JP2003018985A - 長鎖ｄｎａを伸張する方法 - Google Patents
長鎖ｄｎａを伸張する方法Info
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- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
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- G01N27/447—Systems using electrophoresis
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Abstract
(57)【要約】
【課題】簡便で迅速な、伸張させて解析した長鎖ＤＮＡ
を回収して再利用することが可能な方法として、ゲルと
低周波交流電場を用いた長鎖核酸を伸張させる方法およ
び該方法によって伸張された核酸分子を提供することを
目的とする。 【解決手段】核酸分子をゲル中に配置する工程およびゲ
ル中の核酸分子に低周波交流電場を印加する工程を含
む、核酸分子の伸張方法。
を回収して再利用することが可能な方法として、ゲルと
低周波交流電場を用いた長鎖核酸を伸張させる方法およ
び該方法によって伸張された核酸分子を提供することを
目的とする。 【解決手段】核酸分子をゲル中に配置する工程およびゲ
ル中の核酸分子に低周波交流電場を印加する工程を含
む、核酸分子の伸張方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸分子の伸張方
法に関する。より詳細には、本発明は、ゲルと低周波交
流電場を用いた核酸分子の伸張方法に関する。
法に関する。より詳細には、本発明は、ゲルと低周波交
流電場を用いた核酸分子の伸張方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒト・ゲノムのシークエンシングが当初
の予定を大幅に上回るスピードで終了した。このような
ＤＮＡ解析技術の進歩に伴って、今後はたった１つの染
色体ＤＮＡ分子からその情報を読み取る究極の１分子ゲ
ノム解析技術が重要になる。１分子ゲノム解析を実現す
るためのＤＮＡを１分子で自由にマニピュレートする技
術が要求される。従来の単一ＤＮＡ分子マニピュレーシ
ョン・解析法には、光ピンセット、原子間力顕微鏡、高
周波交流電場が用いられてきたが、これらの方法では、
ＤＮＡの前処理が必要であったり、マニピュレートした
ＤＮＡを回収して新たなサンプルとして利用することが
困難であったり、染色体ＤＮＡのような長鎖ＤＮＡを伸
張させることができない等の欠点を有していた。
の予定を大幅に上回るスピードで終了した。このような
ＤＮＡ解析技術の進歩に伴って、今後はたった１つの染
色体ＤＮＡ分子からその情報を読み取る究極の１分子ゲ
ノム解析技術が重要になる。１分子ゲノム解析を実現す
るためのＤＮＡを１分子で自由にマニピュレートする技
術が要求される。従来の単一ＤＮＡ分子マニピュレーシ
ョン・解析法には、光ピンセット、原子間力顕微鏡、高
周波交流電場が用いられてきたが、これらの方法では、
ＤＮＡの前処理が必要であったり、マニピュレートした
ＤＮＡを回収して新たなサンプルとして利用することが
困難であったり、染色体ＤＮＡのような長鎖ＤＮＡを伸
張させることができない等の欠点を有していた。
【０００３】ヒト染色体ＤＮＡのサイズは、全体で３５
億塩基対（３．５ ギガ塩基対：Ｇｂｐ）もあり、最も
小さい第２１染色体でも４千８００万塩基対（４８メガ
塩基対：Ｍｂｐ）を有する。従って、染色体ＤＮＡを切
断して得た断片を分離・同定し、もとの配列を再構成す
る過程では、染色体ＤＮＡをなるべく細切れにしないで
大きいままで扱う方が有利である。それゆえに、Ｍｂｐ
オーダーの巨大断片を迅速かつ精密に解析する技術が望
まれている。
億塩基対（３．５ ギガ塩基対：Ｇｂｐ）もあり、最も
小さい第２１染色体でも４千８００万塩基対（４８メガ
塩基対：Ｍｂｐ）を有する。従って、染色体ＤＮＡを切
断して得た断片を分離・同定し、もとの配列を再構成す
る過程では、染色体ＤＮＡをなるべく細切れにしないで
大きいままで扱う方が有利である。それゆえに、Ｍｂｐ
オーダーの巨大断片を迅速かつ精密に解析する技術が望
まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、簡便で迅速
な、伸張させて解析した長鎖ＤＮＡを回収して再利用す
ることが可能な方法として、ゲルと低周波交流電場を用
いた長鎖核酸を伸張させる方法および該方法によって伸
張された核酸分子を提供することを目的とする。
な、伸張させて解析した長鎖ＤＮＡを回収して再利用す
ることが可能な方法として、ゲルと低周波交流電場を用
いた長鎖核酸を伸張させる方法および該方法によって伸
張された核酸分子を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】即ち、本発明の要旨は、
（１）核酸分子をゲル中に配置する工程およびゲル中の
核酸分子に低周波交流電場を印加する工程を含む、核酸
分子の伸張方法、（２）核酸分子の長さが、２３〜５７
００ｋｂｐである、前記（１）記載の方法。（３）低周
波交流電場の周波数が、１〜１００Ｈｚである、前記
（１）または（２）記載の方法、（４）低周波交流電場
の強度が、｜１０｜〜｜１００００｜（絶対値）Ｖ／ｃ
ｍである、前記（１）〜（３）いずれかに記載の方法、
（５）低周波交流電場の強度を漸増させる、前記（１）
〜（３）いずれかに記載の方法、（６）低周波交流電場
の強度を、｜１０｜Ｖ／ｃｍから｜３００｜（絶対値）
Ｖ／ｃｍまで漸増させる、前記（５）記載の方法、
（７）低周波交流電場の強度を漸増する速度が、｜１｜
〜｜１００｜（絶対値）Ｖ／ｃｍ・ｓである、前記
（５）または（６）記載の方法、（８）低周波交流電場
の周波数を漸増させる、前記（１）〜（７）記載の方
法、（９）低周波交流電場の周波数を１Ｈｚから２０Ｈ
ｚまで漸増させる、前記（８）記載の方法、（１０）低
周波交流電場の周波数を漸増する速度が０．０１〜１Ｈ
ｚ／ｓである、前記（８）または（９）記載の方法、
（１１）伸張した核酸分子を検出し、回収する工程をさ
らに含む、前記（１）〜（１０）いずれかに記載の方
