JPH1090226A - ペプチドのアミノ酸配列決定方法 - Google Patents
ペプチドのアミノ酸配列決定方法Info
- Publication number
- JPH1090226A JPH1090226A JP26346096A JP26346096A JPH1090226A JP H1090226 A JPH1090226 A JP H1090226A JP 26346096 A JP26346096 A JP 26346096A JP 26346096 A JP26346096 A JP 26346096A JP H1090226 A JPH1090226 A JP H1090226A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- amino acid
- ion
- ions
- voltage
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 分解イオンの発生を容易にして、広範な種類
のペプチドに適用し得る質量分析法によるペプチドのア
ミノ酸配列決定方法を提供する。 【解決手段】 分析すべきペプチド分子の末端に、電荷
を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミ
ン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン等）を予め結合
させる。このアミノ酸が結合したペプチド分子をイオン
化（例えばＭＡＬＤＩ）させると共に分解イオンを発生
させ、これらのイオンを質量分析法（例えばＴＯＦＭ
Ｓ）により分離検出して、アミノ酸配列を決定する。
のペプチドに適用し得る質量分析法によるペプチドのア
ミノ酸配列決定方法を提供する。 【解決手段】 分析すべきペプチド分子の末端に、電荷
を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミ
ン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン等）を予め結合
させる。このアミノ酸が結合したペプチド分子をイオン
化（例えばＭＡＬＤＩ）させると共に分解イオンを発生
させ、これらのイオンを質量分析法（例えばＴＯＦＭ
Ｓ）により分離検出して、アミノ酸配列を決定する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、質量分析法による
ペプチドのアミノ酸配列決定方法に関し、より詳しく
は、分解イオンの発生が容易に起こり、広範な種類のペ
プチドのアミノ酸配列を決定し得る方法に関する。
ペプチドのアミノ酸配列決定方法に関し、より詳しく
は、分解イオンの発生が容易に起こり、広範な種類のペ
プチドのアミノ酸配列を決定し得る方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来より、質量分析法によるペプチドの
アミノ酸配列決定方法としては、分析すべきペプチド分
子をイオン化させ、発生したイオンが飛行途中で自然に
分解した種々のポストソース分解イオン（Post Source
Decay Ion ）を分離検出することによって行なうポスト
ソース分解（Post Source Decay,ＰＳＤ）法がある。こ
の方法は、例えば、B. Spengler et al., Rapid Commu
n. Mass Spectrom. 7, 902-910 (1993) 等に記載され
ている。
アミノ酸配列決定方法としては、分析すべきペプチド分
子をイオン化させ、発生したイオンが飛行途中で自然に
分解した種々のポストソース分解イオン（Post Source
Decay Ion ）を分離検出することによって行なうポスト
ソース分解（Post Source Decay,ＰＳＤ）法がある。こ
の方法は、例えば、B. Spengler et al., Rapid Commu
n. Mass Spectrom. 7, 902-910 (1993) 等に記載され
ている。
【０００３】しかしなから、ペプチドの種類によっては
ポストソース分解イオンが十分発生しない場合があり、
このようなペプチドをＰＳＤ法で分析することは非常に
