JP2712058B2 - 絡み合ったポリマー網状構造による試料混合物中への核酸配列決定鋳型の閉じ込め - Google Patents
絡み合ったポリマー網状構造による試料混合物中への核酸配列決定鋳型の閉じ込めInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の技術分野 本発明は一般にDNAのような核酸のキャピラリー電気
泳動に関し、さらに特に試料溶液中の核酸鋳型の移動度
を制限するための試料調製技術に関するものである。
泳動に関し、さらに特に試料溶液中の核酸鋳型の移動度
を制限するための試料調製技術に関するものである。
関連技術の説明 ゲル電気泳動は大きい生体分子、例えばタンパク質、
デオキシリボ核酸（DNA）、およびリボ核酸（RNA）を分
離する有力な方法である。ゲル電気泳動では、生体分子
の混合物は選択されたゲル媒体上に置かれ、ゲルを外部
の電場にかける。ゲルを通過する生体分子の移動速度
（Ｖ）は電場（Ｅ）の強度、分子上の正味電荷（ｚ）、
および媒体の摩擦係数（ｆ）に依存する： ｖ＝Ez/f 摩擦係数は分子の質量と形状、その粘度、および媒体
の多孔度に依存する。
デオキシリボ核酸（DNA）、およびリボ核酸（RNA）を分
離する有力な方法である。ゲル電気泳動では、生体分子
の混合物は選択されたゲル媒体上に置かれ、ゲルを外部
の電場にかける。ゲルを通過する生体分子の移動速度
（Ｖ）は電場（Ｅ）の強度、分子上の正味電荷（ｚ）、
および媒体の摩擦係数（ｆ）に依存する： ｖ＝Ez/f 摩擦係数は分子の質量と形状、その粘度、および媒体
の多孔度に依存する。
ゲルは小さい粘性媒体中の小さい温度勾配によって生
じる対流を抑え、大きい分子の移動を抑える分子篩とし
て働くが、一層小さい分子がゲルの気孔を通って容易に
移動できるので、電気泳動分離を行うための好適な媒体
となっている。一般にポリアクリルアミドゲルは、化学
的に不活性であり、それらの気孔の大きさはアクリルア
ミドとメチレンビスアクリルアミド（架橋剤）の所望の
割合、および重合に使用される全モノマー濃度を選択す
ることによって制御できるので、分離を行うため選択さ
れる媒体であった。代表的にはポリアクリルアミドゲル
は、電気泳動媒体の存在で、遊離基開始剤を用い、成分
モノマーの遊離基重合化によって生じる。
じる対流を抑え、大きい分子の移動を抑える分子篩とし
て働くが、一層小さい分子がゲルの気孔を通って容易に
移動できるので、電気泳動分離を行うための好適な媒体
となっている。一般にポリアクリルアミドゲルは、化学
的に不活性であり、それらの気孔の大きさはアクリルア
ミドとメチレンビスアクリルアミド（架橋剤）の所望の
割合、および重合に使用される全モノマー濃度を選択す
ることによって制御できるので、分離を行うため選択さ
れる媒体であった。代表的にはポリアクリルアミドゲル
は、電気泳動媒体の存在で、遊離基開始剤を用い、成分
モノマーの遊離基重合化によって生じる。
タンパク質の電気泳動分離はタンパク質変性の条件下
に架橋ポリアクリルアミドゲル中で多くは行われる。例
えば、タンパク質は洗剤溶液、例えばドデシル硫酸ナト
リウム（SDS）中に溶解でき、メルカプトエタノールま
たはジチオスレイトール処理で任意のジスフィルド結合
を減らすことができる。SDSアニオンはタンパク質に２
個のアミノ酸残基に対し約１個のSDS分子の割合で結合
し、これによって大きい正味の負の電荷と嵩密度を変性
したタンパク質に与える。タンパク質−SDS複合体の電
荷と嵩密度は本来のタンパク質の質量におおよそ比例し
ている。これによってゲルマトリックス内のタンパク質
またはペプチドの置換は分子上の寸法と電荷に基づいて
分子の寸法と関係がある。核酸の場合には、おおよそ同
じ電荷密度を有し、ゲルマトリックス中の置換は一層直
接に分子の大きさと関係がある。
に架橋ポリアクリルアミドゲル中で多くは行われる。例
えば、タンパク質は洗剤溶液、例えばドデシル硫酸ナト
リウム（SDS）中に溶解でき、メルカプトエタノールま
たはジチオスレイトール処理で任意のジスフィルド結合
を減らすことができる。SDSアニオンはタンパク質に２
個のアミノ酸残基に対し約１個のSDS分子の割合で結合
し、これによって大きい正味の負の電荷と嵩密度を変性
したタンパク質に与える。タンパク質−SDS複合体の電
荷と嵩密度は本来のタンパク質の質量におおよそ比例し
ている。これによってゲルマトリックス内のタンパク質
またはペプチドの置換は分子上の寸法と電荷に基づいて
分子の寸法と関係がある。核酸の場合には、おおよそ同
じ電荷密度を有し、ゲルマトリックス中の置換は一層直
接に分子の大きさと関係がある。
電気泳動を行った複合体は通常、染料、例えばクーマ
シーブルーで染色して、あるいは分子に放射性による標
識を付ける際のオートラジオグラフィーによって視覚化
される。ゲル中の生体分子の置換はほぼ直線的に分子の
質量の対数に比例し、例外はグリコシル化タンパク質の
膜タンパク質のような種に見られる。質量で２％の小さ
い差があるタンパク質は電気泳動によって区別できる場
合が多い。
シーブルーで染色して、あるいは分子に放射性による標
識を付ける際のオートラジオグラフィーによって視覚化
される。ゲル中の生体分子の置換はほぼ直線的に分子の
質量の対数に比例し、例外はグリコシル化タンパク質の
膜タンパク質のような種に見られる。質量で２％の小さ
い差があるタンパク質は電気泳動によって区別できる場
合が多い。
迅速な高分解が可能なひとつの電気泳動技術はキャピ
ラリー電気泳動（CE）である。ひとつのCE法では、キャ
ピラリーチューブを流体の電気泳動媒体で充填し、流体
の媒体をチューブ内で架橋または温度固化し流動しない
安定な分離媒体を形成する。試料の大きな塊を静電学的
な注入によってチューブの一端に引き入れ、電場をチュ
ーブの全域に付加して試料を、媒体を介して引き出す。
代表的には、CEによって行われる生体分離には直径が約
50〜200ミクロンの内径をもち、長さが約10〜100cmまた
はそれ以上の範囲の溶解シリカキャピラリーチューブを
用いる。
ラリー電気泳動（CE）である。ひとつのCE法では、キャ
ピラリーチューブを流体の電気泳動媒体で充填し、流体
の媒体をチューブ内で架橋または温度固化し流動しない
安定な分離媒体を形成する。試料の大きな塊を静電学的
な注入によってチューブの一端に引き入れ、電場をチュ
ーブの全域に付加して試料を、媒体を介して引き出す。
代表的には、CEによって行われる生体分離には直径が約
50〜200ミクロンの内径をもち、長さが約10〜100cmまた
はそれ以上の範囲の溶解シリカキャピラリーチューブを
用いる。
分離媒体のポリマー濃度および／または架橋度は広範
囲の分子量と電荷にわたって種を分離するように変化さ
せることができる。例えば、約1,000塩基よりも大きい
核酸フラグメントを分離する際に、ひとつの好ましい温
度硬化物質はアガロースであり、アガロースの濃度は、
５〜60キロ塩基の大きさの範囲のフラグメントを分離す
るための約0.3％から、100〜3,000塩基対の範囲のフラ
グメントを分離するための約２％まで変えることができ
る。大きさが小さいフラグメント、代表的には約1,000
塩基対以下では、通常架橋ポリアクリルアミドで分離さ
れる。アクリルアミドポリマーの濃度は、100〜1,000塩
基対の範囲のフラグメントを分離するための約3.5％か
ら、10〜100塩基対の範囲で分離を行うための約20％ま
での範囲にわたる。タンパク質を分離するため、架橋ポ
リアクリルアミドの濃度は３〜20％が一般に適当であ
る。一般に、分割すべき分子種が小さいほど、必要な架
橋ポリマーの濃度は高い。
囲の分子量と電荷にわたって種を分離するように変化さ
せることができる。例えば、約1,000塩基よりも大きい
核酸フラグメントを分離する際に、ひとつの好ましい温
度硬化物質はアガロースであり、アガロースの濃度は、
５〜60キロ塩基の大きさの範囲のフラグメントを分離す
るための約0.3％から、100〜3,000塩基対の範囲のフラ
