JP2006528772A - ダイクロイック／ハイパス複合フィルタを用いた撮像装置 - Google Patents

Abstract

撮像装置（１６）は、レンズ（１２）と、レンズ（１２）の前に配置されたダイクロイックフィルタ（１８）と、レンズ（１２）とダイクロイックフィルタ（１８）との間に配置されたハイパスフィルタ（２０）とを有する。この撮像装置（１６）の各構成品を協調させて、蛍光性被写体（１０）の広角撮像に関連した撮像アーティファクトを減少させる適切な構成を提供する。

Description

本発明は、一般に蛍光撮像装置に関し、特に、ダイクロイックフィルタが通過させた広角の励起光の迷光の低減に関する。

蛍光測定を用いる最も一般的な理由は、感度の必要性から、あるいは、暗視野での蛍光測定によって達成される高いＳ／Ｎ（信号対雑音）レベルだからである。蛍光測定の主な目的は、蛍光信号（波長帯）のみをセンサに受け入れて、励起波長を排除することである。蛍光測定の感度は通常、暗視野を侵す背景の迷光に関連したノイズによって制限される。背景の迷光が、サンプルまたは測定装置から放散される場合がある。装置からの迷光は、スペクトルフィルタリングによって軽減される。励起エネルギから生じる迷光を、実質的な蛍光エネルギ信号がフォトセンサへ至るまでの光路から除去する必要がある蛍光測定において、光のスペクトルフィルタリングは不可欠である。

蛍光測定時の多くの場合、最も高い感度は、放射光波長よりわずか数十ｎｍ短い波長の光を励起することにより得られる。この励起光−放射光間の波長差は、蛍光色素のストークス・シフトと呼ばれる。ダイクロイック（干渉）フィルタは、生産的な放射光から励起光の迷光を適切に排除できるように設計および製造可能であるため、一般的に利用されている。発色団を用いて光を吸収するハイパスフィルタは、励起光を吸収して放射光を通過させるように設計および製造可能ではあるが、要求される数十ｎｍの範囲における生産的な排除および透過は通常は実施可能ではなく、また、発色団は蛍光を発する傾向がある（すなわち、測定波長領域におけるノイズの原因となる）。さらに、ダイクロイックフィルタの設計／製造では、放射スペクトルのカットオンおよびカットオフ波長（従来の順次増大するスペクトルに従ったもの）によって規定された透過光帯域の通過を可能にしやすく、放射光のための透過ウィンドウが得られる。良好に設計されたダイクロイック帯域通過フィルタは、高感度の蛍光測定には不可欠である。その理由は、測定対象の蛍光色素以外の材料が、蛍光を発することがあるからである。そのような他の材料がターゲットの蛍光色素のために設定された通過帯域幅以外の蛍光を発することは多く、それらによる放射を排除すると、蛍光測定の感度は向上する。

蛍光測定が一般的に必要とされるようになったのは、撮像の用途においてであって、複数レンズの組み合わせを用いて、蛍光エネルギ信号を、フィルムなどのエリアセンサまたは電子センサ（ＣＣＤアレイ）へ方向付ける。蛍光測定の感度およびダイナミックレンジをさらに向上させるために、冷却ＣＣＤアレイセンサを使用することがより一般的になってきている。撮像の速度および明瞭度を向上させ、かつ、光学構造部分の作動範囲を広げるためには、とても複雑なレンズ（多くの素子）を使用する必要がある。

適切に設計されたダイクロイックフィルタを撮像の用途に利用する際の難点は、図１Ａに示すように、ダイクロイックフィルタの通過帯域幅が、フィルタ面上の光の入射角の関数となっていることである。すなわち、垂直入射からずれて入射した光は、干渉コーティング中をより長い光路長で横断する。そのため、ダイクロイックフィルタのカットオン（およびカットオフ）波長が短くなり、通過帯域幅はブルーシフトする。したがって、精巧なレンズによって実現された広い画角において、放射光フィルタの通過帯域幅は、イメージ半径に沿って増大するブルーシフトを示す（図１Ｂ）。高感度の蛍光撮像の用途では、半径方向のブルーシフトは、重度のアーティファクトを生じさせる可能性があるが、それは、ブルーシフトされた放射光フィルタのカットオン波長が、励起光のカットオフ波長にかなり重なる場合である。それによって生じた励起光の迷光が、視野の周縁部に侵入し、多くの場合には暗視野内の明るい環として観察される撮像アーティファクトを発生させる。一般的に、明るい環状のアーティファクトは、迷光をダイクロイックフィルタに戻すよう反射する多素子レンズにおける円形構造を反映したものである。ダイクロイックフィルタは、レンズに向けてその光を反射して戻し、最終的にセンサに至るようにする。撮像アーティファクトの一例を、図２Ａに示す。

