JP2007006852A

JP2007006852A - 顕微鏡

Info

Publication number: JP2007006852A
Application number: JP2005194763A
Authority: JP
Inventors: Taijiro Kiyota; 泰次郎清田; Takayuki Uozumi; 孝之魚住; Nobuhiko Yonetani; 信彦米谷; Hirobumi Shiono; 博文塩野
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2005-07-04
Filing date: 2005-07-04
Publication date: 2007-01-18
Anticipated expiration: 2025-07-04
Also published as: JP4774835B2

Abstract

【課題】培養容器で培養される試料を観察する顕微鏡において、試料の生育状態に関する情報を自動で取得可能な顕微鏡を提供すること。
【解決手段】培養容器で培養される試料を観察する顕微鏡であって、培養容器において試料が存在する第１の面と、所定の条件に基づいて、第１の面と異なる第２の面との少なくとも２つの面に対して焦点調節を行う焦点調節部と、第１の面と第２の面とにおいて、撮像して画像を生成する撮像部とを備える。
【選択図】図１

Description

本発明は、培養容器で培養される試料を観察する顕微鏡に関する。

従来から、自動培養装置としてインキュベータが知られている（例えば、特許文献１参照）。このようなインキュベータでは、培養容器の格納、搬送などが自動で行われている。さらに、このようなインキュベータで培養されている試料を観察する際には顕微鏡が用いられ、電子カメラを用いた撮像による自動観察も行われている。
特開２００４−１８０６７５号公報

通常、顕微鏡では試料の存在する培養容器の底面のみが観察対象とされる。しかしながら、培養容器の底面の観察情報だけでは試料の生育状態を正確に把握できない。
本発明は、培養容器で培養される試料を観察する顕微鏡において、試料の生育状態に関する情報を自動で取得可能な顕微鏡を提供することを目的とする。

本発明の顕微鏡は、培養容器で培養される試料を観察する顕微鏡であって、前記培養容器において前記試料が存在する第１の面と、所定の条件に基づいて、前記第１の面と異なる第２の面との少なくとも２つの面に対して焦点調節を行う焦点調節部と、前記第１の面と前記第２の面とにおいて、撮像して画像を生成する撮像部とを備える。
なお、好ましくは、前記焦点調節部は、前記第２の面として、前記培養容器の表面と、前記培養に用いる培地の表面と、前記培地の表面および前記第１の面の間で、かつ、前記試料の種類に応じて決められる中間面との少なくとも１つの面に対して焦点調節を行うようにしても良い。

また、好ましくは、前記焦点調節部は、前記培養容器の種類と、前記試料の種類と、前記培養に用いる培地の量との少なくとも１つに応じて、前記第２の面を決定して焦点調節を行うようにしても良い。
また、好ましくは、前記顕微鏡は、所定の環境条件に調整された恒温室で前記培養容器の前記試料を培養するインキュベータの内部に設置されるようにしても良い。

本発明によれば、培養容器で培養される試料を観察する顕微鏡において、試料の生育状態に関する情報を自動で取得可能な顕微鏡を提供することができる。

以下、本発明の実施形態について図面を用いて詳細に説明する。
図１は、本発明の実施形態における顕微鏡の構成を示すブロック図である。図１に示すように、顕微鏡１は、顕微鏡本体２、照明部３、コンピュータ４から構成される。
顕微鏡１は、ミクロ系およびマクロ系の観察が可能に構成される。顕微鏡本体２は、観察対象の試料を静置するステージ５、ミクロ用対物ガラス部６、ミクロ用対物レンズ部７、マクロ用対物ガラス部８、マクロ用対物レンズ部９、撮像部１０、ミクロ用対物レンズ部７からの光束を撮像部１０に導くミラー１１、マクロ用対物レンズ部９からの光束を撮像部１０に導くミラー１２を備える。また、顕微鏡本体２は、照明部３と相互に接続可能なコネクタＩ／Ｆ部１３、コンピュータ４と相互に接続可能な外部Ｉ／Ｆ部１４、焦点調節を行う焦点調節部１５、各部を制御する顕微鏡制御部１６を備える。顕微鏡制御部１６は、撮像部１０、コネクタＩ／Ｆ部１３、外部Ｉ／Ｆ部１４、焦点調節部１５と相互に接続されるとともに、ステージ５を制御する。

