JP2006519601A - 白血病におけるmrdを検出するための標準化および最適化された実時間定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応法 - Google Patents
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Abstract
Description
しかしながら、これは、CGおよびFGアッセイの最適化および標準化にかなり依存する。
ローベンベルグ・ビー(Lowenberg B)、ダウニング・ジェイ・アール(Downing JR)およびバーネット エイ(Burnett A)著,「アキュート・ミエロイド・ロイケミア エヌ・イングル・ジェイ・メド(Acute myeloid leukemia.N Engl J Med)」,1999年,341号,p1051−1062 ベルマ・エイ(Verma A)およびストック・ダブリュー(Stock W)著,「マネージメント・オフ・アダルト・アキュート・リンフォブラスティック・ロイケミア:ムービング・トゥワード・ア・リスク−アダプテッド・アプローチ.キュア・オピン・オンコール(Management of adult acute lymphoblastic leukemia:moving toward a risk-adapted approach.Curr Opin Oncol)」,2001年,13号,p14−20 アペルバウム・エフ・アール(Appelbaum FR),「パースペクティブ・オン・ザ・フューチャー・オフ・クロニック・ミエロイド・ロイケミア・トリートメント.セミン・ヘマトル(Perspectives on the future of chronic myeloid leukemia treatment.Semin Hematol)」,2001年,38号,p35−42 カンパナ・ディー(Campana D)およびピュイ・シー−エイチ(Pui C-H),「ディテクション・オフ・ミニマル・ディズィーズ・イン・アキュート・ロイケミア:メソドロジック・アドバンス・アンド・クリニカル・シグニフィカンス.ブラッド(Detection of minimal disease in acute leukemia:methodologic advances and clinical significance.Blood)」,1995年,85号,p1416−1434 ヴァン・ドンジン・ジェイ・ジェイ(Van Dongen JJ)、マキンティレ・イー・エイ(Macintyre EA)、ガベルト・ジェイ・エイ(Gabert JA)、デラベッセ・イー(Delabesse E)、ロッシ・ブイ(Rossi V)、サグリオ・ジー(Saglio G)、ゴッタルジ・イー(Gottardi E)、ランバルディ・エイ(Rambaldi A)、ドッティ・ジー(Dotti G)、グリーシンガー・エフ(Griesinger F)、パレリラ・エイ(Parrerira A)、ガメイオ・ピー(Gameio P)、ディアス・エム・ジー(Diaz MG)、マレック・エム(Malec M)、ランゲラク・エイ・ダブリュー(Langerak AW)、サン・ミゲル・ジェイ・エフ(San Miguel JF)、ビオンディ・エイ(Biondi A)著,「スタンダダイズド・RT−PCR アナリシス・オフ・フュージョン・ジーン・トランスクリプツ・フロム・クロモソーム・アベレーション・イン・アキュート・ロイケミア・フォー・ディテクション・オフ・ミニマル・レジドュアル・ディジーズ(Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberration in acute leukemia for detection of minimal residual disease)」,レポート・オフ・ザ・BIOMED−1 Concerted Action(Report of the BIOMED-1 Concerted Action):インベスティゲーション・オフ・ミニマル・レジドゥアル・ディジーズ・イン・アキュート・ロイケミア.ロイケミア(investigation of minimal residual disease in acute leukemia.Leukemia),1999年,第13号,p1901−1928 ファン・デル・ベルデン・ブイ(van der Velden V)、ホシュハウス・エイ(Hochhaus A)、カザニジア・ジー(Cazzanigia G)、セゼパンスキ・ティー(Szczepanski T)、ガベルト・ジェイ(Gabert J)およびファン・ドンジン・ジェイ(van Dongen J)著,「ディテクション・オフ・ミニマル・レジドゥアル・ディジーズ・イン・ヘマトポイエティック・マリグナンシーズ・バイ・リアル−タイム・クウァンティタティブ・PCR(Detection of minimal residual disease in hematopoietic malignancies by real-time quantitative PCR):プリンシプルズ,アプローチズ、アンド・ラボラトリ・アスペクト.ロイケミア(Principles,approaches,and laboratory aspect.Leukemia)」,2003年
(i)増幅可能な適正化された患者サンプルを次の分析のために選択する工程と、
(ii)RT反応を実施するための最適条件を規定する工程と、
(iii)RQ−PCRプロトコルのための最適条件を規定する工程と、
(iv)データ分析のための標準化された手技を確立する工程と
を包含する。
配列番号7(ENF1102)、配列番号8(ENPr1142)および配列番号9(ENR1162)
これらの3つの好ましい対照遺伝子のセットの配列および局在性は表37に与えられる。
− 融合遺伝子がE2A−PBX1である場合には、その対応するフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーの配列は、それぞれ、下記の通りであり:
配列番号10(ENF101)、配列番号11(ENP141)および配列番号12(ENR161)、
− 融合遺伝子がMLL−AF4である場合には、その対応するフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーの配列は、それぞれ下記の通りであり:
配列番号13(ENF207)、配列番号14(ENF208)、配列番号15(ENP242)および配列番号16(ENR262)、
− 融合遺伝子がTEL−AML1である場合には、その対応するフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーの配列は、それぞれ下記の通りであり:
配列番号17(ENF301)、配列番号18(ENPr341)および配列番号19(ENR361)、
− 融合遺伝子がBCR−ABL m−bcrである場合には、その対応するフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーの配列は、それぞれ下記の通りであり:
配列番号20(ENF402)、配列番号21(ENP541)および配列番号22(ENR561)、
− 融合遺伝子がBCR−ABL M−bcrである場合には、その対応するフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーの配列は、それぞれ下記の通りであり:
配列番号23(ENF501)、配列番号24(ENP541)および配列番号25(ENR561)、
− 融合遺伝子がSIL−TAL1である場合には、その対応するフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーの配列は、それぞれ下記の通りであり:
配列番号26(ENF601)、配列番号27(ENP641)および配列番号28(ENR664)、
− 融合遺伝子がPML−RARAである場合には、その対応するフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーの配列はそれぞれ下記の通りであり:
配列番号29(ENF903)、配列番号30(ENF906)、配列番号31(ENF905)、配列番号32(ENP942)および配列番号33(ENR962)、
− 融合遺伝子がCBFB−MYH11である場合には、その対応するフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーの配列は、それぞれ下記の通りであり:
配列番号34(ENF803)、配列番号35(ENPr843)、配列番号36(ENR862)、配列番号37(ENR863)および配列番号38(ENR865)、
− 融合遺伝子がAML−ETOである場合には、その対応するフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーの配列は、それぞれ下記の通りである:
配列番号39(ENF701)、配列番号40(ENP747)および配列番号41(ENR761)。
全RNA 1μgをH2O 10μl中に加え;
70℃で10分間にわたってインキュベートし;
氷冷し、下記試薬を最終容量が20μlになるまで加え:
逆転写酵素(MMLVまたはSuperscript IまたはIIのいずれか):100U
RTバッファー(用いられるRTアーゼによる)
DNTP:1Mm
DTT:10Mm
ランダム・ヘキサマー(Random Hexamers):25μM
RNアーゼインヒビター:20U
続いて下記条件でインキュベートし:
室温で10分間;
42℃で45分間;そして、
99℃で3分間
RT工程後に4℃でサンプルを置き;そして、
最終的なcDNAを30μlのH2Oで希釈する。
最終容量: 25μl;
最終cDNA 5μl(100ngのRNAに等価);
プライマー: 各300nm;
プローブ:200nM(AML1−ETOプローブの場合には100nM);
マスターミックス(Master Mix):12.5μl(1X)
からなるサンプルを下記条件でインキュベートし;
50℃で2分間;そして、
95℃で10分間;
次に50サイクル下記を行う:
95℃で15秒間;そして、
60℃で1分間。
共通の閾値を0.1(ただし、PML−RARAについては0.05)に設定し;
共通のベースラインを3〜15(ただし、B2Mについては3〜10)サイクルに設定する。
フェーズIおよびIIの目的は、プライマーおよびプローブの最初の選択、さらには、メンバーの訓練であった。
