JPH07508096A

JPH07508096A - 時間とともに変化する場の強さを利用する毛管電気泳動

Info

Publication number: JPH07508096A
Application number: JP6501814A
Authority: JP
Inventors: グットマン、アンドラス
Original assignee: ベックマン　インスツルメンツ　インコーポレーテッド
Priority date: 1992-06-17
Filing date: 1993-06-17
Publication date: 1995-09-07
Also published as: WO1993025899A1; US5296116A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】時間とともに変化する場の強さを利用する毛管電気泳動ル肌Ω背且１、発明の分野本発明は電気泳動、特に毛管電気泳動、より詳細には毛管ゲル電気泳動に関する。

２、関連技術の説明近時、毛管電気泳動法によるＤＮＡ解析において非常に多くの活動がある（　［１］　（：ｏｈｅｎ、　Ａ、Ｓ、；　Ｎａｊａｒｉａｎ、　Ｄ、Ｒ，；　Ｐａｕｌｕｓ、　Ａ；Ｇｕｔｔｍａｎ、　Ａ；　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｊ、Ａ、；にａｒｇｅｒ、　Ｂ、Ｌ、；　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、１９８８．８５．９６６０−９６６３；　［２］　Ｐａｕｌｕｓ、　Ａ、、　Ｇａｓｓｍａｎｎ。

Ｅ、；　Ｆｉｅｌｄ、　Ｍ、Ｊ、；　Ｅｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、　１９９０．１１，７０２−７０８　［３］　Ｙｉｎ。

Ｈ，Ｆ、；　Ｌｕｘ、　Ｊ、Ａ、；　Ｓｈｏｍｂｕｒｇ、　Ｇ；　Ｊ、Ｈｉｇｈ　Ｒｅｓ、Ｃｈｒｏｍ、、　１９９０．１３゜６２４−６２７　）この新しく有力な技術を用いた結果が、合成りＮＡ分析における、単一ストランドのＤＮＡ分子の分ｉｌｉ！　（［４］　Ｇｕｔｔｍａｎ。

Ａ；　Ｃｏｈｅｎ、　Ａ、Ｓ、；　Ｈｅｉｇｅｒ、　Ｄ、Ｎ、；　Ｋａｒｇｅｒ、　Ｂ、Ｌ、；　Ａｎａｌ、Ｃｈｅｍ、、１９９０゜６２、２０３８−２０４２）と、二重ストランドのＤＮＡ分子の分離、特にＰＣＲ生成物および制限フラグメント（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓｌ（［５］　Ｓｃｈｗａｒｔｚ、　Ｈ，Ｅ、；　Ｕｌｆｅｌｄｅｒ、　Ｋ、；５ｕｎｚｅｒｉ、　Ｆ、；Ｂｕｓｃｈ、Ｍ、；ＢｒｏｗｎｌｅｓｓＪ！、Ｇ、；　Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、　１９９１．５５９．２６７−２８３）とに関して公表された。また、細長いポリアクリルアミド・ゲル充填の毛管コラムの使用によりＤＮＡ分子の高効率で迅速な分離を達成することができることが明らかにされた（　［６］　Ｈｅｉｇｅｒ、Ｄ、Ｎ、　；Ｃｏｈｅｎ、　Ａ、Ｓ、　；Ｋａｒｇｅｒ、　Ｂ、Ｌ、　；　Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、　、１９９０．５１６３３−４８；　［７］　Ｇｕｔｔｍａｎ。

Ａ；　Ｃｏｏｋｅ、　Ｎ、；　Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、、１９９１．５５９．２８５−２９４）　、異なるシーケンス（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有する同じ鎖長の同じフラグメントが、分子構造の違いのため、この方法により分離された（　［８］　Ｇｕｔｔｍａｎ。

Ａ、；　Ｎｅ１ｓｏｎ、ＲＪ、；　Ｃｏｏｋｅ、　Ｎ、　Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、、　１９９１．５９３．２９７−３０３）。

