JP2006292602A - 還元性物質を用いるタンパク質又はペプチドの構造解析手法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】MSの2乗以上の分析が可能なMALDI(マトリックス支援レーザー脱離イオン化)質量分析装置により、マトリックスとしてジスルフィド結合に対して還元性を示す物質を用いて、タンパク質又はペプチドのMS分析を行い、前記MS分析で得られた分子量関連イオンをプリカーサイオンとしてMSn分析を行い、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列情報を得る、タンパク質又はペプチドの構造解析手法。
【選択図】図3
Description
・試料タンパク質を6M塩酸グアニジン及び2mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含む0.5Mトリス緩衝液(pH 8.1)に溶解して、50℃の恒温槽に30分置いて変性させる。
・タンパク質に含まれるジスルフィド結合の50倍量過剰のDTTを加え、室温で4時間インキュベートすることにより還元反応を行う。
・1N水酸化ナトリウム溶液に溶解したモノヨード酢酸を加えてアルキル化し、還元の際に生成したSH基を保護する。
・ゲル濾過や透析によって過剰の試薬や塩類を取り除いた後、凍結乾燥する。
なお、試料や還元剤の種類によって、これら反応の最適条件や各試薬の最適濃度は異なってくる。
質量分析装置による構造解析は、酵素消化で得られるペプチド断片試料又は酵素消化プロセスを経なかった試料を、MS及びMSnすることによって行われる。すなわち、MSで計測される試料分子の分子量関連イオン(すなわち分子量情報の獲得に直接役立つイオン種)をプリカーサイオンとして MSnを行い、得られたプロダクトイオンを解析して試料分子のアミノ酸配列情報を得る。
(1)MSの2乗以上が可能なLI(レーザーイオン化)質量分析装置により、ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質を用いてタンパク質又はペプチドのMSを行い、前記MSで得られた分子量関連イオンをプリカーサイオンとしてMSnを行い、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列情報を得る、タンパク質又はペプチドの構造解析手法。
タンパク質試料又はペプチド試料と、ジスルフィド結合に対して還元性を示すマトリックスとの混合物;タンパク質試料又はペプチド試料と、還元性を示すマトリックスと、強い還元性を示さないマトリックスとの混合物;又は、タンパク質試料又はペプチド試料と、還元性を示し且つマトリックスでない物質と、強い還元性を示さないマトリックスとの混合物など。
すなわち、MALDI質量分析用のプレートに、測定試料の溶液とマトリックスの溶液とを、同一の位置に微量滴下し、乾燥させる。測定試料の溶液は、測定試料のタンパク質又はペプチドを、TFA水溶液に適当な濃度で溶解することによって調製すると良い。マトリックスの溶液は、上記の溶媒に、上記の濃度で溶解することによって調製すると良い。滴下する量としては、特に限定されず、当業者が適宜決定すればよい。例えば、試料にして数fmol〜数pmol程度となるような量とすることができる。
測定試料として、図1に示すように、A鎖(A-chain:GIVEQCCASVCSLYQLENYCN(配列表の配列番号1),ジスルフィド結合CysA6-CysA11)とB鎖(B-chain:FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKA(配列表の配列番号2))とがジスルフィド結合CysA7-CysB7及びCysA20-CysB19で架橋した構造を有するInsulinを用い、還元性を示すマトリックスとして、ジアミノナフタレンの位置異性体3種、及び比較用として強い還元性を示さない2,5-dihydroxybenzoic acid(DHBA)をそれぞれ用いて、AXIMA−QIT(島津製作所)によりポジティブモード及びネガティブモードで質量分析を行った。本実験例で用いたジアミノナフタレンの位置異性体は、1,5-diaminonaphthalene(1,5−DAN)、1,8-diaminonaphthalene(1,8−DAN)、及び2,3-diaminonaphthalene(2,3−DAN)である。また、DHBAを用いた場合においては、還元性を有する物質は用いなかった。
図1中の全てのマススペクトルにおいて、横軸は(質量/電荷)を表し、縦軸は相対強度(%Int)を表す(以下、全ての図において同じ)。
測定試料として、ペプチドUrotensin II(human由来; アミノ酸配列: ETPDCFWKYCV(配列表の配列番号3), ジスルフィド結合: Cys5-Cys10, 分子式:C64H86N13O18S2,分子量:1388.6,最小質量による精密質量:1387.6)を用いた。マトリックスとしてDHBAを用いて、MALDI−QIT−TOF(マトリックス支援レーザー脱離イオン化四重極イオントラップ型飛行時間型)質量分析装置(AXIMA−QIT(島津製作所))によって、MSと、MSで得られた分子量関連イオンをプリカーサイオンとしたMS/MSとを行った。得られたMS/MSスペクトルを図2に示す。なお、比較例1では、還元性を示す物質は用いなかった。