法、（１２）前記（１）〜（１１）いずれかに記載の方
法により伸張されてなる核酸分子、に関する。
（１）核酸分子をゲル中に配置する工程およびゲル中の
核酸分子に低周波交流電場を印加する工程を含む、核酸
分子の伸張方法、（２）核酸分子の長さが、２３〜５７
００ｋｂｐである、前記（１）記載の方法。（３）低周
波交流電場の周波数が、１〜１００Ｈｚである、前記
（１）または（２）記載の方法、（４）低周波交流電場
の強度が、｜１０｜〜｜１００００｜（絶対値）Ｖ／ｃ
ｍである、前記（１）〜（３）いずれかに記載の方法、
（５）低周波交流電場の強度を漸増させる、前記（１）
〜（３）いずれかに記載の方法、（６）低周波交流電場
の強度を、｜１０｜Ｖ／ｃｍから｜３００｜（絶対値）
Ｖ／ｃｍまで漸増させる、前記（５）記載の方法、
（７）低周波交流電場の強度を漸増する速度が、｜１｜
〜｜１００｜（絶対値）Ｖ／ｃｍ・ｓである、前記
（５）または（６）記載の方法、（８）低周波交流電場
の周波数を漸増させる、前記（１）〜（７）記載の方
法、（９）低周波交流電場の周波数を１Ｈｚから２０Ｈ
ｚまで漸増させる、前記（８）記載の方法、（１０）低
周波交流電場の周波数を漸増する速度が０．０１〜１Ｈ
ｚ／ｓである、前記（８）または（９）記載の方法、
（１１）伸張した核酸分子を検出し、回収する工程をさ
らに含む、前記（１）〜（１０）いずれかに記載の方
法、（１２）前記（１）〜（１１）いずれかに記載の方
法により伸張されてなる核酸分子、に関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明の核酸分子の伸張方法は、
核酸分子をゲル中に配置する工程およびゲル中の核酸分
子に低周波交流電場を印加する工程を含む。ここで、核
酸分子を「伸張する」とは、高次構造（例えば、コイ
ル、屈曲構造など）を有する核酸分子を電場方向に平行
に配向させ、伸張させた状態にすることをいう。
核酸分子をゲル中に配置する工程およびゲル中の核酸分
子に低周波交流電場を印加する工程を含む。ここで、核
酸分子を「伸張する」とは、高次構造（例えば、コイ
ル、屈曲構造など）を有する核酸分子を電場方向に平行
に配向させ、伸張させた状態にすることをいう。
【０００７】本発明の伸張方法に適用される核酸分子と
しては、二本鎖ＤＮＡが挙げられ、その長さは、２３〜
５７００ｋｂｐが好ましく、４８〜２２００ｋｂｐがさ
らに好ましいが、特に、本発明の方法によれば、２２０
０〜５７００ｋｂｐのような長鎖のものに対しても適用
できる。伸張方法に適用される核酸分子の量は、１分子
観察の観点から、６．２５〜３９４ｎｇ／ｍｌが好まし
く、２０〜３９４ｎｇ／ｍｌがさらに好ましい。
しては、二本鎖ＤＮＡが挙げられ、その長さは、２３〜
５７００ｋｂｐが好ましく、４８〜２２００ｋｂｐがさ
らに好ましいが、特に、本発明の方法によれば、２２０
０〜５７００ｋｂｐのような長鎖のものに対しても適用
できる。伸張方法に適用される核酸分子の量は、１分子
観察の観点から、６．２５〜３９４ｎｇ／ｍｌが好まし
く、２０〜３９４ｎｇ／ｍｌがさらに好ましい。
【０００８】本発明の核酸の伸張方法に使用されるゲル
としては、アガロースゲル、アクリルアミドゲル等の核
酸分子を導入することができるものであれば、いかなる
ものであってもよい。使用するゲル濃度は、ゲル構造保
持の観点から、０．５〜３．０重量％が好ましく、０．
５〜２．５重量％がさらに好ましく、１．０〜２．０重
量％が特に好ましい。使用されるゲルの大きさは、特に
限定されることなく適宜決められるが、一般には、１〜
１００ｍｍ×１〜１００ｍｍ×１〜１００ｍｍのゲルが
使用される。
としては、アガロースゲル、アクリルアミドゲル等の核
酸分子を導入することができるものであれば、いかなる
ものであってもよい。使用するゲル濃度は、ゲル構造保
持の観点から、０．５〜３．０重量％が好ましく、０．
５〜２．５重量％がさらに好ましく、１．０〜２．０重
量％が特に好ましい。使用されるゲルの大きさは、特に
限定されることなく適宜決められるが、一般には、１〜
１００ｍｍ×１〜１００ｍｍ×１〜１００ｍｍのゲルが
使用される。
【０００９】ゲル中の核酸分子に低周波交流電場を印加
する工程では、一般に緩衝液を使用することが好まし
く、例えば、ＴＢＥ（トリス−ホウ酸、ＥＤＴＡ）、Ｔ
Ｂ（トリス−ホウ酸）、ＴＡＥ（トリス−酢酸、ＥＤＴ
Ａ）、ＦＩＳＨ用バッファーＳＳＣ（塩化ナトリウム−
クエン酸ナトリウム）、変性用バッファー（ホルムアミ
ド−ＳＳＣ、硫酸デキストラン−ホルムアミド−ＳＳ）
等の緩衝液が使用される。
する工程では、一般に緩衝液を使用することが好まし
く、例えば、ＴＢＥ（トリス−ホウ酸、ＥＤＴＡ）、Ｔ
Ｂ（トリス−ホウ酸）、ＴＡＥ（トリス−酢酸、ＥＤＴ
Ａ）、ＦＩＳＨ用バッファーＳＳＣ（塩化ナトリウム−
クエン酸ナトリウム）、変性用バッファー（ホルムアミ
ド−ＳＳＣ、硫酸デキストラン−ホルムアミド−ＳＳ）
等の緩衝液が使用される。
【００１０】核酸分子をゲル中に配置する手段として
は、例えば、サンプルとするＤＮＡが溶液である場合に
は、サンプル溶液をＤＮＡ伸張用ゲルにあらかじめ作成
したウェルに滴下し、直流電場によりＤＮＡ伸張用ゲル
に導入する方法等が挙げられ、サンプルとするＤＮＡが
ゲルプラグ中に包含されている場合には、ゲルプラグ周
辺にＤＮＡ伸張用ゲルを作製し、直流電場によりＤＮＡ
伸張用ゲルに導入する方法等が挙げられる。
は、例えば、サンプルとするＤＮＡが溶液である場合に
は、サンプル溶液をＤＮＡ伸張用ゲルにあらかじめ作成
したウェルに滴下し、直流電場によりＤＮＡ伸張用ゲル
に導入する方法等が挙げられ、サンプルとするＤＮＡが
ゲルプラグ中に包含されている場合には、ゲルプラグ周
辺にＤＮＡ伸張用ゲルを作製し、直流電場によりＤＮＡ
伸張用ゲルに導入する方法等が挙げられる。
【００１１】本発明において、「低周波交流電場」と
は、１〜１００Ｈｚの周波数をもつ正弦波、矩形波、三
角波等の＋方向と−方向への電圧の印加において、その
波形と強度の等しい電場をいう。低周波交流電場は、例
えば、慣用の周波発生器を用いることにより発生させる
ことができる。
は、１〜１００Ｈｚの周波数をもつ正弦波、矩形波、三
角波等の＋方向と−方向への電圧の印加において、その
波形と強度の等しい電場をいう。低周波交流電場は、例