異なるサイズのＤＮＡ分子のより良好な分離を達成するため、最近、平板ゲル電気泳動を用いた異なる場の操作技術が説明されている。デニソン等（［９］　Ｄｅｎｎｉｓｏｎ、　Ｃ，；　Ｌｉｎｄｅｒ、Ｗ、Ａ、；　Ｐｈ１ｌｌｉｓ、　ＮＣ，に、；　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１９８２．１２０．１２−１８　）は、円錐形または楔形の平板ゲルを用いて、バンドの対数分布を線形にした（非線形電圧傾斜法：ｎＯ耐１ｎｅａｒ　ｖｏｌｔａｇｅ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄ　）　、ビギン等（［１０］　Ｂｉｇｇｉｎ、Ｍ、Ｄ、；　Ｇｉｂｓｏｎ、　Ｔ、Ｊ、；　Ｈａｎｇ、Ｇ、Ｆ、；　Ｐｒｏｃ、　ＮａｔｌＡｃａｄ、　Ｓｃｉ、’ＵＳＡ、　１９８３．８０．３９６３−３９６５　）は、陽極の方向における前記ゲルの抵抗が、ＤＮＡの泳動路に沿った負の場の強さの勾配を減少させまた生じさせる高イオン力陽極緩衝剤の有効性を研究した。彼らは、この特別な方法が毛管ゲル電気泳動のための場合もそうであるように非常に薄いゲルには実際的でないとの結論を下した（　［ｌ　１　］　Ｇｕｔｔｍａｎ、　Ａ、　；ベックマン・インスツルメント・インコーホレーテッド、研究開発、非公表の成果１９９１　）。アンサージ等が、バンドの輪郭をよりはっきりさせるために場の勾配を生じさせる平板ゲルの横断面積の増大を利用することを試み、これにより、ゲルごとの７容解可能の塩基（ｂａｓｅ）の数を増大させた（［１２］Ａｎｓｏｒｇｅ、　Ｗ；　Ｌａｂｅｉｔ、Ｓ、；Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、　１９８４．１０゜２３７−２４３　）　、カンタ− 等（［１３］　Ｃａｎｔｏｒ、Ｃ，Ｒ，；　Ｓｍ１ｔｈ、Ｃ，Ｌ、　；Ｍａｔｈｅｗ、Ｍ、に、；　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、ｃｈｅｍ、、　１９８８．１７．２８７−３０４）は、ゲル中の細長い方向付けられた大きいＤＮＡ　（＞５０ｋｂｐ　）分子の外形を利用するパルス・フィールド法（ｐｕｌｓｅｄ　ｆｉｅｌｄｍｅｔｈｏｄ・振動のように場の方向および大きさを変化させる）を導入した。ハイガー等［６］は、非常に低いゲル濃度でパルス・フィールド技術を用いる大きさが２３．０００の塩基対に達する二重ストランドＤＮＡ分子の毛管ゲル電気泳動分離を説明した。平板ゲルの操作では低濃度ゲルを取り扱うことにおいて含まれるある機械的困難があった（　［１４］　Ｆａｎｇｍａｎ、Ｗ、Ｌ、　；　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、、　１９７８．５゜６５３−６６５　）が、これは毛管電気泳動技術では問題を示さない。デマナおよび協力者（［１５］　Ｄｅｍａｎａ、　Ｔ、　；Ｌａｎａｎ、　Ｍ；　Ｍｏｒｒｉｓ、　Ｍ、Ｄ、　；Ａｎａｌ、Ｃｈｅｍ、、　１９９１．６３．２７９５− ２７９７　）は、ＤＮＡ制限フラグメントの毛管ゲル電気泳動における分離力を増大させるために検体速度調節法を用いた。

発明の概要本発明は、電気泳動における高められた分離分解を提供する技術に向けられている。この技術は、時間の関数として規則的にまたはその反対に、次第に増大または減少する、時間とともに変化する場の強さを利用することを含む。時間に関する前記場の強さの外形または形態は時間に関して連続または段階的であり、単調またはその反対である。

異なる大きさの種の移動度が付与電場の相関的要素であるため、一定でない（時間とともに変化する）電場の使用が電気泳動の分解力を増大させる。この技術は、毛管ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動における二重ストランドＤＮＡ分子の分解を高めることがわかった。サイズにおいて１ないし１０００以上の塩基対のＤＮＡ制限フラグメントの促進された分離が本発明の技術を使って達成されることがわかった。

