１００による第１のレーザ光の帰線期間に実行させることが可能となる。この結果、各光学系が相互に及ぼす影響を排除することができる。例えば、第２のレーザ光が画像用走査光学系１００に混入することにより生ずる取得画像の輝度不良の問題や、第１のレーザ光と第２のレーザ光とが同時に同一位置を照射してしまうことによる蛍光褪色の不具合等を解消することができる。
更に、画像用走査光学系１００は、一定の速度で第１のレーザ光を走査できるので、時間的定量性が維持された画像を取得することが可能となる。これにより、精度の高い実験結果を得ることができる。

〔第２の実施形態〕
次に、本発明の第２の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡について説明する。
図８は、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示すブロック図である。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡は、図９に示すように、図１に示した第１の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の構成に、更に、データイネーブル信号変換回路３１を追加した構成をとる。このデータイネーブル信号変換回路３１は、第１のデータイネーブル信号発生回路２１と、第２のクロック発生回路２３との間に設けられている。
データイネーブル信号変換回路３１には、刺激用走査光学系２００による第２のレーザ光の走査領域（特定部位）の開始ライン番号及び同領域の終了ライン番号が予め登録されている。例えば、図１０に示すように、画像用走査光学系１００による第１のレーザ光の走査領域の走査ライン数が「５１６」であり、その走査領域内において、走査ライン番号「２０８」から「３０８」に渡り、刺激用走査光学系２００による第２のレーザ光の走査領域が設定されている場合、データイネーブル信号変換回路３１には、第２のレーザ光の走査領域の開始ライン番号として「２０８」が、終了ライン番号として「３０８」が登録されている。

以下、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡について、上述した第１の実施形態と異なる部分について説明する。
まず、上述の第１の実施形態と同様に、ＣＰＵ２６から第１のクロック発生回路２１に対して走査開始指令が供給されると、第１のクロック信号が第１のクロック発生回路２０から第１のデータイネーブル信号発生回路２１などに供給される。これにより、第１のデータイネーブル信号発生回路２１では、第１のデータイネーブル信号が生成されて、データイネーブル信号変換回路３１に供給される。
データイネーブル信号変換回路３１は、図１１に示すような第１のデータイネーブル信号の立ち下がり或いは立ち上がりをカウントすることにより、図１０に示すような第１のレーザ光の走査領域において、現在、どの走査ライン番号を第１のレーザ光が走査中であるのかを監視し、この監視結果に基づいて、第１のデータイネーブル信号発生回路２１から供給される第１のデータイネーブル信号を変換して、第２のクロック発生回路２３に供給する。

具体的には、図１０に示すように、刺激用走査光学系２００による第２のレーザ光の走査領域の開始ライン番号として「２０８」が、終了ライン番号として「３０８」が登録されていた場合、上記カウント数に基づく第１のレーザ光の走査ライン番号が開始ライン番号「２０８」以上「３０８」以下の条件を満たすか否かを判定する。この結果、上記条件を満たしていなかった場合には、つまり、現時点における第１のレーザ光の走査ライン番号が「１乃至２０７のいずれか」又は「３０９乃至５１６のいずれか」であった場合には、データイネーブル信号変換回路３１は、図１１に示すようにこの期間における第１のデータイネーブル信号を全てオン状態に変換して、第２のクロック発生回路２３へ出力する。一方、上記条件を満たしていた場合、つまり、第１のレーザ光の走査ライン番号が「２０８乃至３０８のいずれか（共通領域走査期間）」であった場合には、データイネーブル信号変換回路３１は、図１１（Ｂ）に示すように、この期間における第１のデータイネーブル信号を変換せずに、そのまま第２のクロック発生回路へ出力する。
これにより、第２のクロック発生回路２３により生成される第２のクロックは、図１１（Ｃ）に示すように、第１のデータイネーブル信号がＯＦＦのときにおいて発生することとなる。

そして、このような変換処理された第１のデータイネーブル信号をもとに、刺激用走査光学系２００が制御されることにより、画像用走査光学系１００による第１のレーザ光の走査領域と刺激用走査光学系２００による第２のレーザ光の走査領域とが重なる共通領域以外の領域において、刺激用走査光学系２００による走査を常に行うことができるので、第２のレーザ光の照射効率を高めることが可能となる。

