JP2007057765A - 顕微鏡装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 標本の状態を変化させることなく、標本の異なる位置を顕微鏡観察することを可能とする。
【解決手段】 レーザ光Ｌを出射するレーザ光源３と、対物レンズ７を下向きに備え、レーザ光源３から発せられたレーザ光Ｌを標本Ａに照射し、標本Ａから発せられる光を検出する顕微鏡本体４と、該顕微鏡本体４を吊り下げた状態に支持し標本に対して顕微鏡本体を移動させる移動ユニット２とを備え、レーザ光源３から導かれてきたレーザ光Ｌの光軸に沿い、かつ、対物レンズ７の光軸に交差する方向に沿って、顕微鏡本体４を標本Ａに対して移動させる可動部材１８，１９と、該可動部材１８，１９に固定され、レーザ光Ｌを偏向して顕微鏡本体４に入射させる偏向部材２２〜２３とを備える顕微鏡装置１を提供する。
【選択図】 図１

Description

この発明は、顕微鏡装置に関するものである。

従来、顕微鏡装置として、ステージ上に搭載した標本に対物レンズを近接させて観察するものが知られている。
この顕微鏡装置においては、ステージが水平な２方向（Ｘ，Ｙ方向）に移動可能に設けられており、標本上の異なる位置を観察したい場合に、ステージを作動させることで、対物レンズの光軸に交差する方向に標本を移動させていた。

しかしながら、ステージに搭載した標本を移動させる場合、標本が培地内に浮遊する生細胞等である場合には、ステージの移動により標本に加速度が加わることになるため、標本が培地内において移動し、あるいは変形してしまう不都合がある。また、標本が比較的大きな実験小動物等である場合にも、標本に横力が加わる場合、標本が変動してしまう不都合が考えられる。

これに対して、ステージを固定し、顕微鏡本体を移動させる構造の顕微鏡装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
この顕微鏡装置によれば、ステージを固定しているので、ステージ上の標本の状態を変化させることなく、標本の異なる位置を顕微鏡観察することができる。
特開２０００−８８７５１号公報

しかしながら、特許文献１の顕微鏡装置は、ステージの下方に配置したガイドレールに沿って、ガイドレール上のスライダに固定した顕微鏡本体を移動させるものであるため、可動部分が大きく、その剛性を確保するためにフレーム等が頑強に作られ、装置が大型化する不都合がある。装置が大型化することにより、設置スペースの大型化、動作速度の低下等の問題が考えられる。また、比較的大きな標本を観察する場合に、対物レンズの周囲の空間をできるだけ広く確保し、対物レンズの取り回し性を向上する必要もある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、可動部分を小さくして装置の大型化および低速化を防止し、対物レンズの周囲に広い空間を確保して対物レンズの取り回し性を向上することができる顕微鏡装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、レーザ光を出射するレーザ光源と、対物レンズを下向きに備え、前記レーザ光源から発せられたレーザ光を標本に照射し、標本から発せられる光を検出する顕微鏡本体と、該顕微鏡本体を吊り下げた状態に支持し、標本に対して顕微鏡本体を移動させる移動ユニットとを備え、該移動ユニットが、レーザ光源から導かれてきたレーザ光の光軸に沿い、かつ、対物レンズの光軸に交差する方向に沿って、顕微鏡本体を標本に対して移動させる可動部材と、該可動部材に固定され、前記レーザ光を偏向させて前記顕微鏡本体に入射させる偏向部材とを備える顕微鏡装置を提供する。

本発明によれば、レーザ光源から出射されたレーザ光は、移動ユニットを介して顕微鏡本体に入射される。顕微鏡本体に入射されたレーザ光は対物レンズを介して標本に照射され、標本において発生した蛍光等の光が対物レンズによって集められ、検出される。この場合において、標本におけるレーザ光の照射位置を変更したい場合には、可動部材を作動させることにより、レーザ光の光軸に沿い、かつ、対物レンズの光軸に交差する方向に沿って、顕微鏡本体を移動させる。