図面の簡単な説明図１は自動電気泳動装置の該略図である。

図２は、異なる一定の付与電場（等静電の）を利用する毛管ゲル電気泳動による φＸ１７４ＤＮＡ制限フラグメント混合物の分離を示すエレクトロフェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｉ）を比較する。（Ａ）１００、ＣＢ）２００、（Ｃ）５００　Ｖ／ｃｍ図３は、増大する電圧を用いる毛管ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によるφＸ１７４ＤＮＡ制限フラグメント混合物の分離を示すエレクトロフェログラムである。点線は電流の出力を示す。

図４は、減少する電圧勾配を用いる毛管ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によるφＸ　１７４ＤＮＡ制限フラグメント混合物の分離を示すエレクトロフェログラムである。

図５Ａは、増大する段階的勾配の場を用いる毛管ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によるｐＢＲ３２２ＤＮＡ制限フラグメント混合物の分離を示すエレクトロフェログラムである。図５Ｂは電流の出力を示す。

図６は、システム　ゴールド　ソフトウェア　パッケージ（カリフォルニア州　フラートンのベックマン　インスッルメンツ　インコーホレーテッド）を用いることにより計算された、図２−図４におけるピークの理論プレート数の値を示す表である。

図示の実施例の説明以下の説明は、目下最良に完成された本発明を実施するモードについてのものである。この説明は、本発明の大まかな原理を明らかにする目的でなされており、限定的に認識されるべきでない。本発明の範囲は添付の請求の範囲により最良に決定される。

本発明は、毛管電気泳動、特に毛管ゲル電気泳動におけるＤＮＡ制限フラグメントの分離に関して以下に説明されている。しかし、本発明の技術が他のタイプの電気泳動（例えば平板ゲル電気泳動）および他のタイプの試料（例えば蛋白質、ペプチド）に適用可能であることは理解されよう。

試験セクション装置。試験の全てにおいて、Ｐ／ＡＣＥ　（商標）システム２１００毛管電気泳動装置（カリフォルニア州　フラートンのベックマン　インスッルメンツ　インコーホレーテッド）を使用した。前記システム１０が図１に概略的に示されている。このシステムの詳細は、このシステムが公然と入手可能であるため、省略する。このシステムでは、毛管カラム１２が、前記毛管の両端部が電解質（液体またはゲル）または試料（８液のバイアル１６．１８にアクセスすることが可能であるように支持されたカートリッジ１４に入れられている。ここで言及する毛管とは、典型的には１１０００ｕ、さらに典型的には３００ｕｍより小さい内径を有する管形の材料を意味する。毛管１２の温度をコントロールするために前記カートリッジの内部にクーラントが送り込まれる。検出器２０が、分離された種を検出するために設けられている。前記バイアルは、選択されたバイアルを毛管１２の端部に配置すべくモータ２６，２８により回転されるカル−セル２２．２４に保持されている。選択された溶液は、前記毛管の一端部を前記溶液中に入れ、従来の手段により前記バイアルを気体で加圧することにより、前記毛管内に入れられる。低濃度の重合されたゲル（すなわち高分子網目構造）は前記カル−セル上のバイアル内に含まれることができ、溶液についてなされたと同様の方法で毛管内に送られる。前記毛管内の前記ゲルは前記システムの洗浄操作モードを適用することにより入れ替えることができ、これにより、前記毛管内のゲルを前記毛管から一度に流し出し、続いて新しいゲルが前記毛管を満たすことができる。

システム１０は、電気泳動注入ｆｅｌｅｃｔｒｏｍｉｇｒａｔｉｏｎ　１ｎｊｅｃｔｉｏｎｌまたは気体加圧注入によりバイアルから前記毛管の一端部内に試料を注入する試料注入モードを有する。電気泳動注入および電気泳動を行なうための電圧供給源３４から必要な高電圧を（毛管の単位ｃｍ当たり数百ボルトのオーダーで）印加するため、電極２６．２８が設けられている。電気泳動は、両バイアルに収容された電解質に前記毛管の２つの端部を浸して行なわれる。前記電解質は、前記ゲルを形成する過程で使用される緩衝剤に似た緩衝液の形態、または、ゲル（すなわちゲル緩衝剤システム）の形態を取り得る。前記システムの様々な機能の操作および継続は、ユーザーによりプログラムを組むことができるコントローラ３６の制御下で自動的に行なわれる。これらの機能は、後記するようなユーザーがプログラムを組んだ分析表に従って電極２６．２８を横切る、時間とともに変化する電場を適用することを含む。