グメントを分離するための約２％まで変えることができ
る。大きさが小さいフラグメント、代表的には約1,000
塩基対以下では、通常架橋ポリアクリルアミドで分離さ
れる。アクリルアミドポリマーの濃度は、100〜1,000塩
基対の範囲のフラグメントを分離するための約3.5％か
ら、10〜100塩基対の範囲で分離を行うための約20％ま
での範囲にわたる。タンパク質を分離するため、架橋ポ
リアクリルアミドの濃度は３〜20％が一般に適当であ
る。一般に、分割すべき分子種が小さいほど、必要な架
橋ポリマーの濃度は高い。
上記タイプの固化電気泳動で得られる分解は、小さい
分子量の種の場合には、電気泳動チューブ内、特にキャ
ピラリーチューブ内では高いポリマー濃度で、均質な均
一ポリマーマトリックスを形成することが難しいので限
られていた。チューブ内で高濃度固化マトリックスを形
成するためのひとつの一般方法は、非架橋の低粘度形態
では、高濃度ポリマー溶液をチューブ内に流動形態で導
入する。次に流動物質を、例えば、過硫酸塩と架橋材の
存在で光照射して架橋させる。
分子量の種の場合には、電気泳動チューブ内、特にキャ
ピラリーチューブ内では高いポリマー濃度で、均質な均
一ポリマーマトリックスを形成することが難しいので限
られていた。チューブ内で高濃度固化マトリックスを形
成するためのひとつの一般方法は、非架橋の低粘度形態
では、高濃度ポリマー溶液をチューブ内に流動形態で導
入する。次に流動物質を、例えば、過硫酸塩と架橋材の
存在で光照射して架橋させる。
高いポリマー濃度で、チューブ内に形成された重合化
反応熱グラジエントは、マトリックスの不均質を導く不
均一な反応速度と熱乱流を生じる傾向がある。また、架
橋反応中に生じた閉じ込められた気泡はマトリックス全
体に空隙を生成する。マトリックス中の非均一性は、特
に密接に関連した小さい分子量の種の間に達成される分
解度を制限する。これらの問題は高圧でゲル物質を重合
することによって解決することができる。しかしなが
ら、キャピラリーゲル内に制限された圧力を生成するこ
とは難しい技術の問題を導く。
反応熱グラジエントは、マトリックスの不均質を導く不
均一な反応速度と熱乱流を生じる傾向がある。また、架
橋反応中に生じた閉じ込められた気泡はマトリックス全
体に空隙を生成する。マトリックス中の非均一性は、特
に密接に関連した小さい分子量の種の間に達成される分
解度を制限する。これらの問題は高圧でゲル物質を重合
することによって解決することができる。しかしなが
ら、キャピラリーゲル内に制限された圧力を生成するこ
とは難しい技術の問題を導く。
温度固化ゲルの場合には、ポリマーは流動形態で電気
泳動チューブに導かれ、次いでチューブ内で冷却してゲ
ルを固体形態にする。しかしながら、このアプローチは
一般に、必要な温度固化凝固性質を持つことが知られて
いる寒天やアガロースのようなポリマーは、高ポリマー
濃度でさえも、低分子量の種を分別するために有効では
ないので、小さいペプチドやオリゴヌクレオチドのよう
な低分子量の種を分別するためには一般に適さない。
泳動チューブに導かれ、次いでチューブ内で冷却してゲ
ルを固体形態にする。しかしながら、このアプローチは
一般に、必要な温度固化凝固性質を持つことが知られて
いる寒天やアガロースのようなポリマーは、高ポリマー
濃度でさえも、低分子量の種を分別するために有効では
ないので、小さいペプチドやオリゴヌクレオチドのよう
な低分子量の種を分別するためには一般に適さない。
架橋したまたは温度固化したマトリックスと関連した
第２の限界は架橋したゲルマトリックスをゲル支持体か
ら除去することが難しいことである。キャピラリーチュ
ーブ支持体の場合には、これはゲル内の分離した物質の
回収を妨げ、またキャピラリーチューブの再使用を妨げ
る。
第２の限界は架橋したゲルマトリックスをゲル支持体か
ら除去することが難しいことである。キャピラリーチュ
ーブ支持体の場合には、これはゲル内の分離した物質の
回収を妨げ、またキャピラリーチューブの再使用を妨げ
る。
キャピラリー電気泳動システムに用いられるゲルマト
リックスは、歴史的に一般にアガロースゲルまたは架橋
ポリマーマトリックス、例えば架橋ポリアクリルアミド
マトリックスのような固体ゲルであった。このようなゲ
ルは気泡や空隙なしでキャピラリーチューブ内に導くこ
とは難しく、一般にチューブの再使用を妨げる。さらに
最近は、分離媒体としてポリマー溶液を用いるキャピラ
リー電気泳動システムが開示された。「対向移動キャピ
ラリー電気泳動による核酸分離」と題する米国特許第5,
096,554号は、ゲル内のDNA移動の方向とは反対方向に電
気泳動流によってそれ自体がチューブを移動するポリマ
ー溶液中にDNA分離が起こる電気泳動システムを記載し
ている。「高粘度ポリマーマトリックスおよび方法」に
ついて別の共有の米国特許第5,164,055号は、キャピラ
リー電気泳動における架橋ゲルマトリックスについて代
替マトリックスとして粘弾性ポリマー溶液の使用を開示
する。「キャピラリー電気泳動用の低粘度ポリマー溶
液」と題する別の共有の米国特許第5,126,021号は、選
択されたメッシュ寸法と低い溶液粘度をもつ低粘度ポリ
マー溶液を含むキャピラリー電気泳動チューブを開示す
る。メッシュ寸法は、一本鎖オリゴヌクレオチドを分離
するため、50〜100オングストロームから、比較的大き
い二本鎖DNAフラグメントまたはタンパク質を分離する
ための300オングストロームまでまたはそれ以上の範囲
であることができる。1993年１月21日に出願された、別
の共有の米国特許出願第08/003,968号は線状ポリアクリ
ルアミドの低粘度溶液を用いるキャピラリー電気泳動に
基づくDNA配列決定法を開示している。1993年12月17日
に出願された別の共有の米国特許第08/170,078号はDNA
配列決定に有用な壁被覆剤および篩わけ剤として働く低
粘度ポリマー組成物を開示している。これらの特許およ
び共有特許出願はここにそのまま参照文献として組み込
まれる。
リックスは、歴史的に一般にアガロースゲルまたは架橋
ポリマーマトリックス、例えば架橋ポリアクリルアミド
マトリックスのような固体ゲルであった。このようなゲ
ルは気泡や空隙なしでキャピラリーチューブ内に導くこ
とは難しく、一般にチューブの再使用を妨げる。さらに
最近は、分離媒体としてポリマー溶液を用いるキャピラ
リー電気泳動システムが開示された。「対向移動キャピ
ラリー電気泳動による核酸分離」と題する米国特許第5,
096,554号は、ゲル内のDNA移動の方向とは反対方向に電
気泳動流によってそれ自体がチューブを移動するポリマ
ー溶液中にDNA分離が起こる電気泳動システムを記載し
ている。「高粘度ポリマーマトリックスおよび方法」に
ついて別の共有の米国特許第5,164,055号は、キャピラ
リー電気泳動における架橋ゲルマトリックスについて代
替マトリックスとして粘弾性ポリマー溶液の使用を開示
する。「キャピラリー電気泳動用の低粘度ポリマー溶
液」と題する別の共有の米国特許第5,126,021号は、選
択されたメッシュ寸法と低い溶液粘度をもつ低粘度ポリ
マー溶液を含むキャピラリー電気泳動チューブを開示す
る。メッシュ寸法は、一本鎖オリゴヌクレオチドを分離
するため、50〜100オングストロームから、比較的大き
い二本鎖DNAフラグメントまたはタンパク質を分離する
ための300オングストロームまでまたはそれ以上の範囲
であることができる。1993年１月21日に出願された、別
の共有の米国特許出願第08/003,968号は線状ポリアクリ
ルアミドの低粘度溶液を用いるキャピラリー電気泳動に
基づくDNA配列決定法を開示している。1993年12月17日
に出願された別の共有の米国特許第08/170,078号はDNA
配列決定に有用な壁被覆剤および篩わけ剤として働く低
粘度ポリマー組成物を開示している。これらの特許およ
び共有特許出願はここにそのまま参照文献として組み込
まれる。
