JP3773059B2 - バイオチップ読取装置 - Google Patents

Description

本発明は、バイオチップ読取装置に係り、特にレーザ等のコヒーレント光源を励起光として使用したバイオチップ読取装置に関するものである。

この種のバイオチップ読取装置に関連する先行技術文献としては次のようなものがある。

新しい光学顕微鏡、第二巻、「共焦点レーザ顕微鏡の医学・生物学への応用」、学際企画株式会社、１９９５年３月２８日発行、Ｐ１３２〜１３３ 実験医学別冊、ポストゲノム時代の実験講座３、「ＧＦＰとバイオイメージング」、株式会社羊土社、２０００年１０月２５日発行、Ｐ１５８

図１７は、非特許文献１に記載の共焦点光学系に基づく原理構成図である。このような原理構成図に基づいたバイオチップ読取装置では、遮光板２に設けられたピンホールＰＨを介して出射された光源１からのレーザ光がレンズ３により平行光となりダイクロイックミラー４を透過して対物レンズ５に入射する。対物レンズ５はこの励起光を集光してサンプル（バイオチップ）６を照射する。

バイオチップ６の試料に付着された蛍光物質は励起光に励起されて発光し、その蛍光は対物レンズ５を介してダイクロイックミラー４で反射された後、集光レンズ７により絞られて遮光板８に設けられたピンホールＰＨ上に結像する。この像はサンプル６の蛍光像であり、受光器９により検出される。

サンプル６面の蛍光像（２次元像）を観測するにはサンプル６面上を励起光で走査する必要がある。この場合、通常、励起光側を走査するのではなく、サンプル６を載置したステージ（図示せず）側を光軸とは直角な方向に走査（ステージスキャンと言う）する。

このようなバイオチップ読取装置では、光源として白色光を用いると光量不足となるためレーザ光が用いられている。また、ピンホールを用いて共焦点型としたことにより、検出像にはサンプル６に付着したゴミの影響が出ないと共に、励起光を絞ってサンプルに照射しているためスペックルノイズも生じないようになっている。

また、図１８は従来のバイオチップ読取装置の他の一例を示す原理構成図である。このような原理は、例えば、非特許文献２に記載されている。
図１８において、レーザ等の平行光光源（図示せず）からの励起光は集光レンズ１１で絞られ、その後ダイクロイックミラー１２で反射して対物レンズ１３に入射する。このとき、励起光は対物レンズ１３の焦点距離ｆの位置に結像し、これが第２光源となって対物レンズ１３に入射する。

サンプル１４は対物レンズ１３を透過した励起光で照射される。サンプルとしては例えば表面が平坦なスライドグラス上にＤＮＡを配置したＤＮＡチップ等である。ＤＮＡチップの各サイト１５では、標識したＤＮＡの蛍光物質が励起光により励起されて蛍光を発する。

その蛍光は、像形成光学系を介して受光器１８上に結像する。すなわち、蛍光は実線で示すように対物レンズ１３により平行光となってダイクロイックミラー１２およびバリアフィルタ１６を通過してレンズ１７に入射する。レンズ１７により結像したサンプル１４の像は受光器１８で検出される。

この場合、サンプル面の全面にわたって照射された励起光の振舞を考察すると次の通りである。破線で示すように平面が平坦な試料面で反射した励起光（この励起光を反射励起光あるいは戻り励起光と呼ぶ）は、対物レンズ１３で絞られ焦点距離ｆの位置に収束する。そしてこの焦点位置を中間像面とするレンズ１７を通って受光器１８に入る。

なお、反射励起光はレンズ１７を通る前にダイクロイックミラー１２とバリアフィルタ１６を透過する。バリアフィルタ１６は蛍光は通すが反射励起光は除去（減衰）するように形成されており、このバリアフィルタ１６を通すことにより背景光として受光器１８へ混入する反射励起光を低減している。

