JP2006333816A - タンパク質の製造方法および絹糸腺の分離方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 カイコガや、クモ目の生体組織混濁物などの鱗翅目昆虫の生体組織混濁物から、絹糸腺を迅速、簡便、且つ一度に多量に分離し、タンパク質を製造する。
【解決手段】 節足動物を圧搾して絹糸腺を分離し、該絹糸腺よりタンパク質を抽出することを特徴とするタンパク質の製造方法。
【選択図】 なし

Description

本特許は、絹糸腺を含む組織混濁物を利用したタンパク質の製造方法、および、絹糸腺分離方法に関する。

絹糸昆虫の絹糸を構成する絹フィブロインタンパク質には、創傷、火傷などに対する治癒促進作用があることが知られている（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４参照）。その為、絹フィブロインを種々の創傷被覆剤として利用する為に、絹糸、又は繭を変性剤によって一度溶媒に溶解し液状フィブロインに加工する研究が精力的に行われてきた（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４参照）。しかしながら、これらの製造手法によって得られる液状フィブロインは、繭を高温条件下に於いて精錬し、変性剤によって溶解する為に、フィブロインタンパク質が分解してしまう事が報告されており、より温和なアルカリ水溶液や尿素水溶液を用いた、未分解の液状フィブロインの製造法が報告されている（特許文献５参照）。

一方で、高等真核生物である鱗翅目昆虫、または鱗翅目昆虫由来細胞を用いた遺伝子組み換えタンパク質の生産系は、細菌や酵母の系では問題となるタンパク質の翻訳後修飾機能を有することから多くの生理活性タンパク質の発現が可能である。このような、鱗翅目昆虫を用いた遺伝子組み換えタンパク質の生産では、主に鱗翅目昆虫とバキュロウイルスの組み合わせによる生産系が利用されてきた。具体的には、外来タンパク質遺伝子を組み込んだバキュロウイルスを、鱗翅目昆虫、または鱗翅目昆虫由来細胞に感染させ、感染幼虫体液から組み換えタンパク質が得ることにより、医薬品として製品化された生理活性タンパク質も知られている（特許文献６、特許文献７参照）。

バキュロウイルス感染幼虫から体液を回収する手法には、幼虫表皮を刃物などで傷つける方法や、すりつぶす方法（特許文献８参照）、回転刃を用いて迅速に幼虫を切開する方法（特許文献９参照）、赤外線レーザーを利用する方法（特許文献１０参照）、幼虫の自発収縮現象を利用した方法（特許文献１１参照）がある。特に、特許文献８や、特許文献９に記載された方法では、幼虫表皮を刃物、又は回転刃で切断するため、幼虫表皮や体腔内容物がウイルス感染体液と共にシャーレなどへ投入される事になるが、体液回収後の感染幼虫を産業的に利用する方法に関しては、従来あまり検討されておらず、唯一、昆虫廃棄物の分離・選別装置（特許文献１２参照）が報告されているのみである。

しかしながら、特許文献１２の手法は、体液回収後の昆虫廃棄物を一度乾燥した後、風選により各組織を選別する方法であり、上述の液状フィブロインを得る為には、フィブロインが分解する恐れがあり適切とは言えない。

このように、鱗翅目昆虫とバキュロウイルスを利用した組み換え型タンパク質の生産技術は精力的に汎用されているが、目的タンパク質を有する幼虫体液回収後の昆虫廃棄物に含まれる絹糸腺を利用する為には、昆虫表皮、中腸、絹糸腺、脂肪体などの混濁物から絹糸腺を、迅速、且つ簡便な絹糸腺の回収方法が所望されていた。
特開平１−２５４１６４号公報 特開平８−１９８９７０号公報 特開平９−１９２２１０号公報 特開平１１−１０４２２８号公報 特開２００１−１６３８９９号公報 特開昭６１−９２８８号公報 特開昭６１−９２９７号公報 特開平７−２８９２７０号公報 特開２００３−２２５０３６号公報 特開２００１−３５２８６１号公報 国際特開Ｗ０９８／４８６１７号公報 特開２００３−２６６０１９号公報

本発明は、鱗翅目昆虫を始めとする節足動物などの絹糸腺を、組織混濁物から、迅速、簡便、更に一度に多量に回収することを目的とする。

本発明のタンパク質の製造方法は、分離溶媒に絹糸腺を含む組織混濁物を投入して絹糸腺を分離し、該絹糸腺よりタンパク質を抽出することを特徴とするタンパク質の製造方法である。