困難であった。つまり、この方法は、ポストソース分解
イオンが発生容易なペプチドのみにしか適用することが
できなかった。
ポストソース分解イオンが十分発生しない場合があり、
このようなペプチドをＰＳＤ法で分析することは非常に
困難であった。つまり、この方法は、ポストソース分解
イオンが発生容易なペプチドのみにしか適用することが
できなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明の目的
は、上記の問題点を解決し、分解イオンの発生を容易に
して、広範な種類のペプチドに適用し得る質量分析法に
よるペプチドのアミノ酸配列決定方法を提供することに
ある。
は、上記の問題点を解決し、分解イオンの発生を容易に
して、広範な種類のペプチドに適用し得る質量分析法に
よるペプチドのアミノ酸配列決定方法を提供することに
ある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、分析すべき
ペプチド分子の末端に、電荷を有するアミノ酸を予め結
合させることによって、分解イオンの発生を容易にでき
るという知見に基づき、本発明を完成するに至った。
ペプチド分子の末端に、電荷を有するアミノ酸を予め結
合させることによって、分解イオンの発生を容易にでき
るという知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【０００６】本発明のペプチドのアミノ酸配列決定方法
は、分析すべきペプチド分子の末端に、電荷を有するア
ミノ酸を結合させ、このアミノ酸が結合したペプチド分
子をイオン化させると共に分解イオンを発生させ、これ
らのイオンを質量分析法により分離検出することによる
方法である。
は、分析すべきペプチド分子の末端に、電荷を有するア
ミノ酸を結合させ、このアミノ酸が結合したペプチド分
子をイオン化させると共に分解イオンを発生させ、これ
らのイオンを質量分析法により分離検出することによる
方法である。
【０００７】ペプチド分子のイオン化方法としては、特
に限定されるものではないが、レーザー脱離法（Ｌ
Ｄ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡ
ＬＤＩ）、高速原子衝撃法（ＦＡＢ）、液体二次イオン
質量分析法（ＬＳＩＭＳ）、液体イオン化法（ＬＩ）等
が挙げられる。
に限定されるものではないが、レーザー脱離法（Ｌ
Ｄ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡ
ＬＤＩ）、高速原子衝撃法（ＦＡＢ）、液体二次イオン
質量分析法（ＬＳＩＭＳ）、液体イオン化法（ＬＩ）等
が挙げられる。
【０００８】これらのうち、ＬＤ法ではマトリックスを
用いないので、ペプチド分子自身が、レーザー光を吸収
することが必要である。一方、ＭＡＬＤＩ法、ＦＡＢ
法、ＬＳＩＭＳ法、ＬＩ法ではマトリックスを用いるの
で、マトリックスのみがレーザー光を吸収すれば良く、
ペプチド分子自身が直接レーザー光を吸収する必要がな
いため、極めて多種類の化合物をイオン化することがで
きる。
用いないので、ペプチド分子自身が、レーザー光を吸収
することが必要である。一方、ＭＡＬＤＩ法、ＦＡＢ
法、ＬＳＩＭＳ法、ＬＩ法ではマトリックスを用いるの
で、マトリックスのみがレーザー光を吸収すれば良く、
ペプチド分子自身が直接レーザー光を吸収する必要がな
いため、極めて多種類の化合物をイオン化することがで
きる。
【０００９】マトリックスとしては、例えばＭＡＬＤＩ
法の場合、以下の化合物が挙げられる。レーザーとして
Ｎｄ−ＹＡＧ第４高調波２６６ｎｍを使用する場合、ニ
コチン酸、２−ピラジンカルボン酸等が挙げられ、パル
ス窒素レーザー３３７ｎｍやＮｄ−ＹＡＧ第３高調波３
５５ｎｍを使用する場合、シナピン酸（３，５−ジメト
キシ−４−ヒドロキシケイ皮酸）、２，５−ジヒドロキ
シ安息香酸、５−メトキシサリチル酸、α−シアノ−４
−ヒドロキシケイ皮酸、３−ヒドロキシピコリン酸、ジ
アミノナフタレン、２−（４−ヒドロキシフェニルア
ゾ）安息香酸、ジスラノール等が挙げられ、ＣＯ2 ２．
９４μｍを使用する場合、コハク酸、５−（トリフルオ
ロメチル）ウラシル、グリセリン等が挙げられる。