さらに最近、粘性の電気泳動ポリマー媒体が開発さ
れ、これはキャピラリーチューブから容易に除去される
安定化ゲルであり、水性媒体中で集塊の規則正しい交互
共重合体とマトリックスからなる。この共重合体は、親
水性のポリマーセグメントによって規則正しく繰り返す
間隔で互いにスペースを入れて収容される複数の疎水性
ポリマーセグメント中に実質的に一様なセグメント結合
を有する親水性ポリマーセグメントからなる。この媒体
の特徴は、１）一定の分子の大きさの範囲で生体ポリマ
ー分子の高分解電気泳動分離を行うための媒体の能力；
および２）共重合体の水性分散の粘度の著しい上昇が認
められる共重合体の濃度によって画定される共重合の凝
集遷移濃度を越える共重合体濃度にある。どのように疎
水性ポリマー鎖が配列されているかによって、この共重
合体はコームまたはタフト構造、ブロック構造、または
スター構造をもつことができる。この粘性の電気泳動ポ
リマー媒体は1992年９月24日に出願された共有の米国特
許出願第07/950,863号にさらに詳しく記載されており、
ここにその全体が参照文献として組み込まれる。
れ、これはキャピラリーチューブから容易に除去される
安定化ゲルであり、水性媒体中で集塊の規則正しい交互
共重合体とマトリックスからなる。この共重合体は、親
水性のポリマーセグメントによって規則正しく繰り返す
間隔で互いにスペースを入れて収容される複数の疎水性
ポリマーセグメント中に実質的に一様なセグメント結合
を有する親水性ポリマーセグメントからなる。この媒体
の特徴は、１）一定の分子の大きさの範囲で生体ポリマ
ー分子の高分解電気泳動分離を行うための媒体の能力；
および２）共重合体の水性分散の粘度の著しい上昇が認
められる共重合体の濃度によって画定される共重合の凝
集遷移濃度を越える共重合体濃度にある。どのように疎
水性ポリマー鎖が配列されているかによって、この共重
合体はコームまたはタフト構造、ブロック構造、または
スター構造をもつことができる。この粘性の電気泳動ポ
リマー媒体は1992年９月24日に出願された共有の米国特
許出願第07/950,863号にさらに詳しく記載されており、
ここにその全体が参照文献として組み込まれる。
核酸標的、鋳型および、DNA伸長生成物のような部分
配列核酸フラグメント分析物、を含む液状核酸配列決定
試料混合物を、上記のようなアガロースゲルまたはポリ
マーゲルのようなゲル媒体で充填したキャピラリー電気
泳動チューブに動電学的に装填することは、分析物の試
料をキャピラリー電気泳動チューブに導入する好ましい
方法である。動電学的装填は分析物を優先的に導入し、
従って、実質的に、試料を濃縮する。しかしながら、キ
ャピラリー電気泳動媒体に導入された分析物の分量は、
キャピラリーチューブ中のCE媒体の注入端表面に核酸鋳
型が蓄積して制限される。この鋳型の蓄積は、これらの
大きな生体分子でキャピラリーチューブの端部を詰まら
せ、追加の分析物の媒体への通過を妨げる。この現象は
注入して電気泳動することができる部分配列のフラグメ
ントの最大量を効果的に制限する。
配列核酸フラグメント分析物、を含む液状核酸配列決定
試料混合物を、上記のようなアガロースゲルまたはポリ
マーゲルのようなゲル媒体で充填したキャピラリー電気
泳動チューブに動電学的に装填することは、分析物の試
料をキャピラリー電気泳動チューブに導入する好ましい
方法である。動電学的装填は分析物を優先的に導入し、
従って、実質的に、試料を濃縮する。しかしながら、キ
ャピラリー電気泳動媒体に導入された分析物の分量は、
キャピラリーチューブ中のCE媒体の注入端表面に核酸鋳
型が蓄積して制限される。この鋳型の蓄積は、これらの
大きな生体分子でキャピラリーチューブの端部を詰まら
せ、追加の分析物の媒体への通過を妨げる。この現象は
注入して電気泳動することができる部分配列のフラグメ
ントの最大量を効果的に制限する。
この詰まりの問題は、キャピラリーの端部が試料成分
の侵入を妨げるだけでなく、一連の事件の原因となり、
伸長生成物の分離とキャピラリーの電気伝導性の両方を
妨げる気泡が、広範囲にキャピラリーチューブ内で生成
することになるので、キャピラリー電気泳動では特にシ
ビアである。
の侵入を妨げるだけでなく、一連の事件の原因となり、
伸長生成物の分離とキャピラリーの電気伝導性の両方を
妨げる気泡が、広範囲にキャピラリーチューブ内で生成
することになるので、キャピラリー電気泳動では特にシ
ビアである。
例えば、コームポリマーゲル媒体を充填した従来のCE
キャピラリーチューブが詰まるまでの最大注入時間に、
米国特許出願第07/950,863号に記載されているように、
0.7kV（0.4IAA）で約60秒であり、これは4.5kVで８秒に
等しい。順番にキャピラリー電気泳動チューブの詰まり
はキャピラリー電気泳動中に分離できる伸長生成物（部
分配列フラグメント）の分量を厳しく制限する。
キャピラリーチューブが詰まるまでの最大注入時間に、
米国特許出願第07/950,863号に記載されているように、
0.7kV（0.4IAA）で約60秒であり、これは4.5kVで８秒に
等しい。順番にキャピラリー電気泳動チューブの詰まり
はキャピラリー電気泳動中に分離できる伸長生成物（部
分配列フラグメント）の分量を厳しく制限する。
キャピラリーチューブの末端の詰まりを解決する一つ
は、UDG酵素を用いてジピラミッド化（dipyramidinatio
n）によって試料から鋳型DNAを有効に除去することであ
る。この方法はスウェルドロウらの「DNAの自動化配列
決定用キャピラリーゲルの安定性」、Electrophoresis
1992,13,475−483に記載されている。UDGは酵素であ
り、DNAポリメラーゼによって不注意に組み込まれ、ま
たはシトシンのジアミン化によって生成できる副次的な
ウラシル残基を除去するようにDNAを修正する。
は、UDG酵素を用いてジピラミッド化（dipyramidinatio
n）によって試料から鋳型DNAを有効に除去することであ
る。この方法はスウェルドロウらの「DNAの自動化配列
決定用キャピラリーゲルの安定性」、Electrophoresis
1992,13,475−483に記載されている。UDGは酵素であ
り、DNAポリメラーゼによって不注意に組み込まれ、ま
たはシトシンのジアミン化によって生成できる副次的な
ウラシル残基を除去するようにDNAを修正する。
キャピラリー電気泳動チューブの詰まりに対する他の
解決法は試料の導入直後にキャピラリーチューブの鋳型
の詰まった端部を切り離すことである。このようにして
切断部は進行中のランから緩衝液および／または分析物
を導入するため、並びにチューブ内に導入される次の試
料に対して新しい端面を与える。この工程の不十分な点
は、少い試料のみを同じキャピラリーチューブに逐次的
に走らせ、その後に、キャピラリーチューブの長さを短
くすることがDNAフラグメント分離物の分離と再生に不
利に働くことである。代わりに、新しいチューブを試料
毎に使用することができる。
解決法は試料の導入直後にキャピラリーチューブの鋳型
の詰まった端部を切り離すことである。このようにして
切断部は進行中のランから緩衝液および／または分析物
を導入するため、並びにチューブ内に導入される次の試
料に対して新しい端面を与える。この工程の不十分な点
は、少い試料のみを同じキャピラリーチューブに逐次的
に走らせ、その後に、キャピラリーチューブの長さを短
くすることがDNAフラグメント分離物の分離と再生に不
利に働くことである。代わりに、新しいチューブを試料
毎に使用することができる。
発明の概要 本発明の目的は、キャピラリー電気泳動チューブの入
口端部に導入できる液体試料中の単数または複数の分析
物の分量を増加する方法を提供することである。本発明
の他の目的は試料溶液中の大きいマクロ分子の移動を遅
らせ、これによって一層小さい生体分子を電気泳動媒体
中に導入できる時間を長くする方法を提供することであ
る。
口端部に導入できる液体試料中の単数または複数の分析