さらに、本発明の絹糸腺の分離方法は、分離溶媒に絹糸腺を含む組織混濁物を投入し、絹糸腺を取得する絹糸腺の分離方法である。

本発明では、分離溶媒を使用することによって、絹糸腺を含む組織混濁物から絹糸腺を分離し、該絹糸腺よりタンパク質を抽出することにより、タンパク質を製造することが可能となる。

さらに、本発明では、分離溶媒を使用することによって、好ましくは、鱗翅目昆虫、より好ましくは、カイコガ、またはクモ目由来であるところの絹糸腺を含む組織混濁物から絹糸腺を分離することが可能となる。

本発明によるタンパク質の製造方法では、絹糸腺の分離、回収方法は、液相で迅速な手法であること、簡便であり技術の習得を要しないこと、一度に多量の生体組織混濁物からの分離、回収が可能であることから、特に未分解液状フィブロインや、遺伝子組み換え昆虫を作出した場合の絹糸腺からの有用タンパク質の抽出に有効である。

本発明は、分離溶媒に絹糸腺を含む組織混濁物を投入して絹糸腺を分離し、該絹糸腺よりタンパク質を抽出することを特徴とするタンパク質の製造方法である。

また、本発明は、分離溶媒に絹糸腺を含む組織混濁物を投入し、絹糸腺を取得する絹糸腺の分離方法である。

以下に、望ましい本発明の実施態様を説明する。

本発明が使用できる組織混濁物は、絹糸腺を有する節足動物の組織混濁物が好ましく、節足動物は、組み換え型タンパク質発現の為のバキュロウイルス感染鱗翅目昆虫、遺伝子組み換えカイコ、もしくは、未分解液状フィブロインタンパク質の回収を目的とした所望の鱗翅目昆虫、またはクモ目由来のいずれかでも良い。

本発明が使用できる節足動物としては、例えば、絹糸腺を有する鱗翅目昆虫、クモ目が挙げられる。鱗翅目昆虫としては、例えば、ヒトリガ科、ヤママユガ科、スズメガ科、ヤガ科、カイコガ科が挙げられ、クモ目としてはコガネグモ科、アシナガグモ科が挙げられ、特に好適なものとしてカイコガが挙げられる。

本発明では、分離溶媒を使用することによって、例えば、鱗翅目昆虫、好ましくはカイコガ、またはクモ目由来であるところの絹糸腺を含む組織混濁物から絹糸腺を分離し、該絹糸腺よりタンパク質を抽出することにより、タンパク質を製造することが可能となる。

本発明では、組織混濁物は、例えば、所望の鱗翅目昆虫、またはクモ目を、特開平７−２８９２７０、または特開２００３−２２５０３６に記載のカッターや回転刃を用いた手法によって調製できるが、絹糸腺を傷つけない種々の解剖、切断を含む手法によっても絹糸腺を含む生体組織混濁物として調製可能である。

本発明では、好ましくは、分離溶媒の２５℃における比重が、１．０２５〜１．１２５ｇ／ｃｍ^３である。

分離溶媒の２５℃における溶液比重を、好ましくは、１．０２５〜１．１２５、より好ましくは１．０４〜１．１１ｇ／ｃｍ^３へ調製することで、絹糸腺以外の生体組織を上層へ浮かし、これらを取り除くことで沈殿した絹糸腺を分離することが出来る。分離溶媒の量は、例えば、カイコガ２５頭から５０本の絹糸腺を回収するには１Ｌあれば充分であり、分離溶媒の量を増やすことで一度に処理できる組織混濁物の量を増やすことも可能である。また、表皮等の組織と絹糸腺の解離が悪い際には、適宜回転子を用いることで解離効果を上げることも可能である。溶液の温度は、いずれの温度でも絹糸腺の分離、回収は可能である。

本発明では、分離溶媒の２５℃における比重を、１．０２５〜１．１２５ｇ／ｃｍ^３にする事により、絹糸腺を含む組織混濁物から絹糸腺をより容易に分離し、該絹糸腺よりタンパク質を抽出することにより、タンパク質を製造することが可能となる。