このとき、可動部材に偏向部材が固定されているので、可動部材の作動により顕微鏡本体とともに偏向部材が移動させられる。偏向部材も可動部材と同様にレーザ光の光軸に沿って移動させられるので、可動部材の位置にかかわらず、レーザ光が偏向部材によって偏向され、常に顕微鏡本体内に指向される。

したがって、本発明によれば、顕微鏡本体を、標本を移動させることなく移動させて、標本の異なる位置を観察できる。その結果、生細胞や実験小動物等のような標本においても、標本に横力を加えずに、標本を静止した状態に維持したまま、異なる位置の観察を行うことができる。

また、この場合に、レーザ光が常に偏向部材により顕微鏡本体内に導かれるので、光ファイバのような光学要素にレーザ光を通過させずに済む。したがって、例えば、レーザ光源として極短パルスレーザ光源を採用した場合においても、標本に到達するまでの間におけるレーザ光の群速度分散の発生を抑制して、パルス幅が伸びるのを防止することができる。その結果、大がかりな群速度分散補償器が不要となり、効率的に多光子励起効果を発生させて、鮮明な多光子蛍光画像を得ることができる。

また、本発明によれば、移動ユニットが顕微鏡本体を吊り下げた状態に支持しているので、顕微鏡本体を含む可動部を最小限に抑えることができる。その結果、装置の大型化を防止し、可動部を高速かつ精度よく移動させることが可能となる。また、顕微鏡本体を吊り下げることにより、その最下端に配置される対物レンズの周囲に充分な空間を確保することができ、比較的大きな標本の取り扱い性を向上することができる。

上記発明においては、前記対物レンズの光軸に直交する第１の方向に移動可能に設けられる第１の可動部材と、該第１の可動部材に対して前記対物レンズの光軸および前記第１の方向に直交する第２の方向に移動可能に設けられ、顕微鏡本体を固定する第２の可動部材とを備え、前記偏向部材が、前記第１の可動部材に固定され第２の方向に向けてレーザ光を偏向する第１の偏向部材と、第２の可動部材に固定され第２の方向に沿って入射されるレーザ光を偏向するる第２の偏向部材とを備え、前記レーザ光源からのレーザ光が前記第１の方向に沿って第１の偏向部材に入射されることが好ましい。

このようにすることで、第１の可動部材を第１の方向に移動させると、第１の可動部材に搭載された第２の可動部材および第２の可動部材に取り付けられた顕微鏡本体が対物レンズの光軸に交差する第１の方向に沿って移動させられる。レーザ光は第１の方向に沿って入射され、第１の可動部材には第１の偏向部材が固定されているので、第１の可動部材の位置にかかわらず、入射されたレーザ光が第１の偏向部材によって第２の方向に向けて反射される。

また、第２の可動部材を第１の可動部材に対して第２の方向に移動させると、第２の可動部材に取り付けられた顕微鏡本体が対物レンズの光軸に直交する第２の方向に移動させられる。第１の偏向部材からは第２の方向に沿ってレーザ光が入射されてきているので、第２の偏向部材は、第２の可動部材の位置にかかわらず、入射されたレーザ光を対物レンズに向けて偏向する。
したがって、本発明によれば、第１の可動部材と第２の可動部材の位置調整によって、対物レンズの光軸に直交する平面内の任意の位置に対物レンズを配置することが可能となり、標本に横加速度を付与することなく、標本の２次元範囲にわたる観察を行うことができる。

また、上記発明においては、前記第１の可動部材を移動可能に取り付けるとともに、前記対物レンズの光軸方向に移動させる第３の可動部材を備え、該第３の可動部材に、第１の方向に向けてレーザ光を偏向させる第３の偏向部材が固定されていることとしてもよい。
このようにすることで、光ファイバのような光学要素にレーザ光を通過させることなく、対物レンズをその光軸方向に沿う方向にも移動させることが可能となる。

本発明によれば、可動部分を最小限に抑えて装置の大型化や低速化を防止することができる。また、対物レンズの周囲の空間を広く確保して、比較的大きな標本の取り扱い性やそのような標本に対する対物レンズの取り回し性を向上することができる。さらに、標本の状態を変化させることなく、標本の異なる位置を顕微鏡観察することができるという効果を奏する。したがって、標本が生細胞のようにデリケートな場合や、実験小動物のように比較的大きい標本である場合等に、標本を変化させることなく、観察することができる。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡装置１について、図１および図２を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１は、図１に示されるように、レーザ光源３と、標本Ａにレーザ光Ｌを入射させ標本Ａから発せられる光を観察する顕微鏡本体４と、レーザ光源３からのレーザ光Ｌを顕微鏡本体４に入射させる移動ユニット２とを備えている。