マトリックスとして本発明の1,5-diaminonaphtalene(1,5−DAN)を用いた以外は比較例1と同じ条件でMS及びMS/MSを行った。すなわち、測定試料として、ペプチドUrotensin II(human由来; アミノ酸配列: ETPDCFWKYCV(配列表の配列番号3), ジスルフィド結合: Cys5-Cys10, 分子式:C64H86N13O18S2,分子量:1388.6,最小質量による精密質量:1387.6)を用い、還元性を示すマトリックスとして1,5-diaminonaphtalene(1,5−DAN)を用いて、MALDI−QIT−TOF(マトリックス支援レーザー脱離イオン化四重極イオントラップ型飛行時間型)質量分析装置(AXIMA−QIT(島津製作所))によって、MSと、MSで得られた分子量関連イオンをプリカーサイオンとしたMS/MSとを行った。得られたMS/MSスペクトルを図3に示す。
これらプロダクトイオン群について、de novo Sequencingによるマニュアル解析と自動解析とのそれぞれの方法によって行った。なお、図2に示す解析結果は、de novo Sequencingによるマニュアル解析により得られた結果である。
マトリックスとしてDHBAを用いると、MSによる分子量関連イオンが、ジスルフィド結合が維持された分子として得られる。このため、MS/MSによるプロダクトイオンは、ジスルフィド結合及びそれに由来するシステイン残基のチオール基の状態を考慮して質量の理論値を計算する必要がある。さまざまなプロダクトイオン種が入り混じっているため、マニュアルによる解析は大変困難な作業となった。
1)ジスルフィド結合をもつタンパク質・ペプチドの一次構造解析が容易になった。
2)ジスルフィド結合の還元を、迅速且つ容易に行うことが可能となった。
3)ジスルフィド結合の還元により生じたSH基を保護する過程が省略できる。
4)ジスルフィド結合をもつタンパク質・ペプチドの一次構造について自動解析 (de novo Sequencing)が可能となった。
5)タンパク質・ペプチド中のジスルフィド結合の有無及び数が確認できる。
6)ジスルフィド結合の有無に関らずタンパク質・ペプチドの一次構造解析に適用できる。
Claims (7)
- MSの2乗以上が可能なLI(レーザーイオン化)質量分析装置により、ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質を用いてタンパク質又はペプチドのMSを行い、前記MSで得られた分子量関連イオンをプリカーサイオンとしてMSnを行い、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列情報を得る、タンパク質又はペプチドの構造解析手法。
- 前記ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質が、ジスルフィド結合に対して還元性を示すマトリックスである、請求項1に記載のタンパク質又はペプチドの構造解析手法。
- 前記ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質が、ジアミノナフタレンの位置異性体から選ばれる、請求項1又は2に記載のタンパク質又はペプチドの構造解析手法。
- 前記ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質が、1,5−ジアミノナフタレン、2,3−ジアミノナフタレン、及び1,8−ジアミノナフタレンからなる群から選ばれる、請求項1〜3のいずれか1項に記載のタンパク質又はペプチドの構造解析手法。
- 前記LI質量分析装置が、MALDI(マトリックス支援レーザー脱離イオン化型)質量分析装置である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のタンパク質又はペプチドの構造解析手法。
- 前記MALDI質量分析装置が、MALDI−QIT−TOF(マトリックス支援レーザー脱離イオン化四重極イオントラップ飛行時間型)質量分析装置である、請求項5に記載のタンパク質又はペプチドの構造解析手法。
- 前記タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列情報を、de novo Sequencingの自動分析により得る、請求項1〜6のいずれか1項に記載のタンパク質又はペプチドの構造解析手法。
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WO2003102572A2 (en) * | 2002-05-30 | 2003-12-11 | Shimadzu Research Laboratory (Europe) Limited | Mass spectrometry |
JP2004317398A (ja) * | 2003-04-18 | 2004-11-11 | Amersham Bioscience Kk Kk | 質量分析法 |
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2005
- 2005-04-13 JP JP2005115344A patent/JP4517925B2/ja active Active
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