JP2006520187A - コンジュゲート用の脱グリコシル化された酵素 - Google Patents
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Abstract
Description
組み換えによって産生されたアルカリホスファターゼの脱グリコシル化
ピキア・パストリスから単離した10mgの組み換えによって産生されたアルカリホスファターゼ(図中では「recAP」ともいわれる)を、200ミリ単位のエンドグリコシダーゼH(「endoH」、Rocheカタログ番号1643053)と共に、1mMのMgCl2と1.5MのNaClを含む1mlの30mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)中で2時間インキュベートした。この時間の後、溶液を、YM30膜を取り付けた濾過チャンバー中で、150mMのNaCl、1mMのMgCl2、および0.1mMのZnCl2を含むトリエタノールアミン/HCl緩衝液(pH7.6)を使用して徹底的に透析し、これによって1mlの最終容量を得た。図1は、endo Hでの処理の前および後の、組み換えによって産生されたアルカリホスファターゼのTSK 3000カラム上での溶出時間を示す。処理前の6.88分での溶出ピークが完全に消滅しており、新しい溶出ピークが7.61分に現れたことを見ることができる。このことは、組み換えによって産生されたアルカリホスファターゼがグリカン鎖を失い、その結果、変化していない分子と比較して、より分子量が小さくなり、溶出時間が遅くなったことを示している。
AP酵素活性の測定
アルカリホスファターゼの酵素活性を、記載されている試験プロトコール(Z. Klin. Chem. Klin. Biochem. 8(1970)658-660;およびZ. Klin. Chem. Klin. Biochem. 10(1972)182)にしたがって基質として4−ニトロフェニルホスフェートを使用して決定した。組み換えによって産生されたピキア・パストリス由来アルカリホスファターゼは、約7,000U/mgの比活性を示し、これはエンドグリコシダーゼHでの処理によって変化しなかった。
アルカリホスファターゼコンジュゲートの調製
APの活性化
0.5mlの30mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.1)中に溶解させたアルカリホスファターゼ調製物(組み換えによって産生されたアルカリホスファターゼ;組み換えによって産生されたアルカリホスファターゼ/endo Hで処理したもの)各5mgを、12μlのDMSO中に溶解させた0.059mgのN−スクシンイミジル−S−アセチルチオプロピオナート(SATP)と混合し、室温(RT)で1時間攪拌した。反応を、5μlの1Mリジン−HClの添加によって停止させ、室温(RT)でさらに30分間攪拌した。その後、反応混合物を、50mMのNaClを含む1.5lの10mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.1)に対して、4℃で一晩、徹底的に透析した。
1mlの30mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.1)中に溶解させた20mgのモノクローナル抗体である抗hCG−M−INN22−IgGを、21μlのDMSO中に溶解させた0.205mgのマレイミドヘキサノイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MHS)と混合し、RTで1時間攪拌した。反応を、5μlの1Mリジン−HClの添加によって停止させ、RTでさらに30分間攪拌した。その後、反応混合物を、50mMのNaClを含む5lの10mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.1)に対して、4℃で一晩、徹底的に透析した。
50mMのNaClを含む324μlの10mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)中に溶解させた、SATPで活性化したAP調製物(組み換えによって産生されたアルカリホスファターゼ;組み換えによって産生されたアルカリホスファターゼ/endo Hで処理したもの)各3mgを、8μlの1Mヒドロキシルアミン溶液と混合し、RTで1時間攪拌した。この時間の後、50mMのNaClを含む262μlの10mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)中に溶解させた1.74mgのMHS活性化抗hCG−M−INN22−IgGを添加し、反応混合物をRTで2時間攪拌した。その後、7μlの0.2Mシステイン−HCl溶液(1Mのリン酸の添加によってpH6.7に調整した)を添加し、RTで30分間攪拌した。この後、7μlの0.5M N−メチルマレイミド水溶液を添加し、RTでさらに30分間攪拌した。次いで、反応混合物を、150mMのNaCl、1mMのMgCl2、および0.1mMのZnCl2を含む1.5lの50mMのトリエタノールアミン−HCl緩衝液(pH7.6)に対して、4℃で一晩、徹底的に透析した。透析後、溶液を3MのNaCl濃度とし、使用するまで+4℃で保存した。
hCG ELISAによるコンジュゲートの比較
hCG ELISAを、ストレプトアビジンでコーティングしたマイクロタイタープレートを使用することによって、サンドイッチアッセイとして行った。ビオチニル化Mab抗hCG−M−1F79−Fab誘導体を、固定化した結合パートナーとして使用した(1ウェルあたり、インキュベーションバッファー中の5μg/ml溶液150μlをRTで30分間インキュベートした)。3回の洗浄後、それぞれ、インキュベーションバッファー中に溶解させた、0、14.84、254.8、2103、および7801mU/mlの濃度の120μlのhCG試料を、それぞれのウェルに添加し、RTで1時間インキュベートした。3回の洗浄後、100μlの上記アルカリホスファターゼ/Mab抗hCG−M−INN22−IgGコンジュゲートをそれぞれ添加し、RTで1時間インキュベートした。3回の洗浄後、1ウェルあたり100μlの100mM 4−ニトロフェニル−ホスフェート基質溶液を添加し、RTで20分間のインキュベーションの後、吸光度を、補正波長として490nmを使用して、405nmでELISAリーダーで測定した。
マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置(MALDI−TOF−MS)によるendo Hで脱グリコシル化したrecAPの分子量の決定
ピキア・パストリス中で産生させたrecAPを、実施例1に記載したようにendo Hによって処理し、蒸留水に対して透析した。タンパク質溶液をシナピン酸マトリックス溶液と混合し、標的上で結晶化させた(chrystallized)。試料を、ディレイドエクストラクションを備えたVoyager Biospectrometryワークステーション上で、ポジティブモードで分析した。
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Claims (24)
- (a)形質転換された酵母における発現により得、該酵母から単離したグリコシル化酵素を提供する工程、
(b)工程(a)の酵素を脱グリコシル化する工程、
(c)脱グリコシル化された酵素を単離する工程、
(d)工程(c)の脱グリコシル化された酵素を、標的分子に結合可能な分子に結合させる工程
を含む、標的分子に結合可能な分子と酵素とのコンジュゲートの作製方法。 - (a)形質転換された酵母における発現により得、該酵母から単離したグリコシル化酵素を提供する工程、
(b)工程(a)の酵素を部分的に脱グリコシル化する工程、
(c)部分的に脱グリコシル化された酵素を単離する工程、
(d)工程(c)の部分的に脱グリコシル化された酵素を、標的分子に結合可能な分子に結合させる工程
を含む、標的分子に結合可能な分子と酵素とのコンジュゲートの作製方法。 - 工程(b)において、10%〜99%の炭水化物残基がグリコシル化酵素から切断除去されることを特徴とする、請求項2記載の方法。
- 工程(b)において、20%〜70%の炭水化物残基がグリコシル化酵素から切断除去されることを特徴とする、請求項3記載の方法。
- 工程(b)において、約60%の炭水化物残基がグリコシル化酵素から切断除去されることを特徴とする、請求項4記載の方法。
- 工程(a)のグリコシル化酵素が哺乳動物性タンパク質を含まないことを特徴とする、請求項1〜5いずれか記載の方法。
- 工程(a)のグリコシル化酵素が哺乳動物性病原体を含まないことを特徴とする、請求項1〜6いずれか記載の方法。
- 該酵素がアルカリホスファターゼであり、ここで、該アルカリホスファターゼのアミノ酸配列が、該アルカリホスファターゼを発現する形質転換宿主生物において認識されるグリコシル化部位を含有することを特徴とする、請求項1〜7いずれか記載の方法。
- アルカリホスファターゼが真核生物起源のものであることを特徴とする、請求項8記載の方法。
- アルカリホスファターゼが、配列番号:1のアミノ酸配列を含有するアルカリホスファターゼであることを特徴とする、請求項9記載の方法。
- 工程(b)において、該酵素が、化学試薬、アミダーゼ、エキソグリコシダーゼまたはエンドグリコシダーゼにより脱グリコシル化または部分的に脱グリコシル化されることを特徴とする、請求項1〜10いずれか記載の方法。
- 工程(b)において、該酵素が、エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼH、エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼF、またはペプチド−N−グリコシダーゼF、またはその組み合わせにより脱グリコシル化または部分的に脱グリコシル化されることを特徴とする、請求項11記載の方法。
- 標的分子に結合可能な分子が、
(a)抗体またはその機能性断片、
(b)アビジン、またはアビジン分子のポリマー、またはビオチンに結合可能なアビジンの断片、またはビオチンに結合可能なアビジン断片のポリマー、
(c)ストレプトアビジン、またはストレプトアビジン分子のポリマー、またはビオチンに結合可能なストレプトアビジンの断片、またはビオチンに結合可能なストレプトアビジン断片のポリマー、
(d)レクチン、または炭水化物に結合可能なその断片、
(e)ハプテン、
(f)核酸またはそのアナログ
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項1〜12いずれか記載の方法。 - 標的分子に結合可能な分子が、連結基によって酵素に結合することを特徴とする、請求項1〜13いずれか記載の方法。
- (a)形質転換された酵母における発現により得、該酵母から単離したグリコシル化酵素を提供する工程、ここで、該グリコシル化酵素の炭水化物部分は多数のマンノースサブユニットを含む、
(b)工程(a)の酵素を部分的に脱グリコシル化する工程、
(c)部分的に脱グリコシル化された酵素を単離する工程
を含む方法によって得られ得る、哺乳動物性タンパク質を含まない、哺乳動物起源の単離および部分的に脱グリコシル化された酵素。 - 該酵素が、アルカリホスファターゼであることを特徴とする、請求項15記載の酵素。
- アルカリホスファターゼが、配列番号:1のアミノ酸配列を含有するサブユニットを含むことを特徴とする、請求項16記載の酵素。
- アルカリホスファターゼのサブユニットの分子量が54kDa〜58kDaであることを特徴とする、請求項17記載の酵素。
- コンジュゲートを形成するための請求項15〜18いずれか記載の酵素の使用。
- 請求項1〜14いずれか記載の方法により得られ得る、標的分子に結合可能な分子と酵素とのコンジュゲート。
- 標的分子の存在を検出するため、または標的分子の量を測定するためのアッセイにおける請求項20記載のコンジュゲートの使用。
- アッセイが酵素免疫測定法であることを特徴とする、請求項21記載の使用。
- 酵素免疫測定法が不均一系または均一系酵素免疫測定法であることを特徴とする、請求項22記載の使用。
- 固相に結合させた標的分子に結合可能な分子、請求項20記載のコンジュゲート、インキュベーションバッファー、および該コンジュゲートの酵素部分により変換され得る基質を含有してなる、パーツのキット。
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