前記レーザ光源３は、例えば、チタンサファイアレーザであって、パルス幅が１００ｆｓｅｃ（フェムト秒）程度、波長８００ｎｍ程度の近赤外極短パルスレーザ光を発生する超短パルスレーザ光源である。レーザ光源３は、略水平なベースプレート５上に固定され、水平方向にレーザ光Ｌを出射するようになっている。符号２５はレーザ光Ｌを通過させる筒状のカバーである。
標本Ａは、例えば、生細胞であって、シャーレ状の容器６に貯留した培地Ｂ内に配置されている。

前記顕微鏡本体４は、先端に、標本Ａに対向させられる対物レンズ７を備え、移動ユニット２から入射されてきたレーザ光Ｌを２次元的に走査する、例えば、近接ガルバノミラーのような走査部８と、該走査部８により２次元方向に走査されたレーザ光Ｌを一旦結像して中間像を形成する瞳投影レンズ９と、中間像を結像したレーザ光Ｌを集光して対物レンズ７に入射させる結像レンズ１０とを備えている。図中、符号１１はミラーである。

また、結像レンズ１０と瞳投影レンズ９との間には、多光子蛍光を分岐するダイクロイックミラー１２と、分岐された多光子蛍光を集光する集光レンズ１３と、集光された多光子蛍光を検出する光検出器１４とを備えている。光検出器１４により検出された多光子蛍光情報は、図示しない画像処理装置に送られ、例えば、モニタにより表示されるようになっている。光検出器１４は例えば光電子増倍管である。

前記移動ユニット２は、レーザ光源３を固定するベースプレート５上に固定されたブラケット１５に、レーザ光源３からのレーザ光Ｌの光軸回りに揺動可能に支持され、鉛直平面に沿って伸びる第１のアーム１６と、該第１のアーム１６の長手方向に直交して水平方向に延びるとともに、第１のアーム１６の長手方向に沿って移動可能に支持された第２のアーム１７と、該第２のアーム１７に取り付けられ、第２のアーム１７の長手方向に移動可能に支持される第１のスライダ（第１の可動部材）１８と、該第１のスライダ１８に取り付けられ、第１のスライダ１８の移動方向に直交する方向に移動可能に支持され、前記顕微鏡本体４を吊り下げ状態に取り付ける第２のスライダ（第２の可動部材）１９とを備えている。

第１のアーム１６は、図示しないモータによってその軸線回りに揺動させられるようになっている。第２のアーム１７、第１のスライダ１８および第２のスライダ１９は、それぞれ、リニアガイドのような図示しない公知の手段によってその移動を支持されるとともに、ボールネジのような図示しない公知の手段によって直線的に駆動され、任意の位置に位置決め状態に停止させられるようになっている。

第１のアーム１６の回転軸線位置には、レーザ光源３から軸線に沿って入射されてきたレーザ光Ｌを反射して、第１のアーム１６の長手方向に指向させる第１のミラー（偏向部材）２０が設けられている。第１のミラー２０は、第１のアーム１６に固定され、第１のアーム１６の揺動とともに揺動させられて、レーザ光源３からのレーザ光Ｌを常に第１のアーム１６の長手方向に向けて反射するようになっている。

第２のアーム１７には、第１のミラー２０により反射されてきたレーザ光Ｌの光軸位置に配置される第２のミラー（偏向部材）２１が設けられている。第２のミラー２１は、第２のアーム１７に固定され、第１のアーム１６の長手方向に沿う第２のアーム１７の直線移動とともに、第１のミラー２０からのレーザ光Ｌの光軸に沿って直線移動させられるようになっている。第２のミラー２１は、入射させたレーザ光Ｌを第２のアーム１７の長手方向に沿う方向に向けて反射するようになっている。これにより、第２のミラー２１は、第１のアーム１６に対する第２のアーム１７の位置にかかわらず、常に、第１のミラー２０からのレーザ光Ｌを反射して第２のアーム１７の長手方向に指向させるようになっている。