(原理)
現在利用可能なRQ−PCR技術により、1(タックマン(登録商標))または2(Light Cycler)の内部オリゴヌクレオチドプローブからのPCR反応中の蛍光放出または蛍光色素を検出することができ、検出された蛍光は、サンプル7に存在するターゲットの量に比例する。
アッセイは、15のRNAターゲット(E2A−PBX1、MIL−AF4(変異体エクソン9−エクソン5、エクソン10−エクソン4およびエクソン11−エクソン5)、TEL−AML1、BCR−ABL(M−bcrおよびm−bcr)、SIL−TAL1、PML−RARA(bcr1、bcr2およびbcr3)、CBFB−MYH11(タイプA、DおよびE)およびAML1−ETO)を生じさせるより共通の切断点変異体を含む9の白血病関連融合遺伝子を検出するように設計された。
プライマーおよびプローブは、プライマーエクスプレス(登録商標)ソフトウェア(Applied Biosystems)を用い、2の分離されたエクソン上のそれらの位置およびBIOMED−1プログラム(5)に記載されたプライマーセットによって発生されたアンプリコン(amplicon)の配列に基づいて設計された。それらは、対応するFGのエクソン/イントロン構造の概略図に表される(実施例1〜9を参照のこと)。最初の2回のミーティングの間、プライマーおよびプローブの最初の選択がなされ、各分子ターゲットに対して新たに設計されたセットおよび経験を積んだ研究所からのすでに利用可能な「組織内(in house)」セットが評価された。セットの選択は、下記に基づく;1)非特異的な増幅人為産物がないこと;2)−3.32(100%の理論効率)前後の傾きを有する良好な効率;3)良好な感度(プラスミド希釈物に対して少なくとも10−4のRNA希釈物または100コピー);4)最も高い希釈物に対する安定期においてΔRn値>1.0を有する反応のロバストネス(robustness)(表4)。このような結果は、特定のプライマー/プローブセットが選択される参加研究所の少なくとも80%に到達される必要があった。潜在的なプライマー/プローブセットが並行して細胞系およびプラスミドの一連の希釈物に関して試験され、最良の性能プロファイルを、特に感度の点で有するセットが選択された。選択基準を満たすプライマー/プローブのセットがない場合には、新たなセットが設計および評価された。全体として、第1のフェーズ中に試験された47のプライマーセットおよび44のプローブから開始して、12のプライマーのセットおよび9のプローブが15のターゲットのために最終的に選択された(各実施例中の図を参照のこと)。各場合において、タックマン(登録商標)ベースのRQ−PCR分析の感度は、以前に標準化されたネステッド(nested)RT−PCR分析(5)に匹敵するようである。BCR遺伝子については、Y(シチジンまたはチミジン)は、最近記載された多形性(polymorphism)にしたがってBCRプライマー上の位置3188に現れる。
RNAおよび/またはcDNAサンプルは、本部においてFGネットワークリーダーによって調製され(表1)、フェーズI〜IVa中にドライアイスを用いてそれらの各ネットワークのメンバーに分配された。患者のRNAがネットワークリーダーによって提供される希少なFG転写産物(PML−RARA bcr2およびbcr3およびCBFB−MYH11 タイプDおよびE)以外は、FG転写産物−陽性細胞系RNAは共通に用いられた(特定の細胞系については表1を参照のこと)。これらのRNAサンプルは、PBリンパ球(PBL)RNAまたはFG転写産物陰性細胞系RNA中に希釈された。細胞系は、DSMZ(Brauschweig,ドイツ)、ATCC(Manassas,VA,米国)から購入されたか、または、大学の研究所によって直接的に提供され(TOM−1、ME−1およびPF382)て、供給者に指示にしたがって培養された。フェーズIIIの間、ネットワークリーダーの研究所は、cDNAの当量希釈物系列を調製した。フェーズIVbの間、関連のFG転写産物に対して陽性であり18月未満の保存された患者サンプルRNAが、未希釈であるかおよび/または大腸菌 16S&23S rRNA(Roche,Meylan,フランス)の1μg/μlの溶液に希釈されて局所で2回分析された。
プラスミドを調製するためのABL、B2MおよびGUS遺伝子転写産物のPCR生成物は、それぞれ、ABL−F(5’−CCT TCA GCG GCC AGT AGC−3’)およびABL−R(5’−GGA CAC AGG CCC ATG GTA C−3’)、B2M−F(5’−CCT TGA GGC TAT CCA GCG T−3’)およびB2M−R(5’−CCT GCT CAG ATA CAT CAA ACA TG−3’)およびGUS−F(5’−CCT GTG ACC TTT GTG AGC AA−3’)およびGUS−R(5’−GTC TGC CGT GAA CAG TCC A−3’)により増幅された。BIOMED−1 Concerted ActionのPCR条件が用いられた(5)。プラスミド希釈物のクローニングおよび調製のためのプロトコルは既に開示されている。ABLおよびGUSプラスミドについては、3の希釈物(105、104および103コピーを5μl)が標準曲線を計算するために用いられた。B2Mプラスミドについては、3の異なる希釈物(107、106および105コピーを1μl)が用いられた。Ct値のための対応する変動係数は、全ての希釈物に対して4%(ABL)、5%(B2M)または3%(GUS)未満であった(全フェーズからのデータ)。
ヘパリン添加された末梢血(PB)、骨髄(BM)およびPB幹細胞(PBSC)から単核細胞(MNC)がフィコール−ハイバック密度勾配遠心分離によって得られた。全ての患者サンプリングは、所与の施設および/または地理的地帯の地域倫理委員会によって認可されたプロトコルにしたがって実施された。RS4;11の細胞系は、10%のウシ胎仔血清を有する培地RPMI1640において生育され、指数関数的生育期に採取された。RNAは、製造業者の推奨に従い、TRIゾル試薬(Invitrogen,Cergy,フランス)、RNAゾル試薬(Biotech Italia,ローマ,イタリア)またはカラムベースシステム(column based system)(Qiagen,Hilden,ドイツ)のいずれかを採用する参加研究所において型通りの方法によって抽出された。抽出および単離の後、RNA濃度は、260nmにおける光学密度の測定によって決定され、RNAは使用するまで−80℃で保存された。
15の異なるFG転写産物のPCR生成物は、以前に記載されたように、BIOMED−1 AおよびBプライマーを用いるRT−PCRによって細胞系または患者のRNAから発生された(5)。PCR生成物は、PCR II TOPOベクター(Invitron,Groningen,オランダ)にクローニングされた。選択されたプラスミドクローンは、それらの挿入を確認するために配列決定された(Genome Express,Grenoble,フランス)。続く大量生成の後、プラスミドは、QIAFILTER Plasmid MIDIキット(Qiagen,Courtaboeuf,フランス)を用いて抽出され、分光光度計により定量された。1μgに対するコピー数は、ベクターおよび挿入物の分子量に従って判断された。次いで、20μgのプラスミドが、BamHIまたはHindIII制限酵素により37℃で1時間にわたって攪拌下に線状にされた。分解されたプラスミドは、20ng/μlの大腸菌16S&23S rRNA(Roche)を含むTris 10mM、EDTA 1mM pH8の溶液に連続的に希釈された。5の一連の希釈物(200,000、20,000、200、20、および2コピー/ml)が調製された。対応する標準曲線が、−3.45の平均傾きおよび39.8±1Ctの切片を生じさせた。22.5±1の平均Ct値は、20,000コピー/μlの希釈物に対して得られた。
共通のEACプロトコルは、フェーズIおよびII中に全ての分子ターゲット(FGおよびCG転写産物)に対して確立され、その後、フェーズIIIおよびIVの全体にわたって各研究所によって用いられた(表4)。
この反応は、BIOMED−1プロトコル24から適合させられた。全RNA 1μgから開始して、主要な修飾は、ランダム・ヘキサマー(25μM)およびMMLVまたはSuprescript(Invitrogen;Roche)のいずれかの逆転写酵素(100U)の濃度変更を含んでおり、これは、アッセイの感度をかなり増大させた。
全てのRQ−PCR反応は、7700ABI大綱(Applied Biosystems,Foster City,米国)によって、Applied Biosystemsから購入されたTaqMan(登録商標) Universal Master Mixと共に同一の製造業者の好意により提供されたプライマーおよびタックマン(登録商標)プローブを用いて実施された。増幅サイクル数は50であった(詳細なプロトコルは表3に記載されている)。
結果を最適化し、費用を節約するために、フェーズIIは、プライマーおよびプローブの濃度(プライマーに対して900および300nMおよびプローブに対して200および100nM)および反応容積(50μl対25μl)のアッセイの感度への影響の評価を含んでいた。
RNA、cDNAおよびプラスミドの標準曲線間の比較は、結果(標準曲線の傾き、感度および再現性)へのRT工程の影響を決定するために各研究所に対して実施された。FGネットワークリーダーは、ターゲットネットーク内の異なる研究所(4〜12のメンバー、表1を参照のこと)に本部で調製されたFG転写産物−陽性細胞系RNAの一連の希釈物および対応するcDNA、さらには、対応するFG対照プラスミドの一連の希釈物(200000、20000、200、20および2コピー/μL)を送った。
(一般的な構成)
QC1(フェーズIIIa)およびQC3(フェーズIVa)は、特定の研究所によって実施され(表1)、Q2(フェーズIIIb)は、含まれる無作為に選択された研究所で行われた(均衡無作為アッセイの項を参照のこと)。
全ての実験およびQCラウンドにおける陽性対照は、明確に定義された細胞系および患者サンプルに関係する(表1および2)。次の2つのタイプの陰性対照が用いられた:1)コード化されたFG陰性RNAサンプルおよび2)PCR生成物の汚染をチェックするための既知の陰性対照。これらの後者の汚染対照は、非増幅対照(NAC)および非テンプレート対照(NTC)に関係し、非増幅対照(NAC)はヒトのcDNAの代わりに大腸菌RNAを含み、非テンプレート対照(NTC)はヒトのcDNAの代わりに水を含んでいた。特にNACおよびNTC陰性対照は、この問題が過小評価されがちであるため、PCR生成物の交差汚染(cross-contamination)の同定のために最大限に重要であると見なされた。