えば、慣用の周波発生器を用いることにより発生させる
ことができる。
【００１２】低周波交流電場の周波数は、ＤＮＡとゲル
との絡み合い効果を引出し、効果的にＤＮＡを駆動する
観点から、１〜１００Ｈｚが好ましく、１〜２０Ｈｚが
さらに好ましく、５〜１５Ｈｚが特に好ましい。
との絡み合い効果を引出し、効果的にＤＮＡを駆動する
観点から、１〜１００Ｈｚが好ましく、１〜２０Ｈｚが
さらに好ましく、５〜１５Ｈｚが特に好ましい。
【００１３】低周波交流電場の強度は、ＤＮＡとゲルと
の絡み合い効果を引出し、効果的にＤＮＡを駆動させる
観点から、｜１０｜〜｜１００００｜Ｖ／ｃｍが好まし
く、｜１０｜〜｜１０００｜Ｖ／ｃｍがさらに好まし
く、｜１０｜〜｜４５０｜Ｖ／ｃｍがさらに好ましく、
｜２００｜〜｜３００｜Ｖ／ｃｍが特に好ましい。
の絡み合い効果を引出し、効果的にＤＮＡを駆動させる
観点から、｜１０｜〜｜１００００｜Ｖ／ｃｍが好まし
く、｜１０｜〜｜１０００｜Ｖ／ｃｍがさらに好まし
く、｜１０｜〜｜４５０｜Ｖ／ｃｍがさらに好ましく、
｜２００｜〜｜３００｜Ｖ／ｃｍが特に好ましい。
【００１４】伸張対象の核酸分子が５００ｋｂｐを越え
る長さを有する長鎖ＤＮＡである場合には、ＤＮＡ分子
とゲル繊維との不可逆的な絡み合いを防ぐ観点から、低
周波交流電場の強度を低強度から増加させる方が好まし
い。
る長さを有する長鎖ＤＮＡである場合には、ＤＮＡ分子
とゲル繊維との不可逆的な絡み合いを防ぐ観点から、低
周波交流電場の強度を低強度から増加させる方が好まし
い。
【００１５】この場合、低周波交流電場の強度は、ＤＮ
Ａ分子とゲル繊維との不可逆的な絡み合いを防ぐ観点か
ら、｜１００｜Ｖ／ｃｍから｜３００｜Ｖ／ｃｍまで漸
増させることが好ましく、｜５０｜Ｖ／ｃｍから｜３０
０｜Ｖ／ｃｍまで漸増させることがさらに好ましく、｜
１０｜Ｖ／ｃｍから｜３００｜Ｖ／ｃｍまで漸増させる
ことが特に好ましい。
Ａ分子とゲル繊維との不可逆的な絡み合いを防ぐ観点か
ら、｜１００｜Ｖ／ｃｍから｜３００｜Ｖ／ｃｍまで漸
増させることが好ましく、｜５０｜Ｖ／ｃｍから｜３０
０｜Ｖ／ｃｍまで漸増させることがさらに好ましく、｜
１０｜Ｖ／ｃｍから｜３００｜Ｖ／ｃｍまで漸増させる
ことが特に好ましい。
【００１６】低周波交流電場の強度の漸増速度は、ＤＮ
Ａ分子とゲル繊維との不可逆的な絡み合いを防ぐ観点か
ら、｜１｜〜｜１００｜Ｖ／ｃｍ・ｓが好ましく、｜５
｜〜｜１００｜Ｖ／ｃｍ・ｓがさらに好ましく、｜１０
｜〜｜１００｜Ｖ／ｃｍ・ｓが特に好ましい。
Ａ分子とゲル繊維との不可逆的な絡み合いを防ぐ観点か
ら、｜１｜〜｜１００｜Ｖ／ｃｍ・ｓが好ましく、｜５
｜〜｜１００｜Ｖ／ｃｍ・ｓがさらに好ましく、｜１０
｜〜｜１００｜Ｖ／ｃｍ・ｓが特に好ましい。
【００１７】伸張対象の核酸分子が、５００ｋｂｐを越
える長さを有する長鎖ＤＮＡである場合には、ＤＮＡ分
子とゲル繊維との不可逆的な絡み合いを防ぐ観点から、
低周波交流電場の周波数を漸増させて印加することが好
ましい。
える長さを有する長鎖ＤＮＡである場合には、ＤＮＡ分
子とゲル繊維との不可逆的な絡み合いを防ぐ観点から、
低周波交流電場の周波数を漸増させて印加することが好
ましい。
【００１８】この場合、低周波交流電場の周波数は、Ｄ
ＮＡ分子とゲル繊維との不可逆的な絡み合いを防ぐ観点
から、１Ｈｚから２０Ｈｚまで漸増させることが好まし
く、１Ｈｚから１０Ｈｚまで漸増させることが特に好ま
しい。
ＮＡ分子とゲル繊維との不可逆的な絡み合いを防ぐ観点
から、１Ｈｚから２０Ｈｚまで漸増させることが好まし
く、１Ｈｚから１０Ｈｚまで漸増させることが特に好ま
しい。
【００１９】低周波交流電場の周波数の漸増速度は、Ｄ
ＮＡ分子とゲル繊維との不可逆的な絡み合いを防ぐ観点
から、０．０１〜１Ｈｚ／ｓが好ましく、０．０１〜
０．５Ｈｚ／ｓがさらに好ましく、０．０１〜０．１Ｈ
ｚ／ｓが特に好ましい。
ＮＡ分子とゲル繊維との不可逆的な絡み合いを防ぐ観点
から、０．０１〜１Ｈｚ／ｓが好ましく、０．０１〜
０．５Ｈｚ／ｓがさらに好ましく、０．０１〜０．１Ｈ
ｚ／ｓが特に好ましい。
【００２０】本発明の核酸分子の伸張方法を行なう際に
は、ゲルの融解を防ぐ観点から、全操作を０〜８０℃、
好ましくは１０〜３５℃、より好ましくは１５〜２５℃
で行なうことが望ましい。
は、ゲルの融解を防ぐ観点から、全操作を０〜８０℃、
好ましくは１０〜３５℃、より好ましくは１５〜２５℃
で行なうことが望ましい。
【００２１】本発明の核酸分子の伸張方法は、ゲル中に
核酸分子を配置し、ゲル中の核酸分子に低周波交流電場
を印加して核酸分子を伸張させた後に、伸張した核酸分
子を検出し、回収する工程をさらに含む。
核酸分子を配置し、ゲル中の核酸分子に低周波交流電場
を印加して核酸分子を伸張させた後に、伸張した核酸分
子を検出し、回収する工程をさらに含む。
【００２２】核酸分子の伸張状態を観察する手段として
は、倒立型蛍光顕微鏡、正立型蛍光顕微鏡、レーザー共
焦点顕微鏡等が挙げられる。
は、倒立型蛍光顕微鏡、正立型蛍光顕微鏡、レーザー共
焦点顕微鏡等が挙げられる。
【００２３】核酸分子を検出する手段としては、レーザ
ー誘起蛍光検出器、紫外・可視部吸収検出、蛍光検出、
示差屈折率検出、熱光学的検出、円二色性検出、電気化
学的検出、電気伝導度検出等が挙げられる。
ー誘起蛍光検出器、紫外・可視部吸収検出、蛍光検出、
示差屈折率検出、熱光学的検出、円二色性検出、電気化
学的検出、電気伝導度検出等が挙げられる。
【００２４】伸張した核酸分子を回収する手段として
は、（１）ゲルの再融解、（２）ゲルの状態のまま回
収、（３）伸張した核酸分子を含むゲルの周辺に新たな
ゲルを調製し、電気泳動的手法により新たなゲルに回収
する、（４）ゲルを酵素的、化学的に切断した後、電気
泳動的手法により回収する等の方法が挙げられ、これら
は慣用の方法により行われる。
は、（１）ゲルの再融解、（２）ゲルの状態のまま回
収、（３）伸張した核酸分子を含むゲルの周辺に新たな
ゲルを調製し、電気泳動的手法により新たなゲルに回収
する、（４）ゲルを酵素的、化学的に切断した後、電気
泳動的手法により回収する等の方法が挙げられ、これら
は慣用の方法により行われる。
【００２５】本発明はさらに、本発明の伸張方法により
伸張された核酸分子に関する。かかる核酸分子は、たっ
た１つのＤＮＡ分子からその情報を読みとる１分子ゲノ
