JP2006342120A - 細胞賦活剤、紫外線障害緩和剤及びメラニン産生抑制剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】カカオ殻の水抽出物を含有することを特徴とする細胞賦活剤、カカオ殻の水抽出物を含有することを特徴とする紫外線障害緩和剤、及び、カカオ殻の水抽出物を含有することを特徴とするメラニン産生抑制剤。
【選択図】なし
Description
例えば、真皮線維芽細胞の代謝活性を向上させ、紫外線などの外来ストレスによる皮膚の障害や老化を有効に防止あるいは改善する作用に優れる老化防止用皮膚外用剤として、ハナビラタケ子実体から極性溶媒により抽出された抽出物を含有する老化防止用皮膚外用剤が提案されている(特許文献1)。しかし、ハナビラタケは、針葉樹の切り株や樹皮の割れ目に生じるキノコであって、大量に採取することは容易ではない。また、皮膚の障壁機能を増強させる化粧品用組成物として、ココア豆の殻の水性−アルコール性抽出物からなるβ−エンドルフィン模倣性の植物抽出物の使用が提案され、ココア豆の殻の水/ブチレングリコール抽出物が例示されている(特許文献2)。しかし、カカオ殻の水性−アルコール性抽出物は、細胞賦活剤として十分な効果を有しない。
すなわち、本発明は、
(1)カカオ殻の水抽出物を含有することを特徴とする細胞賦活剤、
(2)カカオ殻の水抽出物を含有することを特徴とする紫外線障害緩和剤、及び、
(3)カカオ殻の水抽出物を含有することを特徴とするメラニン産生抑制剤、
を提供するものである。
本発明に用いるカカオ殻は、ココア、チョコレート菓子などの原料を採取するために栽培されるアオギリ科の植物であるテオブロマ・カカオ(Theobroma cacao)の種子の殻である。テオブロマ・カカオは、ガーナ、ブラジル、トリニダード、スリ・ランカなどで大量に栽培され、その果実は食品の原料として安全衛生的に厳重な管理の下に処理されるので、カカオ殻は薬剤の原料として安全な状態で大量かつ経済的に入手することができる。
本発明に用いるカカオ殻の水抽出物は、カカオ殻を水で処理して、カカオ殻中に含まれる水に可溶性の成分を、水に不溶性又は難溶性の成分と分離することにより得ることができる。カカオ殻の水抽出に用いる装置に特に制限はなく、例えば、ソックスレー抽出器、バッテリー抽出機、ボールマン抽出機、ロトセル抽出機、ルルギ抽出機、ケネディー抽出機などの浸透貫流型固液抽出装置、パチューカタンク、ボノトー抽出機、ヒルデブランド抽出機などの固体分散型固液抽出装置、千代田式L型抽出機、ミアグ抽出機などの貫流−浸漬併用型固液抽出装置などを挙げることができる。
本発明の細胞賦活剤、紫外線障害緩和剤又はメラニン産生抑制剤においては、必要に応じて、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、酸化防止剤、防腐剤、香料、着色料、皮膚栄養剤などを配合することができる。
実施例1
カカオ殻30gを粉砕し、ソックスレー抽出器を用いて精製水300mLで7時間抽出を行った。抽出液から水分を留去したのち、残渣を凍結乾燥してカカオ殻の水抽出物2.0gを得た。
5重量%ウシ血清[FBS,EQUITECH−BIO INC.]を添加したダルベッコ改変イーグル培地[DMEM、(株)医学生物学研究所]を用いて維持した正常ヒト線維芽細胞[クラボウ(株)]を、細胞賦活作用の試験に供した。
臭化3−(4,5−ジメチル−2−チアゾリル)−2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウム(MTT)は、ミトコンドリアにおいて細胞内のエネルギー代謝過程で生じるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート(NADPH)又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)により開裂し、ホルマザンを生成する。このために、ホルマザンの生成量を、細胞賦活作用の指標とした。
正常ヒト線維芽細胞を、1ウェルあたり2.0×104個の細胞密度で、96穴マイクロプレートに播種した。1重量%ウシ血清(FBS)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)にて24時間培養したのち、所定の濃度のカカオ殻の水抽出物を含有した1重量%ウシ血清(FBS)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に交換した。さらに48時間培養したのち、臭化3−(4,5−ジメチル−2−チアゾリル)−2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウム[MTT、ナカライテスク(株)]0.4mg/mLを含有する1重量%ウシ血清(FBS)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に交換して2時間培養した。細胞を洗浄したのち、2−プロパノールにて細胞内に生成したホルマザンを溶解し、マイクロプレートリーダーを用いて560nm及び660nmの吸光度を測定し、両者の差をもって、細胞内に生成したホルマザン量として評価した。細胞賦活作用は、抽出物無添加培養細胞(コントロール)の吸光度(ABS)を100とした賦活指数(%)で表した。なお、試験ごとの陽性コントロール(PC)として、5重量%ウシ血清(FBS)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)にて培養した細胞を用いた。