感度および再現性の基準は、各FG転写産物に対してコード化されたサンプルによってQC実験中に規定された(表4)。実験は、研究所の80%超が、1.5Ct未満のCt差を有する少なくとも2の陽性ウェルを検出すれば特定の希釈物に対して再現可能であると仮定された。実験の感度は、どんなCt値であったとしても研究所の80%超において陽性ウェルの少なくとも50%を示す最後の希釈物として規定された。
このアッセイは、医療情報局(Department of Medical Information)(マルセイユ,フランス)によって設計された。目的は、どの程度のRQ−PCR結果が、EACプロトコルにしたがう臨床設定においてFG転写産物のMRD定量化に対して研究所間で類似したかについて評価することにある。研究は次の2つの主要点に焦点を当てた:1)多中心(multicenter)研究のとって重要である特定のFG転写産物に対する研究所間の結果の比較および2)治療中の潜在的な腫瘍負荷(load)を評価するために重要である希釈物実験でのRQ−PCR方法論の線形性。均衡無作為アッセイは、各参加研究所(n=25)における全てのRQ−PCR分析(n=15)を行うことなくこれらの2点を評価するための適切な統計的研究であるようである。
14の候補CG(17のプライマーおよびプローブのセット)を試験するために、データが、i)ABI内因性対照プレート、ii)組織内およびiii)新たに設計されたEACのプライマーおよびプローブのセットから得られた。ABI内因性対照プレートについては、5の研究所が、全部で65の異なる保管されたサンプル:診断時に得られた22の正常なPBMNC、15のALL(4のPB/11のBM)、15のCML(10のPB/5のBM)および13のAML(5のPB/8のBM)サンプルを試験した。この数は、TFRCに対して53(1の研究所に関して部分的に失敗したデータ)に、18S rRNAに対して21(1つの研究所のみから利用可能なデータ)に低減された。最小の4の正常PBおよび4の白血病サンプルは、研究所毎に要求された。組織内のABL、B2MおよびTBPのプライマーおよびプローブのセットについては、20のサンプル:4の正常PBMNC、3のALL、7のAMLおよび6のCMLが1の研究所において試験された。EAC ABL、PBGDおよびPBGD2のセットについては、36のサンプル:4のPBMNC、11のALL、7のAMLおよび14のCMLが2の研究所において試験された。同じCGに対して2の異なるセットのプライマーを伴って得られた対をなす結果(1研究所のみ)が、3のCG:ABL(n=20)、B2M(n=12)およびTBP(n=12)に対して利用可能であった。全てのこれらの実験は、RT工程を最適化する前およびデータ分析のための共通の閾値を確立する前に実施された。
(一般方法論)
CGおよびFG RQ−PCRデータが、各FGネットワークリーダーによって収集および分析された。各遺伝子のための平均Ctまたは平均ΔCt(平均Ct[FG]−平均Ct[CG])値およびコピー数(CN)のlog10の平均値が用いられた。規格化されたコピー数(NCN)は、CG転写産物の1コピー当たりのFGのCN(log10[FG CN]の平均値−log10[CG CNの平均値)として規定された(ただし、B2M遺伝子転写産物レベルについての規格化については、結果は、100コピー当たりで表現された)。CNは、正規分布を示さないので、統計分析のためにCNの対数値が用いられた。より容易に理解するために、対数方式で得られた結果は、続いて、十進数値に変換された。
− 研究所間の転写産物定量化における有意差の検出
サンプル毎の4のパラメータ(Ct、ΔCt、CNおよびNCN)が、全体的な線形モデルを用いて試験された。研究所数は、無作為効果として設定され、データが分析された。結果が研究所間で選択されたパラメータおよび転写産物に対して類似しなかった場合(p<0.05)には、サブグループを規定するその他(p≧0.05)により再現可能な研究所の数を評価するためにポストホック(post-hoc)分析(ターキー(Tukey)法)が用いられた。このために、結果の再現性を見積もるために2の基準:ターキー法にしたがって平均間の有意差がない相違(p≧0.05)によって規定されるような少なくとも2の他の研究所により再現可能なサブグループの数(Sn)および研究所の数(Ln)が選択された。特定の研究所が2または3のサブグループに存在する場合には、1回だけカウントされた。研究所間の結果を比較するために最良のパラメータは、最も高いLn値および最も低いSn値を有するものである。理想的には、全ての研究所(Ln=11または12/ネットワークまたは全体的なアッセイに対してLn=25)を含む1サブグループ(Sn=1)のみが期待された。
3のコード化された陽性サンプルを用いてFG転写産物の定量化の線形性を測定するために、ピアソン相関係数が選択された。各FG転写産物に関しては、結果を評価するための最良のパラメータ(ΔΔCtまたはNCN)は、最も高い相関係数を有するものであった。
CG増幅がABL Ct[21.8−29.4]、B2M Ct[15.6−24.9]およびGUS Ct[20.8−28.0]のように規定された新鮮なサンプルの正常範囲内にない場合には白血病サンプルは分析から除外された。PBおよびBM間の比較は、非パラメトリック試験(少なくとも5の対になったサンプルに対するウィルコクスン検定(Wilcoxon paired test)または対になっていないサンプルに対するマン・ホイットニー検定(Mann-Whitney U test))により実施された。少なくとも5の対になったサンプルは、FG転写産物毎に予想された。NCNの発現の95%範囲は、選択された遺伝子に対する3〜97%の範囲にあてはまる。FG CNおよび各CG CN間の相関係数は、CGによる規格化の前に与えられる。細胞系(単数または複数)に関しては、8の異なる研究所における同一のサンプルについて得られた中間値が示されている。
(対照遺伝子の選択)
(選択基準)
対照遺伝子群は、i)11の共通に用いられるCGに対するプライマー/プローブセットを含む予め発生分化されたヒト内因性対照プレート(ABI)、ii)6のプライマー/プローブのセット(表36)を用いて、正常PBおよび診断上の白血病サンプルについての候補CGのスクリーニングを開始した。14のCGをカバーする17のプライマー/プローブのセットのうちで、ネットワークは、高位の中間発現(16.4〜23.0のCt)を有する少なくとも1つおよび中位の中間発現(23.0〜29.6のCt)を有する少なくとも1つを同定することを目的とした。任意に規定されるこれらの制限は、2log(6.6 Ct)の範囲をカバーした。より低い制限は、ベースライン計算のために適切な数の記録を得るように選択され、より高い制限は、サンプル評価のための十分な感度を達成するように選択された。
これらの5の最初に選択されたCGは、正常なドナーから5の局所的に調製されたPBサンプルを用いて6のCG研究所のそれぞれにおいてさらなる分析に付された。RQ−PCR分析は、最適化されたEAC RTおよびPCR手技を用いて実施された。ABL、B2M、CYCおよびGUSのCt値における変動は類似しており、全てが3のCt値内であった(図37)。これらの4のCGの線を結ぶとほぼ平行であった。このため、Ct値における変動は、cDNA合成の効率の差および/またはRNAの最初の量(下記参照)の変動のせいであるとされてもよい。対照的に、TBP遺伝子転写産物は、5のCt値の変動(32倍に等しい)および非平行のサンプル線を示し、これは、TBP遺伝子発現のより大きい変動を示す(図37)。したがって、TBP遺伝子は、さらなる分析から除外された。
ヒト内因性対照プレートのために用いられたプライマーおよびプローブの配列は利用可能でなかったので、CYCおよびGUS遺伝子に対する新しいプライマーおよびプローブのセット(EACセット)が設計および試験された。3の異なるCYCプライマー/プローブのセットが、2の研究所において評価され、各セットが偽遺伝子の存在に起因してゲノムDNAを増幅させることが見出された。このため、CYCは、さらなる分析から除外された。
最初の研究でcDNA合成およびRQ−PCRプロトコルのための最適条件を確立し、最適のCGを規定した後、EACネットワークは、正常および白血病サンプルにおける選択されたCGの発現での生物学的な変動を確立することを進めた。
この見込みのある研究は、正常なドナー(n=126)並びに診断時の白血病患者(n=184)について実施された。この特定の採取ではMRDも研究され得るので、正常なPBSC(n=26)が試験された。寄与研究所並びにサンプルタイプおよび数は、表38に示されている。
発明者らは、CG発現の範囲を評価し、続いて、低品質サンプルを識別するために、新鮮なサンプルについての基準値を確立することを決めた(材料および方法の項を参照のこと)。基準値は、目標(中間離)および2の制限(3%および97%)によって規定された。この範囲外のサンプル(新鮮なサンプルの6%)は、予期しない結果として考えられた。高すぎるCt値を有し、結果として低すぎるCNを有するサンプルは、抑制因子(inhibitor)を含む劣化されたと思われるサンプル(単数または複数)であり、これに対して、低すぎるCt値を有し、このため高すぎるCN値を有するサンプルは、過大評価されたRNA定量化に関連付けられ得る。126の正常サンプルおよび184の診断時の白血病サンプルに基づく基準値が表39に示されている。
識別されたFG転写産物を有する、保管された診断時白血病サンプル(n=311)についてのデータは、FGグループから得られた。品質劣化していないサンプルが、上記に規定された基準値にしたがって選択され、これにより、品質劣化または抑制因子の存在に起因してCGの増幅が粗悪なまたはない場合を除外した。ABLは、GUSまたはB2Mに比較してサンプルを含むことについてより限定的なCGであり(除外されたサンプルの比率は、それぞれ、11%、9%および6%)、結果として、このCGのために分析されたサンプルの数はより少なくなった。TEL−AML1ネットワークでは57サンプルのうちの30のみがGUS転写産物発現について試験されたので、257サンプルの結果のみが最終的にこのCGに対して利用可能であった。