本発明では、好ましくは、分離溶媒に糖類を含有する。

本発明において、溶質に用いる溶解性化合物は、特に限定するものではないが、浸透圧によって、分離した各組織の比重が変化し絹糸腺と同様に沈殿してしまうこと、或いは、絹糸腺に傷がつき液状フィブロインが溶出することがあるので、溶解性化合物に、糖類を用いることで、各組織の分離時間を長くすることや、液状フィブロインの溶出を抑えることが可能である。

本発明では、糖類を含有する分離溶媒を使用することによって、絹糸腺を含む組織混濁物から絹糸腺を分離し、絹糸腺よりタンパク質を抽出することにより、タンパク質を製造することがより容易に可能となる。

本発明では、回収した絹糸腺は、一度緩衝液などで洗浄した後、ダウンスホモジナイザー、野菜カッター、乳鉢などにより容易に抽出可能である。

本発明では、好ましくは、緩衝液で洗浄後、野菜カッター等で切断することにより絹糸腺よりタンパク質を容易に抽出できる。

本発明によって、絹糸腺を有する生体組織混濁物からの効果的な絹糸腺の分離、回収が可能となる。

以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに何ら限定されるものではない。

実施例１（５齢６日目カイコガ熟蚕幼虫の絹糸腺の分離、回収）
５齢６日目となるカイコガ熟蚕幼虫（錦秋×鐘和）５０頭を解剖皿上にて解剖し、絹糸腺と、その他の表皮、中腸、脂肪体、マルピーギ管などの組織を混合し、組織混濁物とした。これら組織混濁物をグルコースによって比重調製された分離溶媒に投入し、絹糸腺のみが組織混濁物の中から分離されてくるかどうか観察した。

その結果、２５℃における比重が、１．０２５〜１．１２５ｇ／ｃｍ^３の場合において絹糸腺のみが分離溶媒中で沈殿し、その他の組織混濁物は上層に浮くことが観察された。特に、２５℃における比重が１．０４〜１．１１ｇ／ｃｍ^３の場合において絹糸腺とその他の組織混濁物の著しい分離が観察された（図１参照）。また比重を調製する溶質にグルコース、ショ糖、塩化ナトリウム、リン酸緩衝液を用いた場合、塩化ナトリウムやリン酸緩衝液を分離溶媒に用いた際、絹糸腺が傷つき、絹糸腺内の液状フィブロインが溶出することが観察された。

本分離溶媒による絹糸腺の分離は、２００ｍｌの分離溶媒を用いた場合、５０頭カイコ組織混濁物からの分離が３秒程度で可能であり、その後上清に浮遊した組織混濁物を網などで除去することで、絹糸腺を１分で回収することが可能であった
実施例２（分離溶媒によって分離した絹糸腺内の液状フィブロインの解析）
５齢４日目となるカイコガ（ｗ１ｐｎｄ）熟蚕幼虫を解剖皿上にて解剖し、分離絹糸腺と、その他の表皮、中腸、脂肪体、マルピーギ管などの組織を混合し、組織混濁物とした。これら組織混濁物を、予めグルコースによって２５℃における比重を１．０７ｇ／ｃｍ^３へ調製した分離溶媒に投入し、絹糸腺とその他の組織混濁物を分離した。分離した絹糸腺は、２度リン酸緩衝液にて洗浄した後、カッターで切断し、溶媒分離液状フィブロイン溶液を得た。

次に、カイコガ（ｗ１ｐｎｄ）の繭を０．０５％炭酸ナトリウム溶液によって１時間煮沸精錬した繭、または未精錬の繭を１０ｍｇ、６０％ＬｉＳＣＮ４ｍｌを加え攪拌後、終夜室温に静置し、繭を溶解した。これを８Ｍ尿素、２％ＳＤＳ、５％２−メルカプトエタノールで１０倍希釈し、精錬繭溶液、未精錬繭溶液を得た。

溶媒分離液状フィブロイン溶液、精錬繭溶液、及び未精錬繭溶液をサンプルバッファーにて希釈し、ポリアクリルアミド電気泳動を行った。その結果、精錬した繭由来絹溶液のフィブロインＨ鎖タンパク質は分解していたのに対し、溶媒分離液状フィブロイン溶液、及び未精錬繭溶液のフィブロインＨ鎖タンパク質は分解せず、３５００００ダルトンのバンドが観察された（図２）。このことは精錬繭溶液由来のフィブロインＨ鎖タンパク質が分解していること、また溶媒分離液状絹溶液は未精錬繭溶液と同様に、フィブロインＨ鎖タンパク質の分解を受けていない事を示している。