広角撮像装置においてブルーシフトされた通過帯域幅に対処する方法の一つは、ダイクロイック放射光源フィルタ（破線で描いた要素１００として、図１Ａに示す）をレンズ素子群の後段に配置することである。この方法では、良好に設計されたレンズにおいて広角の光線を低減させることができるので、ブルーシフトを軽減するのにある程度有効である。有効ではあるが、この方法では、反射性および蛍光性の材料および表面をレンズ中に含むレンズ素子群から、過剰な励起光を排除することはできない。それによって生じたイメージアーティファクトは、暗視野内のもや（均一とは限らない）として表れ、背景ノイズとなる。

こうしたことから、高感度の蛍光測定を阻害する撮像アーティファクトを低減する費用対効果の高い技術が要求されている。

本発明によって、上記要求が満たされるとともに、上記問題点に対する解決策が提供される。

本発明の一つの特徴によれば、撮像装置が提供される。その撮像装置は、レンズと、レンズの前に配置されたダイクロイックフィルタと、前記レンズと前記ダイクロイックフィルタとの間に配置されたハイパスフィルタと、を有する。

本発明の他の特徴によれば、撮像装置が提供される。その撮像装置は、電子センサ上に蛍光イメージを結像させるレンズと、前記レンズの前に配置され、蛍光イメージの放射スペクトルを通過させると共に励起光をフィルタリングして排除するダイクロイック帯域通過フィルタと、前記レンズと前記ダイクロイックフィルタとの間に配置され、前記ダイクロイックフィルタが通過させた広角の励起光の迷光をフィルタリングするハイパスフィルタと、を有する。

本発明は、以下の利点を有する。１．撮像装置が、高感度の蛍光測定を阻害する撮像アーティファクトを低減する費用対効果の高い技術を実現する。２．広角蛍光撮像装置において、励起光の通過帯域幅のブルーシフトが軽減される。

図１Ａに、本発明の実施形態を示す。図に示すとおり、蛍光イメージの被写体面１０が、広角レンズ１２によって、撮像装置１６の電子センサ１４上に結像される。

同じ波長を有する複数の光線が、カメラレンズ１２の前に設けられたダイクロイック帯域通過フィルタ１８に入射する。拡大部分図に示すように、光線１は、フィルタ表面に対してほぼ垂直である狭角（Ａ１）にて入射する。光線２は、広角（Ａ２）にて入射する。ダイクロイックフィルタ１８は、図１Ｂの透過スペクトルで表される帯域通過スペクトルを有するよう設計されている。そのように設計されたフィルタ１８は、垂直または狭角の光線を良好に排除する。広角にて入射する光線は、干渉コーティング中をより長い光路長で横断し、帯域通過スペクトルをブルーシフトさせる影響がある。十分に広角な入射角（Ａ２）では、「２」などの光線はフィルタ１８が通過させてしまう。ダイクロイックフィルタ１８とレンズ１２との間に設置された、良好に設計されたハイパスフィルタ２０が、垂直および狭角であれば排除される広角光線を減少させる。