以上説明してきたように、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡によれば、画像用走査光学系１００による第１のレーザ光の帰線期間に、刺激用走査光学系２００による第２のレーザ光の走査を行うので、各光学系が相互に及ぼす影響を排除することが可能となる。これにより、例えば、第２のレーザ光が画像用走査光学系１００に混入することにより生ずる取得画像の輝度不良の問題や、第１のレーザ光と第２のレーザ光とが同時に同一位置を照射してしまうことによる蛍光褪色の不具合等を解消することができる。
更に、画像用走査光学系１００は、一定の速度で第１のレーザ光を走査できるので、時間的定量性が維持された画像を取得することが可能となる。これにより、精度の高い実験結果を得ることができる。

さらに、画像用走査光学系１００による第１のレーザ光の走査範囲と刺激用走査光学系２００による第２のレーザ光の走査範囲との重複領域以外の領域では、刺激用走査光学系２００による第２のレーザ光の走査を常に行うことが可能となるため、より効率的に試料に対して光刺激を行うことが可能となる。

なお、上記実施形態においては、データイネーブル信号変換回路３１に、刺激用走査光学系２００による第２のレーザ光の走査領域の開始ライン番号及び同領域の終了ライン番号が予め登録されている場合について述べたが、データイネーブル信号変換回路３１に登録されている情報は、上記情報に限られない。例えば、第２のレーザ光の走査領域の走査ライン数（例えば、図１０の例では、「３０８−２０８＝１００」である）及び同走査領域の中心となる走査ライン番号（例えば、図１０の例では「２０８＋（３０８−２０８）／２＝２５８」）が登録されていれば、上記第２のレーザ光の走査領域の開始ライン番号及び同領域の終了ライン番号を算出することが可能となる。このように、上記例に限られず、データイネーブル信号変換回路３１には、第１のレーザ光が走査される走査領域と、第２のレーザ光が走査される走査領域との共通領域を特定するための情報が登録されていれば足りる。

また、上記実施形態においては、第１のレーザ光が第２のレーザ光の走査領域が設定されている走査ラインに照射されている期間において、第２のレーザ光の照射タイミングを第１のレーザ光の帰線期間としていたが、上記共通領域だけでなく、該共通領域を含む所定の領域（例えば、共通領域に上下2ラインずつ足した領域、つまり、上記実施形態では、「走査ライン番号２０６乃至捜査ライン番号３１０の範囲」）において、上記第２のレーザ光の照射タイミングを第１のレーザ光の帰線期間としても良い。
更に、第１のレーザ光が第２のレーザ光の走査領域を照射している期間において、第２のレーザ光の照射を停止するような構成としても良い。

このような構成によれば、画像用走査光学系１００により特定部位（第２のレーザ光の走査領域）に第１のレーザ光が照射されていない期間においては、第２のレーザ光を特定部位に照射させることが可能となるので、第２のレーザ光の照射効率を更に高めることが可能となる。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。

第１に、上記第１及び第２の実施形態において、特定部位は、一点（ポイント）でも良い。
第２に、刺激用走査光学系２００は、試料１７上の１点に第２のレーザ光を照射させる機能のみを有するものでも良い。
第３に、上記特定部位は、複数箇所設定されていても良い。
第４に、刺激用走査光学系２００は１台に限られず、２台以上設けられていても良い。