物の分量を増加する方法を提供することである。本発明
の他の目的は試料溶液中の大きいマクロ分子の移動を遅
らせ、これによって一層小さい生体分子を電気泳動媒体
中に導入できる時間を長くする方法を提供することであ
る。
さらにまた本発明の目的は、部分配列のDNAフラグメ
ントをキャピラリーチューブに動電学的に導入する間
に、鋳型DNAの移動を遅らせるために有効な絡み合った
ポリマーマトリックスに試料混合物を埋め込むことによ
って、部分配列のDNAフラグメントの分離を速めるキャ
ピラリー電気泳動システムを提供することである。
ントをキャピラリーチューブに動電学的に導入する間
に、鋳型DNAの移動を遅らせるために有効な絡み合った
ポリマーマトリックスに試料混合物を埋め込むことによ
って、部分配列のDNAフラグメントの分離を速めるキャ
ピラリー電気泳動システムを提供することである。
本発明のこれらおよび他の目的は、DNA鋳型とDNA伸長
生成物を含有するDNA配列決定試料混合物中に開いて絡
み合ったまたは凝縮したポリマー網状構造物を配合する
ことによって達成される。ポリマーマトリックスは、絡
み合いによってまたはミセル相互作用によって安定化さ
れ組織された網状構造である。次いで試料成分を動電学
的注入によってキャピラリー電気泳動チューブに導入す
る。
生成物を含有するDNA配列決定試料混合物中に開いて絡
み合ったまたは凝縮したポリマー網状構造物を配合する
ことによって達成される。ポリマーマトリックスは、絡
み合いによってまたはミセル相互作用によって安定化さ
れ組織された網状構造である。次いで試料成分を動電学
的注入によってキャピラリー電気泳動チューブに導入す
る。
さらに特に、本発明のこれらおよび他の目的は好まし
くは、キャピラリーチューブへ分析物を動学的に装填ま
たは注入する前に、小さい濃度の長い線状ポリマーの溶
液をDNA配列決定試料混合物に導入することによって達
成される。この長い線状ポリマー溶液は、米国特許第5,
126,021号に記載されているように、開いて絡まったポ
リマー網状構造またはマトリックスをつくり、DNA伸長
生成物のようなDNA鋳型マクロ生体分子および生体分子
を含有する試料混合物が組み込まれまたは埋め込まれる
ことになる。この開いて絡み合ったポリマーの網目構造
は、部分配列フラグメント、例えばDNA伸長生成物のよ
うな一層小さい生体分子の自由な通過を効果的に可能に
する一方、DNA鋳型マクロ生体分子の移動を遅らせる。
要するに、開いて絡み合ったポリマーの網目構造または
マトリックスは、約2,000塩基または塩基対（bp）より
も大きい寸法をもつ大きな生体分子の移動を優先的に制
限する篩分けの性質を有する。選択された長い線状ポリ
マーは好ましくは、２×105と５×106ダルトンの間の分
子量をもつヒドロキシエチルセルロース（HEC）であ
る。化学的に類似のポリマーを使用することができる。
くは、キャピラリーチューブへ分析物を動学的に装填ま
たは注入する前に、小さい濃度の長い線状ポリマーの溶
液をDNA配列決定試料混合物に導入することによって達
成される。この長い線状ポリマー溶液は、米国特許第5,
126,021号に記載されているように、開いて絡まったポ
リマー網状構造またはマトリックスをつくり、DNA伸長
生成物のようなDNA鋳型マクロ生体分子および生体分子
を含有する試料混合物が組み込まれまたは埋め込まれる
ことになる。この開いて絡み合ったポリマーの網目構造
は、部分配列フラグメント、例えばDNA伸長生成物のよ
うな一層小さい生体分子の自由な通過を効果的に可能に
する一方、DNA鋳型マクロ生体分子の移動を遅らせる。
要するに、開いて絡み合ったポリマーの網目構造または
マトリックスは、約2,000塩基または塩基対（bp）より
も大きい寸法をもつ大きな生体分子の移動を優先的に制
限する篩分けの性質を有する。選択された長い線状ポリ
マーは好ましくは、２×105と５×106ダルトンの間の分
子量をもつヒドロキシエチルセルロース（HEC）であ
る。化学的に類似のポリマーを使用することができる。
好ましくは、DNA配列決定試料混合物は室温で二本鎖D
NAを変性する、すなわち、二本鎖DNAを一本鎖にするた
めに十分な変性剤を含む。好ましい変性剤は尿素、ジメ
チルホルムアミド、ｎ−メチル−２−ピロリジノン、お
よび２−ピロリジノンを含む。さらに好ましくは、変性
剤は２−ピロリジノンである。
NAを変性する、すなわち、二本鎖DNAを一本鎖にするた
めに十分な変性剤を含む。好ましい変性剤は尿素、ジメ
チルホルムアミド、ｎ−メチル−２−ピロリジノン、お
よび２−ピロリジノンを含む。さらに好ましくは、変性
剤は２−ピロリジノンである。
図面の簡単な説明 図１はコントロールの実施例１の結果の電気泳動図で
ある。
ある。
図２は実施例２の結果の電気泳動図の第一の部分であ
る。
る。
図３は実施例２の結果の電気泳動図の第二の部分であ
る。
る。
図４は実施例３の結果の電気泳動図である。
図５は実施例４の結果の電気泳動図である。
図６は本発明によるシステムの略図である。
発明の詳細な説明 本発明によるシステムと方法は、溶媒中に関係するマ
クロ生体分子および生体分子分析物を含有する試料混合
物中に、試料混合物を埋め込む絡み合ったポリマー網目
構造を形成するために有効な分子量をもつ線状ポリマー
を混合物中に導入することによって、マクロ生体分子を
本質的に取り込む。マトリックスを通って一つの方向に
生体分子を引き出す方向に電場を印加する際に、網目構
造またはマトリックスはマクロ生体分子がマトリックス
を移動するのを遅らせるために有効なメッシュ寸法をも
つ。
クロ生体分子および生体分子分析物を含有する試料混合
物中に、試料混合物を埋め込む絡み合ったポリマー網目
構造を形成するために有効な分子量をもつ線状ポリマー
を混合物中に導入することによって、マクロ生体分子を
本質的に取り込む。マトリックスを通って一つの方向に
生体分子を引き出す方向に電場を印加する際に、網目構
造またはマトリックスはマクロ生体分子がマトリックス
を移動するのを遅らせるために有効なメッシュ寸法をも
つ。
マクロ生体分子は、タンパク質と核酸配列決定鋳型を
含み、一般に少なくとも5,000ダルトンの分子量をも
つ。少なくとも約2,000塩基または塩基対のDNA配列決定
鋳型に対し、分子量は少なくとも約６×105ダルトンで
ある。
含み、一般に少なくとも5,000ダルトンの分子量をも
つ。少なくとも約2,000塩基または塩基対のDNA配列決定
鋳型に対し、分子量は少なくとも約６×105ダルトンで
ある。
さらに特に、DNA配列決定鋳型マクロ分子を本発明に
よる試料混合物中に閉じ込める方法は次の工程からな
る： ａ）少なくともDNA鋳型マクロ分子、DNA伸長生成物、お
よび溶媒を含む液状核酸配列決定試料混合物を用意し、
そして ｂ）開いて絡み合ったポリマー網目構造を形成すること
ができる線状ポリマーをDNA鋳型およびDNA伸長生成物を
含有する混合物に導入する、そこでは網目構造は約2,00
0塩基よりも大きい寸法をもつ大きい生体分子フラグメ
ントのみの移動を制限するために有効な篩分けの性質を
有する。
よる試料混合物中に閉じ込める方法は次の工程からな
る： ａ）少なくともDNA鋳型マクロ分子、DNA伸長生成物、お
よび溶媒を含む液状核酸配列決定試料混合物を用意し、
そして ｂ）開いて絡み合ったポリマー網目構造を形成すること
ができる線状ポリマーをDNA鋳型およびDNA伸長生成物を
含有する混合物に導入する、そこでは網目構造は約2,00
0塩基よりも大きい寸法をもつ大きい生体分子フラグメ
ントのみの移動を制限するために有効な篩分けの性質を
有する。
特に本発明はキャピラリーチューブ内においてゲルの
ような細長い分離媒体中で電気泳動により核酸フラグメ
ントの配列決定をするために適している。本発明による
DNA配列のような核酸配列を決定するための方法は次の
工程からなる： ａ）比較的高い分子量の鋳型核酸分子も含むフラグメン
ト混合物中に部分配列核酸フラグメントの混合物を生成
