JP2006523083A5 - - Google Patents

Description

プラズマ細胞の作製：先のアッセイにより該当免疫グロブリンを分泌するＢ細胞クローンを含むと同定された単一微量培養ウェルの内容物を回収した。１００−１０００μｌピペットマンを使用し、３７Ｃ ＲＰＭＩ（＋１０％ＦＣＳ）を加えることによりウェルの内容物を回収した。細胞をピペッティングにより再懸濁した後に別の１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移した（最終容量５００〜７００μｌ）。細胞をマイクロ遠心機で１５００ｒｐｍ（２４０ｒｃｆ）にて２分間室温で遠心した後、試験管を１８０°反転させ、再び２分間１５００ｒｐｍで遠心した。凍結培地を吸引除去し、免疫細胞をＲＰＭＩ（１０％ＦＣＳ）１００μｌに再懸濁した後、遠心した。ＲＰＭＩ（１０％ＦＣＳ）によるこの洗浄を繰返し、細胞をＲＰＭＩ（ＦＣＳ）６０μｌに再懸濁し、使用時まで氷上保存した。

プラークアッセイ結果：二次検出試薬単独（０／４）に比較してコーティングを検出するためにＭＡＢ３０７を使用して免疫蛍光顕微鏡測定によりコーティングを定性測定した処、非常に高品質（４／４）であることが判明した。ストレプトアビジンのみをコーティングした赤血球でＭＡＢ３０７抗体を使用した場合にはシグナルは検出されなかった（０／４）。次にこれらの赤血球を使用して表４に示す１４個のウェルから抗原特異的プラズマ細胞を同定した。抗原特異的プラズマ細胞を回収する顕微操作後に、可変領域遺伝子をコードする遺伝子を単一プラズマ細胞でＲＴ−ＰＣＲにより回収した。

発現。単一プラズマ細胞の単離後に、ｍＲＮＡを抽出し、逆転写ＰＣＲを実施してｃＤＮＡを作製した。ポリメラーゼ連鎖反応を使用して重鎖及び軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡを特異的に増幅した。重鎖可変領域はＩｇＧ２発現ベクターにクローニングした。このベクターはヒトＩｇＧ２の定常領域をｐｃＤＮＡ３．１＋／Ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）のマルチクローニング部位にクローニングすることにより作製した。軽鎖可変領域はＩｇＫ発現ベクターにクローニングした。このベクターはヒトＩｇＫの定常領域をｐｃＤＮＡ３．１＋／Ｎｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）のマルチクローニング部位にクローニングすることにより作製した。次に重鎖及び軽鎖発現ベクターの適当な対を７０％コンフルエントヒト胚性腎２９３細胞の６０ｍｍ皿にコリポフェクションし、トランスフェクト細胞に組換え抗体を２４時間分泌させた。上清（３ｍＬ）をＨＥＫ２９３細胞から回収し、ヒトＩｇＧを特異的に検出するサンドイッチＥＬＩＳＡで無傷抗体（ＡＢ−ＡＢＴ２−ＸＧ２−０１２及びＡＢ−ＡＢＴ２−ＸＧ２−１９８）の分泌を確認した（表５，第４列）。ＥＬＩＳＡを使用して組換え抗体とビオチン化とＥｐｏＲの結合によりＡＢ−ＡＢＴ２−ＸＧ２−０１２とＡＢ−ＡＢＴ２−ＸＧ２−１９８の特異性を確認した（表５，第５列）。