JP2006325409A - 電界印加によるポリ（ａ）ｒｎａ精製又は作成方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 ポリアデニン分子に対する電界印加の新規効果に基づき、効率的に高純度のポリ（Ａ）ＲＮＡを精製し、あるいは、ポリ（Ａ）ＲＮＡを作製する。
【解決手段】
反応場に電界を印加することによって、ポリアデニン分子の双極子モーメント及び配向を変化させるようにする。これにより、反応場に電界を印加することによって、ｄＴ鎖とポリ（Ａ）ＲＮＡのポリ（Ａ）鎖との相補結合を促進させたり、ＲＮＡの３'末端部位に対するポリ（Ａ）鎖の付加及び／又は伸長を促進させたりする。
【選択図】 図１

Description

本発明は、ポリ（Ａ）ＲＮＡの精製又は作製に係る技術に関する。より詳しくは、ポリアデニン分子に電気力学的作用を与えることによって、ポリ（Ａ）ＲＮＡを精製又は作製する技術に関する。

近年、遺伝子工学の発展により種々の生物の遺伝子配列が解明されつつある。例えば、ヒトに存在する遺伝子数は１０万を越えるであろうといわれている。しかしながら、ゲノムＤＮＡ全てが生命現象を担っているわけではなく、生命現象の主たる担い手タンパク質のアミノ酸配列情報を含む領域である。言い換えればタンパク質の合成の前にまずＲＮＡに転写されるが、この際その間に挟まれたアミノ酸配列情報を含まない領域（イントロン）も合わせて転写され、スプライシングと呼ばれる過程でこの領域が切除され、アミノ酸配列情報を含む領域が残ったメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が生成する。

また、真核生物などのｍＲＮＡにおいては、転写に続いてポリ（Ａ）ポリメラーゼにより、その３’末端に１００〜２００ｂｐ程度のポリ（Ａ）鎖（poly(A)tail）と呼ばれるＡＭＰ残基の連続体が付加されるポリアデニル化（polyadenylation）が行われ、ポリ（Ａ）ＲＮＡが生成する。ポリ（Ａ）鎖の機能は未だわかっていないが、ｍＲＮＡを分解するような酵素群から保護し、ｍＲＮＡの安定性を高めていると考えられている。

遺伝子の機能解析においては、生物の各組織内でいかなる遺伝子が発現されているかを知ることは極めて重要である。ポリ（Ａ）ＲＮＡの解析において、しばしばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ（ポリＡ+ＲＮＡ）等の混合物であるTotal ＲＮＡを用いて行われる。しかし、このTotal ＲＮＡに占めるポリ（Ａ）ＲＮＡは５％以下であり、特にコピー数の少ないポリ（Ａ）ＲＮＡの解析は困難である。そのため、生体材料から効率的にポリ（Ａ）ＲＮＡを単離することは、これらの解析において非常に有意義である。

現在、ポリ（Ａ）ＲＮＡの精製やｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）の作製にポリ（Ａ）構造が利用されている。例えば、ポリ（Ａ）と相補的に結合するｄＴ鎖を担体に結合したカラムに細胞から抽出したTotal ＲＮＡを流すと、ポリ（Ａ）構造を持たないｔＲＮＡ、ｒＲＮＡは通り抜け、タンパク質に翻訳されるｍＲＮＡだけが捕捉され、次いで、低塩濃度溶液でｍＲＮＡを溶出させて精製する（例えば、特許文献１参照）。また、ｍＲＮＡを鋳型に逆転写酵素でｃＤＮＡを合成する際にも、ｄＴ鎖のプライマーをｍＲＮＡに付着し部分的に二重鎖にして、逆転写酵素によるＤＮＡ合成反応を開始することが行われている。
特開２００１−２９９３４４号公報。

従来のポリ（Ａ）ＲＮＡの精製技術においては、ｄＴ鎖に対するポリ（Ａ）ＲＮＡの捕捉効率や精度に改良の余地があった。より具体的には、担体に固定等されたｄＴ鎖に対して、回収目的とするポリ（Ａ）ＲＮＡ以外にも他の不要分子が非特異的に吸着するという問題が発生するため、ポリ（Ａ）ＲＮＡの回収効率や純度が悪かった。