し； ｂ）電場をマトリックスを横切って置くとき、マトリッ
クスを通過する鋳型核酸分子の移動を優先的に遅らせる
ために有効なポリマーマトリックス中にフラグメント混
合物を埋め込み、 ｃ）電場を媒体の端部領域を横切って置くとき、このよ
うな部分配列フラグメントを分離するために有効な細長
い電気泳動媒体の１端領域と連結してマトリックスと埋
め込まれた混合物を配置し； ｄ）核酸フラグメントをマトリックスを通して媒体中に
そして媒体を通して引き出す方向で、電場をマトリック
スと前記媒体の他端部の領域との間に印加し、これによ
って電気泳動媒体に入る部分配列のフラグメントの分量
の実質的な増加を達成することができる。
ような細長い分離媒体中で電気泳動により核酸フラグメ
ントの配列決定をするために適している。本発明による
DNA配列のような核酸配列を決定するための方法は次の
工程からなる： ａ）比較的高い分子量の鋳型核酸分子も含むフラグメン
ト混合物中に部分配列核酸フラグメントの混合物を生成
し； ｂ）電場をマトリックスを横切って置くとき、マトリッ
クスを通過する鋳型核酸分子の移動を優先的に遅らせる
ために有効なポリマーマトリックス中にフラグメント混
合物を埋め込み、 ｃ）電場を媒体の端部領域を横切って置くとき、このよ
うな部分配列フラグメントを分離するために有効な細長
い電気泳動媒体の１端領域と連結してマトリックスと埋
め込まれた混合物を配置し； ｄ）核酸フラグメントをマトリックスを通して媒体中に
そして媒体を通して引き出す方向で、電場をマトリック
スと前記媒体の他端部の領域との間に印加し、これによ
って電気泳動媒体に入る部分配列のフラグメントの分量
の実質的な増加を達成することができる。
比較的高い分子量の鋳型核酸も含むフラグメント混合
物中の部分配列核酸フラグメントの混合物の電気泳動分
離によって、核酸フラグメントを配列決定する際に使用
するための本発明による電気泳動システムは次のものか
らなる： １）そのような混合物をマトリックス中に埋め込みマト
リックスを横切って電場を置くときに、マトリックスを
通る鋳型核酸の移動を優先的に遅らせるために有効なポ
リマーマトリックス； ２）電場を媒体の端部領域を横切って置き、この媒体が
前記マトリックスと連結した一端を有するとき、このよ
うな部分配列フラグメントを分離するために有効な細長
い電気泳動媒体；および ３）媒体と媒体の他端領域との間に、核酸フラグメント
をマトリックスを通って媒体にさらに媒体を通って引き
出す方向に電場を印加するための手段。
物中の部分配列核酸フラグメントの混合物の電気泳動分
離によって、核酸フラグメントを配列決定する際に使用
するための本発明による電気泳動システムは次のものか
らなる： １）そのような混合物をマトリックス中に埋め込みマト
リックスを横切って電場を置くときに、マトリックスを
通る鋳型核酸の移動を優先的に遅らせるために有効なポ
リマーマトリックス； ２）電場を媒体の端部領域を横切って置き、この媒体が
前記マトリックスと連結した一端を有するとき、このよ
うな部分配列フラグメントを分離するために有効な細長
い電気泳動媒体；および ３）媒体と媒体の他端領域との間に、核酸フラグメント
をマトリックスを通って媒体にさらに媒体を通って引き
出す方向に電場を印加するための手段。
この手段は、一般にキャピラリー電気泳動に使用され
るような、一定のD.C.電圧またはパルス電圧源であって
もよい。
るような、一定のD.C.電圧またはパルス電圧源であって
もよい。
本発明方法を行うために適しているキャピラリー電気
泳動システムの略図を図６に示す。システム10は分離媒
体14を支持するキャピラリーチューブ12を含む。この媒
体は絡み合ったポリマー、ゲル、または上述したような
任意の他の分離媒体であってもよい。システムにおいて
陽極コンテナまたは貯槽16は電解溶液18を含む。20で示
したチューブの陽極端は、図に示すように、電気泳動の
間、試料溶液中に浸す。システムの貯槽22はマーカー溶
液を含み、または、電気泳動分離中に、分離すべき生体
分子の試料溶液24を含む。この試料溶液は試料中の大き
いマクロ生体分子の移動を遅らせるための絡み合ったポ
リマーマトリックスを含む。２つの陽極貯槽は、チュー
ブ12の下部陽極端20を貯槽流体（18または24）に浸すこ
とができる位置に置くため、カルーセル等で運ぶことが
できる。ここには示していないが、カルーセルは電気泳
動行程間または異なる溶液間でチューブを洗浄し洗い流
すための溶液を含む追加の貯槽を収容することができ、
２種またはそれ以上の溶液を単一電気泳動分別法で使用
する。
泳動システムの略図を図６に示す。システム10は分離媒
体14を支持するキャピラリーチューブ12を含む。この媒
体は絡み合ったポリマー、ゲル、または上述したような
任意の他の分離媒体であってもよい。システムにおいて
陽極コンテナまたは貯槽16は電解溶液18を含む。20で示
したチューブの陽極端は、図に示すように、電気泳動の
間、試料溶液中に浸す。システムの貯槽22はマーカー溶
液を含み、または、電気泳動分離中に、分離すべき生体
分子の試料溶液24を含む。この試料溶液は試料中の大き
いマクロ生体分子の移動を遅らせるための絡み合ったポ
リマーマトリックスを含む。２つの陽極貯槽は、チュー
ブ12の下部陽極端20を貯槽流体（18または24）に浸すこ
とができる位置に置くため、カルーセル等で運ぶことが
できる。ここには示していないが、カルーセルは電気泳
動行程間または異なる溶液間でチューブを洗浄し洗い流
すための溶液を含む追加の貯槽を収容することができ、
２種またはそれ以上の溶液を単一電気泳動分別法で使用
する。
チューブ12の反対側の陰極端部26は陰極貯槽28内に密
閉され、図に示すように、貯槽28に含まれる陰極電解質
溶液30に浸される。
閉され、図に示すように、貯槽28に含まれる陰極電解質
溶液30に浸される。
システム10内の高電圧源32を図に示すように陽極と陰
極の貯槽18および28に連結し、２個の貯槽間に選択され
た電位を印加する。電源は陽極と陰極の貯槽のプラチナ
電極34、36にそれぞれ連結する。電源は電極を横切っ
て、好ましくは、５〜50kVの電圧設定にて、定電圧（D
C）を印加するために設計することができる。代わり
に、またはさらに、電源は貯槽間に選択された周波数の
パルス電圧を印加するように設計することができる。一
般に、キャピラリーチューブが短いほど、印加できる電
解強度は大きく、電気泳動分離が早くなる。
極の貯槽18および28に連結し、２個の貯槽間に選択され
た電位を印加する。電源は陽極と陰極の貯槽のプラチナ
電極34、36にそれぞれ連結する。電源は電極を横切っ
て、好ましくは、５〜50kVの電圧設定にて、定電圧（D
C）を印加するために設計することができる。代わり
に、またはさらに、電源は貯槽間に選択された周波数の
パルス電圧を印加するように設計することができる。一
般に、キャピラリーチューブが短いほど、印加できる電
解強度は大きく、電気泳動分離が早くなる。
パルス電圧モードで操作するとき、好ましくは電源は
約50HzからkHzの範囲まで調整できる周波数、および約1
0〜30kVのrms電圧出力で方形波パルスを出力する。パル
ス周波数が高いほど、MHz範囲でもいくつかの応用に適
している。
約50HzからkHzの範囲まで調整できる周波数、および約1
0〜30kVのrms電圧出力で方形波パルスを出力する。パル
ス周波数が高いほど、MHz範囲でもいくつかの応用に適
している。
図６に示されるシステムの説明の最後に、システム中
の検出器38をチューブの陰極端部に近接して配置し、チ
ューブ内の光学検出ゾーン40を通って移動する核酸フラ
グメントを光学的にモニターする。検出器はUV吸収検出
および／または蛍光放射検出のために設計することがで
きる。UV吸収は代表的には、例えば、フローセルをキャ
ピラリーホルダーと置換して、アプライド バイオシス
テムズ（フォスターシティ、CA）によって変更されたク