ミクロ用対物レンズ部７は、対物レンズ、対物レンズ駆動部、中間変倍部などを備える。なお、複数の対物レンズを備え、それらを切り替えて使用可能な構成であっても良い。また、マクロ用対物レンズ部９は、対物レンズ、対物レンズ駆動部などを備える。また、撮像部１０は、撮像素子、Ａ／Ｄ変換などの画像処理を行う画像処理部などを備える。
照明部３は、ミクロ用照明ガラス部２０、ミクロ用照明部２１、マクロ用照明ガラス部２２、マクロ用照明部２３を備える。ミクロ用照明部２１およびマクロ用照明部２３は、ＬＥＤなどの光源、集光レンズ、絞り、ミラーなどを備える。また、照明部３は、マクロ用照明ガラス部２２およびマクロ用照明部２３を制御する照明部制御部２４を備える。照明部制御部２４は、上述したコネクタＩ／Ｆ部１３を介して、顕微鏡制御部１６と接続され、顕微鏡制御部１６の指示にしたがってミクロ用照明部２１およびマクロ用照明部２３を制御する。

コンピュータ４は、コンピュータ制御部３１、表示部３２、操作部３３を備え、操作部３３を介して顕微鏡１の動作に関わるユーザ指示を受け付けるとともに、顕微鏡１から取得した画像を表示部３２に表示する。また、コンピュータ制御部３１は、不図示のメモリに各部を制御するためのプログラムを予め記録する。そして、コンピュータ制御部３１は、外部Ｉ／Ｆ部１４を介して顕微鏡制御部１６と接続され、撮像部１０により生成された画像を顕微鏡制御部１６から取得するとともに、顕微鏡制御部１６を制御する。

顕微鏡１は、不図示のインキュベータの内部に設置される。そして、顕微鏡１のうち、照明部３およびステージ５は、インキュベータ内の恒温室内に設置される。このような構成により、調整された環境条件を変化させることなく観察を行うことができる。また、ステージ５には、不図示の搬送系により、観察対象の試料の培養容器が搬送される。搬送系の構成は、公知技術と同様であるため、説明を省略する。

ミクロ系の観察においては、ステージ５に静置された培養容器に対して、ミクロ用照明部２１により照明光を照射し、ミクロ用照明ガラス部２０、培養容器、ミクロ用対物ガラス部６、ミクロ用対物レンズ部７を順に透過し、ミラー１１で反射された透過光を、撮像部１０により撮像する。また、マクロ系の観察においては、ステージ５に静置された培養容器に対して、マクロ用照明部２３により照明光を照射し、マクロ用照明ガラス部２２、培養容器、マクロ用対物ガラス部８、マクロ用対物レンズ部９を順に透過し、ミラー１２で反射された透過光を、撮像部１０により撮像する。

顕微鏡制御部１６は、ステージ５を上下方向に移動することにより、焦点調節の対象となる面を変更するとともに、焦点調節部１５を介してミクロ用対物レンズ部７またはマクロ用対物レンズ部９の一部を対物レンズの光軸方向に移動して、焦点調節を行う。なお、焦点調節は、公知技術と同様に行われるため、説明を省略する。
図２に、本実施形態の顕微鏡１の観察対象である培養容器の例を示す。図２Ａに示す培養容器は、３５ｍｍディッシュである。不図示の搬送系によりステージ５上に搬送可能であれば、ウェルプレートやフラスコなどどのような培養容器であっても良い。なお、以下では、図２Ａに示す３５ｍｍディッシュを培養容器として液体培地で培養された細胞を、顕微鏡１で観察する場合を例に挙げて説明を行う。

以下、図面を用いて、本発明の特徴であるマクロ系の観察について説明する。このマクロ系の観察により、試料の生育状態に関する情報を取得することができる。
図３は、マクロ系の観察時の顕微鏡１の動作を示すフローチャートである。なお、観察に際しては、観察対象の試料の種類、培養容器の種類、培養に用いる培地の量の他、培養容器が複数存在する場合には観察順序、観察スケジュール（例えば、１日１回など）の情報が予めユーザにより指定されているものとする。これらの情報の指定については、従来の自動培養装置などと同様に行われるため、説明を省略する。

ステップＳ１において、コンピュータ制御部３１は、各部を介して細胞接着面に対して焦点調節を行う。
図４Ａは、培養容器である３５ｍｍディッシュの断面図であり、図４Ｂは、図４Ａの一部分を拡大した図である。細胞接着面とは、図４Ｂに示すように、培養容器の底面近傍の面である。コンピュータ制御部３１は、試料の種類、培養容器の種類などに基づいて、細胞接着面を決定し、外部Ｉ／Ｆ部１４、顕微鏡制御部１６を介してステージ５を上下方向に移動して、細胞接着面を焦点調節の対象となる面にする。なお、試料の種類、培養容器の種類などに基づく細胞接着面の決定は、コンピュータ制御部３１の不図示のメモリにテーブルや演算式を予め記録しておくことにより実現する。