本発明は、高感度の蛍光測定を妨害する撮像アーティファクトを低減する、費用対効果の高い技術を実現する。本発明の主な特徴は、安価な吸収性のハイパスフィルタ２０を、レンズ１２面とダイクロイックフィルタ１８との間に配置することである。ハイパスフィルタ２０としては、励起光のカットオフ波長にて十分な吸収性を示すものを選択する。それにより、広角での作動時にブルーシフトされた放射光源フィルタが励起光の迷光を通過させてしまった場合に、その励起光の迷光を確実かつ適切に減少させる。本発明の効果の一例は、図２Ａおよび図２Ｂに示す比較イメージ（高感度蛍光測定装置で得られた比較用広角イメージ）において明らかである。最大画角は、垂直入射から約２１度に相当する。測定された被写体は、ニトロセルロース膜中に帯状に吸収された色素Cy5.5である。円形のイメージアーティファクトが、ダイクロイックフィルタのみを用いた図２Ａでは存在し、吸収性フィルタを追加して使用した図２Ｂでは存在しない。使用した撮像装置は、大型ＴＶレンズ（１０倍ズーム）と、ハロゲン光源をフィルタリングする６３０ｎｍ用のＡＦ３０オメガ(Omega)励起光源フィルタと、７００ｎｍ用のＤＦ３０オメガ放射光源フィルタとを備える。利用した吸収性フィルタは、ラッテン(Wratten)70である。カメラはコダック社のIS2000であり、図示した画像は、１６ビットデジタル出力の８ビットスライス（暗視野から２５６段階まで）である。

本発明に関するさらなる知識および設計原理は、解析モデリングによって説明できる。解析のポイントは、励起光と放射光の通過帯域幅の重なりを予測することである。ブルーシフトの原因は入射角であり、高品質ダイクロイックフィルタにおいて測定されるブルーシフトは、垂直入射からのずれ１度当たり約０．５ｎｍである。広角撮像装置では、垂直から２５度以上ずれた光の入射も含むため、放射光のカットオン波長のブルーシフトは１３ｎｍとなる。高感度蛍光アッセイにおいて、励起光源フィルタおよび放射光源フィルタの対のフィルタは通常、中心波長で約６０ｎｍの間隔をあけて用いられ、それらの各フィルタは３０〜３５ｎｍの通過帯域幅（ＦＷＨＭ；半値全幅）を有する。ＦＷＨＭ３５ｎｍの高品質ダイクロイック帯域通過フィルタを用いると、最大値０．００１で、５０ｎｍより大きい通過帯域幅が得られる（実験データによる）。高感度蛍光アッセイにおいて、放射光帯域幅内で励起光を１０^−６未満に確実に抑えることは不可欠であり、それは、励起光カットオフ波長および放射光カットオン波長の両方に関してドメイン波長が０．００１未満に減衰していることを確実とすることによって達成される。図３ｂのグラフは、垂直入射の場合に、部分透過率０．００１にて、励起光カットオフ波長と放射光カットオン波長との間に約５ｎｍの領域が存在する。しかし、放射光に１３ｎｍのブルーシフトがあると、基準が満たされない。それは、最も広角な画角では放射光源フィルタがかなりの励起光を通過させてしまうことを意味する。励起光のカットオフレベル０．００１にて２より大きい光学濃度を有する吸収性フィルタ（典型的なラッテン・ハイパスフィルタにならって設計されたもの）を挿入すると、ちょうど１０^−６の減衰基準を満たすことができる。

放射光源フィルタと吸収性フィルタとの組み合わせフィルタの設計において、上述のような解析モデリング手法を用いることは重要である。実際には、１０^−６の適切減衰基準を満たすことは重要であるが、それは臨界最適条件として取り扱わなければならない。吸収性フィルタでより一層大きく減衰させることを選択した場合、垂直入射における生産的な蛍光放射光が減衰し、その減衰は、放射光源ダイクロイックフィルタの半径方向のブルーシフトに起因して、イメージ半径の関数として増大する。さらに、いずれの吸収性フィルタも、過多の励起光を吸収した場合には、蛍光性背景を生成してしまう傾向がある。したがって、吸収性フィルタをダイクロイックフィルタとレンズ面との間のみに配置することが重要である。イメージアーティファクトを低減するという吸収性フィルタの顕著な効果は、ブルーシフトされた放射光源フィルタによって通過された広角の励起光は吸収性フィルタを３回以上通過しないとイメージ形成に関与できないという原理により説明される。したがって、励起光のカットオフレベル０．００１にて１より大きい光学濃度を有するハイパス吸収性フィルタを選択すれば、最低限に十分であると考えられる。より狭い視野の場合は、１未満の光学濃度を有するハイパス吸収性フィルタを選択してもよい。