ム解析技術、またそのような１分子ゲノム解析技術の開
発にも有効に使用される。
伸張された核酸分子に関する。かかる核酸分子は、たっ
た１つのＤＮＡ分子からその情報を読みとる１分子ゲノ
ム解析技術、またそのような１分子ゲノム解析技術の開
発にも有効に使用される。
【００２６】
【実施例】実施例に先立ち、下記の装置を準備し、各実
施例で使用した。
施例で使用した。
【００２７】図１に示すように倒立型蛍光顕微鏡上の電
気泳動用ミニチュアセルをＤＮＡ分子の挙動の直接的な
観察のために使用した。２つのＰｔ電極をミニチュアセ
ル上に１ｃｍまたは０．５ｃｍの距離をおいて配置し
た。任意波形発生装置（１９４２，エヌエフ回路設計ブ
ロック）により生成する交流電場を、高速電力増幅双極
性パワーサプライ（４０２０，エヌエフ回路設計ブロッ
ク）により適切な強度に増強し、Ｐｔ電極間に印加し
た。１００倍油浸対物レンズ（Ｐｌａｎ−ＮＥＯＦＬＵ
ＡＲ、Ｎ．Ａ．＝１．３）および高圧水銀ランプを備え
た倒立型蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ １３５ＴＶ、
Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を用いた。蛍光イメージを、Ｓ
ＩＴ（シリコン増感標的）カメラ（Ｃ２４００−０８、
浜松ホトニクス）を用いて観察した。ＤＮＡのイメージ
および電場の電圧を、イメージキャプチャーボード（ひ
まわり、株式会社ライブラリー）によりパーソナルコン
ピュータのメモリーに直接記録した。ＤＮＡ分子の最大
径および重心を、イメージプロセシングソフトウェア
（Ｃｏｓｍｏｓ３２，株式会社ライブラリー）により計
算した。
気泳動用ミニチュアセルをＤＮＡ分子の挙動の直接的な
観察のために使用した。２つのＰｔ電極をミニチュアセ
ル上に１ｃｍまたは０．５ｃｍの距離をおいて配置し
た。任意波形発生装置（１９４２，エヌエフ回路設計ブ
ロック）により生成する交流電場を、高速電力増幅双極
性パワーサプライ（４０２０，エヌエフ回路設計ブロッ
ク）により適切な強度に増強し、Ｐｔ電極間に印加し
た。１００倍油浸対物レンズ（Ｐｌａｎ−ＮＥＯＦＬＵ
ＡＲ、Ｎ．Ａ．＝１．３）および高圧水銀ランプを備え
た倒立型蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ １３５ＴＶ、
Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を用いた。蛍光イメージを、Ｓ
ＩＴ（シリコン増感標的）カメラ（Ｃ２４００−０８、
浜松ホトニクス）を用いて観察した。ＤＮＡのイメージ
および電場の電圧を、イメージキャプチャーボード（ひ
まわり、株式会社ライブラリー）によりパーソナルコン
ピュータのメモリーに直接記録した。ＤＮＡ分子の最大
径および重心を、イメージプロセシングソフトウェア
（Ｃｏｓｍｏｓ３２，株式会社ライブラリー）により計
算した。
【００２８】実施例１
１５．５ｐｇのＴ４ＤＮＡ（１６５．６ｋｂｐ，ニッポ
ンジーン社製）を、蛍光色素、ＹＯＹＯ−１（モルキュ
ラープローブ株式会社製）で染色し、０．５×ＴＢＥ緩
衝液中の１．０重量％アガロースゲル（Ａｇａｒｏｓｅ
ＮＡ，アマシャムファルマシアバイオテク社製）（５
ｍｍ×５ｍｍ×２ｍｍ）に定常電場下（５Ｖ／ｃｍ）で
５分間かけて注入した。ＤＮＡ観察の前にゲル中から酸
素を除去するために、アガロースゲルを４％（ｖ／ｖ）
２−メルカプトエタノール、２．３ｍｇ／ｍｌグルコー
ス、０．１ｍｇ／ｍｌグルコースオキシダーゼ、および
０．０１８ｍｇ／ｍｌカタラーゼを含有する溶液に供し
た。
ンジーン社製）を、蛍光色素、ＹＯＹＯ−１（モルキュ
ラープローブ株式会社製）で染色し、０．５×ＴＢＥ緩
衝液中の１．０重量％アガロースゲル（Ａｇａｒｏｓｅ
ＮＡ，アマシャムファルマシアバイオテク社製）（５
ｍｍ×５ｍｍ×２ｍｍ）に定常電場下（５Ｖ／ｃｍ）で
５分間かけて注入した。ＤＮＡ観察の前にゲル中から酸
素を除去するために、アガロースゲルを４％（ｖ／ｖ）
２−メルカプトエタノール、２．３ｍｇ／ｍｌグルコー
ス、０．１ｍｇ／ｍｌグルコースオキシダーゼ、および
０．０１８ｍｇ／ｍｌカタラーゼを含有する溶液に供し
た。
【００２９】図２Ａ）は、Ｔ４ＤＮＡ分子を伸張する蛍
光イメージを示す。ここで、ＡＣ電場（１０Ｈｚ、２０
０Ｖ／ｃｍ）を時間０秒から７０秒間印加した。図２
Ｂ）は、ＤＮＡの最大径［Ｒ1 （μｍ）］における変化
を示す。ここで、最大径とは、対象となるＤＮＡ蛍光像
の重心を通る径のうち、最長のものをいう。図２Ｂ）に
示されるように、Ｒ1 は、徐々に増大し、約２０秒後に
漸近値に達した。ここで、Ｒ1 の値は４０μｍ付近を変
動し、一方、２本鎖のＴ４ＤＮＡ分子の自然長は約５５
μｍである。アガロースゲルの細孔サイズの不均一性の
ために、ＤＮＡ分子は、ときどき、かかる中間状態で図
２Ｂ）の１０秒付近でトラップされた。アガロースゲル
中での伸張プロセスの間、ＤＮＡ分子は、この中間状態
でのトラッピングと、脱出とを繰り返した。この試行の
後、ＤＮＡ分子は、最大径の漸近値に到達するための効
果的なアガロースゲル中のパスを見出し得た。
光イメージを示す。ここで、ＡＣ電場（１０Ｈｚ、２０
０Ｖ／ｃｍ）を時間０秒から７０秒間印加した。図２
Ｂ）は、ＤＮＡの最大径［Ｒ1 （μｍ）］における変化
を示す。ここで、最大径とは、対象となるＤＮＡ蛍光像
の重心を通る径のうち、最長のものをいう。図２Ｂ）に
示されるように、Ｒ1 は、徐々に増大し、約２０秒後に
漸近値に達した。ここで、Ｒ1 の値は４０μｍ付近を変
動し、一方、２本鎖のＴ４ＤＮＡ分子の自然長は約５５
μｍである。アガロースゲルの細孔サイズの不均一性の
ために、ＤＮＡ分子は、ときどき、かかる中間状態で図
２Ｂ）の１０秒付近でトラップされた。アガロースゲル
中での伸張プロセスの間、ＤＮＡ分子は、この中間状態
でのトラッピングと、脱出とを繰り返した。この試行の
後、ＤＮＡ分子は、最大径の漸近値に到達するための効
果的なアガロースゲル中のパスを見出し得た。
【００３０】実施例２
ＤＮＡ分子の伸張に対する電場の周波数の影響を解析し
た。種々の周波数の電場を印加した以外は、実施例１と
同様の条件下でＴ４ＤＮＡ分子を伸張させた。結果を図
