JP2006505275A5 - - Google Patents
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Description
したがって、一つの態様において、本発明は、ポリヌクレオチドが選択された標的領域を含む、該細菌および/または真菌を含むことが疑われる試料における細菌または真菌-酵母リボ核酸（RNA）の存在を決定するための方法およびキットであって、以下の段階を含む方法およびキットに関する：
（a）メンブレンおよび/またはDEAE樹脂上での遠心濾過後DNアーゼと共にインキュベートすることによって、1000 mlまでの試料から細菌または真菌-酵母リボ核酸（RNA）を抽出する段階：
（b）細菌または真菌-酵母リボ核酸（RNA）を、1本のチューブの反応においてRTとPCRとを組み合わせることができる、Tth DNAポリメラーゼまたはTth DNAポリメラーゼのような酵素のような、RNA依存的逆転写酵素活性およびDNA依存的ポリメラーゼ活性を有する熱に安定な酵素と、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドプライマーと共に、リボヌクレオチド標的領域に対するポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、およびcDNAを合成するための該ポリメラーゼまたはTthのような酵素の逆転写酵素活性を可能にする条件下でインキュベートする段階：
；ならびに
（c）Tth DNAポリメラーゼのようなポリメラーゼ酵素と、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドプライマーおよびプローブとを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって検出可能なレベルで生成されたcDNAを増幅する段階：
実施例1
単純な濾過によって試料を分析するための好ましい方法（濾過可能な液体）。遠心濾過後にDNアーゼとのインキュベーションを行った場合の、1000 mlまでの試料からの細菌または真菌-酵母リボヌクレオチドの抽出の特異性。
Claims (27)
-
以下の段階を含む、細菌および/または真菌を含むことが疑われる試料において細菌または真菌-酵母リボ核酸（RNA）の存在を判定する方法であって、該リボ核酸（RNA）が選択された標的領域を含む方法：
（a）試験される試料または細菌もしくは真菌-酵母リボ核酸（RNA）を含むことが疑われる試料を提供する段階；
（b）細菌または真菌-酵母リボ核酸（RNA）を、RNA依存的逆転写酵素活性およびDNA依存的ポリメラーゼ活性を有する熱に安定な酵素と、ポリヌクレオチドプライマーと共に、リボヌクレオチド標的領域からcDNAを合成するための該熱に安定な酵素の逆転写酵素活性を可能にしかつ熱に安定な酵素の該DNAポリメラーゼ活性とポリヌクレオチドプライマーとを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって検出可能なレベルに生成されたcDNAの増幅を可能にする条件下でインキュベートする段階；ならびに
（c）一つまたは複数のプローブポリヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーションにより、増幅されたcDNAを検出する段階。
-
熱に安定な酵素の逆転写酵素活性によって合成されたcDNA標的配列が、一段階リアルタイムRT-PCRによって同じチューブにおいて熱に安定な酵素のDNA依存的ポリメラーゼ活性によって増幅される、請求項1記載の方法。
-
段階(a)が、メンブレンおよび/またはDEAE樹脂に対して遠心濾過（centrifiltration）した後DNアーゼと共にインキュベートすることによって、最大1000mlの試料から細菌または真菌-酵母リボ核酸（RNA）を抽出する段階を含む、請求項1または2記載の方法。
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段階（b）および（c）が同時に実施される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
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熱に安定な酵素がTth DNAポリメラーゼである、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
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ポリヌクレオチドプライマーが、（i）逆転写によりcDNAを合成するための一つまたは複数のポリヌクレオチドプライマー；（ii）ポリメラーゼ連鎖反応によりcDNAを増幅するための複数のポリヌクレオチドプライマー；および（iii）増幅されたcDNAを検出するための一つまたは複数のポリヌクレオチドプローブを含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
-
逆転写によりcDNAを合成するためのポリヌクレオチドプライマーが以下からなる群より選択される、請求項6記載の方法。
-
ポリメラーゼ連鎖反応によりcDNAを増幅するためのポリヌクレオチドプライマーが以下からなる群より選択される、請求項6記載の方法。
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増幅されたcDNAを検出するための一つまたは複数のポリヌクレオチドプローブが以下からなる群より選択される、請求項6記載の方法。
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ポリヌクレオチドプライマーおよびプローブが以下の配列からなる、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
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ポリヌクレオチドプライマーおよびプローブが以下の配列からなる、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
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ポリヌクレオチドプライマーおよびプローブが以下の配列からなる、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
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ポリヌクレオチドプライマーおよびプローブが以下の配列からなる、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
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ポリヌクレオチドプライマーおよびプローブが以下の配列からなる、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
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プライマーおよびプローブが以下の配列からなる、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
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ポリヌクレオチドプライマーおよびプローブが、核酸（DNAおよびRNA）にハイブリダイズすることができる天然の核酸またはペプチド核酸（PNA）である、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
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大腸菌およびカンジダ種からなる群由来の定量された外部標準RNAと比較することによってRNAを定量する段階をさらに含む、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
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ポリヌクレオチドプローブが非放射性標識をさらに含む、請求項16記載の方法。
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非放射性標識がフルオレセインである、請求項18記載の方法。
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細菌および/または真菌を含むことが疑われる試料において細菌または真菌-酵母リボ核酸（RNA）の存在を判定するキットであって、以下を含むキット：
（a）RNA依存的逆転写酵素活性およびDNA依存的ポリメラーゼ活性を有する熱に安定な酵素；
（b）（i）逆転写によりcDNAを合成するための一つまたは複数のポリヌクレオチドプライマー；
（ii）ポリメラーゼ連鎖反応によりcDNAを増幅するための複数のポリヌクレオチドプライマー；および
（iii）増幅されたcDNAを検出するための一つまたは複数のポリヌクレオチドプローブ；
を含む、ポリヌクレオチドプライマー。
-
試料から細菌または真菌-酵母リボ核酸（RNA）を得るための遠心濾過メンブレンおよび/またはDEAE樹脂をさらに含む、請求項20記載のキット。
-
DNアーゼをさらに含む、請求項20または21記載のキット。
-
逆転写によりcDNAを合成するためのポリヌクレオチドプライマーが以下からなる群より選択される、請求項20〜22のいずれか一項記載のキット。
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ポリメラーゼ連鎖反応によりcDNAを増幅するためのポリヌクレオチドプライマーが以下からなる群より選択される、請求項20〜22のいずれか一項記載のキット。
-
増幅されたcDNAを検出するための一つまたは複数のポリヌクレオチドプローブが以下からなる群より選択される、請求項20〜22のいずれか一項記載のキット。
-
熱に安定な酵素がTth DNAポリメラーゼである、請求項20〜25のいずれか一項記載のキット。
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請求項1〜19のいずれか一項記載の方法を実行するための、請求項20〜26のいずれか一項記載のキット。
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2005
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