そして、コンピュータ制御部３１は、外部Ｉ／Ｆ部１４、顕微鏡制御部１６、焦点調節部１５を介してマクロ用対物レンズ部９を制御して、細胞接着面に対して焦点調節を行う。なお、焦点調節は山登り方式の画像ＡＦやアクティブＡＦなど、どのような方法で行っても良い。
ステップＳ２において、コンピュータ制御部３１は、外部Ｉ／Ｆ部１４、顕微鏡制御部１６を介して撮像部１０を制御し、細胞接着面において撮像を行う。

ステップＳ３において、コンピュータ制御部３１は、各部を介して浮遊面に対して焦点調節を行う。
浮遊面とは、図４Ｂに示すように、細胞接着面および後述する培地表面の間の中間面である。一般に、死細胞や弱った細胞は、細胞接着面に接着せずに培地に浮遊することが知られている。浮遊面は、このような浮遊した細胞が存在すると推測される面であり、コンピュータ制御部３１は、試料の種類（特に、細胞の大きさ）、培養容器の種類、培地の量などに基づいて、浮遊面を決定し、外部Ｉ／Ｆ部１４、顕微鏡制御部１６を介してステージ５を上下方向に移動して、焦点調節の対象を細胞接着面から浮遊面に変更する。なお、試料の種類、培養容器の種類、培地の量などに基づく浮遊面の決定は、細胞接着面の決定と同様に、コンピュータ制御部３１の不図示のメモリにテーブルや演算式を予め記録しておくことにより実現する。

そして、コンピュータ制御部３１は、ステップＳ１と同様に各部を制御して、浮遊面に対して焦点調節を行う。なお、細胞の輪郭のボケ量を算出して、細胞接着面に接着した細胞の高さを超えたことを認識して、ＡＦを行うようにしても良い。
ステップＳ４において、コンピュータ制御部３１は、外部Ｉ／Ｆ部１４、顕微鏡制御部１６を介して撮像部１０を制御し、浮遊面において撮像を行う。

ステップＳ５において、コンピュータ制御部３１は、各部を介して培地表面に対して焦点調節を行う。
培地表面とは、図４Ｂに示すように、培養に用いられる培地の表面である。コンピュータ制御部３１は、培養容器の種類、培地の量などに基づいて、培地表面を決定し、外部Ｉ／Ｆ部１４、顕微鏡制御部１６を介してステージ５を上下方向に移動して、焦点調節の対象を浮遊面から培地表面に変更する。なお、培養容器の種類、培地の量などに基づく培地表面の決定は、細胞接着面の決定と同様に、コンピュータ制御部３１の不図示のメモリにテーブルや演算式を予め記録しておくことにより実現する。

そして、コンピュータ制御部３１は、ステップＳ１と同様に各部を制御して、培地表面に対して焦点調節を行う。なお、培地の表面界面の画像コントラスト変化を利用して、ＡＦを行うようにしても良い。
ステップＳ６において、コンピュータ制御部３１は、外部Ｉ／Ｆ部１４、顕微鏡制御部１６を介して撮像部１０を制御し、培地表面において撮像を行う。

ステップＳ７において、コンピュータ制御部３１は、各部を介して培養容器表面に対して焦点調節を行う。
培養容器表面とは、図４Ｂに示すように、培養容器の上側の表面である。コンピュータ制御部３１は、培養容器の種類、蓋の高さなどに基づいて、培養容器表面を決定し、外部Ｉ／Ｆ部１４、顕微鏡制御部１６を介してステージ５を上下方向に移動して、焦点調節の対象を培地表面から培養容器表面に変更する。なお、培養容器の種類、蓋の高さなどに基づく培養容器表面の決定は、細胞接着面の決定と同様に、コンピュータ制御部３１の不図示のメモリにテーブルや演算式を予め記録しておくことにより実現する。

そして、コンピュータ制御部３１は、ステップＳ１と同様に各部を制御して、培養容器表面に対して焦点調節を行う。なお、培養容器の蓋の部分に文字などが記載されている場合は、この文字に対して、ＡＦを行うようにしても良い。
ステップＳ８において、コンピュータ制御部３１は、外部Ｉ／Ｆ部１４、顕微鏡制御部１６を介して撮像部１０を制御し、培養容器表面において撮像を行う。