３に示す。図３は、電場の周波数の関数としての平均最
大径［Ｒ1 （μｍ）］を示す。図３では、黒丸は、各周
波数（１，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１
３，１５，２０，３０，４０，５０，７５，１００Ｈ
ｚ）における１〜５個の異なる分子での１０秒間につい
て時間平均した後、分子間で平均したＲ1 を示し、白丸
は、２秒（０．１Ｈｚ）および７秒（０．５Ｈｚ）につ
いて時間平均した後、分子間で平均したＲ1 を示す。
た。種々の周波数の電場を印加した以外は、実施例１と
同様の条件下でＴ４ＤＮＡ分子を伸張させた。結果を図
３に示す。図３は、電場の周波数の関数としての平均最
大径［Ｒ1 （μｍ）］を示す。図３では、黒丸は、各周
波数（１，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１
３，１５，２０，３０，４０，５０，７５，１００Ｈ
ｚ）における１〜５個の異なる分子での１０秒間につい
て時間平均した後、分子間で平均したＲ1 を示し、白丸
は、２秒（０．１Ｈｚ）および７秒（０．５Ｈｚ）につ
いて時間平均した後、分子間で平均したＲ1 を示す。
【００３１】ゲル中でのＤＮＡ分子の運動はポリマー溶
液中で観察されたような領域（例えば、直線状運動、反
共鳴、伸張、配向）に周波数を分類しえないが、運動中
のＤＮＡ分子の平均最大径Ｒ1 と重心のｘ成分Ｇx を用
いて図３の周波数領域を特徴づけることができる。Ｇx
の変動レベルが、時間平均したＲ1 よりも小さい場合、
ＤＮＡ分子は、アガロースゲル中でもチューブ様運動
（Ｕeda ら、（１９９７） Stretching of Long DNA u
nder Alternating Current Electric Fields ina Conce
ntrated Polymer Solution, Polymer Journal,Vol.29.N
o.12.pp1040-1043 参照）を行うことが予測される。一
方、Ｒ1 よりも大きなＧx の変動は、チューブ様運動よ
り複雑な動きを示す。
液中で観察されたような領域（例えば、直線状運動、反
共鳴、伸張、配向）に周波数を分類しえないが、運動中
のＤＮＡ分子の平均最大径Ｒ1 と重心のｘ成分Ｇx を用
いて図３の周波数領域を特徴づけることができる。Ｇx
の変動レベルが、時間平均したＲ1 よりも小さい場合、
ＤＮＡ分子は、アガロースゲル中でもチューブ様運動
（Ｕeda ら、（１９９７） Stretching of Long DNA u
nder Alternating Current Electric Fields ina Conce
ntrated Polymer Solution, Polymer Journal,Vol.29.N
o.12.pp1040-1043 参照）を行うことが予測される。一
方、Ｒ1 よりも大きなＧx の変動は、チューブ様運動よ
り複雑な動きを示す。
【００３２】図４Ａ）、Ｂ）およびＣ）は、１Ｈｚ、１
０Ｈｚおよび１００Ｈｚ（２００Ｖ／ｃｍ）それぞれの
周波数でのＲ1 およびＧx の時間経過を示す。ここで、
Ｇxは、時間平均がゼロになるように再計算されてい
る。１Ｈｚの場合、Ｒ1 およびＧx の両方が、平均値付
近を変動する。Ｇx は、外部電場と単純に相関し、一
方、Ｒ1 は、図４Ａ）に示されるようなより複雑な様式
で変動する。１０Ｈｚの場合、Ｒ1 およびＧx の両方
が、図４Ｂ）に示されるように一定である。ＤＮＡ分子
は、この条件で伸張するが、その位置は変化しない。１
００Ｈｚの場合、Ｒ1およびＧx の両方が、図４Ｃ）に
示されるように一定である。この条件において、ＤＮＡ
分子は配向するが、伸張しない。低周波数（０．１Ｈｚ
付近）において、ＤＮＡ分子の直線状運動はアガロース
ゲルでは現れない。このように、平均最大径Ｒ1 は１０
Ｈｚ付近で最大値を有することが理解される。
０Ｈｚおよび１００Ｈｚ（２００Ｖ／ｃｍ）それぞれの
周波数でのＲ1 およびＧx の時間経過を示す。ここで、
Ｇxは、時間平均がゼロになるように再計算されてい
る。１Ｈｚの場合、Ｒ1 およびＧx の両方が、平均値付
近を変動する。Ｇx は、外部電場と単純に相関し、一
方、Ｒ1 は、図４Ａ）に示されるようなより複雑な様式
で変動する。１０Ｈｚの場合、Ｒ1 およびＧx の両方
が、図４Ｂ）に示されるように一定である。ＤＮＡ分子
は、この条件で伸張するが、その位置は変化しない。１
００Ｈｚの場合、Ｒ1およびＧx の両方が、図４Ｃ）に
示されるように一定である。この条件において、ＤＮＡ
分子は配向するが、伸張しない。低周波数（０．１Ｈｚ
付近）において、ＤＮＡ分子の直線状運動はアガロース
ゲルでは現れない。このように、平均最大径Ｒ1 は１０
Ｈｚ付近で最大値を有することが理解される。
【００３３】実施例３
ＤＮＡ分子の伸張に対する電場強度の影響を解析した。
種々の電場強度を印加した以外は、実施例１と同様にし
てＴ４ＤＮＡ分子を伸張させた。結果を図５および６に
示す。図５Ａ）は、異なる電場強度（１５０Ｖ／ｃｍ、
５０Ｖ／ｃｍ、および２５０Ｖ／ｃｍ）での平均最大径
Ｒ1 およびＴ４ＤＮＡ分子の重心の水平方向成分Ｇx を
示す。図５Ｂ）は、図５Ａ）に対応する蛍光イメージを
示す。図５Ｂ）のＤＮＡの左端の明るいスポットは、コ
イル構造または曲折構造を示す。
種々の電場強度を印加した以外は、実施例１と同様にし
てＴ４ＤＮＡ分子を伸張させた。結果を図５および６に
示す。図５Ａ）は、異なる電場強度（１５０Ｖ／ｃｍ、
５０Ｖ／ｃｍ、および２５０Ｖ／ｃｍ）での平均最大径
Ｒ1 およびＴ４ＤＮＡ分子の重心の水平方向成分Ｇx を
示す。図５Ｂ）は、図５Ａ）に対応する蛍光イメージを
示す。図５Ｂ）のＤＮＡの左端の明るいスポットは、コ
イル構造または曲折構造を示す。
【００３４】図６に示されるように、ＤＮＡ分子の平均
最大径は、約３００Ｖ／ｃｍまでは外部電場の強度にほ
ぼ比例し、４００Ｖ／ｃｍ〜６００Ｖ／ｃｍまでの領域
で徐々に減少する。図６の鉛直方向の破線は、伸張領域
および非伸張領域の間の境界を示す。
最大径は、約３００Ｖ／ｃｍまでは外部電場の強度にほ
ぼ比例し、４００Ｖ／ｃｍ〜６００Ｖ／ｃｍまでの領域
で徐々に減少する。図６の鉛直方向の破線は、伸張領域
および非伸張領域の間の境界を示す。