しかしながら、このような従来のバイオチップ読取装置には次のような課題があった。
（１）図１７に示すバイオチップ読取装置では、ピンホール等の調整が大変であり、また高価にもなるという課題があった。さらに、ステージは走査を行なうために耐久性が要求され、高価になるという欠点もあった。

（２）図１８に示す装置では、バリアフィルタで反射励起光を減衰するものの十分な減衰は得られなかった。蛍光分子測定等においては背景光を１０^−９程度まで落とす必要があるが、この装置では１０^−７程度の減衰率しか得られず、明らかに減衰不足であるという課題があった。

また、バイオチップにおけるｍＲＮＡの発現をｃＤＮＡで測定する場合は、その発現量に大幅な違いがあり、次のような課題があった。例えば、図１９（ａ）に示す遺伝子Ａと遺伝子Ｂの発現量に同図（ｂ）のように１０〜１００倍もの違いがある場合、発現量をそのまま精度良く測定しようとすると、検出器内に使用のアナログ・デジタル変換器や増幅器に大きなダイナミックレンジと高精度が要求され、高価になるという問題があった。

また、アナログ・デジタル変換器や増幅器のゲインを変えて複数回測定する方式も考えられるが、この方式では測定時間がかかり、測定値のばらつきやバイオチップの退色も大きくなるという問題があった。

本発明の目的は、上記の課題を解決するもので、光の利用効率を高め、安価で低精度のアナログ・デジタル変換器や増幅器の使用によっても高精度に試料を測定できるバイオチップ読取装置を提供することにある。

このような課題を達成するために、本発明の請求項１に記載の発明では、
光源からの励起光を複数のマイクロレンズを介してバイオチップの複数のセルにそれぞれ照射し、前記複数のセル内に注入された蛍光物質付着の試料からの蛍光画像情報を検出器により読取るバイオチップ読取装置であって、前記光源は、光強度の強い部位と光強度の弱い部位から成る励起光を発生するように構成され、前記バイオチップは、試料の発現量が光強度の強い励起光が照射される部位のものほど少なく光強度の弱い励起光が照射される部位のものほど多くなるように、各セルの試料が配置されて成ることを特徴とする。

このような構成によれば、発現量のより少ない試料にはより強い光強度の励起光が照射され、発現量のより多い試料にはより弱い光強度の励起光が照射されるため、検出器で受光する各試料からの蛍光量に大きな差はなくなる。
これにより検出器側のアナログ・デジタル変換器や増幅器には、従来のような大きなダイナミックレンジや高精度は要求されなくなる。

この場合、光強度分布を、請求項２のように中央が強く周辺が弱くなるようにしても構わない。
また、請求項３のように、光源と試料の間に励起光の一部を遮光または減光するマスクを配置してもよい。このようにマスクを使用して励起光の一部だけを用いるようにすると、バイオチップ上での試料の配置の自由度が向上する。

また、請求項４のように前記光源にズーム機構部を備え、バイオチップの発現量に対応して前記光源からの励起光の光強度分布を変化させるようにすることもできる。
このようにすると、発現量分布の異なるバイオチップにもそれぞれ容易に対応することができる。

本発明によれば、バイオチップの各試料の発現量に大きな差があっても検出器には大きなダイナミックレンジや高精度は要求されず、安価で低精度のアナログ・デジタル変換器や増幅器を使用した検出器で満足の行く試料像を検出することができる。
また、光源の光強度分布のシェーディング量を大きくできるため、光量の大幅な効率アップが図れるという効果もある。

以下図面を用いて本発明を詳細に説明する。図１は本発明に係るバイオチップ読取装置の一実施例を示す要部構成図である。

図１において、３１はレーザ等のコヒーレント光（以下レーザ光という）を励起光として発生する光源、３２はそのレーザ光を平行光にするレンズ、３３はマイクロレンズアレイである。マイクロレンズアレイ３３は、複数のマイクロレンズＭＬを配列したもので、回転板３４に取付けられている。