ラトス78UV吸収検出器を使用し、205〜280nmで行われ
る。蛍光放射検出は好ましくは、下記のように、核酸フ
ラグメントと結合した蛍光種によって、約240〜500nmの
間に調整できる選択された励起波長で行われる。ひとつ
の例示的な蛍光検出器はヒューレット−パッカード（パ
ロアルト、CA）から入手できるSP1046A検出器であり、
キャピラリーチューブ検出のために上記のように変更し
た。検出器は電気泳動ピークを記録するために積分器／
プロッター45に連結する。
の検出器38をチューブの陰極端部に近接して配置し、チ
ューブ内の光学検出ゾーン40を通って移動する核酸フラ
グメントを光学的にモニターする。検出器はUV吸収検出
および／または蛍光放射検出のために設計することがで
きる。UV吸収は代表的には、例えば、フローセルをキャ
ピラリーホルダーと置換して、アプライド バイオシス
テムズ（フォスターシティ、CA）によって変更されたク
ラトス78UV吸収検出器を使用し、205〜280nmで行われ
る。蛍光放射検出は好ましくは、下記のように、核酸フ
ラグメントと結合した蛍光種によって、約240〜500nmの
間に調整できる選択された励起波長で行われる。ひとつ
の例示的な蛍光検出器はヒューレット−パッカード（パ
ロアルト、CA）から入手できるSP1046A検出器であり、
キャピラリーチューブ検出のために上記のように変更し
た。検出器は電気泳動ピークを記録するために積分器／
プロッター45に連結する。
本発明に従って絡み合ったポリマーマトリックスに埋
め込まれた試料混合物を含む試料溶液の一つの好ましい
例は、DNA鋳型および伸長生成物、２−ピロリジノンか
らなる溶媒中に溶解した約４×106ダルトンの分子量を
もつヒドロキシエチルセルロース（HEC）（例えばユニ
オンカーバイト QP100MH）のような長い線状ポリマ
ー、水、およびDNA鋳型の電気泳動移動度を制限する最
小値に調整された2.5mM EDTAを含有する試料混合物で
ある。溶液混合物中の線状ポリマーの有効な最小の濃度
は、0.1ないし約0.2パーセントの間である。この濃度は
4.5kVで少なくとも40秒の上首尾の注入時間となる。こ
れは従来の動電学的な注入時間を越えた８のファクター
の増加である。好ましい溶媒は10％（wt/wt）と60％（w
t）の間の２−ピロリジノン水溶液である。
め込まれた試料混合物を含む試料溶液の一つの好ましい
例は、DNA鋳型および伸長生成物、２−ピロリジノンか
らなる溶媒中に溶解した約４×106ダルトンの分子量を
もつヒドロキシエチルセルロース（HEC）（例えばユニ
オンカーバイト QP100MH）のような長い線状ポリマ
ー、水、およびDNA鋳型の電気泳動移動度を制限する最
小値に調整された2.5mM EDTAを含有する試料混合物で
ある。溶液混合物中の線状ポリマーの有効な最小の濃度
は、0.1ないし約0.2パーセントの間である。この濃度は
4.5kVで少なくとも40秒の上首尾の注入時間となる。こ
れは従来の動電学的な注入時間を越えた８のファクター
の増加である。好ましい溶媒は10％（wt/wt）と60％（w
t）の間の２−ピロリジノン水溶液である。
実施例 次の実施例は本発明を説明するために示されるもので
本発明の範囲を何ら制限するためのものではない。
本発明の範囲を何ら制限するためのものではない。
実施例１ J and W Scientific,Folsom,CAのカタログ番号126−1
013から入手したタイプDB−１キャピラリーチューブを
準備して50センチメートルの長さに切断した。チューブ
の内径は50μｍであった。次にキャピラリーをメタノー
ルと水ですすいだ。次にキャピラリーの流体力学によ
り、125mMボレート−テトラメチル水酸化アンモニウム
（TMA）中の７％C4F9/カーボワークス4600、1.25mMのED
TA、6.6モルの尿素および標準状態で9.0のpHのからなる
ポリエチレングリコール（PEG）／フッ素化コポリマー
ゲルを充填した。50cmのキャピラリーチューブを８分間
で半分充填し32分で完全に充填した。
013から入手したタイプDB−１キャピラリーチューブを
準備して50センチメートルの長さに切断した。チューブ
の内径は50μｍであった。次にキャピラリーをメタノー
ルと水ですすいだ。次にキャピラリーの流体力学によ
り、125mMボレート−テトラメチル水酸化アンモニウム
（TMA）中の７％C4F9/カーボワークス4600、1.25mMのED
TA、6.6モルの尿素および標準状態で9.0のpHのからなる
ポリエチレングリコール（PEG）／フッ素化コポリマー
ゲルを充填した。50cmのキャピラリーチューブを８分間
で半分充填し32分で完全に充填した。
試料溶液中、絡み合ったポリマーなしの、第一の試料
はコントロール試料であった。Ｃで終わるフラグメント
の単一色配列決定ラダーを、アプライド バイオシステ
ムズ（パーツ番号第401119号）配列分析キットと付随す
るプロトコルを用いるジデオキシ配列決定方法によって
調製した。M13mp18DNA鋳型（m13mp18（＋）ストラン
ド、0.1pモル）を、蛍光染料プライマー（FAM M13（−
21）プライマー）にアニールして、31終端塩基として用
意したジデオキシシチジンと共に、Taqポリメラーゼを
用いてプライマー伸長を行った。
はコントロール試料であった。Ｃで終わるフラグメント
の単一色配列決定ラダーを、アプライド バイオシステ
ムズ（パーツ番号第401119号）配列分析キットと付随す
るプロトコルを用いるジデオキシ配列決定方法によって
調製した。M13mp18DNA鋳型（m13mp18（＋）ストラン
ド、0.1pモル）を、蛍光染料プライマー（FAM M13（−
21）プライマー）にアニールして、31終端塩基として用
意したジデオキシシチジンと共に、Taqポリメラーゼを
用いてプライマー伸長を行った。
５μｌのフォルムアミドと2.5mMのEDTAナトリウム、p
H9、を含有するガラス瓶に試料を調製した。0.5pgのM13
鋳型DNAを５μｌのフォルムアルデヒドと2.5mMのEDTAに
溶解したFAM Taq M13（−21）プライマー配列からの
反応物を試料は含んでいた。次に試料を90℃で２分間加
熱した。動電学的な注入の前にチューブで9kV、5.8μＡ
にて予め調整する操作を行った。動電学的試料注入は0.
4μＡ、0.9kVにて60秒間行い、電荷総量は24μクローン
に達した。得られた電気泳動図は図１に示される。
H9、を含有するガラス瓶に試料を調製した。0.5pgのM13
鋳型DNAを５μｌのフォルムアルデヒドと2.5mMのEDTAに
溶解したFAM Taq M13（−21）プライマー配列からの
反応物を試料は含んでいた。次に試料を90℃で２分間加
熱した。動電学的な注入の前にチューブで9kV、5.8μＡ
にて予め調整する操作を行った。動電学的試料注入は0.
4μＡ、0.9kVにて60秒間行い、電荷総量は24μクローン
に達した。得られた電気泳動図は図１に示される。
実施例２ 長さが50cmで直径が50μｍのキャピラリーチューブ断
片を、125mMのホウ酸−TMA、1.25mMのEDTA、6.6モルの
尿素および9.0のpH中のC4F9/カーボワックス4600から作
られた７％ゲルを用いて、実施例１で述べたように調整
した。この場合の試料は５μｌのホルムアルデヒドと2.
5mMのEDTAナトリウムと０〜１％のQP100MH HEC（ヒド
ロキシエチルセルロース）に溶解した0.5μｇのM13鋳型
DNAのFAM Taq M13（−21）プライマー配列からの反応
物であった。試料溶液を90℃まで２分間加熱し、次にキ
ャピラリーチューブに4.5kV、３μＡにて20秒間注入し
た。得られた電気泳動図は図２と図３に示す。
片を、125mMのホウ酸−TMA、1.25mMのEDTA、6.6モルの
尿素および9.0のpH中のC4F9/カーボワックス4600から作
られた７％ゲルを用いて、実施例１で述べたように調整
した。この場合の試料は５μｌのホルムアルデヒドと2.