そこで、本発明は、ポリアデニン分子に対する電界印加の効果に基づき、細胞等の核酸を含有する試料から、効率的に高純度のポリ（Ａ）ＲＮＡを精製することができる技術やポリ（Ａ）ＲＮＡを作製する方法を提供することを主な目的とする。

核酸分子は、骨格をなすリン酸イオン（陰電荷）とその周辺にある水がイオン化した水素原子（陽電荷）とによってイオン曇を作っていると考えられ、これらの陰電荷及び陽電荷によって分極ベクトル（双極子：dipole）が生じる。この分極ベクトルは電界によりその方向が変化し、また、分子配向も変化する。

本願発明者らは、鋭意研究を行った結果、電界印加によって、他の核酸分子に比べて、アデニン分子が急激に双極子モーメント（dipole moment）と配向（transformation）が変化することを突き止め、この電界印加による電気力学的作用によって、ｄＴ鎖に対してＲＮＡのポリ（Ａ）鎖部分が高効率で相補結合し、また、ポリ（Ａ）ＲＮＡが効率良く生成することを明らかにした。

そこで、本発明は、まず、反応場に電界を印加することによってポリアデニン分子の双極子モーメント及び配向を変化させる方法を提供する。

また、本発明では、ｄＴ鎖が固定化された固相表面を有する反応場へＴｏｔａｌＲＮＡを含有するサンプル溶液を送り込み、前記反応場に電界を印加することによって、ｄＴ鎖とポリ（Ａ）ＲＮＡのポリ（Ａ）鎖との相補結合を進行させる相補鎖形成工程と、前記反応場に所定の洗浄液を送り込んで、該反応場から遊離物質を除去する洗浄工程と、該反応場に存在する相補鎖を解離し、前記ポリ（Ａ）ＲＮＡを遊離させる解離工程と、前記ポリ（Ａ）ＲＮＡを該反応場から回収する回収工程と、を少なくとも行うポリ（Ａ）ＲＮＡ精製方法を提供する。この方法では、前記解離工程においても電界を印加することによって、ポリ（Ａ）ＲＮＡの解離を促進させてもよい。

さらに、本発明では、反応場に電界を印加してポリアデニン分子の双極子モーメントの配向を変化させることによって、ＲＮＡの３'末端部位に対するポリＡ鎖の付加及び／又は伸長を促進させてポリ（Ａ）ＲＮＡを作製する方法を提供する。

本発明によれば、ポリアデニン分子を標的として電界印加を行って、ポリアデニン分子の双極子モーメントとその配向を急激に変化させることができる。この電気力学的効果によって、ｄＴ鎖とポリ（Ａ）ＲＮＡのポリ（Ａ）鎖との間の相補鎖結合効率を向上させたり、あるいは、ｄＴ鎖とポリ（Ａ）鎖の相補結合の解離を促進させたりすることができる。

また、電界印加によって、ｄＴ鎖に対するミスマッチ結合の解離をＡ−Ｔフルマッチの解離よりも相対的に増やすことによって、相補結合中のＡ−Ｔフルマッチの割合を増加させることができる。このため、ｄＴ鎖に対してポリ（Ａ）ＲＮＡのポリ（Ａ）鎖部位を相補結合させるアッセイの精度を高めることができ、ひいては、回収されたポリ（Ａ）ＲＮＡの純度を向上させることができる。

さらに、前記電気力学的効果によって、ＲＮＡの３'末端部位に対するポリＡ鎖の付加や伸長を促進させて、ポリ（Ａ）ＲＮＡの人為的な作製を効率よく行うことができる。

以下、本発明を実施するための好適な形態について、添付図面を参照しながら説明する。なお、添付図面に示された各実施形態は、本発明に係わる物や方法の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。

まず、図１は、本発明に係るポリ（Ａ）ＲＮＡ精製方法の工程手順の一例を示す図である。

符号Ｒで示す反応場としては、例えば、カラム内に形成された反応場や基板上に形成された反応場を利用できる。このような反応場Ｒにおいて、担体（例えば、ビーズ）や基板の表面ＳにｄＴ鎖（符号１）の一端を、例えば、カップリング反応やビオチン‐アビジン結合等を用いて固定しておく。