３５は回転板３４を回転させるモータ、３６はサンプル、３７はレンズ、３８はバリアフィルタ、３９は集光レンズ、４０は受光素子としてＣＣＤ等を用いたカメラである。

光源３１から出射されたレーザ光はレンズ３２により平行光となってマイクロレンズアレイ３３に入射する。各マイクロレンズＭＬはそれぞれレーザ光を集光してサンプル３６を照射する。サンプル３６には、複数のセルが２次元状配置され、各セル内には試料が注入される構造となっている。

モータ３５により回転板３４を回転させると、各マイクロレンズＭＬで絞られた励起光ビームがサンプル３６上を走査する。マイクロレンズＭＬは、その各ビームがサンプルの各セルを個別に走査できるような空間位置関係で回転板３４上に配置されている。

各試料からの蛍光は、レンズ３７に入射した後バリアフィルタ３８を介してレンズ３９に入射する。バリアフィルタ３８は、サンプル３６からの蛍光は通すがサンプル３６を通って入って来た励起光は減衰させる作用効果を有するもので、試料像の背景光を除去するために使用される。
レンズ３９により集光し結像した試料像は、カメラ４０の受光素子（図示せず）により受像される。

このような構成により、複数のマイクロレンズによりマルチビームを得て、そのビームでサンプルを走査しサンプルの２次元像を容易に得ることができる。
なお、サンプルに付着するゴミはカートリッジ等を使用すると激減できるため、従来のように共焦点型の読取装置にしなくてもよい。ただし、励起光の光量は必要である。本発明では励起光としてレーザ光を用いているため、高輝度で十分な光量が得られる。

また、本発明ではマイクロレンズにより励起光を絞っているため試料像にはスペックルノイズが生じない。また、従来のようにピンホールを使用しないので調整が楽であり、さらには光走査のためにステージを移動させる移動機構も不要のため耐久性に富み小型で安価な装置が容易に実現できる。

図２は他の一例を示す要部構成図である。図１のバイオチップ読取装置は透過型であるが、図２は反射型の場合である。マイクロレンズアレイ３３とサンプル３６の間にダイクロイックミラー４１を配置し、サンプル３６で発光した蛍光をこのダイクロイックミラー４１で反射させレンズ３９に入れる。レンズ３９はこの蛍光を集光してカメラ４０の受光素子面に結像する。その他の構成や動作は図１に同じである。

図３は励起光を±５度以下の入射角でバリアフィルタに入射させる本発明の他の実施例図である。図１８の従来例との違いは、バリアフィルタの配置位置である。図３においてはレンズ１７と受光器１８の間にバリアフィルタ１６を配置してある。

バリアフィルタ１６の減衰率（入射光強度に対する出射光強度の比）は図４に示すように光の入射角に依存し、１０^−７以上の減衰率を得るにはバリアフィルタへの入射角を±５度（deg）以下にする必要がある。

なお、図４に示すデータは平行なレーザ光を用いてバリアフィルタを測定した例である。一般の分光光度計では発散または収束光を用いるため、このような値は得られない。

バリアフィルタ１６のこのような配置により、励起光は±５度以下の入射角でバリアフィルタ１６に入射するため、ほぼ１０^−９程度減衰する。そのため、受光器１８面での観測像の背景光は十分に少なくなる。

なお、本発明は上記実施例に限定されない。例えば、以下のような構成を採用することもできる。
（１）光源像の大きさに係る場合
図５に白色光等の非レーザ光を用いた場合のケーラー照明系の要部構成図を示す。光源５１（光源の直径がａ）からの光が集光レンズ１１に入射して直径ａ’の第２光源５２を作る。この第２光源５２によりサンプル１４は照射される。このときのサンプル１４を照射する励起光の角度（ここではこの角度を照射角と呼ぶ）βは第２光源５２の直径に対応する。

透過型や反射型の顕微鏡ではケーラー照明で大きな角度βがないと必要十分な分解能は得られない。蛍光顕微鏡の場合も同様に光源像５２の直径ａ’は元の光源５１の直径ａの１０倍程度に拡大され、角度βを大きくしている。