法の場合、以下の化合物が挙げられる。レーザーとして
Ｎｄ−ＹＡＧ第４高調波２６６ｎｍを使用する場合、ニ
コチン酸、２−ピラジンカルボン酸等が挙げられ、パル
ス窒素レーザー３３７ｎｍやＮｄ−ＹＡＧ第３高調波３
５５ｎｍを使用する場合、シナピン酸（３，５−ジメト
キシ−４−ヒドロキシケイ皮酸）、２，５−ジヒドロキ
シ安息香酸、５−メトキシサリチル酸、α−シアノ−４
−ヒドロキシケイ皮酸、３−ヒドロキシピコリン酸、ジ
アミノナフタレン、２−（４−ヒドロキシフェニルア
ゾ）安息香酸、ジスラノール等が挙げられ、ＣＯ2 ２．
９４μｍを使用する場合、コハク酸、５−（トリフルオ
ロメチル）ウラシル、グリセリン等が挙げられる。
【００１０】マトリックスは光エネルギー吸収体以外の
役割（例えばジアミノナフタレンはＳ−Ｓ結合開裂の役
割）も有しているので、分析対象物の化学的・物理的性
質の違いによってマトリックスも適宜選択する必要があ
る。また、各々のマトリックスは、それぞれ固有の吸収
波長と吸光率を持っているので、使用するレーザーの波
長が変われば、マトリックスも変更する必要がある。
役割（例えばジアミノナフタレンはＳ−Ｓ結合開裂の役
割）も有しているので、分析対象物の化学的・物理的性
質の違いによってマトリックスも適宜選択する必要があ
る。また、各々のマトリックスは、それぞれ固有の吸収
波長と吸光率を持っているので、使用するレーザーの波
長が変われば、マトリックスも変更する必要がある。
【００１１】これらのうち、ペプチドの分析のために
は、ニコチン酸、シナピン酸、２，５−ジヒドロキシ安
息香酸、５−メトキシサリチル酸、α−シアノ−４−ヒ
ドロキシケイ皮酸、ジアミノナフタレン、コハク酸、５
−（トリフルオロメチル）ウラシル等が好ましい。特
に、２，５−ジヒドロキシ安息香酸は、紫外光エネルギ
ーを吸収する役割を有し且つプロトンドナーでもあり、
また、極性物質と均一に混合しやすい性質を有している
ので好ましい。
は、ニコチン酸、シナピン酸、２，５−ジヒドロキシ安
息香酸、５−メトキシサリチル酸、α−シアノ−４−ヒ
ドロキシケイ皮酸、ジアミノナフタレン、コハク酸、５
−（トリフルオロメチル）ウラシル等が好ましい。特
に、２，５−ジヒドロキシ安息香酸は、紫外光エネルギ
ーを吸収する役割を有し且つプロトンドナーでもあり、
また、極性物質と均一に混合しやすい性質を有している
ので好ましい。
【００１２】また、レーザーとしてはパルス窒素レーザ
ー３３７ｎｍが、以下の点から好ましい。(i) 小型・安
定・安価・取扱い容易である。(ii)３３７ｎｍは、多く
の化合物において吸光度が低い。(iii) パルスイオン化
に十分な半値幅（５００ｐｓ〜３ｎｓ）と出力（１パル
ス：数十〜数百μＪ）を発生するので、分析対象物を急
速に加熱することができる。分析対象物を急速加熱する
ことにより、分析対象物を分解させることなく、イオン
化することができる。パルスレーザーイオン化は熱イオ
ン化の一種であるが、分子量１００ｋＤａを超えるタン
パク質のような熱的不安定分子をも分解させることな
く、脱離イオン化が可能である。
ー３３７ｎｍが、以下の点から好ましい。(i) 小型・安
定・安価・取扱い容易である。(ii)３３７ｎｍは、多く
の化合物において吸光度が低い。(iii) パルスイオン化
に十分な半値幅（５００ｐｓ〜３ｎｓ）と出力（１パル
ス：数十〜数百μＪ）を発生するので、分析対象物を急
速に加熱することができる。分析対象物を急速加熱する
ことにより、分析対象物を分解させることなく、イオン
化することができる。パルスレーザーイオン化は熱イオ
ン化の一種であるが、分子量１００ｋＤａを超えるタン
パク質のような熱的不安定分子をも分解させることな
く、脱離イオン化が可能である。
【００１３】以上より、ＭＡＬＤＩ法においては、パル
ス窒素レーザー３３７ｎｍと２，５−ジヒドロキシ安息
香酸の組合わせが好適である。
ス窒素レーザー３３７ｎｍと２，５−ジヒドロキシ安息
香酸の組合わせが好適である。
【００１４】ＭＡＬＤＩ法におけるサンプル調製は、通
常分析対象のペプチド分子溶液とマトリックス溶液とを
モル比１：１００〜１：１００００で混合後乾燥させ、
ペプチド分子とマトリックスとがミクロンレベルで均一
に混合された状態、すなわち、ペプチド分子の微細結晶