ステップＳ９において、コンピュータ制御部３１は、ステップＳ２、ステップＳ４、ステップＳ６、ステップＳ８で生成した画像を、顕微鏡制御部１６、外部Ｉ／Ｆ部１４を介して、コンピュータ４に取り込む。
ステップＳ１０において、コンピュータ制御部３１は、取り込んだ画像を解析する。コンピュータ制御部３１は、以下の点について解析を行う。

（１）ステップＳ２で撮像した細胞接着面の画像の解析
コンピュータ制御部３１は、細胞接着面の画像を解析し、細胞の混み具合と、細胞の密度とを検出する。細胞の混み具合とは、培地中の細胞の局地的な粗密を示し、生育状態が良好であれば、均一になる。また、密度とは、培地面積に対する細胞の存在する面積であり、生育が進むにつれて密度は高くなる。

（２）ステップＳ４で撮像した浮遊面の画像の解析
コンピュータ制御部３１は、浮遊面の画像を解析し、死細胞の数を検出することにより、死亡率を求める。
（３）ステップＳ６で撮像した培地表面の画像の解析
コンピュータ制御部３１は、培地表面の画像を解析し、培地の白濁の度合いを検出することにより、コンタミネーションの有無および程度を検出する。また、培地にフェノールレッドなどの指示薬が含まれている場合には、色相を検出して培地のｐＨを推定する。

（４）ステップＳ８で撮像した培養容器表面の画像の解析
コンピュータ制御部３１は、培養容器表面の画像を解析し、文字情報やクロスコンタミネーションの有無などを検出する。図２Ｂの点線ａで囲まれた部分に示すように、文字情報が記入されている場合は、この文字情報を取得する。なお、また、図２Ｂの点線ｂで囲まれた部分に示すように、培養容器にヒビなどの損傷が見られる場合は、損傷が存在することを認識する。また、図２Ｂの点線ｃで囲まれた部分に示すように、培地のこぼれが見られる場合には、クロスコンタミネーションが発生している可能性があるということを認識する。

（５）複合的な解析
コンピュータ制御部３１は、（１）で説明した細胞の混み具合および細胞の密度、（３）で説明した培地のｐＨなどに基づいて、継代時期および培地交換時期を推定する。なお、推定の際には、生育状態の推移を知る必要があり、今回の観察より以前に観察された各画像との比較を行って、継代時期および培地交換時期を推定する。

ステップＳ１１において、コンピュータ制御部３１は、ステップＳ９で取り込んだ画像とステップＳ１０で行った解析の解析結果とを不図示の記録部に記録する。記録の際には、観察日時などの情報とともに画像と解析結果とを関連付けて記録する。
このとき、解析結果をユーザに対して報知したり、解析結果に基づいてユーザに対して警告を行うようにしても良い。例えば、継代時期、培地交換時期をユーザに対して報知するようにしても良い。また、死亡率が一定の値を超えた場合やコンタミネーション、クロスコンタミネーション、損傷が発生した場合にユーザに対して警告するようにしても良い。報知および警告は、ブザーなどの音声情報を利用しても良いし、文字情報やランプなどの視覚情報を利用しても良い。また、電子メールなどを利用して報知および警告を行うようにしても良い。

また、記録の際に、各情報をデータベース化するようにしても良い。例えば、生育状態の推移を知るために、以前の観察結果と併せてグラフなどを作成するようにしても良い。
以上説明したように、本実施形態によれば、培養容器において試料が存在する第１の面と、所定の条件に基づいて、前記第１の面と異なる第２の面との少なくとも２つの面に対して焦点調節を行い、第１の面と第２の面とにおいて、撮像して画像を生成する。したがって、これらの画像の比較検討により、試料の生育状態に関する情報を自動で取得することができる。

また、本実施形態によれば、第２の面として、培養容器の表面と、培養に用いる培地の表面と、培地の表面および第１の面の間で、かつ、試料の種類に応じて決められる中間面との少なくとも１つに対して焦点調節を行う。したがって、培養容器の表面を第２の面とした場合には、表面に記入された文字などの情報や培地がこぼれることによるクロスコンタミネーションの有無などの情報を取得することができる。また、培養に用いる培地の表面を第２の面とした場合には、カビなどによるコンタミネーションの有無や培地の色相などの情報を取得することができる。また、中間面を第２の面とした場合には、死細胞の状態などの情報を取得することができる。