前記第１のスライダ１８には、図２に示されるように、第３のミラー（偏向部材）２２および第４のミラー（偏向部材）２３が固定されている。第３のミラー２２は、前記第２のアーム１７に固定された第２のミラー２１に対向して、第２のミラー２１によって反射されてきたレーザ光Ｌを入射させる位置に配置されている。第３のミラー２２は、入射させたレーザ光Ｌを第２のスライダ１９に引き渡すように、入射方向に対して直交する方向に反射するようになっている。第４のミラー２３は、第３のミラー２２により反射されたレーザ光Ｌを第２のスライダ１９の移動方向に沿う方向に向けて反射するようになっている。

第３のミラー２２および第４のミラー２３は第１のスライダ１８に固定されているので、第１のスライダ１８が第２のアーム１７の長手方向に移動すると、第１のスライダ１８とともに移動する。したがって、第１のスライダ１８の位置にかかわらず、第２のミラー２１により反射されてきたレーザ光Ｌを、常に第２のスライダ１９の移動方向に沿う方向に指向させるようになっている。

前記第２のスライダ１９には、図２に示されるように、第５のミラー（偏向部材）２４が固定されている。第５のミラー２４は、第４のミラー２３により反射されてきたレーザ光Ｌの光軸上に配置されており、レーザ光Ｌを反射して、顕微鏡本体４内に向けて指向させるようになっている。第５のミラー２４は第２のスライダ１９に固定されているので、第２のスライダ１９の移動とともに移動し、常に、顕微鏡本体４内に向けてレーザ光Ｌを指向させるようになっている。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡装置１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１を用いて真上から標本Ａの多光子蛍光観察を行うには、第１のアーム１６を鉛直方向に沿って配置する。これにより、第２のアーム１７が標本Ａの上方に水平方向に延び、該第２のアーム１７の真下に第１のスライダ１８、第２のスライダ１９および顕微鏡本体４が配置され、顕微鏡本体４の下部に対物レンズ７が真下を向いて配置される。この状態で、第１のスライダ１８および第２のスライダ１９を移動させて標本Ａに対する対物レンズ７の水平方向位置を調節し、第１のアーム１６に対して第２のアーム１７を移動させて標本Ａに対する対物レンズ７の鉛直方向位置を調節する。そして、レーザ光源３を作動させることにより、レーザ光Ｌを水平方向に出射させ、第１のアーム１６の回転軸線に沿って第１のアーム１６内に入射させる。

第１のアーム１６の回転軸線位置には第１のミラー２０が配置されているので、入射されたレーザ光Ｌは第１のミラー２０によって第１のアーム１６の長手方向に沿う方向に反射される。第１のアーム１６の先端には第２のアーム１７が配置され、レーザ光Ｌの光軸上には第２のミラー２１が配置されているので、レーザ光Ｌは第２のミラー２１によって反射され、第２のアーム１７の長手方向に沿って指向される。

また、第２のアーム１７の先端には第１のスライダ１８に固定された第３のミラー２２が配置されているので、レーザ光Ｌは第３のミラー２２によって反射された後、同じく第１のスライダ１８に固定された第４のミラー２３によって第２のスライダ１９の移動方向に沿う方向に指向される。さらに、そのレーザ光Ｌの光軸上には第２のスライダ１９に固定された第５のミラー２４が配置されているので、レーザ光Ｌは第５のミラー２４によって反射されて顕微鏡本体４内に入射させられる。

顕微鏡本体４内に入射されたレーザ光Ｌは、走査部８の作動により２次元的に走査され、瞳投影レンズ９、結像レンズ１０および対物レンズ７を介して試料Ａに照射される。試料Ａにおいては、レーザ光Ｌが集光された所定の深さ方向位置において多光子励起効果により蛍光Ｆが発せられる。そして、発せられた蛍光Ｆは、対物レンズ７および結像レンズ１０を介して同一光路を戻る途中で、ダイクロイックミラー１２によって光路から分岐させられ、集光レンズ１３によって集光されて光検出器１４により検出される。走査部８を構成するガルバノミラーの角度情報および、光検出器１４により検出される多光子蛍光の光量情報に基づいて、２次元的な画像を構築することができ、例えば、モニタに表示されて観察される。

