JP3721603B2 - Ｄｎａの複製方法 - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
本発明はＤＮＡの塩基配列を決定するシーケンス法や、ＤＮＡ試料を増量するＰＣＲ（ポリメラーゼ・チエーン・リアクション）において、鋳型ＤＮＡの一部の長さにわたり又は全長にわたって複製する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
シーケンス法やＰＣＲにおけるＤＮＡの複製は、通常以下の手順で行なわれる。 （１）鋳型ＤＮＡをアルカリや熱を用いて１本鎖ＤＮＡにするディネーチャー（熱変性）工程。
（２）その一本鎖ＤＮＡにプライマーを結合させるアニーリング工程。
（３）ＤＮＡ合成酵素により、鋳型ＤＮＡの塩基配列に対し相補的な塩基配列となるように、プライマーから４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸を反応させてプライマーからＤＮＡ鎖を伸長させていく合成反応工程。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ディネーチャー工程により一本鎖になったＤＮＡは、通常の状態ではまっすぐに伸びた状態にはなっておらず、糸が丸まったような屈曲した立体的な形状になっている。そのような屈曲した形状は、アニーリング反応や合成反応を阻害する。
そこで、本発明はアニーリング反応や合成反応の工程では、１本鎖鋳型ＤＮＡを直線状に伸ばすことによって、反応速度を高めることを目的とするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
反応容器に鋳型ＤＮＡ、プライマー、４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸及び合成酵素を少なくとも含む反応溶液を収容し、所定の温度に加熱してＤＮＡを複製する方法において、本発明では一本鎖になった鋳型ＤＮＡにプライマーを結合させるアニーリング反応工程、及びプライマーからＤＮＡ鎖を伸長させる合成反応工程では、反応溶液に電界を印加して鋳型ＤＮＡを直線状にした状態で反応を行なわせる。
【０００５】
反応溶液に印加する電界は、直流又はパルス状のいずれでもよく、その大きさは電気分解を生じるような高い電圧は避け、１本鎖ＤＮＡが直線状になったのを顕微鏡で確認しながら適当な大きさに設定する。
【０００６】
【作用】
反応溶液に適当な大きさの電界を印加すると、屈曲して複雑な立体構造をとっていた１本鎖鋳型ＤＮＡが直線状になる。それにより、プライマーのアニーリング反応やその後の合成反応が進行しやすくなる。
【０００７】
【実施例】
図１に本発明を実施する装置の一例を示す。反応溶液を収容する反応容器２は円筒状で、例えば樹脂製である。反応容器２内には一対の電極４ａと４ｂが対向して配置され、両電極４ａ，４ｂ間によって所定の大きさの直流又はパルス状の電圧を印加し、反応容器２に収容された反応溶液に所定の電界を印加する。反応容器２が置かれる基台は温調ブロック８となっており、反応容器２内の反応用液を所定の温度に加熱する。制御部１０は温調ブロック８による温度制御と高電圧発生装置６による印加電圧とを制御する。
【０００８】
温調ブロック８による温度制御は、ディネーチャー、アニーリング反応及び合成反応の各工程ごとに所定の温度と時間を設定しておき、その設定した条件にしたがって反応溶液を加熱する。
制御部１０はマイクロコンピュータやパーソナルコンピュータなどを使用することができ、温調ブロック８による反応の各工程での温度と時間、高電圧発生装置６による印加電圧、及び反応の３工程を含むサイクルの繰返し回数を予め設定しておき、その設定した条件にしたがって複製反応を行なわせる。
【０００９】
この反応装置を用いてシーケンス法におけるＤＮＡ複製の方法について説明する。反応容器２には、反応溶液として鋳型ＤＮＡ、プライマー、Ａ（アデニン），Ｇ（グアニン），Ｃ（シトシン），Ｔ（チミン）の４種類の塩基のデオキシヌクレオチド三リン酸、Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔのうちの１種類の塩基のダイデオキシヌクレオチド三リン酸、合成酵素及び緩衝液などを含んでいる。その反応液に対し、制御部１０により温調ブロック８を制御して反応の各工程（ディネーチャー、アニーリング及び合成）の温度と時間と制御する。その各工程の条件は既に確立されたものであり、その一例を示すと以下のごとくである。ディネーチャー ： ９５℃， ３０秒アニーリング ： ５０〜６０℃， ３０秒合成 ： ７２℃， １分これらの各工程では、温度制御とともに、高電圧発生装置６により電極４ａ，４ｂ間に１本鎖ＤＮＡが直線状になるように設定された大きさの直流又はパルス状の電圧を印加する。
【００１０】
ＰＣＲは試料の鋳型ＤＮＡを複製して増量するものであり、反応溶液としては上記のシーケンス法における反応溶液のうちから、ダイデオキシヌクレオチド三リン酸を除いたものである。
シーケンス法ではディネーチャー、アニーリング及び合成の３工程からなるサイクルを１回のみ行なうが、ＰＣＲでは複数サイクルを繰り返す。
【００１１】
【発明の効果】
本発明ではＤＮＡの複製反応を行なわせる反応溶液中の１本鎖鋳型ＤＮＡがその反応溶液に印加された電界により直線状になるので、鋳型ＤＮＡとプライマーとのアニーリングやプライマーから塩基配列を伸長させる合成反応が円滑に行なわれるようになり、反応速度が大きくなる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明を実施する反応装置の一例を示す概略斜視図である。
【符号の説明】
２ 反応容器
４ａ，４ｂ 電極
６ 高電圧発生装置
８ 温調ブロック
１０ 制御部
Claims (1)
- 反応容器に鋳型ＤＮＡ、プライマー、４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸及び合成酵素を少なくとも含む反応溶液を収容し、所定の温度に加熱してＤＮＡを複製する方法において、
一本鎖になった鋳型ＤＮＡにプライマーを結合させるアニーリング反応工程、及びプライマーからＤＮＡ鎖を伸長させる合成反応工程では、前記反応溶液に直流又はパルス状で、電気分解を生じない大きさの電界を印加して鋳型ＤＮＡを直線状にすることを特徴とするＤＮＡの複製方法。
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| JP15866595A JP3721603B2 (ja) | 1995-05-31 | 1995-05-31 | Ｄｎａの複製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| JP15866595A JP3721603B2 (ja) | 1995-05-31 | 1995-05-31 | Ｄｎａの複製方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08322569A JPH08322569A (ja) | 1996-12-10 |
| JP3721603B2 true JP3721603B2 (ja) | 2005-11-30 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP15866595A Expired - Fee Related JP3721603B2 (ja) | 1995-05-31 | 1995-05-31 | Ｄｎａの複製方法 |
Country Status (1)
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|---|---|---|---|---|
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1995
- 1995-05-31 JP JP15866595A patent/JP3721603B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| JPH08322569A (ja) | 1996-12-10 |
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