5mMのEDTAナトリウムと０〜１％のQP100MH HEC（ヒド
ロキシエチルセルロース）に溶解した0.5μｇのM13鋳型
DNAのFAM Taq M13（−21）プライマー配列からの反応
物であった。試料溶液を90℃まで２分間加熱し、次にキ
ャピラリーチューブに4.5kV、３μＡにて20秒間注入し
た。得られた電気泳動図は図２と図３に示す。
実施例３ 長さが50cmで直径が50μｍのキャピラリーチューブ
は、125mMボレート−TMA、1.25mMのEDTAナトリウム、6.
6モルの尿素および9.0のpH中のC4F9/カーボワックス460
0から作られた７％ゲルを用いて調製した。この場合の
試料は５μｌのフォルムアルデヒドと2.5mMのEDTAナト
リウムと0.15％のQP100MH HECに溶解した0.5μｇのM13
鋳型DNAのFAM Taq M13（−21）プライマー配列からの
反応物であった。試料溶液を90℃まで２分間加熱し、次
に4.5kV、３μＡにて20秒間キャピラリーチューブに動
電学的に注入した。この実験結果は図４に示される。
は、125mMボレート−TMA、1.25mMのEDTAナトリウム、6.
6モルの尿素および9.0のpH中のC4F9/カーボワックス460
0から作られた７％ゲルを用いて調製した。この場合の
試料は５μｌのフォルムアルデヒドと2.5mMのEDTAナト
リウムと0.15％のQP100MH HECに溶解した0.5μｇのM13
鋳型DNAのFAM Taq M13（−21）プライマー配列からの
反応物であった。試料溶液を90℃まで２分間加熱し、次
に4.5kV、３μＡにて20秒間キャピラリーチューブに動
電学的に注入した。この実験結果は図４に示される。
実施例４ 長さが50cmで直径が50μｍのキャピラリーチューブ
は、125mMボレート−TMA中の７％C4F9/カーボワックス4
600、1.25mMのソジウムEDTA、6.6モルの尿素および9.0
のpHから作られた７％ゲルを用いて調製した。この場合
の試料は５μｌのフォルムアルデヒドと2.5mMのソジウ
ムEDTAと0.15％のQP100MH HECに溶解した0.5μｇのM13
鋳型DNAのFAM Taq M13（−21）プライマー配列からの
反応物であった。試料溶液を90℃まで２分間加熱し、次
に4.5kV、３μＡにて40秒間キャピラリーチューブに動
電学的に注入した。この実験結果は図５に示される。
は、125mMボレート−TMA中の７％C4F9/カーボワックス4
600、1.25mMのソジウムEDTA、6.6モルの尿素および9.0
のpHから作られた７％ゲルを用いて調製した。この場合
の試料は５μｌのフォルムアルデヒドと2.5mMのソジウ
ムEDTAと0.15％のQP100MH HECに溶解した0.5μｇのM13
鋳型DNAのFAM Taq M13（−21）プライマー配列からの
反応物であった。試料溶液を90℃まで２分間加熱し、次
に4.5kV、３μＡにて40秒間キャピラリーチューブに動
電学的に注入した。この実験結果は図５に示される。
図１から図５の電気泳動図は信号振幅対時間をプロッ
トした。信号の振幅は一般に注入した分析物の量に比例
する。ピーク上の数字はセグメント中の塩基対の番号を
示す。実施例１の試料混合物はコントロールであり、他
の実施例におけるような絡み合ったポリマーを含まな
い。キャピラリーチューブに導入したDNA伸長生成物の
分量は、図１に表されるコントロール試料の注入と比較
して、図２から図５に示される各実施例２、３および４
では実質的に大きいことが容易にわかる。コントロール
の電気泳動図（図１）の振幅はQP1000MH HECの絡み合
ったポリマーを含む実施例のそれよりも少なくとも約８
分の１ないし10分の１である。
トした。信号の振幅は一般に注入した分析物の量に比例
する。ピーク上の数字はセグメント中の塩基対の番号を
示す。実施例１の試料混合物はコントロールであり、他
の実施例におけるような絡み合ったポリマーを含まな
い。キャピラリーチューブに導入したDNA伸長生成物の
分量は、図１に表されるコントロール試料の注入と比較
して、図２から図５に示される各実施例２、３および４
では実質的に大きいことが容易にわかる。コントロール
の電気泳動図（図１）の振幅はQP1000MH HECの絡み合
ったポリマーを含む実施例のそれよりも少なくとも約８
分の１ないし10分の１である。
本発明はその特定例について記載されているが、本方
法の試料組成は特に記載したものとは別のものを実施し
てもよい。種々のポリマーとコポリマーを用いて、ポリ
マーまたはコポリマーが試料が埋め込まれ絡み合ったポ
リマーマトリックスを形成するように、提供される本発
明によるシステムと方法でDN配列決定鋳型の移動を遅ら
せたり阻害したりすることができる。
法の試料組成は特に記載したものとは別のものを実施し
てもよい。種々のポリマーとコポリマーを用いて、ポリ
マーまたはコポリマーが試料が埋め込まれ絡み合ったポ
リマーマトリックスを形成するように、提供される本発
明によるシステムと方法でDN配列決定鋳型の移動を遅ら
せたり阻害したりすることができる。
本発明に用いられる上記ポリマーに加えて、試料混合
物中のポリマーまたはコポリマーの濃度のDNA配列決定
鋳型のようなマクロ分子の移動度に影響を及ぼすであろ
う。例えば、QP100MH HECのような高分子量のHECを用
いるとき、有効な最小濃度は、.1％ないし.2％である。
異なるポリマーを使用する場合、濃度は関係する分析物
の移動度に影響を与えないで移動制限を最適にするよう
に変化させなければならない。
物中のポリマーまたはコポリマーの濃度のDNA配列決定
鋳型のようなマクロ分子の移動度に影響を及ぼすであろ
う。例えば、QP100MH HECのような高分子量のHECを用
いるとき、有効な最小濃度は、.1％ないし.2％である。
異なるポリマーを使用する場合、濃度は関係する分析物
の移動度に影響を与えないで移動制限を最適にするよう
に変化させなければならない。
本発明の具体例では請求の範囲の正しい範囲と公平な
意義から離れることなく改良、変量、変更される。従っ
て、このような変更、改良、変量のすべては請求の範囲
の精神と広い視野において採用される。ここに引用した
特許、特許出願、および刊行物はすべてその全体におい
て参考文献としてここに組み込まれる。
意義から離れることなく改良、変量、変更される。従っ
て、このような変更、改良、変量のすべては請求の範囲
の精神と広い視野において採用される。ここに引用した
特許、特許出願、および刊行物はすべてその全体におい
て参考文献としてここに組み込まれる。
Claims (40)
- 【請求項１】ａ）関係ある生体分子の分析物および、溶
媒中で前記生体分子よりも実質的に大きい分子量を有す
るマクロ生体分子の混合物を生成し； ｂ）電場をマトリックスを横切って配置するとき、ポリ
マーマトリックスを通過するマクロ生体分子の移動を優
先的に遅らせるために有効なポリマーマトリックス中に
混合物を埋め込み、 ｃ）電場を媒体の端部領域を横切って配置するとき、こ
のような生体分子を分離するために有効な細長い電気泳
動媒体の１端領域と連結して埋め込まれた混合物を有す
るマトリックスを配置し； ｄ）生体分子の分析物をマトリックスを通って媒体中に
そして媒体を通って引き出す方向で、電場をマトリック
スと前記媒体の他端部の領域との間に印加し、これによ
って電気泳動媒体に入る生体分子の分析物の分量の実質
的に増加させることができる、 各工程からなる電気泳動によって生体分子を分離するた
めの方法。 - 【請求項２】前記マクロ生体分子がDNA配列決定鋳型で
ある請求項１記載の方法。 - 【請求項３】前記関係のある分析物が部分配列DNAフラ
グメントである請求項２記載の方法。 - 【請求項４】前記マクロ生体分子が少なくとも5000ダル
トンの分子量をもつ請求項１記載の方法。 - 【請求項５】前記マクロ生体分子がDNA配列決定鋳型で
ある請求項４記載の方法。 - 【請求項６】前記ポリマーがヒドロキシエチルセルロー
スである請求項５記載の方法。 - 【請求項７】溶媒がさらに変性剤を含む請求項１記載の