このようなｄＴ鎖（符号１）が固定されている環境の反応場Ｒに対して、細胞等から抽出されたＴｏｔａｌＲＮＡを含有する試料を添加又は送液等して送り込む。図１中の（Ｉ）には、ポリ（Ａ）鎖を有するＲＮＡ、即ちポリ（Ａ）ＲＮＡ（符号２）とポリ（Ａ）鎖を持たないＲＮＡ（符号３）が反応場Ｒに混在している様子が模式的に示されている。

なお、ポリ（Ａ）ＲＮＡ含有する試料は、特に限定されないが、例えば、血清、血液、髄液、組織、尿、糞便、唾液、精液等の生体材料から分離した細胞及び培養細胞などの生体試料を挙げることができる。

続いて、このような物質環境の反応場Ｒに対して、電界Ｅを印加することによって、ポリ（Ａ）ＲＮＡ２において、特にそのポリ（Ａ）鎖部位２１の双極子モーメントに対して、選択的に影響を与える。

図２は、電界Ｅを印加することによって、ポリ（Ａ）ＲＮＡ２のポリ（Ａ）鎖部位２１の双極子モーメントの向きが急激に変化して配向が変化することによって、ランダムコイル形状などを形成して絡み合っているポリＡ鎖部位が反応場Ｒに露出し、表面Ｓに固定されているｄＴ鎖（符号１）に引き寄せられている様子が模式的に示されている。

図３は、さらに、図２の段階から進行し、ポリ（Ａ）ＲＮＡ２のポリ（Ａ）鎖部位２１と表面Ｓに固定されているｄＴ鎖（符号１）とが相補結合することにより、相補鎖を形成している様子が模式的に示されている。

このような電界印加による相補鎖形成工程に続いて、洗浄工程へ移行する。図１中の（III）は、この洗浄工程の概念を模式的に簡潔に示している。この洗浄工程では、反応場Ｒに対して所定の洗浄用のバッファー溶液（相補鎖に影響を与えないもの）を送り込み、反応場Ｒに遊離状態で存在しているポリ（Ａ）鎖を持たないＲＮＡ３を、該反応場Ｒから除去する。

この洗浄工程が完了したら、続いて解離工程に移行する。図１中の（VI）にはこの解離工程の概念が模式的に示されている。

この解離工程では、表面Ｓ近傍の反応場Ｒに形成されている相補鎖、即ち、ポリ（Ａ）ＲＮＡ２のポリ（Ａ）鎖部位２１と表面Ｓに固定されているｄＴ鎖（符号１）との相補結合部位を、反応場Ｒの温度条件、塩濃度、ｐＨ条件などを操作することによって解離し、一本鎖のポリ（Ａ）ＲＮＡ２を反応場Ｒへ遊離させるようにする。なお、解離のための反応場の条件は、適宜選択すればよい。

なお、この解離工程において、再び電界を印加することによって、ポリ（Ａ）ＲＮＡ２のポリ（Ａ）鎖部位２１の双極子モーメントやその配向を急激に変化させ、その効果により解離を促進させるようにしてもよい。

即ち、電界印加による電気力学的効果によって、ｄＴ鎖に対するミスマッチ結合の解離をＡ−Ｔフルマッチの解離よりも相対的に増やすことによって、全相補結合中のＡ−Ｔフルマッチの割合を増加させることができる、これにより、ｄＴ鎖に対するポリ（Ａ）ＲＮＡのポリ（Ａ）鎖部位を相補結合させるアッセイの精度を高めることができ、ひいては、回収されたポリ（Ａ）ＲＮＡの純度を向上させることができる。

最後に、反応場Ｒに存在する溶液を回収することによって、該溶液中に含まれているポリ（Ａ）ＲＮＡ２を回収することができる。図１の（Ｖ）には、この回収工程の概念が模式的に示されている。