後述する試験では、陰極が注入側にあり、また、陽極が検出側にある。したがって、負に帯電したＤＮＡ分子が、ゲルで満たされた毛管カラム中で前記陽極に向けて泳動する。分離は、２５４ｎｍにおいてカラム上でモニターされた。前記毛管カラムの温度は、前記Ｐ／ＡＣＥ装置の液体冷却システムにより、２０℃±０．１’Ｃに一定に保たれた。エレクトロフェログラムはエバレタス（Ｅｖｅｒｅｘ）　３８６／３３コンピユータで得られまたこれに保存された。使用された毛管には分離担体媒質としてのゲルが詰められている。

化学物質。φＸ　１７４　ＤＮＡ　Ｈａｅ−ＩＩＩダイジェストｆｄｉｇｅｓｔｌおよびｐＢＲ３２２ＤＮＡ　Ｍｓｐ−１ダイジエストの制限フラグメント混合物（マサチューセッツ州　ビバリーのニュー　イングランド　バイオチック）が、注入前に２５μｇ／ｍｌの濃度まで水で希釈され、−２０℃で保存された。超純度のアクリル、トリス、硼酸、ＥＤＴＡ、過硫酸アンモニウムおよびテトラメチルエチレンジアミ゛ン（ＴＥＭＥＤＩが試験で使われた（マサチューセッツ州　ケンブリッジのシュワルツ／マン　バイオチック）。全ての緩衝液およびアクリルアミド溶液が孔径０．２μｍのフィルタにューハンプシャー州キーンのシュライバーおよびシュエル）で濾過されかつ慎重に真空ガス抜きをされた。

手順。０．１−開の一様な内径の融解石英（石英ガラス）の毛管材料（カリフォルニア州　サクラメントのジエイ　アンド　ダブリュのＤＢ−２２５）に反応混合物を挿入するに先立ち、線状のポリアクリルアミド・ゲルの重合が過硫酸アンモニウムにより開始され、１００　ｍＭのトリス−硼酸塩、２　ｍＭのＥＤＴＡ緩衝剤（ｐＨ８，３５１中のＴＥＭＥＤにより触媒作用を及ぼされる。重合反応混合物は、気密シリンジ（ルイジアナ州　バトン　ルーシュのクイナテック）を用いて前記毛管内に注入された。前記毛管の壁に拘束されない低粘度の線状ポリアクリルアミドの使用は、前記Ｐ／ＡＣＥ装置の洗浄操作モードによる前記毛管カラム内のゲルー緩衝剤システムの入れ替えを可能にする。ゲル充填の毛管カラムの全長は、それぞれ、４７０ｍｍおよび６７０ｍｍ（検出点まで４００ｍｍおよび６００ｍｍ）であった。

試料は、前記Ｐ／ＡＣＥシステムの加圧注入モードにより、典型的には５秒間、３．５ｐｓｉで注入された。大体の注入量：　０．１　ｎｇ　ＤＮＡ時間とともに変化する場の強さの概要または形態（ｐｒｏｆｉｌｅｌは、前記Ｐ／ＡＣＥ装置において、電圧分離モードを連続的に増大または減少させるようにプログラムされた。段階的に時間とともに変化する場の分離モードでは、図５Ｂに示すように、異なる時間帯のために一定の電圧が用いられた。

結果および検討毛管電気泳動において、低濃度ゲル（５％より低い線状ポリアクリルアミド）を用いることにより、二重ストランドのＤＮＡ分子の広い寸法範囲の良好な分離を達成することが可能である。分離は、平板ゲル操作［５］においてアガロースを用いて達成された分離に匹敵するかまたはそれ以上に良好である。比較的高い電場を用いると、ＤＮＡ分子は比較的短時間で高い分解能をもって分離され得る。