また、本実施形態によれば、培養容器の種類と、試料の種類と、培養に用いる培地の量との少なくとも１つに応じて、第２の面を決定して焦点調節を行う。したがって、第２の面に対する焦点調節を速やかに実行することができる。
また、本実施形態によれば、顕微鏡は、所定の環境条件に調整された恒温室で培養容器の試料を培養するインキュベータの内部に設置される。したがって、調整された環境条件を変化させることなく試料の生育状態に関する情報を取得することができる。

なお、本実施形態では、ステージ５を上下方向に移動することにより、焦点調節の対象となる面を変更する例を示したが、他の部分（撮像部１０など）を移動することにより焦点調節の対象となる面を変更するようにしても良い。また、焦点調節の対象となる面の決定をテーブルや演算式を予め記録しておくことにより実現する例を示したが、他の方法で実現するようにしても良い。また、図４に示した４つの面以外の面を、さらに焦点調節の対象とするようにしても良い。

また、本実施形態では、ミクロ用対物レンズ部７またはマクロ用対物レンズ部９の一部を対物レンズの光軸方向に移動して、焦点調節を行う例を示したが、他の部分（ステージ５など）を移動することにより焦点調節を行うようにしても良い。
また、本実施形態では、それぞれの面に移動した後にＡＦを行う例を示したが、ＡＦを省略することにより動作を簡略化するようにしても良い。また、ＡＦの際に上下限を設けるようにしても良い。例えば、細胞接着面に対する焦点調節では、細胞の大きさに基づいて上下限を設けることによりＡＦに要する時間を短縮することが期待できる。また、例えば、浮遊面に対する焦点調節では、細胞接着面に応じて下限を設定し、培地表面と細胞の大きさとに応じて上限を設定することができる。

また、本実施形態では、ミクロ観察系とマクロ観察系とを隣接して備えた顕微鏡１を例に挙げて説明を行ったが、マクロ観察系のみを備えたものであっても良いし、ミクロ観察系とマクロ観察系とが離れた位置に設けられたものであっても良い。
また、本実施形態では、液体培地で培養された細胞を透過照明により観察する例を示したが、固体培地で培養された試料を観察する場合や、反射照明により観察を行う場合にもにも同様に本発明を適用することができる。

また、本実施形態では、インキュベータの内部に設置された顕微鏡１を例に挙げて説明を行ったが、本発明はこの例に限定されない。また、本実施形態では、照明部３およびステージ５が、インキュベータ内の恒温室内に設置される例を示したが、顕微鏡やインキュベータの構成に応じて適宜本発明を適用することができる。
また、本実施形態では、撮像部１０による撮像の終了後に、コンピュータ４による画像の解析を行う例を示したが、撮像部１０による撮像の終了後には画像の記録のみを行い、解析は後に行うようにしても良い。また、他のコンピュータを用いて画像の解析を行うようにしても良い。

本実施形態の顕微鏡の構成を示すブロック図である。培養容器について説明する図である。本実施形態の顕微鏡の動作を示すフローチャートである。焦点調節について説明する図である。

符号の説明

１，顕微鏡２，顕微鏡本体４，コンピュータ５，ステージ１０，撮像部１５，焦点調節部１６，顕微鏡制御部３１，コンピュータ制御部

Claims

培養容器で培養される試料を観察する顕微鏡であって、
前記培養容器において前記試料が存在する第１の面と、所定の条件に基づいて、前記第１の面と異なる第２の面との少なくとも２つの面に対して焦点調節を行う焦点調節部と、
前記第１の面と前記第２の面とにおいて、撮像して画像を生成する撮像部と
を備えたことを特徴とする顕微鏡。
前記焦点調節部は、前記第２の面として、前記培養容器の表面と、前記培養に用いる培地の表面と、前記培地の表面および前記第１の面の間で、かつ、前記試料の種類に応じて決められる中間面との少なくとも１つの面に対して焦点調節を行う
ことを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
前記焦点調節部は、前記培養容器の種類と、前記試料の種類と、前記培養に用いる培地の量との少なくとも１つに応じて、前記第２の面を決定して焦点調節を行う
ことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の顕微鏡。
前記顕微鏡は、所定の環境条件に調整された恒温室で前記培養容器の前記試料を培養するインキュベータの内部に設置される
ことを特徴とする請求項１から請求項３の何れか１項に記載の顕微鏡。