賦活指数(%)
={ABS(抽出物添加培養細胞)/ABS(抽出物無添加培養細胞)}×100
比較例1
カカオ殻30gを粉砕し、エタノール300gに浸漬して撹拌しながら7日間抽出を行った。固形分をろ別したのち、エタノールを留去し、カカオ殻のエタノール抽出物2.3gを得た。
カカオ殻の水抽出物の代わりに、カカオ殻のエタノール抽出物を用いた以外は実施例1と同様にして、細胞賦活作用を評価した。
実施例1及び比較例1の結果を、第1表に示す。すべての結果は、平均値±標準偏差で表した。有意差検定にはStudentのt−検定を用い、p値が0.05未満のとき有意であると判定した。
実施例2
実施例1で調製したカカオ殻の水抽出物で正常ヒト線維芽細胞を処理したのち紫外線を照射し、細胞生存率をニュートラルレッド法で測定することにより、紫外線障害緩和作用を評価した。
正常ヒト線維芽細胞を、1ウェルあたり2.0×104個の細胞密度で、96穴マイクロプレートに播種した。5重量%ウシ血清(FBS)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)にて24時間培養したのち、所定の濃度のカカオ殻の水抽出物を含有した5重量%ウシ血清(FBS)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に交換した。さらに24時間培養したのち細胞を洗浄し、所定の濃度のカカオ殻の水抽出物を含有したHank's緩衝液(カルシウム、マグネシウム含有)に交換し、紫外線75mJ/cm2[(株)東芝、FL20SEランプ]を照射した。照射後、緩衝液を所定の濃度のカカオ殻の水抽物を含有した5重量%ウシ血清(FBS)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に交換し、さらに24時間培養したのち、細胞を30μg/mLのニュートラルレッド及び5重量%ウシ血清(FBS)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に交換し2時間培養した。細胞を洗浄したのち、細胞に取り込まれたニュートラルレッドをニュートラルレッド用細胞溶解液(30重量%のエタノールを含有する0.1モル/L塩酸)を用いて溶解し、マイクロプレートリーダーを用いて560nm及び660nmの吸光度を測定し、両者の差をもってニュートラルレッド量として評価した。細胞生存率は、紫外線未照射細胞(コントロール)の吸光度(ABS)を100として、細胞生存率(%)で表した。
細胞生存率(%)
=(紫外線照射細胞のABS/紫外線未照射細胞のABS)×100
比較例2
カカオ殻の水抽出物の代わりに、比較例1で調製したカカオ殻のエタノール抽出物を用いた以外は実施例2と同様にして、紫外線障害緩和作用を評価した。
実施例2及び比較例2の結果を、第2表に示す。すべての結果は、平均値±標準偏差で表した。有意差検定にはStudentのt−検定を用い、p値が0.05未満のとき有意であると判定した。
実施例3
実施例1で調製したカカオ殻の水抽出物について、B16メラノーマ細胞のトータルメラニン産生に対する作用を評価した。
5重量%ウシ血清(FBS)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を用いて維持したB16マウスメラノーマF0株[B16F0、大日本製薬(株)]を、1ウェルあたり1.8×104個の細胞密度で、6穴プレートに播種した。5重量%ウシ血清(FBS)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)にて24時間培養したのち、所定の濃度のカカオ殻の水抽出物を含有する5重量%ウシ血清(FBS)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に交換した。さらに5日間培養したのち、細胞をトリプシン処理にて剥離し、タンパク量を測定するとともに、細胞ペレットを作製し、目視判定により細胞ペレットの色調を、1白−5黒の5段階スコアで評価した。なお、陽性コントロール(PC)として、50ミリモル/L乳酸ナトリウムと5重量%ウシ血清(FBS)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)にて培養した細胞を用いた。
比較例3
カカオ殻の水抽出物の代わりに、比較例1で調製したカカオ殻のエタノール抽出物を用いた以外は実施例3と同様にして、B16メラノーマ細胞のトータルメラニン産生に対する作用を評価した。
実施例3及び比較例3の結果を、第3表に示す。すべての結果は、平均値±標準偏差で表した。有意差検定にはStudentのt−検定を用い、p値が0.05未満のとき有意であると判定した。
Claims (3)
- カカオ殻の水抽出物を含有することを特徴とする細胞賦活剤。
- カカオ殻の水抽出物を含有することを特徴とする紫外線障害緩和剤。
- カカオ殻の水抽出物を含有することを特徴とするメラニン産生抑制剤。
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