しかし、高い場の強さにおいては、ＤＮＡ分子の電気泳動の移動度が場に依存するようになる（　［１６］　Ｆｌｉｎｔ、　Ｄ、Ｈ，；Ｈａｒｒｉｎｇｕｔｏｎ、Ｒ，Ｅ、；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１９７２．１１．４８５８−４８６４）　。さらに、鎖のからみ合いが所与の細孔サイズのゲル中のＤＮＡ分子の分離において重大な役割を果たすことが知られており（［１７］Ｓｍ１ｚｅｋ、Ｄ、Ｌ、；　Ｈｏａｇｌａｎｄ、Ｄ、Ａ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　１９９０．２４８．１２２１−１２２３　）、このからみ合いは、前記分子サイズおよび付与電場［１５］の作用である。主要な目標は、与えられたゲル・マトリクスにおいて異なる鎖長を有するＤＮＡ分子混合物の最適の分離のための適当な場を見出すことである。低い場の強さにおいて、ふるい分は効果が当てはまり、また、移動度および分子サイズ間の逆比例関係が見られる（　［１８］　Ｄｅ　Ｇｅｎｎｅｓ、　Ｐ、Ｇ、　；Ｓｃａｌｉｎｇ　Ｃｏｎｃｅｔ　ｉｎ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｐｈｙｓｉｃｓ。

Ｃｏｒｎｅｌｌ　ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｔｈａｃａ　ＮＹ　Ｃｈ、３．１９７９　）　、高い場の強さでは異なる現象が現われる。前記場がＤＮＡ分子の前端の方向を偏らせるために前記分子の鎖がより方向付けられるようになる［１８］。これは、特に大きいサイズの分子については場の強さの増大に伴って移動度の増大へと導く。換言すると、高電場を与えると、より長い鎖長のＤＮＡ分子が前記場の整列線に沿って部分的にまたは完全に伸ばされる。このため、これらの大きい分子の電気泳動の移動度が、高い場の強さでの劣等な分離を引き起こすサイズ依存でなくなる（　［１９］　Ｌｕｍｐｋｉｎ、　Ｏ，ｊ、　；　Ｄｅｊａｒｄｉｎ、Ｐ、　；Ｚｉｍｍ、Ｂ、Ｈ，；　Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、　１９８５．２４．１５７３−１５９３　）　、毛管ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動では、この効果が１０００　ｂｐより長いフラグメント長さで生じるようであることに注意すべきである。おもしろいことに、非常に短い鎖長のフラグメント（＜３００　）については、分離能力は高い付与電場を用いることにより増大される［６゜１９］。

図２は、異なる一定の場の強さを用いるφＸ１７４　ＤＮＡＨａｅ−ＩＩＩの制限フラグメント混合物の分離を比較する。条件：入れ替え可能のポリアクリルアミド・ゲル・カラム、検出器までの効果的長さ４０ｃ叱全長４７ｃｍ；緩衝剤、０．１Ｍトリス−硼酸塩、２ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，３５）。図２Ａは、１００　Ｖ／ｃｍの電場がゲル充填の毛管カラムに付与されるときの試験混合物のエレクトロフェログラム３７を示す。この低い場の強さでは、ＤＮＡ分子は任意のコイルのように振る舞い、このような良好な分離が１０”の塩基対を越えるフラグメントについても達成することができる（ふるい分は効果［１８］）。前記大きいフラグメントのこの分離は、長い分離時間（〉５０分間）を要して達成される。しかし、小さいフラグメントのいくつかは完全には分解されない。ビークはこれらの増大する領域により識別された。それは鎖長に相互に関連する：４１・７２．４２＝１１８．４３＝１９４．４４＝２３４．４５＝２７１．４６＝２８１．４７＝３１０．４８＝６０３．４９＝８７２．５０・１０７８．５１＝１３５３の塩基対。図２Ａに示すように、ビーク４６およびビーク４７（２７１− および２８１−ｂｐフラグメント）の間に不完全な分離がある。同様の結果が、カーガーおよび協力者［６］により、非常に希釈されたゲル充填の毛管カラムにおける長い分離時間のために拡散バンドの広がりに起因すると考えられた。付与電場を２００Ｖ／Ｃｍに増大することにより、全ての１１のフラグメントの完全な分離が２７分間で達成される（図２Ｂのエレクトロフェログラム参照）。