しかし、角度βを大きくするとバリアフィルタ１６への入射角も大きくなり、励起光の減衰率を低下させるため、角度βには限度がある。光源像と対物レンズ１３の焦点距離ｆの間には、次の関係がある。
ａ’／２＝ｆβ
すなわち、
β＝ａ’／（２ｆ）
ここに、ｆは対物レンズ３の焦点距離

十分な減衰率を得るためには、βを±５度以下にする必要がある。±５度以下に抑えるには、例えば光源の大きさあるいは励起光学系の焦点距離ｆ’等を調節すればよい。

（２）光源アレイの場合
図６は緑色Ｇと赤色Ｒのように波長の異なる２つの光源からなる光源アレイを使用した場合の構成図である。Ｇ光源はレンズ１１から距離ｆ’の位置の光軸上に置かれ、Ｒ光源はその位置で光軸よりｂだけ離れた所に置かれている。このような配置では、水平に置かれた試料面に対して、Ｇ光源からの光は垂直に入り、他方のＲ光源からの光は照射角γ（＝ｆ’ｂ）で入る。

試料面で反射した励起光は対物レンズ３およびダイクロイックミラー１２を透過した後、短波長側（Ｇ光源側）の光は第２のダイクロイックミラー１２ａで反射し、他方の長波長側（Ｒ光源側）の光は第２のダイクロイックミラー１２ａを透過する。

そして前者は結像レンズ１７とバリアフィルタ１６を介して受光器１８上に結像し、後者は結像レンズ１７ａとバリアフィルタ１６ａを介して受光器１８ａ上に結像する。

この場合、バリアフィルタ１６ａを水平に取付けているとＲ光源の反射励起光はγ度傾いた角度で入射する。そこで直角に入射するようにバリアフィルタ１６ａを水平面からγ度傾けて配置する。
これにより、試料面での反射励起光はいずれもバリアフィルタ１６，１６ａに直角に入射することになり、それぞれ十分に減衰される。

（３）結像レンズに係る変形例
図７は結像レンズの要部構成図である。バリアフィルタの機能と結像レンズの機能を併せ持つ蛍光フィルタ付レンズ６０を用いた場合の例である。
この蛍光フィルタ付レンズ６０は、平凸レンズ６１の平面側に蛍光用干渉膜６２を貼り付けたものであり、この干渉膜６２により反射励起光をバリアフィルタと同様に減衰させるものである。

（４）ポイントマスク型への変形例
図８に示すように、試料からの反射励起光が対物レンズ１３により収束する箇所に遮光部材７１を配置して反射励起光をカットする。遮光部材７１は例えば透明板あるいは水平方向へ放射状に伸びた３本の支柱等で支える。

遮光部材７１の直径φが１．２２λ／ＮＡ（ただし、λは励起光の波長、ＮＡは対物レンズ１３の開口数）程度であれば（換言すれば励起光のビーム径とほぼ等しい面積であれば）、８０％以上反射励起光をカットできる。この場合、上記実施例におけるようなバリアフィルタを用いなくてよい。あるいは、減衰率の低い安価なフィルタを用いてもよい。

（５）ポイントミラー型への変形例
上記実施例に示すダイクロイックミラーの代わりに、図９に示すようにケーラー照明の第２光源部に小片のミラー７２を配置する。このミラー７２は、励起光のビーム径とほぼ等しい面積を有していて、ダイクロイックミラーと同様に光源８１からの励起光を反射し、サンプル１４を照射すると共に対物レンズ１３で絞られた反射励起光も光源側へ反射する。したがって、反射励起光は受光器（図示せず）へは入らない。
なお、ミラー７２は透明基板や支柱による支持体７３により保持され、その取付け位置と角度が維持される。