方法。 - 【請求項８】変性剤が水溶液中にあり、変性剤が尿素、
フォルムアミド、２−ピロリジノン、およびｎ−メチル
−２−ピロリジノンからなる群から選ばれる請求項７記
載の方法。 - 【請求項９】変性剤が２−ピロリジノンである請求項７
記載の方法。 - 【請求項１０】変性剤の濃度が約10％（wt/wt）と約70
％（wt/wt）の間である請求項７記載の方法。 - 【請求項１１】ａ）約６×105ダルトンよりも大きい分
子量をもつ少なくとも１つのDNA鋳型マクロ分子、DNA伸
長生成物、および溶媒からなる配列決定試料混合物を用
意し、そして ｂ）開いて絡み合ったポリマー網目構造物を形成する線
状ポリマーを、DNA鋳型およびDNA伸長生成物を中に埋め
込む混合物中に、導入し、網目構造はDNA鋳型の移動を
遅らせるために有効な篩分けの性質を有する、 各工程からなる試料混合物中のDNA配列決定鋳型生体分
子を閉じ込める方法。 - 【請求項１２】溶媒がさらに変性剤を含む請求項11記載
の方法。 - 【請求項１３】変性剤が水溶液中にあり、変性剤が尿
素、フォルムアミド、２−ピロリジノン、およびｎ−メ
チル−２−ピロリジノンからなる群から選ばれる請求項
12記載の方法。 - 【請求項１４】変性剤が２−ピロリジノンである請求項
12記載の方法。 - 【請求項１５】変性剤の濃度が約10％（wt/wt）と約70
％（wt/wt）の間である請求項12記載の方法。 - 【請求項１６】ａ）関係あるマクロ分子と分析物を含有
する試料混合物を用意し、 ｂ）前記試料混合物を中に埋め込む絡み合ったポリマー
網目構造を形成するために有効な分子量を有する線状ポ
リマーを混合物中に導入し、前記網目構造は電場を前記
マトリックスに印加するとき前記混合物中のマクロ分子
の移動を遅らせるために有効なメッシュ寸法を有し、 ｃ）試料混合物とマトリックスに分離媒体充填キャピラ
リー電気泳動チューブの一端を挿入し、 ｄ）試料混合物中のチューブの一端と、キャピラリー電
気泳動チューブ中の分離媒体に動電学的に引き入れる関
係ある分析物の量を優先的に増加するために有効なチュ
ーブの他端との間に電位を印加する、 各工程からなるキャピラリー電気泳動用ゲル充填キャピ
ラリーチューブに試料を装填する方法。 - 【請求項１７】前記マクロ分子が核酸鋳型である請求項
16記載の方法。 - 【請求項１８】前記関係ある分析物がDNA伸長生成物を
含む請求項17記載の方法。 - 【請求項１９】前記絡み合ったポリマーマトリックスが
約２×105〜５×106ダルトンの分子量を有する線状ポリ
マーから形成される請求項16記載の方法。 - 【請求項２０】溶媒がさらに変性剤を含む請求項16記載
の方法。 - 【請求項２１】変性剤が水溶液中にあり、変性剤が尿
素、フォルムアミド、２−ピロリジノン、およびｎ−メ
チル−２−ピロリジノンから選ばれる請求項20記載の方
法。 - 【請求項２２】変性剤が２−ピロリジノンである請求項
20記載の方法。 - 【請求項２３】変性剤の濃度が約10％（wt/wt）と約70
％（wt/wt）の間である請求項20記載の方法。 - 【請求項２４】溶液中マクロ分子および関係する分析物
とからなる試料であって、絡み合ったポリマーマトリッ
クスを通過する分析物を引き出すためにマトリックスを
横切る電場を印加するとき、マトリックスを通過する試
料内のマクロ分子の移動を遅らせるために有効な、メッ
シュ寸法を有するマトリックスに埋め込まれ、キャピラ
リー電気泳動分離媒体に電気泳動注入するためのキャピ
ラリー電気泳動試料。 - 【請求項２５】前記マクロ分子がDNA配列決定鋳型であ
る請求項24記載の試料。 - 【請求項２６】前記関係のある分析物がDNA伸長生成物
である請求項25記載の試料。 - 【請求項２７】前記絡み合ったポリマーマトリックスが
約２×105〜５×106ダルトンの分子量を有する線状ポリ
マーから形成されている請求項24記載の試料混合物。 - 【請求項２８】ａ）比較的高い分子量の鋳型の核酸分子
も含有するフラグメント中に部分配列核酸フラグメント
の混合物を生成し、 ｂ）電場をマトリックスを横切って置くとき、マトリッ
クスを通過する鋳型核酸分子の移動を優先的に遅らせる
ために有効な、ポリマーマトリックス中にフラグメント
混合物を埋め込み、 ｃ）電場を媒体の端部領域を横切って配置するとき、こ
のような部分配列フラグメントを分解するために有効な
細長い電気泳動媒体の１端領域と連結してマトリックス
と埋め込まれた混合物を配置し； ｄ）核酸フラグメントをマトリックスを通って媒体中に
そして媒体を通って引き出す方向で、マトリックスと前
記媒体の他端部の領域との間に電場を印加し、これによ
って電気泳動媒体に入る部分配列のフラグメントの分量
を実質的に増加させることができる、 各工程からなる核酸フラグメントを配列決定するための
方法。 - 【請求項２９】前記絡み合ったポリマーマトリックスが
約２×105〜５×106ダルトンの分子量を有する線状ポリ
マーから形成されている請求項28記載の方法。 - 【請求項３０】前記核酸フラグメントがDNAフラグメン
トである請求項28記載の方法。 - 【請求項３１】フラグメント混合物が、さらに変性剤を
含む請求項28記載の方法。 - 【請求項３２】変性剤が、尿素、フォルムアミド、２−
ピロリジノン、およびｎ−メチル−２−ピロリジノンか
ら選ばれる請求項31記載の方法。 - 【請求項３３】変性剤が２−ピロリジノンである請求項
32記載の方法。 - 【請求項３４】比較的高い分子量の鋳型核酸も含有する
フラグメント混合物中の部分配列核酸フラグメントの混
合物の電気泳動分離によって、核酸フラグメントを配列
決定に使用するための電気泳動装置であって、 このような混合物をマトリックス中に埋め込みマトリッ
クスを横切って電場を配置するときに、マトリックスを
通る鋳型核酸の移動を優先的に遅らせるために有効な、
ポリマーマトリックス； 電場を媒体の端部領域を横切って配置し、この媒体が前
記マトリックスと連結した一端を有するとき、このよう
な部分配列フラグメントを分解するために有効な、細長
い電気泳動媒体；および 核酸フラグメントをマトリックスを通って媒体中にさら
に媒体を通って引き出す方向に、マトリックスと前記媒
体の他端領域との間に電場を印加するための手段、から
なる電気泳動装置。 - 【請求項３５】前記核酸フラグメントと核酸鋳型が、DN
Aフラグメントと鋳型である請求項34記載の装置。 - 【請求項３６】さらに、前記マトリックスが前記第一の
容器中に保持され、一端が前記第一の容器中の前記マト
リックスに埋もれ、他端が前記第二の容器中の緩衝液に
埋もれているキャピラリーチューブ中に前記媒体が含ま
れている、第一と第二の容器からなる請求項34記載の装
置。 - 【請求項３７】前記ポリマー網目構造が約２×105〜５
×106ダルトンの分子量を有する線状ポリマーから形成
される請求項34記載の装置。 - 【請求項３８】マトリックスが変性剤含有溶液に溶解さ
れている請求項34記載の装置。 - 【請求項３９】変性剤が、尿素、フォルムアミド、２−
ピロリジノン、またはｎ−メチル−２−ピロリジノンか
らなる群から選ばれる請求項38記載の装置。 - 【請求項４０】変性剤が２−ピロリジノンである請求項
39記載の装置。
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|---|---|---|---|
| US15621893A | 1993-11-23 | 1993-11-23 | |
| US08/156,218 | 1993-11-23 | ||
| US156,218 | 1993-11-23 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08506424A JPH08506424A (ja) | 1996-07-09 |
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|---|---|---|---|
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