大きいＤＮＡ分子は、おそらく、前記電場に整列し始め、このため、大きいサイズの範囲における分解は図２Ａにおけると同様に完全ではない。５００　Ｖ／Ｃｍへの場の強さの増大（図２０のエレクトロフェログラム３’ｌ叩）は、ふるい分はマトリックスがもはや整列された分子のいくつか（ビーク４９および５０）を分離しないため、分解の付随損失で大きいフラグメントのより強い整列（［２０］５ｌａｔｅｒ、ＧＪ、；　Ｎｏｏｌａｎｄｉ、Ｊ、；　Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、１９８６．　２５．　４３１−４５４　）を生じさせる。しかし、分離時間は７分間まで減少し、また、低分子量のフラグメント（ビーク４６および４７）が高い付与電場のために完全に分離される［１９］。

上に示した結果に基づき、時間とともに変化する不規則な電場を適用することによりＤＮＡ分子の増進された分離が達成されると考えられた。このような方法で、異なる分子量の範囲のＤＮＡ分子が、それらの分離のために最適である電場強さに曝され得る。

ＤＮＡの毛管ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動では、規則的な電場（Ｅ）が定常状態の条件下で帯電ポリイオンに付与されるとき［７］、電気泳動速度（Ｖ）を前記電場の成果および所与の場の強さくμ）におけるＤＮＡ分子の電気ｌ永劫の移動度により表すことがしかし、この基本的な式は、その後適用電場が時間（１）に関して変更され、前記ポリイオンの電気泳動速度に変化を生じさせるため、不規則な場が適用される［Ｅ　（ｔ）　］ときに変更される。

また、先に報告されたように（［２１］　Ｇｕｔｔｍａｎ、Ａ、　；　Ｃｏｏｋｅ、Ｎ、　；Ａｎａｌ、Ｃｈｅｍ、、　１’Ｊ９１．６１．２０３８−２０４２　）　、　ＤＮＡ分子の電気泳動の移動度は電場の関数［μ（Ｅ）］であることを考廖し、ｖ　（ｔ）＝ｕ　（Ｅ）Ｅ　（ｔ）　（ｌｂ）と書くことができる。

式１ｂは、ＤＮＡ分子の実際の速度ｖ　（ｔ）が所与の時間において使用中の場の強さと移動度とによって影響を受けることを示し、また、それは前記場の強さの関数である。したがって、不規則な電場が付与されるとき、電気泳動加速度（ａ）は、電気泳動速度の変化、すなわち所与の時間での電気泳動の移動度および前記場の強さの成果として表すことができる。

ａ＝ｄｖ／ｄｔ、＝ｄ　ＣｕＥ’ｌ　／ｄ　Ｌ　（２）ここで、ｄｖおよびｄｔはそれぞれ電気泳動速度の増分および時間の増分である。先の結果［２１］に基づいて、第１の近似として、二重ストランドのＤＮＡ分子の移動度が場に（衣存しない（μ。）要素と、場に依存する要素とを有すると考えることができる。

μ＝μ。＋Ｓ、Ｅ　（３）ここで、μ。は、所与の鎖長のＤＮＡ分子に関する零の場の強さの移動度のプロット（ｐｌｏｔ）に対する電場の袖外値であり、また、Ｓｌは同じプロット（ｒ ”　＝０．９８７１の勾配値（ｓｌｏｐｅ　ｖａｌｕｅｓｌである。この勾配値は、検討された範囲においてＤＮＡ分子の鎖長と線形関係を示すので［１１］、次の式を考える。

Ｓｌ　＝Ａ＋３２ｎ　（４）ここで、Ａは所与のゲルー緩衝剤システムのための定数であり、Ｓ２はｎプロット（ｒ”　＝０．９８７１に対するＳ、の勾配であり、ｎはＤＮＡ分子の鎖長（塩基対数）である。式１−４を組み合わせて次の式を得る。

ａ　＝ｄｖ／ｄｔ　＝　ｄ　［１１゜”　（Ａ＋５ｚｎｌＥ］　Ｅ　／ｄｔ　（５）したがって、ａ　＝　ｕ　ｏ　ｄＥ／ｄｔ　”　ｆＡ＋５２ｎ）　ｄＥ２／ｄｔ　（６）Ｉ　ＩＩここで、■は前記場の強さのみであり、また、ＩＩは前記場および鎖長依存の成分である。−例として、電場の強さが時間の一次関数であるとき、Ｅ＝Ｂ＋ｃｔ　（７）ここで、ＢおよびＣは定数であり、したがって、前記ポリイオンの電気泳動加速度を単に弐６として表すことができる。