図３に、蛍光測定に使用される励起光フィルタおよび放射光フィルタの波長の関数としての部分透過率を示す。波長軸の目盛りは、放射光源フィルタの中心波長からのナノメートルの単位になっている。励起光源（ＥＸ）フィルタおよび放射光源（ＥＭ）フィルタの中心波長は、互いに６０ｎｍずれている。励起光源フィルタは３０ｎｍＦＷＨＭであり、放射光源フィルタは３５ｎｍＦＷＨＭである。励起光源フィルタおよび放射光源フィルタの最大透過率は、実際には部分透過率０．８程度である。図示したデータは、フィルタ特性の実験測定値に沿ってモデリングしたものである。例示したハイパス吸収性フィルタは、典型的なラッテンフィルタに従ったものである。図３ｂのグラフは、図３ａのグラフを単に拡大スケールで示したものであり、励起光カットオフ波長（frTransEX）と、ブルーシフトされた放射光カットオン波長（frTransBluEM）との重なりを、明確に示している。透過率０．００１では、励起光カットオフ波長と、通常の放射光カットオン波長（frTransEM）とは、約５ｎｍの間隙によって隔てられている。吸収性フィルタは、励起光カットオフ波長０．００１レベルでは、部分透過率が０．０１未満であり、積frTransBluEM*Wrによって表される当該重なりを抑制するのに十分すぎるほどである。

コダックIS2000の装置の場合では、上記がレンズに入射する励起光として表れ、それによってレンズ内部構造がダイクロイックフィルタ面へ逆方向に反射され、ダイクロイックフィルタがそれらのレンズ構造のイメージを反射し返してレンズに再入射させ、最終的には、レンズ内部構造のイメージが生成されてしまう。レンズ内部構造の大部分は同心円であるため（IS2000のレンズは不規則な「ポスト部」も含むが）、高感度蛍光撮像の適切な解析を実現可能にするには「フラット」でなければならない暗視野に、円形パターン（ポスト部を含む）が重度のアーティファクトとしてはっきり表れてしまう。

この問題に対する解決策を試験したところ、極めて良好に作用するように見受けられる。組み合わせフィルタは、適切に選択されたハイパス・ラッテンフィルタを、ダイクロイック放射光源フィルタの裏側（カメラ側）に接触させて配置したもので構成される。放射光フィルタの角度に基づくブルーシフトによって帯域通過された励起光は、ラッテンフィルタによって減少され、前述の図の下方のグラフ（図３ｂ）に示したクロストークのモデリング計算によれば、組み合わせフィルタでは０．００１の基準が満たされていることがわかる。実験によればその暗視野は、公称でフラットであり、円形その他のアーティファクトは存在しない。この複合フィルタによる唯一の影響は、ゆるやかな口径食である。それは、放射光源複合フィルタが、中心から周縁部にかけて減少する通過帯域幅を有することに起因し、より広い視野における口径食はさらに顕著になる。

本発明の実施形態を示す略図である。 帯域通過フィルタの波長に対する透過を示すグラフである。 本発明の実施形態を示す略図であり、図１Ａの部分拡大図である。 本発明の説明に有用な図である。 本発明の説明に有用な図である。 励起波長と放射波長の重なりを示すグラフである。 励起波長と放射波長の重なりを示すグラフである。

Claims (3)

1. 撮像装置であって、レンズと、前記レンズの前に配置されたダイクロイックフィルタと、前記レンズと前記ダイクロイックフィルタとの間に配置されたハイパスフィルタと、を有する撮像装置。
2. 撮像装置であって、電子センサ上に蛍光イメージを結像させるレンズと、前記レンズの前に配置され、前記蛍光イメージの放射スペクトルを通過させ、かつ、励起光をフィルタリングして排除するダイクロイック帯域通過フィルタと、前記レンズと前記ダイクロイックフィルタとの間に配置され、前記ダイクロイックフィルタが通過させた広角の励起光の迷光をフィルタリングするハイパスフィルタと、を有する撮像装置。
3. 請求項２に記載の撮像装置において、前記ハイパスフィルタが、励起光フィルタの公称カットオフ波長である適切な波長にて、１より大きい光学濃度を有する撮像装置。

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