次に、図４は、本発明に係るポリ（Ａ）ＲＮＡ作製方法に係る工程手順の概念を示す図である。

反応場Ｒに、符号４で示されたポリアデニン分子と、ポリ（Ａ）鎖を持たないＲＮＡ５、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（poly A polymerase）、酵素反応に必要な成分（例えば、Ｍｇ^２＋又はＭｎ^２＋）などが存在している系を形成する。

このような反応場Ｒに電界Ｅを印加すると、ポリアデニン分子４の双極子モーメントやその配向が急激に変化することにより、ポリアデニン分子４がＲＮＡ５の３'末端に付加され易く、あるいは伸長され易い状態となるため、目的のポリ（Ａ）ＲＮＡ６の生成を効率よく進めることができる。

より具体的には、前記電界Ｅの電気力学的効果によって、ポリアデニン分子４と同反応場Ｒに存在するポリ（Ａ）ポリメラーゼ（図示ぜす）の複合体（中間体）の形成が促進され、これにより、ＲＮＡ５の３'末端部位に対するポリＡ鎖の付加や伸長が促進されると考えられる。

以下、本発明に係るポリ（Ａ）ＲＮＡ精製方法やポリ（Ａ）ＲＮＡ精製方法の有用性の根拠となる電界Ｅの電気力学的効果によるポリアデニン分子の双極子モーメントと配向（トランスフォーメーション）の変化に係る検証結果を、図５〜図８に基づいて説明する。なお、各図の左縦軸はベクトル（Debye）、右縦軸は配向の変化角度（Angle）、横軸は電圧（Ｖ／ｎｍ）をそれぞれ示している。

図５は、ポリアデニン分子の双極子モーメントと配向が、電界強度（電圧）１．６〜２．１Ｖ／ｎｍのときに急激に変化することが示されている。一方、図６はポリチアミン分子、図７はポリシトシン分子、図８はポリグアニン分子のついての双極子モーメントとトランスフォーメーションの変化をそれぞれ示している。

図６から８の結果と図５の結果を比較すればわかるように、ポリチアミン分子、ポリシトシン分子、ポリグアニン分子では、ポリアデニン分子のような電界強度（電圧）１．６〜２．１Ｖ／ｎｍにおける双極子モーメントと配向の急激な変化が見られないことが明らかである。

核酸分子は、骨格をなすリン酸イオン（陰電荷）とその周辺にある水がイオン化した水素原子（陽電荷）とによってイオン曇を作っていると考えられ、これらの陰電荷及び陽電荷によって分極ベクトル（双極子）が生じ、この分極ベクトルが電界の印加によりその方向が変化し、また、配向も変化する。

本実施例１に係る実験で使用したElution Bufferの組成は、10mM Tris-HCL pH7.5, 1mM EDTA（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム）,0.1%SDS（ポリアクリルアミド）であり、洗浄用のバッファー溶液（Washing Buffer）の組成は、10mMTris-HCL pH7.5, 1mM EDTA, 0.1% SDS, 0.5MNaClである。

エタノール沈殿後のtotal RNA400mgに、前記Elution Buffer400mlを加え、更にoligotex-dT30 <super> 400mlを加えて、65度、５分インキュベートした。その後、３分間急冷し、電界（条件：１ＭＨｚ，２Ｖ）を10分かけた。

続いて、5M NaCl 80mlを加え、37度10minインキュベートした後、15000rpm 3min 4度で遠心した。ペレットを上記Washing Buffer 1mlに懸濁し、15000rpm 3min 4℃で遠心し、上清を除去した。再び電界を10分かけてから、TE 400mlを加え、ピペッティングで懸濁し、65℃ 5分インキュベートし、その後、３分間急冷した後、15000rpm 3min 4℃で遠心し、その上清を新しいチューブに移し、15000rpm 3min 4℃遠心した。その上清を新しいチューブに移してエタノール沈殿(2M NaoAc1/10,100% Etoh 2.5倍）させた。その後、ペレットを少し乾かし、DEPC（diethylpyrocarbonete）処理したdH2OまたはTEに溶かして、ポリ（Ａ）ＲＮＡの濃度を測定した。