【００３５】図７Ａ）、Ｂ）およびＣ）は、１０Ｈｚで
の平均最大径Ｒ1 およびＴ４ＤＮＡ分子の重心の水平方
向成分Ｇx の時間変化を示す。伸張領域において、Ｒ1
およびＧx の両方が、図７Ａ）およびＢ）に示されるよ
うに外部電場の周波数に関係なくわずかに変動する。１
０秒間の平均値は、それぞれ５０Ｖ／ｃｍでＲ1 ＝３
６．４±０．９（μｍ）およびＧx ＝０．０±０．７
（μｍ）であり、２００Ｖ／ｃｍでＲ1 ＝４３．６±
１．１（μｍ）およびＧx ＝０．０±２．４（μｍ）で
ある。本質的に、Ｒ1 およびＧx は、伸張領域で一定で
ある。Ｇx の変動（０．７μｍおよび２．４μｍ）は、
平均最大径よりも２０倍小さく（３６．４μｍおよび４
３．６μｍ）、ＤＮＡ分子の伸張した状態を攪乱しな
い。他方で、６００Ｖ／ｃｍの場合には、Ｒ1 およびＧ
x の両方の大きさにおける変動は、図７Ｃ）に示される
通りである。１０秒間の平均値は、Ｒ1 ＝２１．０±
４．４（μｍ）およびＧx ＝０．０±９．９（μｍ）そ
れぞれである。Ｇx （９．９μｍ）の標準偏差は、平均
最大径（２１．０μｍ）と比較して、ＤＮＡ分子の高次
構造を攪乱するのに十分に大きい。それゆえ、本発明者
らは、４５０Ｖ／ｃｍ以下の領域でのＤＮＡ挙動と４５
０Ｖ／ｃｍ以上の領域でのＤＮＡ分子挙動との質的違い
を指摘しうる。高電場（５００Ｖ／ｃｍおよび６００ｖ
／ｃｍ）において、ＤＮＡ分子は、ＤＮＡの平均最大径
に匹敵する幅広い距離を移動する。この結果として、Ｄ
ＮＡ分子の高次構造は、常にアガロースゲルの架橋点で
攪乱される。それゆえ、この領域において、ＤＮＡは、
伸張され得ない。
の平均最大径Ｒ1 およびＴ４ＤＮＡ分子の重心の水平方
向成分Ｇx の時間変化を示す。伸張領域において、Ｒ1
およびＧx の両方が、図７Ａ）およびＢ）に示されるよ
うに外部電場の周波数に関係なくわずかに変動する。１
０秒間の平均値は、それぞれ５０Ｖ／ｃｍでＲ1 ＝３
６．４±０．９（μｍ）およびＧx ＝０．０±０．７
（μｍ）であり、２００Ｖ／ｃｍでＲ1 ＝４３．６±
１．１（μｍ）およびＧx ＝０．０±２．４（μｍ）で
ある。本質的に、Ｒ1 およびＧx は、伸張領域で一定で
ある。Ｇx の変動（０．７μｍおよび２．４μｍ）は、
平均最大径よりも２０倍小さく（３６．４μｍおよび４
３．６μｍ）、ＤＮＡ分子の伸張した状態を攪乱しな
い。他方で、６００Ｖ／ｃｍの場合には、Ｒ1 およびＧ
x の両方の大きさにおける変動は、図７Ｃ）に示される
通りである。１０秒間の平均値は、Ｒ1 ＝２１．０±
４．４（μｍ）およびＧx ＝０．０±９．９（μｍ）そ
れぞれである。Ｇx （９．９μｍ）の標準偏差は、平均
最大径（２１．０μｍ）と比較して、ＤＮＡ分子の高次
構造を攪乱するのに十分に大きい。それゆえ、本発明者
らは、４５０Ｖ／ｃｍ以下の領域でのＤＮＡ挙動と４５
０Ｖ／ｃｍ以上の領域でのＤＮＡ分子挙動との質的違い
を指摘しうる。高電場（５００Ｖ／ｃｍおよび６００ｖ
／ｃｍ）において、ＤＮＡ分子は、ＤＮＡの平均最大径
に匹敵する幅広い距離を移動する。この結果として、Ｄ
ＮＡ分子の高次構造は、常にアガロースゲルの架橋点で
攪乱される。それゆえ、この領域において、ＤＮＡは、
伸張され得ない。
【００３６】実施例４
ＤＮＡ分子の伸張に対するゲル濃度の影響を解析した。
種々の濃度のアガロースゲルを用いた以外は、実施例１
と同様にしてＴ４ＤＮＡ分子を伸張させた。結果を図８
に示す。図８は、ＤＮＡの平均最大径のアガロース濃度
依存性を示す。ＤＮＡの平均最大径は、０．５〜３％ア
ガロース濃度の広範な範囲で本質的に一定である。この
濃度に対応するゲルの細孔サイズは、８００〜２６０ｎ
ｍである。低濃度（＜０．５％）では、ゲルは非常に柔
らかく、ＤＮＡ分子伸張のための実用的なゲルシステム
を作成することはできない。図８の破線は、約３．５μ
ｍを示し、同じ電場条件における５８％ショ糖溶液中で
のＴ４ＤＮＡの平均最大径である。このように、ＤＮＡ
分子は、低分子量溶液では決して伸張しないことに留意
されたい。それゆえ、ゲル繊維との絡み合い効果による
ＤＮＡ分子挙動の拘束がＤＮＡ分子伸張に必要であるこ
とを意味する。図８は、０．５％アガロースゲル（８０
０ｎｍ）の細孔サイズでさえも、チューブ様運動にＴ４
ＤＮＡの分子運動を拘束するのに十分に小さいことを示
す。
種々の濃度のアガロースゲルを用いた以外は、実施例１
と同様にしてＴ４ＤＮＡ分子を伸張させた。結果を図８
に示す。図８は、ＤＮＡの平均最大径のアガロース濃度
依存性を示す。ＤＮＡの平均最大径は、０．５〜３％ア
ガロース濃度の広範な範囲で本質的に一定である。この
濃度に対応するゲルの細孔サイズは、８００〜２６０ｎ
ｍである。低濃度（＜０．５％）では、ゲルは非常に柔
らかく、ＤＮＡ分子伸張のための実用的なゲルシステム
を作成することはできない。図８の破線は、約３．５μ
ｍを示し、同じ電場条件における５８％ショ糖溶液中で
のＴ４ＤＮＡの平均最大径である。このように、ＤＮＡ
分子は、低分子量溶液では決して伸張しないことに留意
されたい。それゆえ、ゲル繊維との絡み合い効果による
ＤＮＡ分子挙動の拘束がＤＮＡ分子伸張に必要であるこ
とを意味する。図８は、０．５％アガロースゲル（８０
０ｎｍ）の細孔サイズでさえも、チューブ様運動にＴ４
ＤＮＡの分子運動を拘束するのに十分に小さいことを示
す。
【００３７】実施例５
漸増する強度および周波数の低周波交流電場を用いてサ
ッカロミセス・セレビシエ染色体ＤＮＡ分子の伸張を行
った。サッカロミセス・セレビシエ染色体ＤＮＡ （２
２５−２，２００ｋｂｐ，バイオラッドラボラトリーズ
社製）をゲルプラグとして購入した。ゲルを剃刀で小片
（約３ｍｍ×２ｍｍ×１ｍｍ）にカットし、０．１μＭ
ＹＯＹＯ−１および４％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエ
タノールを含有する０．５×ＴＢＥ緩衝液中に４℃で１
週間、保存した。次いで、ゲル切片をミニ電気泳動セル
上の溶融したアガロース溶液中でインキュベートした。
アガロースのゲル化の後、アガロースゲルを、４％（ｖ
／ｖ）２−メルカプトエタノール、２．３ｍｇ／ｍｌグ
ルコース、０．１ｍｇ／ｍｌグルコースオキシダーゼ、
および０．０１８ｍｇ／ｍｌカタラーゼを含有する溶液
に供した。染色体ＤＮＡ分子を、１時間の定常電場（１