本発明の第１の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示すブロック図である。 第１のレーザ光の走査領域と第２のレーザ光の走査領域の一例を示した図である。 第１の走査波形発生回路により生成される水平方向及び垂直方向波形、並びに、第１のデータイネーブル信号発生回路により生成される水平方法データイネーブル信号及び垂直方法データイネーブル信号の一例を示す図である。 図１の第１のデータイネーブル信号発生回路の内部構造の一例を示した図である。 図４のデータイネーブル信号演算回路から出力される第１のイネーブル信号を説明するための図である。 第１のイネーブル信号と第２のクロックの関係を示す図である。 第２の走査波形発生回路により生成される水平方向波形及び垂直方向波形、並びに、第２のデータイネーブル信号発生回路により生成される水平方法データイネーブル信号及び垂直方法データイネーブル信号の一例を示す図である。 図１に示した第２のデータイネーブル信号発生回路の内部構造の一例を示した図である。 本発明の第２の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示すブロック図である。 第１のレーザ光の走査領域と第２のレーザ光の走査領域の関係の一例を示した図である。 本発明の第２の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡において、（Ａ）第１のデータイネーブル信号発生回路から出力されるデータイネーブル信号、（Ｂ）データイネーブル信号変換回路から出力される変換後のデータイネーブル信号、（Ｃ）第２のクロックの一例を示す図である。

符号の説明

１ 第１の光源
３ 第１の走査光学ユニット
１０ 第２の光源
１１ 第２の走査光学ユニット
１７ 試料
１９ 第１の走査波形発生回路
２０ 第１のクロック発生回路
２１ 第１のデータイネーブル信号発生回路
２２ 第２の走査波形発生回路
２３ 第２のクロック発生回路
２４ 第２のデータイネーブル信号発生回路
１００ 画像用走査光学系
２００ 刺激用走査光学系

Claims (6)

1. 試料の画像を得るための第１のレーザ光を２次元的に走査して前記試料に照射する画像用走査光学系と、
   前記画像用走査光学系による前記第１のレーザ光の帰線期間に、刺激用の第２のレーザ光を前記試料の特定部位に照射する刺激用光学系と
   を備え、
   前記画像用走査光学系による前記第１のレーザ光の走査を前記刺激用光学系による前記第２のレーザ光の照射よりも優先させる走査型レーザ顕微鏡。
2. 試料の画像を得るための第１のレーザ光を２次元的に走査して前記試料に照射する画像用走査光学系と、
   刺激用の第２のレーザ光を前記試料の特定部位に照射する刺激用光学系と
   を備え、
   前記特定部位が設定されている走査ラインに前記第１のレーザ光を照射する共通領域走査期間において、前記第２のレーザ光の照射を前記第１のレーザ光の帰線期間に実施し、且つ、前記第１のレーザ光の照射を前記第２のレーザ光の照射よりも優先させる走査型レーザ顕微鏡。
3. 試料の画像を得るための第１のレーザ光を２次元的に走査して前記試料に照射する画像用走査光学系と、
   刺激用の第２のレーザ光を前記試料の特定部位に照射する刺激用光学系と
   を備え、
   前記画像用走査光学系が前記特定部位に前記第１のレーザ光を照射する期間において、前記刺激用光学系が前記第２のレーザ光の照射を停止する走査型レーザ顕微鏡。
4. 試料の画像を得るための第１のレーザ光を２次元的に走査して前記試料に照射させるとともに、前記第１のレーザ光の帰線期間に、刺激用の第２のレーザ光を前記試料の特定部位に照射する走査型レーザ顕微鏡の制御方法であって、
   前記第１のレーザ光の走査を前記第２のレーザ光の照射よりも優先させる走査型レーザ顕微鏡の制御方法。
5. 試料の画像を得るための第１のレーザ光を２次元的に走査して前記試料に照射させるとともに、刺激用の第２のレーザ光を前記試料の特定部位に照射する走査型レーザ顕微鏡の制御方法であって、
   前記特定部位が設定されている走査ラインに前記第１のレーザ光を照射する共通領域走査期間において、前記第２のレーザ光の照射を前記第１のレーザ光の帰線期間に実施し、且つ、前記第１のレーザ光の照射を第２のレーザ光の照射よりも優先させる走査型レーザ顕微鏡の制御方法。
6. 試料の画像を得るための第１のレーザ光を２次元的に走査して前記試料に照射させるとともに、刺激用の第２のレーザ光を前記試料の特定部位に照射する走査型レーザ顕微鏡の制御方法であって、
   前記特定部位に第１のレーザ光を照射する期間において、前記第２のレーザ光の照射を停止する走査型レーザ顕微鏡の制御方法。

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