ａ＝定数＋　＋ｊ・定数、　（８）ビーク効率（ｐｅａｋ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｌ　（理論プレート（ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｐｌａｔｅｌ値Ｎ）と分解能（Ｒよ）とは、また、瞬間の場の強さの影響を受ける（［２２］カーガー・ビー・エル、コーエン・エイ・ニス、グツトマン・エイ　Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、、１９８９．４９２．５８Ｓ−６１４）。したがって、適当な置換の後、理論プレート数Ｎの変化が前記加速度の一次関数であると結論づけることができる。

き！−（当＝！１Ｌ（ｊ区孜堕叶ユ’−）（９）ｄｔ　ｄｔ　２０　ｄｔ　２Ｄここで、Ｌは前記毛管の有効長さであり、また、Ｄは前記溶質の拡散係数である。分解能の変化は、直線的に時間と共に変化する場の強さが用いられるとき、前記加速度ｄＲ，／ｄｔ−ｄ（ａ””）ｄｔの平方根［２２］に比例する。

異なる付与電場が、異なるサイズのＤＮＡフラグメントの分離に最適であるので［１３−１６；１９−２１］、時間とともに変化する場の強さの使用が分解力を著しく増大させる。時間とともに変化する場の強さは、必要ならば、増大モード、減少モード、一定またはその反対のモード、連続または段階的なモードで、あるいは、これらの任意の組み合わせで用いられる。振動または脈動される場の電気泳動と比べて、場の強さの変動（増大しまた減少する場の強さの組み合わせを含む線の場合）が、１秒の何分の１とは対照的に、少なくとも数分間（例えば１ −５分間）生じる。脈動される場の電気泳動は、１秒当たり少なくとも数サイクル（例えば５０ヘルツ）の振動する場を用いる。

図３は、時間中に電場を一定に増大（２０分間にＯＶ／ｃ＋ａないし４００　Ｖ／ｃ＋＋＋）させて用いるφＸ１７４　ＤＮＡの制限フラグメント混合物の分離を示すエレクトロフェログラム５６である。他の条件は前と同様である。毛管分離チャネルが一様な内径を有するため、電流は電圧に比例して変化する。点！！５８として図３に時間にとともに変化する電流を示すことにより時間とともに変化する電圧を表すことは容易である。全ての試験混合物成分の完全分離が１９分間未満で達成された。図３および図６に示すように、最後のいくつかのピーク（４９，５０および５１）の見かりの効率（すなわち理論プレート数［７］）は図２Ｂに比べて大きく、ここでは、全ての試料成分の完全分離もまた達成された。

この例では、分離の最後の部分に高い場の強さが付与されているため、これらのフラグメントは前記検出器の窓を素早（移動する。したがって、上記と矛盾しないで、見かけの理論プレート値Ｎは高いようである（式９、図６の表ｙ　！］４　）。Ｒ１が前記場の平方根によってのみ変化するため、前記分解能は評価できるようには高められなかった。分離時間は、時間とともに変化する場の強さを増大させる方法を利用することにより、１／３だけ減少した（図２Ｂと比較して）。

反対に、図４に示すように、付与される・７．、場を時間中減少させることができる。ここでは、２０分間に４００　’、１ｃｍないし１００　Ｖ／ｃｍに一定に減少する場の強さの勾配１図４の点線、５９）が、線状のポリアクリルアミド網目充填の毛管カラムに適用しれた。他の条件は前記したと同じである。エレクトロフェログー・ム５６に示すように、φＸ１７４の制限フラグメント混合物の ′１ａｌｌの成分の基線分離（ｂａｓｅｌｉｎｅ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎｌは１０分間未満で達成され、これは図２Ｃに示す分離時間と比較し得るものである。

［」４のケースでは、分離の端では低い場の強さのために大きいフラグメントは前記検出器の窓をゆっくりと移動した。これは、効率または理論プレート数Ｎ（式９、図６の表参照）と分解能とに、特に最後の３つのピークに関して、見かけの損失を生じさせる。