〜２Ｖ／ｃｍ）下でゲルプラグから伸張用アガロースゲ
ルに注入した。次いで、リザーバー中の緩衝液を新しい
緩衝液に交換し、ＤＮＡ分子伸張の実験を始めた。
ッカロミセス・セレビシエ染色体ＤＮＡ分子の伸張を行
った。サッカロミセス・セレビシエ染色体ＤＮＡ （２
２５−２，２００ｋｂｐ，バイオラッドラボラトリーズ
社製）をゲルプラグとして購入した。ゲルを剃刀で小片
（約３ｍｍ×２ｍｍ×１ｍｍ）にカットし、０．１μＭ
ＹＯＹＯ−１および４％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエ
タノールを含有する０．５×ＴＢＥ緩衝液中に４℃で１
週間、保存した。次いで、ゲル切片をミニ電気泳動セル
上の溶融したアガロース溶液中でインキュベートした。
アガロースのゲル化の後、アガロースゲルを、４％（ｖ
／ｖ）２−メルカプトエタノール、２．３ｍｇ／ｍｌグ
ルコース、０．１ｍｇ／ｍｌグルコースオキシダーゼ、
および０．０１８ｍｇ／ｍｌカタラーゼを含有する溶液
に供した。染色体ＤＮＡ分子を、１時間の定常電場（１
〜２Ｖ／ｃｍ）下でゲルプラグから伸張用アガロースゲ
ルに注入した。次いで、リザーバー中の緩衝液を新しい
緩衝液に交換し、ＤＮＡ分子伸張の実験を始めた。
【００３８】実施例１〜４から理解されるように、Ｔ４
ＤＮＡ分子の伸張の好ましい条件は、１％アガロースゲ
ル、１０Ｈｚおよび２００Ｖ／ｃｍ電場強度である。こ
の条件に加えて、電場の周波数および強度を低周波数、
低電場強度より漸増させることにより、ゲル繊維へのＤ
ＮＡ分子の不可逆的なトラップを防ぎながらサッカロミ
セス・セレビシエ染色体ＤＮＡ分子を伸張させた。まず
１Ｈｚの正弦波型交流電場（｜１００｜Ｖ／ｃｍ）を１
分間印加することにより染色体ＤＮＡ分子を概ね電場方
向に配向させた後、０．５Ｈｚ／ｓの割合で、１０Ｈｚ
まで周波数を漸増させ、同時に｜１０｜Ｖ／ｃｍ・ｓの
割合で２００Ｖ／ｃｍまで電場強度を漸増させながら正
弦波型交流電場を１分間印加することにより伸張させ
た。
ＤＮＡ分子の伸張の好ましい条件は、１％アガロースゲ
ル、１０Ｈｚおよび２００Ｖ／ｃｍ電場強度である。こ
の条件に加えて、電場の周波数および強度を低周波数、
低電場強度より漸増させることにより、ゲル繊維へのＤ
ＮＡ分子の不可逆的なトラップを防ぎながらサッカロミ
セス・セレビシエ染色体ＤＮＡ分子を伸張させた。まず
１Ｈｚの正弦波型交流電場（｜１００｜Ｖ／ｃｍ）を１
分間印加することにより染色体ＤＮＡ分子を概ね電場方
向に配向させた後、０．５Ｈｚ／ｓの割合で、１０Ｈｚ
まで周波数を漸増させ、同時に｜１０｜Ｖ／ｃｍ・ｓの
割合で２００Ｖ／ｃｍまで電場強度を漸増させながら正
弦波型交流電場を１分間印加することにより伸張させ
た。
【００３９】図９Ａ）は、サッカロミセス・セレビシエ
染色体ＤＮＡ分子（約２８５ｋｂｐ）を低周波交流電場
を用いて伸張させたときの蛍光イメージを示す。この蛍
光イメージは、３つのイメージからなり、伸張したＤＮ
Ａ分子の最大径は、約１００μｍである。図９Ｂ）は、
蛍光イメージのトレースである。図９Ｂ）の「コイル」
部分の矢印は、ＤＮＡ分子のコイル部分を示す。この部
分は完全に伸張していない。図９Ｂ）の「ベント」の矢
印は、屈曲した構造を示し、この様な構造はＤＮＡの末
端付近に現れることがある。図９Ａ）およびＢ）から、
約２８５ｋｂｐの長鎖ＤＮＡ分子が本発明の核酸分子の
伸長方法により良好に伸張されたことがわかる。
染色体ＤＮＡ分子（約２８５ｋｂｐ）を低周波交流電場
を用いて伸張させたときの蛍光イメージを示す。この蛍
光イメージは、３つのイメージからなり、伸張したＤＮ
Ａ分子の最大径は、約１００μｍである。図９Ｂ）は、
蛍光イメージのトレースである。図９Ｂ）の「コイル」
部分の矢印は、ＤＮＡ分子のコイル部分を示す。この部
分は完全に伸張していない。図９Ｂ）の「ベント」の矢
印は、屈曲した構造を示し、この様な構造はＤＮＡの末
端付近に現れることがある。図９Ａ）およびＢ）から、
約２８５ｋｂｐの長鎖ＤＮＡ分子が本発明の核酸分子の
伸長方法により良好に伸張されたことがわかる。
【００４０】
【発明の効果】本発明の核酸分子の伸張方法によれば、
より簡便に核酸分子を伸張することが可能になり、さら
に伸張させた核酸分子を回収して再利用することが可能
になるという優れた効果を奏する。
より簡便に核酸分子を伸張することが可能になり、さら
に伸張させた核酸分子を回収して再利用することが可能
になるという優れた効果を奏する。
【図１】図１は、実験装置の模式図である。２つのＰｔ
電極をミニチュアセルに１．０ｃｍまたは０．５ｃｍの
距離をもってに配置した。任意波形発生装置により生じ
た交流電場を、高速電力増幅双極性パワーサプライによ
り適切な強度に増強し、Ｐｔ電極間に印加した。
電極をミニチュアセルに１．０ｃｍまたは０．５ｃｍの
距離をもってに配置した。任意波形発生装置により生じ
た交流電場を、高速電力増幅双極性パワーサプライによ
り適切な強度に増強し、Ｐｔ電極間に印加した。
【図２】図２は、交流電場下における１％アガロースゲ
ル中のＴ４ＤＮＡの伸張プロセスを示す図である。ＹＯ
ＹＯ１で染色したＴ４ＤＮＡの連続蛍光イメージ。０秒
において、交流電場（２００Ｖ／ｃｍ，１０Ｈｚ）を水
平方向にランダムコイル様状態のＴ４ＤＮＡに印加し
た。Ｂ）交流電場を印加後のＴ４ＤＮＡ（Ａで示したも
の）の最大径Ｒ1 のプロット。
ル中のＴ４ＤＮＡの伸張プロセスを示す図である。ＹＯ
ＹＯ１で染色したＴ４ＤＮＡの連続蛍光イメージ。０秒
において、交流電場（２００Ｖ／ｃｍ，１０Ｈｚ）を水
平方向にランダムコイル様状態のＴ４ＤＮＡに印加し
た。Ｂ）交流電場を印加後のＴ４ＤＮＡ（Ａで示したも
の）の最大径Ｒ1 のプロット。
【図３】図３は、Ｔ４ＤＮＡの外部電場の周波数ｆに対
する平均最大径Ｒ1 のプロットを示す図である。各分子
の最大径Ｒ1 を１０秒間（黒丸）および約７秒間（白
丸）、１〜５個の異なる分子も各々の周波数で時間平均
した。水平方向の破線は、外部電場非存在下におけるラ
ンダムコイル様状態のＴ４ＤＮＡの平衡状態の値を示
す。
する平均最大径Ｒ1 のプロットを示す図である。各分子
の最大径Ｒ1 を１０秒間（黒丸）および約７秒間（白
丸）、１〜５個の異なる分子も各々の周波数で時間平均