どんなCtまたはCN値が用いられた場合でも3のCGの発現レベルは常時相関されていた(p<0.01)。最も高い相関は、新鮮な正常サンプルでのABLおよびB2M(r=0.73)またはGUS(r=0.72)のCt値間(図40a)および新鮮な白血病サンプルにおけるABLおよびGUS(r=0.80)のCt値間(図40b)で見出された。
ABL遺伝子発現は正常および診断時の白血病サンプル間で有意には異ならないことが上記に示された。さらに、3の広く試験されたCGのうちで、ABL遺伝子発現は、診断時サンプルにおいてFG転写産物との最も高い相関を有していた。本発明者らの研究では、MRD検出のモデル(フェーズIIIb)において、FG発現のCGとしてのABLの発現への規格化(normalization)が、未処理(規格化していない)CtまたはCN値と比較して、得られたFG転写産物結果の再現性を改善した。したがって、発明者らは、診断および追跡調査サンプルにおける規格化のための第一選択のCGとしてABLを用いることを提案する。第二選択として、発明者らは、B2MまたはGUSのいずれかを、それらの診断時の制限的なFG転写産物発現およびNCNの変動性との相対的な相関に応じて用いることを推奨する。実際に、CGの低発現レベルでの単離されたサンプルの識別は、RNAの劣化またはこのようなサンプルにおける抑制因子の存在を示唆する。他方、試験された全サンプルに対する低減されたまたは消失したCG増幅の観察は、RTまたはPCR反応中の試薬の問題を示す。最後に、各患者RNAサンプルに対するCG転写産物のCNは、予備PCR工程の効率の規格化を許容する。
最低のRNA、cDNA(10−3および10−4)およびプラスミド(106、105および103コピー)希釈物に対するCt値において、本部でおよび局所で調製されたcDNAサンプル間でさえも有意な差異が観察されなかった。最も高い希釈物に関しては、Ct値は、本部から分配されたcDNA(10−3および10−4希釈物)およびプラスミド(10および100コピー)に対するほうがRNA希釈物に対するよりも研究所間でより再現性が高かった。制限的なCVは、cDNAおよびプラスミドに対して5%未満で、最も高い希釈物でのRNAに対して11%であった。2のターゲットネットワーク(AML1−ETOおよびCBFB−MYH11 タイプA)において、この観察は、より一層の結果として、本部で調製されたcDNAサンプルと比較して、RTが局所的に実施されたサンプルに対して有意なより少ない陽性の結果を生じた。cDNAまたはプラスミド希釈物により確立された傾きが、参加研究所の大部分に対して理論的な傾き−3.32(100%効率)に近かった。対照的に、RNA希釈物からの傾きは、転写中のRNA劣化におそらく起因するより低い反応効率を示していた。最後に、全ターゲットに対するRNA希釈物の感度レベルは、BIOMED−1プログラム24で設計された標準化されたネステッドPCRに類似しており、PML−RARAのbcr2およびbcr3変異体に対してより一層良好であった。10のプラスミドコピーは、一般的に、全ての研究所によって検出され得た(フェーズIIIaおよびbを参照のこと)。
このアッセイは、研究所間の転写産物定量化における相違を検出するために企画された。研究所は、4の異なるFG転写産物を増幅させるために無作為に、一般的には、それらの元々のFGネットワーク外部から選ばれた(材料および方法の項を参照のこと)。この方法論はまた、偽陰性および陽性が、特定のFGに焦点を当てる研究所のみが実験を実施した他のフェーズに対して釣り合いがとれるように同一かどうかを検出するためにQCラウンドとして重要である。
− プラスミド希釈物について
発明者らは、25研究所の中で3のABLプラスミド希釈物に対して非常に類似した結果を観察した。発明者らは、ABLの105コピーのプラスミド希釈物に対して、22.30±0.38(Ct±Sd,n=296)および1.7%の対応するCVを見出した。発明者らは、3のABLプラスミド希釈物に対するABL Ct測定に関して有意の研究所効果(無作為効果としてのセット)を見出した(p<0.001,n=296)。しかし、反対の研究所間の相違は、1.2Ct以下であった。このような相違は、臨床の観点ではあまり関連しないようであった。材料および方法の項において規定された基準にしたがって、全ての研究所は、各ABLプラスミド希釈物のCt値に対して再現性のある結果を有していた。
CtまたはCN値(図30aに例として与えられたPML−RARAネットワークの結果)を用いてABL発現が比較された場合、高度に希釈されたサンプル(10−3および10−4)および陰性サンプル間に有意な相違はネットワーク内で見出されなかったが、CBFB−MYH11ネットワークは例外である(p=0.03)。逆に、発明者らは、同一のサンプル(例として図30bに与えられたPML−RARAネットワークの結果)について各ネットワーク内の研究所間に非常に有意な相違(p<0.001)を見出した。このため、CtおよびCN値は、試験研究所に依存するが、サンプルに依存していなかった。これらのデータは、予備PCR工程中に変動(転写およびRT効率)が起こることを強く示唆する。
発明者らは、連続的な希釈物モデルにおいてRQ−PCRの結果を出すために最良のパラメータ(Ct、CN、ΔCtまたはNCN)に焦点を当てた。発明者らは、11の異なる研究所(図31に例としてのPML−RARAネットワーク)において測定された3の希釈されたサンプルについての対応する相関係数を計算した。相関係数は、5のFGにおいてNCN法に対してより高く、2のFGにおいてΔCt法を用いてわずかにより高く、これに対して、両方法は、残る2のFGに対して等価であった(表33)。E2A−PBX1転写産物の定量化に対してのみ、ABLは、RQ−PCR結果を規格化するためのCGとして有用でないようであった。全体として、規格化のためのABL遺伝子転写産物の使用は、結果の線形性を大きく改善することが見出され(図32に例としてのPML−RARAネットワーク)、異なる希釈物間に観察されるFG CtおよびCN値の重複が回避された。
発明者らは、診断時に得られた55の対になったBMおよびPBサンプルを比較した。MLL−AF4ネットワークにおける2のさらなる対は、数が不十分であったため分析されなかった。統計分析は、サンプル源がNCNとして表される関連FGの診断時の発現レベルに有意な影響を有さないことを示したが、CGとしてB2MまたはGUSを用いるPML−RARAは例外であった。これらの分析は、いずれかの診断材料源がMRD研究のための適切な基準として作用し得たことを示唆するだろう。全体として、各FG転写産物の中間のNCNがABL遺伝子転写産物のコピー当たり8.5コピー(E2A−PBX1)から下の0.1コピー(SIL−TAL1)までの範囲で変動可能であった(図33a)。このような結果は、B2MおよびGUS CGによっても観察された。異なるFGの相対的な発現レベルは、一般的に、規格化のために用いられたCGに関わりなく一致していた(図33b、c)が、ある程度の不均一性が少数の場合において観察された(実施例の項におけるPML−RARA、AML1−ETOおよびSIL−TAL1を参照のこと)。大抵の場合には、患者サンプルにおけるFG転写産物のNCNは、対応する細胞系対照において観察されたものに類似する(各実施例を参照のこと)。これらの結果は、情報が利用可能であった場合には、サンプルにおける芽球細胞の割合にしたがって修正された。
FG陽性細胞系または患者RNAは、10倍の希釈工程を用いて、大腸菌RNA中に希釈された(10−1〜10−6、材料および方法の項を参照のこと)。細胞系または患者RNAの最後の陽性希釈物と、対応する未希釈RNAにおけるFGおよびCGレベルを基礎にして予想された感度との間に、制限希釈物実験において一致が観察された。これらのデータは、純粋なサンプル中でのCNによるCGおよびFGの定量化が正しいことを示した。同一の希釈物についての線形性の回帰分析は、FG/CG比が純粋なサンプル中のFG発現レベルに依存する3〜5対数希釈物にわたって有意には変化しない(2倍未満)ことを示した。これらの結果は、大きな希釈範囲についてのFGおよびCGに対する等しいRQ−PCR増幅効率を示した。
RQ−PCR分析によるMRDモニタリングは、多点治療試行(multi-center therapeutic trial)での決定を行うための道具になっている。この理由のために、一定の方法で表現されることがRQ−PCRの結果にとって最も重要である。大部分の出版物は、標準曲線によるFGおよびCG間のコピー数比を用いており、この比は、十進法値または百分率として表現される。標準曲線を得るために、研究所は、細胞系CdnaまたはプラスミドDNAいずれかを用いた。これまでは、ΔΔCt法を用いた著者は少数であり、発明者らの知識では、診断のcDNAの標準曲線はこれまで用いられていない。
この方法の潜在的な欠点は次の通りである。第一に、発明者らは患者サンプルと同一の範囲内のFGコピーを含むプラスミド希釈物を用いたが、汚染の危険性がある。PCR分析に対する通常の厳格な用心がこのリスクを制限するために常時要求される。第二に、プラスミド較正物質の使用が、患者サンプルのために利用可能なウェル数を低減させ、費用をわずかに増加させる。第三に、較正物質は、変動性を潜在的に増大させるさらなる工程/計算を導入する。最後に、DNAプラスミドは、RT効率を直接的には評価しない。しかし、患者サンプルにおけるCG発現レベルは予備PCR工程の対照を明らかに示す。
(背景)
追跡調査中に患者サンプルにおいてFG転写産物増幅の欠失に出くわした場合、得られた結果の信頼性および臨床上の関連を決定するために特定のアッセイに対する検出限界を評価することが必要である。この問題に取り組むために、発明者らは、所与の実験の感度レベルを計算するための2の式を提案する。コピー数の値の使用が以降に記録されることになる。
式は、大腸菌希釈物実験の結果および診断時サンプルにおいて1前後の傾きを有するFG CNとCG CNとの間の相関に基づく(各特定の実施例を参照のこと)。この式では、感度は、診断時のFGのNCNおよびサンプルのCG CNに直接的に関連付けられる。理想的には、計算は、芽球百分率に対する修正後の患者の診断時のNCNに基づくべきである。利用可能でなければ、EACデータが用いられ得る。このモデルでは、FGプラスミドの10コピーが任意の特定の融合転写産物に対して増幅されるべきである。100コピーのみが増幅され得るならば、感度は1log10まで低減されるだろう。
この式では、SENSは、診断時サンプルに対する実験の感度(log10)であり、10SENSとして表現されるべきである。NCNは、診断時の患者サンプルの比、または、利用可能でないならばEACデータからの対応する中間NCNのいずれかである。