この状態で、標本Ａの観察位置を変更する場合には、第２のアーム１７に対して第１のスライダ１８を作動させることにより、顕微鏡本体４を第２のアーム１７の長手方向に沿う方向に水平移動させることができる。また、第１のスライダ１８に対して第２のスライダ１９を作動させることにより、顕微鏡本体４を第２のアーム１７の長手方向に直交する方向に水平移動させることができる。これにより、標本Ａの真上からの観察状態を維持しながらその観察位置を水平方向の任意の位置に２次元的に変更することができる。

また、標本Ａの観察高さを変更する場合には、第１のアーム１６に対して第２のアーム１７を作動させることにより、顕微鏡本体４を上下方向に移動させ、対物レンズ７によるレーザ光Ｌの集光位置を上下方向に変化させることで観察高さを変更できる。
さらに、標本Ａの観察角度を変更する場合には、ベースプレート５に固定されたブラケット１５に対して第１のアーム１６を揺動させる。これにより、顕微鏡本体４の傾斜角度を変化させ、観察角度を変更することができる。

このように、本実施形態に係る顕微鏡装置１によれば、移動ユニット２が対物レンズ７を下向きにして顕微鏡本体４を吊り下げ状態に支持しているので、移動ユニット２と標本Ａとの間に配置される顕微鏡本体４のみを移動させるだけで、標本Ａの観察位置を変更することができる。したがって、顕微鏡本体４をコンパクトに構成することで、可動部分を小型化することができ、装置全体の小型化を達成することができる。また、対物レンズ７の周囲に広い空間を確保することができる。その結果、標本Ａが比較的大きな場合にも、標本Ａを取り扱うための空間を確保して、取り扱い性を向上することができる。

また、標本Ａを移動させたり、標本Ａに横方向の加速度を作用させたりすることなく、顕微鏡本体４を移動させて標本Ａの観察位置および観察角度を変更できる。したがって、生細胞のように取り扱いがデリケートな標本Ａや、質量が大きく横加速度によって位置ズレ等が生ずる虞のある標本Ａ等を観察する際にも、標本Ａの状態を変化させることなく、異なる観察位置や観察角度で自由に観察することができるという利点がある。

また、本実施形態に係る顕微鏡装置１は、ミラー２０〜２４によってレーザ光Ｌをリレーすることにより、光ファイバを用いることなく、顕微鏡本体４の位置を観察位置や角度に合わせて自由に変化させることができる。したがって、本実施形態のように、レーザ光Ｌとして超短パルスレーザ光を用いた場合においても、標本Ａに照射されるまでの間において群速度分散によりパルス幅が伸びてしまうことを効果的に防止できる。したがって、群速度分散補償器のような大がかりな装置を用いる必要がなく、レーザ光源３を含めた装置全体をコンパクトに構成することができる。

また、群速度分散補償器を用いなくても、超短パルスレーザ光Ｌのパルスが鈍ることが防止されるので、標本Ａにおける集光位置において効率的に多光子励起効果を発生させることができ、高い分解能の多光子蛍光画像を取得することができるという効果がある。
また、光ファイバによってレーザ光Ｌを伝達する場合には、光ファイバの揺れ等によっても標本Ａに入射させるレーザ光の光量が変動するため、不安定であるが、本実施形態によれば、そのような不安定さを解消して、均一な光量のレーザ光Ｌを標本Ａに照射することができるという利点がある。

また、本実施形態に係る顕微鏡装置１によれば、レーザ光源３から出射されたレーザ光が、カバー２５，第１のアーム１６および第２のアーム１７内を通して移動ユニット２内に導かれるので、レーザ光Ｌを外部に対して遮蔽する特別の部材を設ける必要がなく、構造を簡易にすることができる。