した。水平方向の破線は、外部電場非存在下におけるラ
ンダムコイル様状態のＴ４ＤＮＡの平衡状態の値を示
す。
【図４】図４は、異なる外部周波数下での２００Ｖ／ｃ
ｍでのＴ４DNA の平均最大径Ｒ 1 および重心のｘ成分Ｇ
x の時系列を示す図である。濃い線は、Ｒ1 を示し、薄
い線は、Ｇx をそれぞれ示す。Ａ）１Ｈｚ。Ｂ）１０Ｈ
ｚ。Ｃ）１００Ｈｚ。
ｍでのＴ４DNA の平均最大径Ｒ 1 および重心のｘ成分Ｇ
x の時系列を示す図である。濃い線は、Ｒ1 を示し、薄
い線は、Ｇx をそれぞれ示す。Ａ）１Ｈｚ。Ｂ）１０Ｈ
ｚ。Ｃ）１００Ｈｚ。
【図５】図５は、異なる電場強度で伸張したＴ４ＤＮＡ
の平均最大径Ｒ1 および重心のｘ成分Ｇx を示す図であ
る。Ａ）１５０Ｖ／ｃｍ、５０Ｖ／ｃｍ、および２５０
Ｖ／ｃｍの電場下でのＲ1 およびＧx のプロット。Ｂ）
１５０Ｖ／ｃｍ、５０Ｖ／ｃｍ、および２５０Ｖ／ｃｍ
の電場下でのＴ４ＤＮＡの蛍光イメージ。
の平均最大径Ｒ1 および重心のｘ成分Ｇx を示す図であ
る。Ａ）１５０Ｖ／ｃｍ、５０Ｖ／ｃｍ、および２５０
Ｖ／ｃｍの電場下でのＲ1 およびＧx のプロット。Ｂ）
１５０Ｖ／ｃｍ、５０Ｖ／ｃｍ、および２５０Ｖ／ｃｍ
の電場下でのＴ４ＤＮＡの蛍光イメージ。
【図６】図６は、Ｔ４ＤＮＡの外部電場の強度に対する
平均最大径Ｒ1 のプロットを示す図である。破線は、伸
張および非伸張領域の間の境界を示す。
平均最大径Ｒ1 のプロットを示す図である。破線は、伸
張および非伸張領域の間の境界を示す。
【図７】図７は、平均最大径Ｒ1 およびＴ４ＤＮＡの重
心のｘ成分Ｇx の時系列を示す図である。濃い線は、Ｒ
1 を示し、薄い線は、Ｇx を示す。Ａ）５０Ｖ／ｃｍ、
１０Ｈｚ。Ｂ）２００Ｖ／ｃｍ、１０Ｈｚ。Ｃ）６００
Ｖ／ｃｍ、１０Ｈｚ。
心のｘ成分Ｇx の時系列を示す図である。濃い線は、Ｒ
1 を示し、薄い線は、Ｇx を示す。Ａ）５０Ｖ／ｃｍ、
１０Ｈｚ。Ｂ）２００Ｖ／ｃｍ、１０Ｈｚ。Ｃ）６００
Ｖ／ｃｍ、１０Ｈｚ。
【図８】図８は、Ｔ４ＤＮＡのアガロースゲル濃度に対
する平均最大径Ｒ1 のプロットを示す図である。破線は
低分子溶液中のＲ1 である。
する平均最大径Ｒ1 のプロットを示す図である。破線は
低分子溶液中のＲ1 である。
【図９】図９は、交流電場（２００Ｖ／ｃｍ、１０Ｈ
ｚ）下での、約２８５ｋｂｐの長さを有する、サッカロ
ミセス・セレビシエＤＮＡの伸張を示す図である。Ａ）
伸張したサッカロミセス・セレビシエ染色体ＤＮＡの蛍
光イメージ。Ｂ）蛍光イメージのトレース。
ｚ）下での、約２８５ｋｂｐの長さを有する、サッカロ
ミセス・セレビシエＤＮＡの伸張を示す図である。Ａ）
伸張したサッカロミセス・セレビシエ染色体ＤＮＡの蛍
光イメージ。Ｂ）蛍光イメージのトレース。
１ 高速電力増幅双極性パワーサプライ
２ 任意波形発生装置
３ １００倍油浸対物レンズ
４ ３０ｍｍ×４０ｍｍカバーガラス
５ Ｐｔ電極
６ アガロースゲル
７ ０．５×ＴＢＥ緩衝液
８ ＤＮＡサンプル
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Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 AA20 CA01 CA11
HA11 HA19 HA20
Claims (12)
- 【請求項１】 核酸分子をゲル中に配置する工程および
ゲル中の核酸分子に低周波交流電場を印加する工程を含
む、核酸分子の伸張方法。 - 【請求項２】 核酸分子の長さが、２３〜５７００ｋｂ
ｐである、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 低周波交流電場の周波数が、１〜１００
Ｈｚである、請求項１または２記載の方法。 - 【請求項４】 低周波交流電場の強度が、｜１０｜〜｜
１００００｜（絶対値）Ｖ／ｃｍである、請求項１〜３
いずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 低周波交流電場の強度を漸増させる、請
求項１〜３いずれかに記載の方法。 - 【請求項６】 低周波交流電場の強度を、｜１０｜Ｖ／
ｃｍから｜３００｜（絶対値）Ｖ／ｃｍまで漸増させ
る、請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 低周波交流電場の強度を漸増する速度
が、｜１｜〜｜１００｜（絶対値）Ｖ／ｃｍ・ｓであ
る、請求項５または６記載の方法。 - 【請求項８】 低周波交流電場の周波数を漸増させる、
請求項１〜７記載の方法。 - 【請求項９】 低周波交流電場の周波数を１Ｈｚから２
０Ｈｚまで漸増させる、請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 低周波交流電場の周波数を漸増する速
度が０．０１〜１Ｈｚ／ｓである、請求項８または９記
載の方法。 - 【請求項１１】 伸張した核酸分子を検出し、回収する
工程をさらに含む、請求項１〜１０いずれかに記載の方
法。 - 【請求項１２】 請求項１〜１１いずれかに記載の方法
により伸張されてなる核酸分子。
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP2001161033A JP2003018985A (ja) | 2001-05-29 | 2001-05-29 | 長鎖ｄｎａを伸張する方法 |
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|---|---|
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
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-
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- 2001-08-31 WO PCT/JP2001/007522 patent/WO2002097083A1/ja not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
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