(診断時)
患者Aが診断時に小児科T−ALLを示す。PBサンプル中のSIL−TAL1 FG転写産物の調査が陰性のままである。発明者らのEACプロトコルを有するRQ−PCRを用いたABL遺伝子転写産物の定量化は46000コピーである。このため、診断時のPB(0.09、表22)における中間SIL−TAL1 FG転写産物発現に対するEACデータに基づく実験の推定された感度は、次の通りである:
SENS
=−log10(0.09)−log10(46000)
=−3.6(すなわち10−3.6)
(再発時)
患者BがTEL−AML1陽性前駆体B−ALLの遅発性再発を示す。TEL−AML1 FG転写産物のそのPBサンプルにおける定量化は、419000コピーである。ABL遺伝子転写産物の同じサンプルにおける定量化は17000コピーである。この患者に対するTEL−AML1/ABL比は25(419000/17000)である。したがって、この患者におけるTEL−AML1 FG発現に基づく推定される感度は次の通りである。
=−log10(25)−log10(17000)
=−5.6(すなわち10−5.6)
(追跡調査の間)
同じ患者Bが3月後に、PBおよびBMサンプルにおけるTEL−AML1 FG転写産物の検出のためにRQ−PCRを行った。TEL−AML1 FG転写産物は、両サンプルにおいてRQ−PCRによって検出されない。PBおよびBMサンプルについてのABL遺伝子転写産物定量化の結果はそれぞれ7700および13700コピーである。TEL−AML1 NCNがPBおよびBM間で有意には異ならないという観察(図11)に基づいて、再発時(419000/17000)でのこの患者における比が、この実験の感度を計算するために用いられる。
=−log10(419/17)−log10(13700)
=−5.5(すなわち10−5.5)
SENS(PB)
=−log10(419/17)−log10(7700)
=−5.3(すなわち10−5.3)
古典的RT−PCR FG転写産物追跡調査と比較して、この事例における感度は、患者に依存し、細胞系サンプルに依存しない。この方法論により計算された感度の閾値は、細胞系希釈物についての古典的なRT−PCR(5)に基づくものより明らかに精密である。
(1.1 背景)
白血病FG転写産物E2A−PBX1は、E2AおよびPBX1(formerly prl)遺伝子のt(1;19)(q23;p13)による融合に由来する。t(1;19)(q23;p13)は、幼児の3〜5%および成人の3%の前駆体−B−ALLにおいて見出される。95%の事例において、E2A−PBX1転写産物が発現される。この発現は、細胞質Igのμ鎖の検出に緊密に関連付けられる。残存するt(1;19)前駆体−B−ALLは、E2A−PBX1陰性であり、E2A遺伝子の再配列を示さない。
(1.2.1 プライマー設計および最適化(フェーズIおよびII))
試験された2のプライマーおよびプローブのセットの中から、一方:ENF101,ENR161およびENP141が選択された。位置およびヌクレオチド配列が図3および表5にそれぞれ示される。このセットは、HL60 RNA中のE2A−PBX1陽性細胞系697(ACC42としても知られる)RNAの高希釈物での安定期においてより高いΔRn値を基礎として選択された。フェーズIIおよびフェーズIII実験の間、プライマーおよびプローブのこのセットにより、7研究所のうち7で、697のHL60 RNA中RNAの10−4希釈物を検出することができた。典型的な増幅プロットの例(10−1、10−3、10−4細胞系RNA希釈物)が図4に示される。結論としては、ENF101、ENR161およびENP141が変異体形態を含めた全てのE2A−PBX1融合転写産物の定量化のために適しているということだった。
1の細胞系697および27の診断時サンプル(14のBMおよび13のPB)が分析された。芽球百分率(形態学的に規定される)が2のサンプル(1のPBおよび1のBM)を除く全てにおいて利用可能であり、74〜100%の範囲(中間=96%)であった。対照遺伝子に対する中間値および95%範囲およびE2A−PBX1のCt値、並びに規格化されたE2A−PBX1のコピー数(芽球百分率にしたがって修正された)が、表6に記録されている。697の細胞系および患者サンプルにおけるE2A−PBX1およびCGに対して検出されたCt値は類似しており、これは、それらが類似のレベルで発現されたことを示している。最も高い相関係数がE2A−PBX1およびABL転写産物間に観察された。PBおよびBMサンプルの中で、10が対になったサンプルであり、疾患の提示時に同じ患者において採取された。統計的に有意な差異は、対になったサンプルにおけるCtまたはNCNに関してBMおよびPB間に観察され得なかった(図5)。
種々のQCラウンド中に、11の陰性サンプル(5の陰性RNA、3のNACおよび3のNTC)および5の陽性サンプル(HL60 RNA中の697の細胞系RNAの10−3(2サンプル)および10−4(3サンプル)希釈物)が8〜10の研究所において試験された(表7)。陰性サンプルのE2A−PBX1増幅は、156のウェルを計上した。3のウェル(3の異なるサンプルに対応する)は、陽性であることが見出された(2%)が、これらサンプルのどれも、材料および方法の項において規定された基準にしたがって陽性とは見なされなかった。陽性サンプルのE2A−PBX1増幅は、78のウェルを計上した。1のみが陰性であるとみなされた(1%)。材料および方法の項において規定された基準にしたがって、以前のフェーズにおいて規定された感度閾値から期待されたように、全部で5の陽性サンプルは陽性であることが見出された。
(2.1 背景)
t(4;11)(q21;q23)は、前駆体−B−ALLにおける最もよくみられる11q23転座であり、MLL(HRX、Htrx、ALL1)およびAF4(FEL)遺伝子を含む。MLL−AF4陽性は、小児および成人ALLの事例の5%で観察され、このサブグループは、幼児および治療誘導型ALLの40〜60%を計上する。哺乳動物MLLの機能は依然として未知の部分が大きいが、発生分化期の分節において中心的な役割を果たしているようである。最近のマウスAF4ノックアウトは、この遺伝子がリンパ系統(lymphoid lineage)の個体発生に含まれる推定の転写因子をエンコードしていることを示唆した。インビボで示されたストレス誘導型細胞死に対するMLL−AF4陽性白血病の増大された抵抗性がそれらの乏しい予後に寄与するために示唆された。
(2.2.1 プライマー設計および最適化(フェーズIおよびII))
試験された3のプローブおよび6のプライマーのセットから、共通のプローブENP242および共通のリバースプライマーENR262(両方ともSF4エクソン5上に位置される)が採用された(図6および表8)。MLL−AF4 FG転写産物が非常に多岐にわたるために、全てのMLL−AF4変異体に対する共通のプライマー/プローブのセットは設計され得なかった。MLL遺伝子上の2のフォワードプライマー:ENF207(エクソン9)およびENF208(エクソン10)(5)が非幼児の少なくとも90%および幼児MLL−AF4 FG転写産物の60%を増幅させるために用いられた。発明者らの知識では、RQ−PCRのためのプライマー/プローブのセットは、今日まで、MLL−AF4または任意の他のMLL FG転写産物について出版されていない。
含まれる22のサンプル(2の対になったサンプルを含む14のBMおよび8のPB)の中で、それらのうちの大部分(n=19)は、ALLのためのフランス治療プロトコルLALA−FRALLEから採用され、マルセイユにて試験された。サンプル中の芽球細胞の百分率は、全サンプルについて知られておらず、したがって、結果は、この提案にしたがって修正されなかった。規格化されたMLL−AF4 FG転写産物発現(NCN)は、細胞系(n=3)および患者間で類似するようである(表9)。MLL−AF4 NCN中の相違は、PBおよびBMサンプル間で観察されなかった(図8)。発現の95%範囲は、B2Mを用いるかCGを全く用いないで得られた結果に比較してCGとしてABLまたはGUSのいずれかを用いた場合に低減した(表9)。さらに、MLL−AF4およびABL転写産物レベル間の相関が、診断時サンプルにおいて試験された3の対照遺伝子で観察された中では最も高かった(表9)。
偽陰性サンプルは10−3および10−4希釈物に対してほとんど観察されなかった(6%,7/110)。偽陽性とも呼ばれる陰性サンプル(FG陰性サンプル、NACおよびNTC)内のMLL−ZF4 cDNAの増幅は、3%(5/176)に制限され、個々の研究所に制限された(表10)。偽陽性ウェルにおけるCt値は常時30より大きく、時間の大部分は37より高かった。
(3.1 背景)
TEL(ETV6)−AML1(CBFA2,RUNX1) FG転写産物は、潜在の(cryptic)t(12;21)(p13;q22)に由来し、幼時前駆体−B−ALLの約25%に見出される。TELおよびAML1の両方が核転写因子をエンコードし、この核転写因子は、正常な造血にとって重要である。それらの融合が白血病誘発につながるのは、TELの正常な機能を妨害すること、および/または、AML1ターゲット遺伝子発現をそこなう転写抑制因子を形成することによる。2の繰り返される転座切断点が記載される。第一のものは、TELイントロン5およびAML1イントロン1内で切断して、TELエクソン5−AML1エクソン2 FG転写産物を発生させる。第二のものは、TEL−AML1陽性ALLの約10%において見出され、AML1イントロン2内で切断して、39bpより短いTELエクソン−AML1エクソン3 FG転写産物を発生させる(図9)。この後者のFG転写産物も、AML1エクソン3を欠く転写産物と共に、選択的スプライシングの結果として、AML1エクソン2融合を有する場合に検出される。TELイントロン4中に切断点を有する事例が記載されてはいるが、例外的であるのは変わりがない。
(3.2.1 プライマー設計および最適化(フェーズIおよびII))
試験のために用いられた細胞系は、TELエクソン5−AML1エクソン2融合を示すREH,93であった。2のプラスミド構成物も用いられ、一方が、「長い転写産物」(TELエクソン5−AML1エクソン2)を含み、他方が、「短い転写産物」(TELエクソン5−AML1エクソン3)を含んでいた(材料および方法の項を参照のこと)。