（６）透過蛍光型の場合
図１０は透過型蛍光読取方式のバイオチップ読取装置の一実施例図である。この場合も同様にバリアフィルタを用いて透過励起光を減衰させることができる。バリアフィルタ９４，９７を、サンプル９３と対物レンズ９５との間と、結像レンズ９６と受光器１８との間にそれぞれ配置する。なお、バリアフィルタはいずれか一方だけにしても差し支えない。
なお、この場合、対物レンズ９５と結像レンズ９６とはテレセントリック系になっている。

なお、図１１は図１に示す構成においてバリアフィルタ３８をレンズ３９とカメラ４０の間に配置したものである。サンプル３６を透過した励起光は、図１１中に点線で示すように、ほぼ平行な光でレンズ３７，３９から成る結像光学系に入射した後、カメラ４０に対してはほぼ平行な光で入射する。
このとき励起光は、±５度以下の入射角でバリアフィルタ３８に入射し、ほぼ１０^−７以上減衰する。

このような実施例によれば次のような効果がある。
（１）励起光をバリアフィルタに±５度以内の入射角で入射させるようにしたため、容易に励起光を減衰させることができる。
（２）結像レンズを平凸レンズとし、これに蛍光用干渉膜を貼り付けることにより、バリアフィルタを用いることなく、バリアフィルタを用いたのと同等の作用効果を容易に実現することができる。

（３）対物レンズにより絞られた反射励起光ビームを遮光または反射させるため、バリアフィルタを用いないでも受光器への反射励起光の混入を容易に防止することができる。
（４）透過型の蛍光読取方式のバイオチップ読取装置においてもバリアフィルタを配置して受光器に入る励起光を容易に減衰させることができる。

また、従来例の図１９で指摘した問題に対する解決策としては、次のような構成とするのが望ましい。光源から光強度の強い部位と光強度の弱い部位から成る励起光を発生させると共に、その励起光のシェーディングを故意に大きくする。

例えば図１２に示すように励起光を中央が強く周辺が弱い光強度パターンとなるようにし、その平行光の有効範囲Ｒ内における光強度Ｉの最高値に対する最低値の割合αを９０％程度にする。このような光強度分布の励起光はマイクロレンズアレイ２１およびダイクロイックミラー２２を介して同様の光強度分布パターンでサンプル２３を照射する。

一方、サンプル２３においては、図１３に示すように発現量の多い試料ほど外側のセルへ、発現量の少ない試料ほど内側のセルへ配置し、発現量分布が励起光の強度分布とは逆のパターンとなるような配置にする。

励起光の光強度分布と試料の発現量分布をこのような関係にすると、発現量の少ない試料、換言すれば蛍光の少ない試料には強い光強度の励起光が照射され、発現量の多い換言すれば蛍光の多い試料には弱い光強度の励起光が照射される。

これにより、発現量に大きな差があっても検出器に入射する各試料からの蛍光にはあまり差がなくなり、したがって検出器内のアナログ・デジタル変換器や増幅器には大きなダイナミックレンジや高精度は要求されず、低精度で安価なものを使用することができる。なお、励起光分布は別途測定しておき、試料からの蛍光は、その励起光分布によって補正して用いる。

なお、このようなバイオチップ読取装置は上記実施例に限定されるものではない。例えば、図１４に示すように遮光または減光のマスク１００を用いて励起光の一部だけを用いると、バイオチップに照射される励起光は図示のような光強度分布となる。このように、遮光または減光パターン（ここでは濃度パターンとも言う）を持つマスクを使用すれば、バイオチップ上の試料の配置の自由度が格段に向上する。

また、図１５に示すように励起光のシェーディング量を可変にするように構成しても構わない。同図において、図１２の構成と異なる点はズーム機構部である。ズーム機構部１１０は通常のズームレンズを使用した機構であり、光源（図示せず）からの平行光ビームを適宜に拡大または縮小してマイクロレンズアレイ２１に与える。

ズーム機構部１１０でビームを拡大すると、光源から出射された励起光の光強度分布パターンが横に広がってマイクロレンズアレイ２１に入射する励起光の強度分布パターンはより平坦なパターンとなる。逆に縮小するとより急峻なパターンとなる。