なお、本発明に係る顕微鏡装置１は、本実施形態のように、多光子励起観察に最も適しているが、これに限定されるものではなく、一光子励起型の蛍光観察装置に適用することにしてもよい。この場合に、顕微鏡本体４に設けた光検出器１４に代えて、レーザ光源３と第１のアーム１６との間の固定光路にダイクロイックミラーを配置して、蛍光Ｆを分離することとしてもよい。このようにすることで、顕微鏡本体４をさらに軽量・コンパクトに構成し、取り回し性を改善することができる。

また、本実施形態においては、偏向部材としてレーザ光を反射するミラーを採用したが、これに代えて、プリズム等他の任意の偏向部材を採用することにしてもよい。

また、上述したように、本実施形態に係る顕微鏡装置１においては、レーザ光源３から移動ユニット２までの間、カバー２５，第１のアーム１６および第２のアーム１７内を通してレーザ光Ｌを導いたが、これに代えて、図３および図４に示されるように、アームの外部を通過させるように導くこととしてもよい。図中符号２６は第２のアーム１７から外部に突出して第２のミラー２１を支持する支持部、符号２７は第１のスライダ１８から外部に突出して第４のミラー２３を支持する支持部、符号２８は第２のスライダ１９に固定された顕微鏡本体４から外部に突出して第５のミラー２４を支持する支持部である。

この場合には、レーザ光源３から出射されたレーザ光は外部の光路を通過することとなるため、顕微鏡装置１全体を遮光するか、図３に鎖線Ｃで示す位置に、伸縮可能なジャバラ状の遮光部材を設けることとすればよい。
このようにすることで、図１の顕微鏡装置１と比較して、第３のミラー２２およびミラー１１を省略することが可能となり、さらに簡略に構成することが可能となる。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡装置を概略的に示す全体構成図である。 図１の顕微鏡装置の移動ユニットの動作を説明するための斜視図である。 図１の顕微鏡装置の変形例を概略的に示す全体構成図である。 図３の顕微鏡装置の移動ユニットの動作を説明するための斜視図である。

符号の説明

Ａ 標本
１ 顕微鏡装置
２ 移動ユニット
３ レーザ光源
４ 顕微鏡本体
７ 対物レンズ
１８ 第１のスライダ（第１の可動部材：可動部材）
１９ 第２のスライダ（第２の可動部材：可動部材）
２２ 第３のミラー（偏向部材：第１の偏向部材）
２３ 第４のミラー（偏向部材：第１の偏向部材）
２４ 第５のミラー（偏向部材：第２の偏向部材）

Claims (3)

1. レーザ光を出射するレーザ光源と、
   対物レンズを下向きに備え、前記レーザ光源から発せられたレーザ光を標本に照射し、標本から発せられる光を検出する顕微鏡本体と、
   該顕微鏡本体を吊り下げた状態に支持し、標本に対して顕微鏡本体を移動させる移動ユニットとを備え、
   該移動ユニットが、レーザ光源から導かれてきたレーザ光の光軸に沿い、かつ、対物レンズの光軸に交差する方向に沿って、顕微鏡本体を標本に対して移動させる可動部材と、該可動部材に固定され、前記レーザ光を偏向させて前記顕微鏡本体に入射させる偏向部材とを備える顕微鏡装置。
2. 前記対物レンズの光軸に直交する第１の方向に移動可能に設けられる第１の可動部材と、該第１の可動部材に対して前記対物レンズの光軸および前記第１の方向に直交する第２の方向に移動可能に設けられ、顕微鏡本体を固定する第２の可動部材とを備え、
   前記偏向部材が、前記第１の可動部材に固定され第２の方向に向けてレーザ光を偏向させる第１の偏向部材と、第２の可動部材に固定され第２の方向に沿って入射されるレーザ光を偏向させる第２の偏向部材とを備え、
   前記レーザ光源からのレーザ光が前記第１の方向に沿って第１の偏向部材に入射される請求項１に記載の顕微鏡装置。
3. 前記第１の可動部材を移動可能に取り付けるとともに、前記対物レンズの光軸方向に移動させる第３の可動部材を備え、
   該第３の可動部材に、第１の方向に向けてレーザ光を偏向させる第３の偏向部材が固定されている請求項２に記載の顕微鏡装置。

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