TEL−AML1発現は、REH細胞系および57のTEL−AML1陽性前駆体−B−ALL(23の対になったサンプルを含む、30のBMおよび27のPBサンプル)において研究された(表12)。サンプルは、18〜100%の白血病芽球を含んでいた。これらのサンプルの大部分は、セントルイス病院(パリ、フランス)の患者から得られた。NCNは、各サンプルに存在する芽球の百分率に対して計算および調節された。
前のフェーズにおいて規定された感度閾値から期待されたように、REH細胞系の10−3および10−4RNA希釈物は、常時、材料および方法の項において規定された基準にしたがって陽性であることが見出された(表13)。5×10−5希釈物は、7/7の研究所において陽性であることが見出された。種々のQCランドの間、11の陰性サンプル(6の陰性RNAおよび5のNACまたはNTCサンプル)が7〜11の研究所において試験され、全部で279の増幅ウェルに対応した(表13)。これらのウェルの9(3%)が偽陽性であることが見出され、これは、上記の基準にしたがって、93のうちの3(3%)の偽陽性サンプルに対応する。これらの偽陽性ウェルは、6の異なる研究所において観察された。3の陽性ウェルを有する偽陽性が観察された事例はなく、Ct値は、常時、39より高かった。全ての偽陽性ウェルは、陰性RNAに対応する一方で、NACおよびNTCは、常時、陰性であった。この観察は、これらの偽陽性結果がRT工程等の増幅に先立つ汚染に起因し得たことを示唆している。
(4.1 背景)
BCR−ABL FGは、フィラデルフィア染色体(Ph)の形成に関連付けられ、白血病において検出される最も一般的な遺伝子異常の1つである。ALLでは、Phは、成人の25〜30%および幼児の2〜5%の事例において検出される。頻度は低いが、それは、急性骨髄性白血病に関連付けられる。ALLサブセットでは、この遺伝子損傷は、非常に乏しい予後を付与することが知られており、結論として、異系骨髄移植を含めて、果敢な治療を計画する際にその検出が重要である。さらに、Ph染色体は、CMLの事例の95%超において見出され、この疾患のホールマークになっている。分子レベルで、Ph染色体すなわちt(9;22)は、BCR遺伝子(染色体22)の5’部のABL遺伝子(染色体9)の3’部への近位に帰着する。大多数の患者において、BCR遺伝子における切断点は、3の明白に規定された領域;i)第一のイントロンの55Kb配列(第二切断点クラスター領域(minor breakpoint cluster region:m−bcr)と呼ばれる)、ii)エクソン12〜16に及ぶ5.8Kb領域(第一切断点クラスター領域(major breakpoint cluster region:M−bcr)と呼ばれる)およびiii)最終のイントロン19(μ−bcrと呼ばれる)内に密集される。μ−bcr切断点の分析は、それらの極度の希少性に起因して議論されることはまずない。m−bcr切断点の場合には、BCR遺伝子の第一のエクソン(e1)がABL遺伝子の第二エクソン(a2)に並置される。結果として生じる融合転写産物(e1−a2)は、190Kdaのキメラタンパク質(p190)をエンコードする。このタイプのBCR−ABL FGは、Ph陽性ALLの成人の65%および幼児の80%において見出される。BCR−ABL遺伝子をエンコードするp190がCMLにおいて見出されるのは散発性の事例のみである。
(4.2.1 プライマー設計および最適化(フェーズIおよびII))
「プライマーエクスプレス(登録商標)」ソフトウェアを用いて設計された4の異なるプライマー/プローブのセットの効率が、TOM−1細胞系(e1−a2接合またはm−bcr)由来RNAのHL60細胞由来RNAへの1:10系列希釈物実験において試験された。全てのプライマー/プローブのセットは非特異的増幅人為産物を含んでいないが、2のセットが安定期の感度およびΔRn値の点で優れていた。両方のセットは、類似の増幅効率を有しており、10−5の感度および10−1細胞系希釈物においてΔRn>3.0に達した。広範囲な試験の後、ENF402(BCRエクソン1に位置される)、ENR561およびプローブENP541(両方とも、ABLエクソン2に位置される)を含んでいたセットが選択された。リバースプライマーおよびプローブの両方がBCR−ABL(M−bcr) FG転写産物のRQ−PCR検出のために用いられたセットに対して共通する(図12、表14)。典型的な増幅プロットの例(10−1、10−3、10−4細胞系RNA希釈物)が図13に示される。
m−bcr転写産物の基準インターバルを確立するために、発明者らは、診断時の一連のALL患者からの17のBMサンプルおよび7のPBサンプル並びにTOM−1細胞系由来の本部で調製され分配されたRNAにおいてFG発現を決定した(表15)。アッセイされたFGおよび3のCG転写産物に対して、別々の系列のプラスミド希釈物が、転写産物のコピー数を計算するために各実験において増幅された。増幅のために適切でないためにABL Ct>293を有するサンプルが分析から除外されたが、全ての転写産物のCt値は、一般的に、患者材料よりも細胞系においてより低かった(BMおよびPBの両方)。これは、おそらく患者RNAのいくつかの量が少ないことに起因する。しかしながら、対照遺伝子による規格化の後には、m−bcr転写産物レベルは、患者およびTOM−1細胞系に類似しており、4の対になったBMおよびPBサンプルにおいてかなり類似していた(図14)。
3回のQCラウンドにおいて3/129ウェルのみが偽陰性結果を与え(詳細は材料および方法を参照のこと)、全ての場合において10−4TOM−1希釈物に対して偽陰性が得られた。さらに、偽陽性結果は、PCR試験の5.3%において検出された(13/246、表16)。
(5.1 背景)
大部分の事例のCMLは、フィラデルフィア染色体として知られる小さい派生染色体22に帰結するt(9;22)の存在と関連付けられる。結果として染色体9上のABLプロトオンコジーンが染色体22上のBCR遺伝子に融合される。CML患者およびフィラデルフィア陽性成人ALL患者の約35%では、染色体22上の切断点が、BCR遺伝子のエクソン12〜16間のいわゆる第一切断点クラスター領域(major breakpoint cluster region:M−bcr)に位置される。染色体9上の切断点は、大抵の場合、ABL遺伝子においてエクソン1および2間に位置される。このBCR−ABL FGの転写産物生成物は、8.5kbの異常融合RNAであり、これは脱調節された活性を有するチロシンキナーゼであるBCR−ABLキメラタンパク質(p210)を生じさせる2の接合変異体b2a2および/またはb3a2を有する。b2a3およびb3a3 BCR−ABL転写産物を有する希少な事例が観察され得る。
(5.2.1 プライマー設計および最適化(フェーズIおよびII))
2の選択的なフォワードBCRプライマー(一方は、BCRエクソン13(エクソンb2)上に位置され、他方は、BCRエクソン14(エクソンb3)上に位置される)およびリバースABLプライマーおよびプローブ(両者とも、ABL遺伝子の第二のエクソン上に位置される)が設計された(図12)。このセットは、ネットワーク内で既に利用可能な5の類似セットと共に、PCR反応の感度並びにロバストネスについて評価された(材料および方法の項を参照のこと)。これらのパラメータに基づいて、EACグループによって設計されたセットが選択された。K−562細胞系の希釈物系列が2のフォワードプライマーのいずれかを用いて等価の効率で増幅されてから、BCRエクソン13(エクソンb2)上に位置される1の共通のフォワードプライマーENF501が、融合変異体BCR−ABL b3−a2およびb2−a2の両方を増幅させるために選択された(図12、表17)。典型的な増幅プロットの例(10−1、10−3、10−4細胞系RNA希釈物)が図15に示されている。
− CMLに関し、K−562および診断時の患者において
BCR−ABL M−bcr転写産物の発現は、診断時のサンプルにおけるFG発現レベルの範囲を確立するために、29のCML患者において定量化された(表18、図16a)。これらのサンプルは、15のBMおよび14のPBを含んでいた。CG対するBCR−ABL FGの発現は、BMおよびPB間で非常に類似していた。BCR−ABL M−bcr発現レベルにおける大きな変動は、個々の患者間に見出されなかった。K−562細胞系におけるBCR−ABL mRNAの発現は、B2Mに対して2logおよびGUS遺伝子に対して1logだけCML診断時サンプルより高いことが見出された(表18を参照のこと)。
慢性期のCML患者からの診断時サンプルに加えて、BCR−ABL M−bcr発現が診断時のBCR−ABL M−bcr陽性ALLサンプルにおいて定量化された(表19、図16b)。B2MおよびGUSに対するBCR−ABLの発現は、CMLサンプルと比較してALLサンプルにおいてより高いことが見出された(表18および19)。発明者らは、CGとしてB2MまたはGUSのいずれかを用いてM−bcr ALLおよびCML患者間の発現のFGレベルにおける統計上の差異を観察した(p=0.001)が、ALLにおいてm−bcrおよびM−bcr間に差は観察されなかった(図17)。
偽陰性の百分率は、第一および第二の品質コントロールラウンドに対して4.9%(14/285)であった(表20)。偽陰性を示した研究所は、特定フェーズにおける全てのターゲットに対する感度において一致した低下を有しており、これは、より低い感度に対する原因は、PCR関連の問題よりも低いRT効率にあることを示していた。
(6.1 背景)
1p32上の微欠失(microdeletion)は、幼時T−ALLにおいて見出される最も頻度の高い染色体異常である。微欠失は、TAL1遺伝子(T細胞急性白血病1遺伝子(T cell acute leukemia 1 gene)、幹細胞白血病(stem cell leukemia:SCL)としても知られている)またはT細胞白血病遺伝子5(TCL5)および約90kb上流に位置されるSIL遺伝子(SCL中断遺伝子座:SCL interrupting locus)を含んでいる。結果として、TAL1コード化配列は、T細胞において発現されるSILプロモーターの制御下に置かれており、結論として、TAL1遺伝子は、含まれるT−ALLにおいて異常に発現される。
(6.2.1 プライマー設計および最適化(フェーズIおよびII))
最初に、3のタックマン(登録商標)プローブ(SILエクソン1a、TAL1エクソン4およびTAL1エクソン5中に位置される)、2のフォワードプライマー(両方ともSILエクソン1a中に位置される)および5のリバースプライマー(2がTAL1エクソン3中に、2がTAL1エクソン4中に、1がTAL1エクソン6中に位置される)が特異性および効率のために試験された。