このように拡大・縮小によりシェーディング量が変化するので、ズーム機構部１１０を操作することによりサンプル２３に応じてシェーディング量を任意に設定することができる。

また、励起光の光強度分布やサンプルの試料の配置は変えないで、入出力特性が図１６に示すような対数関係にある受光素子で構成された検出器を用いてサンプルの蛍光像を検出する構成としてもよい。
このような構成によれば、入力（蛍光量）に大きな違いがあっても検出器側のアナログ・デジタル変換器や増幅器での飽和は防止でき、アナログ・デジタル変換器や増幅器には大きなダイナミックレンジと高精度は要求されなくなる。

以上説明した実施例の発明によれば、バイオチップの各試料の発現量に大きな差があっても検出器には大きなダイナミックレンジや高精度は要求されず、安価で低精度のアナログ・デジタル変換器や増幅器を使用した検出器で満足の行く試料像を検出することができる。
また、光源の光強度分布のシェーディング量を大きくできるため、光量の大幅な効率アップが図れるという効果もある。

本発明に係るバイオチップ読取装置の一実施例を示す要部構成図である。 本発明の他の実施例を示す要部構成図である。 本発明の更に他の実施例を示す要部構成図である。 バリアフィルタの減衰率特性図である。 本発明のバイオチップ読取装置の他の一例を示す要部構成図である。 光源アレイを用いた場合の説明図である。 結像用のレンズの他の実施例を示す構成図である。 遮光部材を用いた場合の構成図である。 ミラーを用いた場合の構成図である。 透過型蛍光読取方式のバイオチップ読取装置に係る一実施例構成図である。 本発明の他の実施例を示す要部構成図である。 本発明の更に他の実施例を示す要部構成図である。 試料の配置の様子を説明するための図である。 本発明の他の実施例を示す要部構成図である。 本発明の他の実施例を示す要部構成図である。 検出素子の入出力特性を示す図である。 従来のバイオチップ読取装置の原理構成図である。 従来のバイオチップ読取装置の他の一例を示す原理構成図である。 バイオチップと試料の発現量の差についての説明図である。

符号の説明

１１，９２，９５，９６ レンズ
１２，１２ａ，４１ ダイクロイックミラー
１３ 対物レンズ
１４，３６，９３ サンプル
１５ サイト
１６，１６ａ，３８，９４，９７ バリアフィルタ
１７，１７ａ，２５，３２，３７，３９ レンズ
１８，１８ａ 受光器
２１，３３ マイクロレンズアレイ
２３，３６ サンプル
３１，５１，８１，９１ 光源
３４ 回転板
３５ モータ
４０ カメラ
５２ 第２光源
６０ 蛍光フィルタ付レンズ
６１ 平凸レンズ
６２ 蛍光用干渉膜
７１ 遮光部材
７２ ミラー
１００ マスク
１１０ ズーム機構部

Claims (4)

1. 光源からの励起光を複数のマイクロレンズを介してバイオチップの複数のセルにそれぞれ照射し、前記複数のセル内に注入された蛍光物質付着の試料からの蛍光画像情報を検出器により読取るバイオチップ読取装置であって、
   前記光源は、光強度の強い部位と光強度の弱い部位から成る励起光を発生するように構成され、
   前記バイオチップは、試料の発現量が光強度の強い励起光が照射される部位のものほど少なく光強度の弱い励起光が照射される部位のものほど多くなるように、各セルの試料が配置されて成る
   ことを特徴とするバイオチップ読取装置。
2. 前記光源は、中央が強く周辺が弱い光強度分布を呈する励起光を発生するように構成されたことを特徴とする請求項１に記載のバイオチップ読取装置。
3. 前記光源と試料の間に、励起光の一部を遮光または減光するマスクを配置したことを特徴とする請求項１または２に記載のバイオチップ読取装置。
4. 前記バイオチップの発現量に対応して前記光源からの励起光の光強度分布を変化させるズーム機構部を備えたことを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載のバイオチップ読取装置。

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