時間とともに変化する場の強さを用いる方法は、連続モードと共に段階的モードを使用することができる。図５Ａは、ｐＢＲ３２２ＤＮＡの制限フラグメント混合物の分離が長い毛管カラム（有効カラム長さ：６０ｃｍ）で段階的に時間とともに変化−４−る電圧を用いる方法を採用するエレクトロフェログラム５７を示すにの方法は、３つの連続したステップ、すなわち口ないし４０分間１００　Ｖ／ｃｍ、４０ないし７０分間２００　Ｖ／ｃｍ、７０ないし１００分間４００　Ｖ／ｃｍからなる（図５Ｂの電流線６０参昭）。他の条件は同じである。この方法では、はとんど全ての成分の完全分離が達成された。図５Ａにおいて、ピーク６１−８１が、鎖長６１＝２６．６２・３４６３・６７、６４＝７６．６５・９０．６６・１１０．５７＝１２３．６８・１４７．６９＝１４７．７０＝１６０．７１＝１６０．７２＝１８０．７３・１９０．７４＝２０１．７５＝２１７．７６＝２３８．７７＝２４２．７８＝３０９．７９＝４０４．８０＝５２７．８１＝６２２の塩基対に対応する。

ピーク６８および６９　（１４７−ｍｅｒｓ）と、ピーク７ｏおよび７７（１６０−ｍｅｒｓ）との基線分離に気づくことに価値があり、これは、これらの成分がシーケンスは異なるが同じ鎖長を有す乞ためである。

これらのフラグメントは、挿入アフィニティ（ａｆｆｉｎｉｔｙｌ　リガンドとしてエチディアム（ｅｔｈｉｄｉｕｍ）臭化物を使用する毛管アフィニティ・ゲル電気泳動手段によってのみ、予め分離される。

概要単純な、時間とともに変化する場の強さの方法は、ＤＮＡ制限フラグメント混合物の毛管ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動分離における分解能力を増大させるために導入された。連続または段階的な電圧を増大、減少させる方法の使用が、分解する能力が所与のＤＮＡの鎖長の範囲のために最適にされ、また、分離時間が著しく減少され得ることを示した。毛管ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によるφＸ１７４　ＤＮＡの制限フラグメントの分離についての検討において、最小時間要求を伴う最良の分離が、連続的に減少するように適用された電場を用いることにより達成された。場の強さの勾配の方法を用いると、異なるサイズの成分がその時点で使用中の電圧によって決定される速度で前記検出器の窓を移動するため、見かけのピークの効率および分解能が誤りに導く。電流、力および温度のような他のタイプの時間と共に変化するパラメータを用いることができ、また、これらの組み合わせも、また、所与の試料混合物の毛管ゲル電気泳動分離を最適にするために用いることができる。

本発明をこれに基づ（図示の実施例に関して説明したが、様々な変更および改良が本発明の範囲および精神から離れることなしになし得ることは当業者に明らかであろう。したがって、本発明が特定の実施例によってではなく、添付の請求の範囲によってのみ限定されることが理解されよう。

時間（分）時間（分）時間（分）時間（分）時間（分）時間（分）

Claims

【特許請求の範囲】

１．試料成分の混合物の電気泳動のための装置であって、電気泳動のための分離通路に配置された試料成分の混合物のための前記分離通路を規定する、電気泳動に適する媒体と、ユーザーに規定された時間に関する電場の形態に従う前記分離通路の部分に沿って、時間とともに変化する電場を適用するための手段であって前記場が試料の電気泳動を生じさせる、電場適用手段とを含み、前記電場の形態は、場の強さが、分離される前記試料成分のサイズに依存するようにユーザーにより選択される、電気泳動装置。
２．前記媒体が毛管に支持され、前記分離通路の部分が断面において一様である、請求項１に記載の装置。
３．前記媒体がゲルである、請求項２に記載の装置。
４．前記電場の形態は、前記電場が時間とともに増大するものである、請求項１に記載の装置。
５．前記電場の形態は、前記電場が時間とともに減少するものである、請求項１に記載の装置。
６．前記電場の形態は、前記電場が時間とともに単調に増大するものである、請求項１に記載の装置。
７．前記電場の形態は、前記電場が時間とともに単調に減少するものである、請求項１に記載の装置。
８．前記電場の形態は、前記電場が時間とともに段階的に増大するものである、請求項１に記載の装置。
９．前記電場の形態は、前記電場が一定の割合で時間とともに増大するものである、請求項１に記載の装置。
１０．前記電場の形態は、前記電場が一定の割合で時間ととも減少するものである、請求項１に記載の装置。