6の異なるSIL−TAL1陽性細胞系の未希釈RNAがCG発現(ABL、B2MおよびGUS)に対して2回、SIL−TAL1 FG発現に対して3回試験された(表22)。3の研究所において、全部で16の診断時SIL−TAL1陽性患者(5の対を含む10のBMおよび10のPBサンプル)も含まれていた。
偽陽性は、46のFG陰性サンプルのうちの2において観察され(4.3%)、162のNAC/NTCウェルのうちでは観察されず(0%)、結果として、全体の偽陽性は1.0%(2/208)であった。偽陰性は第一のQCラウンド(フェーズIIIa)において観察されたのみであり、次の2回のQCラウンドでは観察されなかった(表23)。したがって、偽陰性は、問題ではないようであるが、これは、白血病細胞サンプルにおけるSIL−TAL1 FG転写産物のレベルに依存するかもしれない。
(7.1 背景)
PML−RARA FG転写産物(t(15;17)(q22;q21)転座の分子の結果物)は、APLの事例の大部分に関連し、M3細胞形態を有する明瞭なAMLサブセットである。
(7.2.1 プライマー設計および最適化(フェーズIおよびII))
RARA遺伝子エクソン3上の1のプローブおよび2のリバースプライマーが、PML遺伝子上の7のフォワードプライマーと組み合わせて評価された。5のフォワードプライマーは、PMLエクソン6中に設計され、2および3の特定のプライマーは、それぞれ、bcr1およびbcr2の切断点に対するものであり、他方、bcr3に対する2のプライマーは、PMLエクソン3中に設計された。bcr2 PML切断点の局在性についての出版されたデータに基づいて、PMLエクソン6上の各フォワードプライマーは、bcr2の場合の少なくとも80%をカバーするために設計された。試験のために利用可能な唯一の細胞系は、NB−4,165であり、これは、bcr1 PML切断点を有する。bcr2およびbcr3プライマー/プローブのセットの評価のために、診断時の患者BM RNAが用いられた。全ての3のPML−RARA切断点変異体に対するプラスミド構成物が作製された(材料および方法の項を参照のこと)。
PML−RARAの発現は、NB−4細胞系および16の陽性AML−M3 bcr1患者において研究された(表25、図23)。6の対になったBM/PBサンプルを含む14のBMおよび9のPBサンプルからなる患者サンプルが診断時に得られた。サンプルは、白血病芽球の10〜100%を含んでいた。規格化されたコピー数が、各サンプルに存在する芽球の百分率に対して計算および調節された。NB−4細胞系におけるPML−RARAの発現は、主要な白血病サンプルにおいて検出されたFG発現の範囲内であった。
種々のQCラウンドの間、145の陰性サンプルが3のフェーズの間に7〜11の研究所において試験された(表26)。100のNAC/NTCサンプルのうちの5(5%)および45のFG陰性サンプルのうちの5(11%)がbcr1増幅に対して偽陽性であった(表26)。全体として、偽陽性の頻度は、6.9%(10/145)であった。いわゆる偽陽性は、個々の研究所に制限され、偽陽性ウェルにおけるCt値は、常時、30を超え、時間の大部分は35より長かった。
(8.1 背景)
染色体16の狭動原体逆位(pericentric inversion)(inv(16)(p13q22))は、新しく診断されたAML事例の約8〜9%において見出される。inv(16)陽性AMLは、t(8,21)転座を有するものと共に、一般に「コア結合因子(Core Binding Factor:CBF)」白血病として参照されるグループに含まれる。両方共、造血において必須の役割を担う異種植皮の転写因子CBFの構成要素をコード化する遺伝子の再配列を特徴とするからである。Inv(16)または希少t(16;16)(p13;q22)は、CBFB鎖遺伝子の平滑筋ミオシンの重鎖遺伝子MYH11との融合につながる。結果として生じるFG mRNAは、RT−PCRによって検出され得、診断およびモニタリング研究の両方に対する適切な分子マーカーを示す。これまでに、10の異なるCBFB−MYH11 FG転写産物が報告された。陽性患者の85%超がタイプA転写産物を有し、タイプDおよびE転写産物はそれぞれほぼ5%示し、全ての他のタイプは、散発的な場合において発生する。CBFB−MYH11陽性AMLは、通常、好ましい予後を有すると考えられ、患者の50%超が長期CRを得ている。従来の化学療法によるこのような好ましい結果によって何人かの著者が考えるようになったのは、適切なドナーが利用可能なときでも同種BMT(allo-BMT)がこれらの患者において第一のCRを強化する必要性を示さないということである。それにも関わらず、再発率は依然として高く、血液学的CRの間にMRDを検出するための信頼できる方法が緩解治療後の強度を特定の患者コホート(cohort)により良好に適合させるために必要とされていることを示している。これまでに、CBFB−MYH11 FG転写産物を検出するために採用された定量RT−PCRベースの方法の使用は、CRにおける患者の予後サブグループの矛盾がない識別を可能にしなかった。実際に、標準ネステッドRT−PCRの使用は、相容れないMRD結果を引き起こした。すなわち、最も多い報告では、延期されたCRにおける大多数の患者がPCR陰性であることが見出された一方で、少数の長期生存者は、RT−PCR陰性とは決して考えられなかった。さらに、PCR陰性患者の10〜20%は、結局は再発し、これは、PCR陰性の
達成が治療と同じ意味合いでないことを示唆している。上記結果を解釈する際の困難性のいくつかが、含まれる方法論の標準化を欠くことに由来するかもしれない。競合PCRまたはRQ−PCRを用いる定量RT−PCR研究は、導入および硬着治療の早期の間のCBFB−MYH11 FG転写産物における減少をモニタリングすることを可能にした。しかしながら、これまでに調査された患者数が少ないことに起因して、速動性または再発を予測するための遮断レベルを規定することは可能ではない。
(8.2.1 プライマー設計および最適化(フェーズIおよびII))
フェーズIの間、発明者らは、6のプライマー/プローブのセットを試験した。3はA形態に対するものであり、2はD形態に対するものであり、1はE形態に対するものである。CBFB−MYH11転写産物のタイプA、DおよびEは全事例の約95%を示すので、これらの転写産物を増幅させるために発明者らは、CBFBエクソン5上に位置される共通のフォワードプライマー(ENF803)およびCBFBエクソン5上に位置される共通のプローブ(ENPr843)を用いることを決定した。タイプAに対してはMYH11エクソン12上(ENR862)、タイプDに対してはMYH11エクソン8上(ENR863)およびタイプEに対してはMYH11エクソン7上(ENR865)にそれぞれ位置される3の異なるリバースプライマー(図24および表27)が選択された。典型的な増幅プロットの例(10−1、10−3、10−4RNA希釈物)がCBFB−MYH11転写産物の全てのタイプに対して図25に示される。
ME−1細胞系の純粋なRNA(タイプA)が8の異なる研究所において試験された(表28)。さらに、24のタイプA患者、3のタイプD患者および4のタイプE患者の診断時のBMまたはPBサンプルが分析された(図26)。診断時のFG転写産物の値は、患者の全ての3のカテゴリーにおいて類似していたが、患者毎の変異の範囲が1logであることを示している。
10−3希釈物に対する偽陰性結果は観察されず、これに対して、10−4希釈物で、最大12%の偽陰性結果が観察された(表29)。偽陽性はNACおよびNTCウェルにおける全てのフェーズの間には見られなかった(0%、n=104)が、フェーズIVaの間に偽陽性の単一の事例(16のうちの2ウェル)がコード化されたFG陰性サンプルにおいて観察されたが、原因は汚染であった(表29)。
(9.1 背景)
AML1(CBFA2,RUNX1)−ETO(MTG8)遺伝子融合は、AMLに関連付けられる最も一般的な染色体再配列であるt(8,21)(q22;q22)に由来し、幼児および若い成人のAMLの事例の約8%において検出される。AML1遺伝子は、異種植皮転写因子CBF(コア結合因子:core binding factor)のα2サブユニットをエンコードする。異種植皮転写因子CBFは造血発生分化のために重要であり、そのβサブユニットが、CBFB−MYH11 FGにつながる(実施例8を参照のこと)inv(16)/t(16;16)によって妨害される。
(9.2.1 プライマー設計および最適化(フェーズIおよびII))
最初に、Marcucciら(7)によって出版されたプライマーおよびプローブの配列が、2の「組織内」セットと共に試験された。前者のプライマー/プローブのセットが感度の点で優れていたが、発明者らは、陰性対照サンプルにおいて大きな繰り返されるバックグラウンドシグナルを観察した。したがって、発明者らは、このプライマーセットに類似する2の新しいプローブを設計することを決定し、切断点上に位置されるENP747を、AML1エクソン5上に位置されるフォワードプライマーENF701およびETOエクソン2上のリバースプライマーENR761と共に選択するに至った(図27および表30)(5)。試験のために利用可能な細胞系はKASUMI−1であった。AML1−ETO RQ−PCRアッセイは、比較的高いΔRnと関連して、特にロバストであることが見出された(図28aを参照のこと)。したがって、200nMから100nMへのプローブ濃度の低減が評価された。プローブ濃度の低下は、アッセイの感度に影響を及ぼさず、「ベースライン・クリーピング(baseline creeping)」の人為現象は、非常に希少にのみ観察された(図28b)。
KASUMI−1細胞系の未希釈RNAが5の異なる研究所において試験された(表31)。22の患者サンプルからの保管された診断RNAに対する分析が4の異なる研究所によって請け負われた。対照遺伝子当たりのBMおよびPB間の全て差異は、対になったサンプルについて有意でなかった(n=10、ウィルコクスン検定)。除外基準を適用した後、12のPBおよび10のBMサンプルが評価された(表31)。
10−3および10−4希釈物に対する偽陰性結果は観察されなかった(全部で112の分析されたサンプルのうち0)。これは、RQ−PCRアッセイの良好な感度に沿っている(表32)。全体として、偽陽性の頻度は、9.7%(15/154)であった。108のNAC/NTCサンプルのうちの6(5.6%)および46のFG陰性サンプルのうちの9(20%)がAML1−ETO増幅に対して偽陽性であった(表32)。コード化されたFG陰性サンプルでは、偽陽性は、大部分の事例において、個々の研究所に制限された。