実施例３（ネコインターフェロンを発現する遺伝子組み換えカイコの絹糸腺を分離溶媒によって分離した絹糸腺内の液状フィブロインの解析）
ネコインターフェロンω遺伝子組み換えカイコ（特開２００４−２５４６８１に記載のＨＵＰ・ＩＣ・ＨＡ遺伝子組み換えカイコ）、及びコントロールとして非遺伝子組み換えカイコ（ｗ１ｐｎｄ）の熟蚕幼虫を解剖皿上にて解剖し、分離絹糸腺とその他の表皮、中腸、脂肪体、マルピーギ管などの組織を混合し、組織混濁物とした。本組織混濁物を予めグルコースによって２５℃における比重を１．０７ｇ／ｃｍ^３へ調製した分離溶媒に投入し、絹糸腺とその他の組織混濁物を分離した。分離した絹糸腺は、２度リン酸緩衝液にて洗浄した後、カッターで切断し、溶媒分離液状フィブロイン溶液を得た。一方、本遺伝子組み換えカイコ（ＨＵＰ・ＩＣ・ＨＡ）の繭を１０ｍｇ量り採り、６０％ＬｉＳＣＮ４ｍｌを加え攪拌後、終夜室温に静置し、繭を溶解した。これを８Ｍ尿素、２％ＳＤＳ、５％２−メルカプトエタノールで１０倍希釈し、繭由来絹溶液を得た。これら溶媒分離液状絹溶液サンプルと繭由来絹溶液サンプルを抗ネコインターフェロン抗血清により、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社製）を用い、添付のプロトコールに従ってネコインターフェロンの検出を行った。

その結果、グルコース分離溶媒を用いた分離による溶媒分離液状フィブロイン溶液では、繭由来絹溶液のネコインターフェロンと同様のシグナルが検出された（図３）。本結果より、分離溶媒を用いた絹糸腺分離法によって、遺伝子組み換えカイコが産生する有用タンパク質が、精錬によるフィブロインＨ鎖タンパク質と同様に分解することなく、本発明の方法により分離した絹糸腺より抽出できることが明らかとなった。

図１は、５０頭のカイコガ熟蚕幼虫（錦秋×鐘和）の組織混濁物から、絹糸腺をグルコースによって、それぞれ２５℃における比重を１．０１、１．０２５、１．０４、１．０５５、１．０７、１．０８５、１．１、１．１２５、１．１４ｇ／ｃｍ^３へ調製された分離溶媒によって分離した結果を示した図である。尚、実験は３度行い、標準偏差をグラフ上に示す。 図２は、精錬繭サンプル、未精錬繭サンプル、及び分離溶媒によって分離回収した絹糸腺由来の液状絹サンプルの電気泳動である。 図３は、遺伝子組み換えカイコの発現するネコインターフェロンωタンパク質の繭サンプル、及びグルコース分離溶媒によって分離した絹糸腺の液状フィブロインサンプルをウェスタン解析した結果である。

Claims (8)

1. 分離溶媒に絹糸腺を含む組織混濁物を投入して絹糸腺を分離し、該絹糸腺よりタンパク質を抽出することを特徴とするタンパク質の製造方法。
2. 組織混濁物が、絹糸腺を有する節足動物由来である請求項１に記載のタンパク質の製造方法。
3. 節足動物が、鱗翅目昆虫、または、クモ目である請求項２に記載のタンパク質の製造方法。
4. 分離溶媒の２５℃における比重が、１．０２５〜１．１２５ｇ／ｃｍ^３である請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
5. 分離溶媒に糖類を含有する請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
6. 分離溶媒に絹糸腺を含む組織混濁物を投入し、絹糸腺を取得する絹糸腺の分離方法。
7. 絹糸腺が、鱗翅目昆虫、またはクモ目由来であるところの請求項６に記載の絹糸腺の分離方法。
8. 分離溶媒の２５℃における比重が、１．０２５〜１．１２５ｇ／ｃｍ^３であり、分離溶媒が糖類を含有する請求項６〜７のいずれかに記載の絹糸腺の分離方法。