この実験結果、電界を印加した場合は、電界をかけない場合に比べて、２０％以上のポリ（Ａ）ＲＮＡを生成できることを確認できた。

ストレス条件下で３h培養した枯草菌から抽出したtotal RNAを用いて、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（poly A polymerase）によってpoly Aを付加させる実験を行った。

ＲＮＡは8.4μg使用し、poly A polymerase活性測定用反応液として、Takara社のプロトコルに沿って調製した。電界をかけない時に、酵素反応時間を37℃で60分、10mMのATP(アデノシン三リン酸)濃度がpoly A付加反応を、電界を印加した条件と、電界を印加しない条件でそれぞれ行った。

電界印加条件では、電界を印加しない条件よりも、短時間でpoly A付加反応が終わった。また、付加されたポリ（Ａ）鎖（poly A tail）の長さを調べたところ、電場印加条件でポリ（Ａ）鎖は、電界印加がない時より長いことが分かった。このような電界印加の効果は、ポリ（Ａ）鎖の付加に加え、当該ポリ（Ａ）鎖の伸長も促進させると考えられる。

本発明は、様々な生体材料から効率的にポリ（Ａ）ＲＮＡを精製したり、作製したりする技術として利用できる。本発明に係る方法により得られたポリ（Ａ）ＲＮＡは、ノザンブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲ解析、ｃＤＮＡライブラリーの調製、ｃＤＮＡクローニングなどの鋳型として利用できる。

本発明に係るポリ（Ａ）ＲＮＡ精製方法の工程手順の一例を示す図である。 電界（Ｅ）の印加により、ランダムコイル形状などを形成して絡み合っているポリＡ鎖部位が反応場（Ｒ）に露出し、表面Ｓに固定されているｄＴ鎖（符号１）に引き寄せられている様子を模式的に示す図である。 図２に示す段階から進行して、ポリ（Ａ）ＲＮＡ（２）のポリ（Ａ）鎖部位（２１）と表面（Ｓ）に固定されているｄＴ鎖（符号１）とが相補結合することにより、相補鎖を形成している様子を模式的に示す図である。 本発明に係るポリ（Ａ）ＲＮＡ作製方法に係る工程手順の概念を示す図である。 ポリアデニン分子の双極子モーメントと配向が、電界強度（電圧）１．６〜２．１Ｖ／ｎｍのときに急激に変化することを示す図（図面代用グラフ）である。 ポリチアミン分子の双極子モーメントとトランスフォーメーションの変化を示す図（図面代用グラフ）である。 ポリシトシン分子の双極子モーメントとトランスフォーメーションの変化を示す図（図面代用グラフ）である。 ポリグアニン分子の双極子モーメントとトランスフォーメーションの変化を示す図（図面代用グラフ）である。

符号の説明

１ ｄＴ鎖
２ ポリ（Ａ）ＲＮＡ
３ ポリ（Ａ）鎖を持たないＲＮＡ
Ｅ 電界
Ｒ 反応場
Ｓ 表面

Claims (4)

1. 反応場に電界を印加することによってポリアデニン分子の双極子モーメント及び配向を変化させる方法。
2. ｄＴ鎖が固定化された固相表面を有する反応場へＴｏｔａｌＲＮＡを含有するサンプル溶液を送り込み、前記反応場に電界を印加することによって、ｄＴ鎖とポリ（Ａ）ＲＮＡのポリ（Ａ）鎖との相補結合を進行させる相補鎖形成工程と、
   前記反応場に所定の洗浄液を送り込んで、該反応場から遊離物質を除去する洗浄工程と、
   該反応場に存在する相補鎖を解離、前記ポリ（Ａ）ＲＮＡを遊離させる解離工程と、
   前記ポリ（Ａ）ＲＮＡを該反応場から回収する回収工程と、
   を少なくとも行うポリ（Ａ）ＲＮＡ精製方法。
3. 前記解離工程において、電界を印加することを特徴とする請求項２記載のポリ（Ａ）ＲＮＡ精製方法。
4. 反応場に電界を印加してポリアデニン分子の双極子モーメント及び配向を変化させることによって、ＲＮＡの３'末端部位に対するポリ（Ａ）鎖の付加及び／又は伸長を促進させてポリ（Ａ）ＲＮＡを作製する方法。

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