ABL: Abelson gene(アベルソン遺伝子)
ALL: acute lymphoblastic leukemia(急性リンパ芽球白血病)
APL: acute promyelocytic leukemia(急性前骨髄球性白血病)
B2M: beta-2-microglobulin(ベータ−2−ミクログロブリン)
BM: bone marrow(骨髄)
BMT: bone marrow transplanation(骨髄移植)
CBF: core binding factor(コア結合因子)
CG: control gene(対照遺伝子)
CML: chronic myeloid leukemia(慢性骨髄性白血病)
CN: copy number(コピー数)
COR.COEF: correlation coefficient(相関係数)
CV: coefficient of variation(変動係数)
EAC: Europe Against Cancer
ENF: European network foward primer
ENP: European network TaqMan probe
ENPr: European network reverse TaqMan probe
ENR: European network reverse primer
FAM: 6-carboxy-fluorescein(6−カルボキシ−フルオレセイン)
FG: fusion gene(融合遺伝子)
FISH: Fluorescent in-situ hybridization(蛍光in-situハイブリッド形成)
GUS: beta-glucuronidase(ベータ−グルクロニダーゼ)
MGB: minor groove binding
MMLV: murine moloney leukemia virus(マウスモロニー白血病ウイルス)
MNC: mononuclear cells(単核細胞)
MRD: minimal residual disease(微小残存病変)
MRDv: minimal residual disease value(微小残存病変値)
NAC: no amplification control
NCN: normalized copy number(規格化コピー数)
ND: not done
NTC: no template control
PN: peripheral blood(末梢血)
PBL: peripheral blood lymphocyte(末梢血リンパ球)
PBMN: peripheral blood mononuclear cells(末梢血単核細胞)
PBSCT: peripheral blood stem cell transplanation(末梢血幹細胞移植)
PCR: polymerase chain reaction(ポリメラーゼ連鎖反応)
QC: quality control(品質コントロール)
RQ−PCR: real time quantitative polymerase chain reaction(実時間定量ポリメラーゼ連鎖反応)
RT: reverse transcription(逆転写)
SENSv: sensitivity value(感度値)
TAMRA: 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine(6−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン)
(参照の一覧)
Claims (17)
- 白血病患者における微小残存病変検出のための融合遺伝子転写産物の増幅による実時間定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RQ−PCR)法において、
(i)増幅可能な適正化された患者サンプルを続く分析のために選択する工程と、
(ii)逆転写(RT)反応を実施するための最適条件を規定する工程と、
(iii)RQ−PCRプロトコルのための最適条件を規定する工程と、
(iv)データ分析のための標準化された手技を確立する工程と
を包含することを特徴とする方法。 - 適切な対照遺伝子転写産物を融合遺伝子転写産物と並列して増幅させる、請求項1に記載の方法。
- 対照遺伝子は、ABL、B2MおよびGUSからなる群から選択される、請求項2に記載の方法。
- ABL、B2MおよびGUSのためのフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーの配列が、それぞれ、
配列番号1(ENF1003)、配列番号2(ENPr1043)および配列番号3(ENR1063)、および
配列番号7(ENF1102)、配列番号8(ENPr1142)および配列番号9(ENR1162)
のいずれかである、請求項3に記載の方法。 - 基準範囲(1.3×103〜1.3×105コピー)内のABL値を有する全サンプルが増幅可能なサンプルとして考慮され、続く分析のために適正化される、請求項4に記載の方法。
- 融合遺伝子がE2A−PBX1であり、これに対応するフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーの配列が、それぞれ、
配列番号10(ENF101)、配列番号11(ENP141)および配列番号12(ENR161)
である、請求項1〜5のいずれか1つに記載の方法。 - 融合遺伝子がMLL−AF4であり、これに対応するフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーの配列が、それぞれ、
配列番号13(ENF207)、配列番号14(ENF208)、配列番号15(ENP242)および配列番号16(ENR262)
である、請求項1〜5のいずれか1つに記載の方法。 - 融合遺伝子がTEL−AML1であり、これに対応するフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーの配列が、それぞれ、
配列番号17(ENF301)、配列番号18(ENPr341)および配列番号19(ENR361)
である、請求項1〜5のいずれか1つに記載の方法。 - 融合遺伝子がBCR−ABL m−bcrであり、これに対応するフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーの配列が、それぞれ、
配列番号20(ENF402)、配列番号21(ENP541)および配列番号22(ENR561)
である、請求項1〜5のいずれか1つに記載の方法。 - 融合遺伝子がBCR−ABL M−bcrであり、これに対応するフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーの配列が、それぞれ、
配列番号23(ENF501)、配列番号21(ENP541)および配列番号22(ENR561)
である、請求項1〜5のいずれか1つに記載の方法。 - 融合遺伝子がSIL−TAL1であり、これに対応するフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーの配列が、それぞれ、
配列番号24(ENF601)、配列番号25(ENP641)および配列番号26(ENR664)
である、請求項1〜5のいずれか1つに記載の方法。 - 融合遺伝子がPML−RARAであり、これに対応するフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーの配列が、それぞれ、
配列番号27(ENF903)、配列番号28(ENF906)および配列番号29(ENF905)、配列番号30(ENP942)および配列番号31(ENR962)
である、請求項1〜5のいずれか1つに記載の方法。 - 融合遺伝子がCBFB−MYH11であり、これに対応するフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーの配列が、それぞれ、
配列番号32(ENF803)、配列番号33(ENPr843)、配列番号34(ENR862)、配列番号35(ENR863)および配列番号36(ENR865)
である、請求項1〜5のいずれか1つに記載の方法。 - 融合遺伝子がAML−ETOでありこれに対応するフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーの配列が、それぞれ、
配列番号37(ENF701)、配列番号38(ENP747)および配列番号39(ENR761)
である、請求項1〜5のいずれか1つに記載の方法。 - 工程(ii)が、
全RNA 1μgをH2O 10μl中に加え、
70℃で10分間にわたってインキュベートし、
氷冷し、下記試薬を20μlの最終容積まで加え;
逆転写酵素(MMLVまたはSupercriptIまたはIIのいずれか):100U
RTバッファ:(用いられたRTアーゼによる)
DNTP:1Mm
DTT:10Mm
ランダム・ヘキサマー:25μM
RNAアーゼインヒビター:20U
下記条件でインキュベートし、
室温で10分間;
42℃で45分間;そして、
99℃で3分間
該RT工程後に4℃に該サンプルを置き、そして、
最終cDNAをH2O 30μlで希釈する
ことからなる、請求項6〜14のいずれか1つに記載の方法。 - 工程(iii)が、
サンプルを
最終容積:25μl;
5μlの最終cDNA(100ngのRNAに等価);
プライマー:各300nM;
プローブ:200nM(ただし、AML1−ETOプローブについては100nM);
マスター・ミックス:12.5μl(1X)
となるようにし、
下記により上記サンプルをインキュベートし;
50℃で2分:および
95℃で10分
続いて下記を50サイクル行う;
95℃で15秒;および
60℃で1分
ことにより実施される、請求項6〜15のいずれか1つに記載の方法。 - 工程(iv)が、
共通の閾値を0.1に設定する(ただし、PML−RARAについては0.05)工程と、
共通のベースラインを3〜15サイクルに設定する(ただし、B2Mについては3〜10)工程と
からなる、請求項6〜16のいずれか1つに記載の方法。
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