を多量のマトリックス結晶が取り囲んでいる（又はアモ
ルファス）状態にする。
常分析対象のペプチド分子溶液とマトリックス溶液とを
モル比１：１００〜１：１００００で混合後乾燥させ、
ペプチド分子とマトリックスとがミクロンレベルで均一
に混合された状態、すなわち、ペプチド分子の微細結晶
を多量のマトリックス結晶が取り囲んでいる（又はアモ
ルファス）状態にする。
【００１５】このような状態のサンプルに半値幅１ｎｓ
程度のパルスレーザー光を照射すると、マトリックスが
レーザー光を吸収し、熱エネルギー（ミクロ的には振動
エネルギー）に変換し、マトリックスの一部が急速に加
熱（加熱時間：１〜数十ｎｓ、到達温度：１０００Ｋ以
上）され、ペプチド分子と共に気化（昇華）される。ペ
プチド分子が中性のままで脱離されても、同時に気化さ
れたプロトン、陽イオン（不純物として存在）又はマト
リックスイオンが付加すれば、イオンとなる。
程度のパルスレーザー光を照射すると、マトリックスが
レーザー光を吸収し、熱エネルギー（ミクロ的には振動
エネルギー）に変換し、マトリックスの一部が急速に加
熱（加熱時間：１〜数十ｎｓ、到達温度：１０００Ｋ以
上）され、ペプチド分子と共に気化（昇華）される。ペ
プチド分子が中性のままで脱離されても、同時に気化さ
れたプロトン、陽イオン（不純物として存在）又はマト
リックスイオンが付加すれば、イオンとなる。
【００１６】このように、ＭＡＬＤＩ法は前述の他のイ
オン化法と比較して、以下の特長点を有し、ペプチド分
析に好適な方法である。(i) 瞬時の（パルス）イオン化
を行なう。(ii)効率の高いイオン化が可能である。(ii
i) 広範囲の化合物のイオン化が可能である。(iv)未精
製や混合物状態の化合物のイオン化が可能である。
オン化法と比較して、以下の特長点を有し、ペプチド分
析に好適な方法である。(i) 瞬時の（パルス）イオン化
を行なう。(ii)効率の高いイオン化が可能である。(ii
i) 広範囲の化合物のイオン化が可能である。(iv)未精
製や混合物状態の化合物のイオン化が可能である。
【００１７】本発明においては、ペプチド分子を好まし
くはＭＡＬＤＩ法でイオン化させ、飛行時間型質量分析
法（time of flight mass spectrometry, ＴＯＦＭＳ）
によって、ポストソース分解イオンを分離検出すること
ができる。
くはＭＡＬＤＩ法でイオン化させ、飛行時間型質量分析
法（time of flight mass spectrometry, ＴＯＦＭＳ）
によって、ポストソース分解イオンを分離検出すること
ができる。
【００１８】ＴＯＦＭＳ法は、(i) 高速：１スペクトル
測定時間は、１ｍｓ未満である。(ii)高感度：スキャン
不要であり、明るいイオン光学系である。(iii) 広範囲
の測定が可能：測定可能範囲は０＜ｍ／ｚ＜∞である。
(iv)安価：機械系は高精度不要で、構造が単純である。
という特長点を有する。すなわち、ＴＯＦＭＳは、ＭＡ
ＬＤＩと多くの共通した特長を有し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯ
ＦＭＳは、相性の良いもの同士を組合わせた好ましい方
法の一つである。
測定時間は、１ｍｓ未満である。(ii)高感度：スキャン
不要であり、明るいイオン光学系である。(iii) 広範囲
の測定が可能：測定可能範囲は０＜ｍ／ｚ＜∞である。
(iv)安価：機械系は高精度不要で、構造が単純である。
という特長点を有する。すなわち、ＴＯＦＭＳは、ＭＡ
ＬＤＩと多くの共通した特長を有し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯ
ＦＭＳは、相性の良いもの同士を組合わせた好ましい方
法の一つである。
【００１９】このようなＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ装置の
一例を図１を参照して説明する。図１において、窒素レ
ーザー発振器(1) から窒素レーザー光（波長：３３７ｎ
ｍ）が発振される。レーザー光はミラー(2) で反射さ
れ、光学フィルター(3) によって調光され、光学レンズ
(4) で集光された後、サンプル(5) に照射される。発生
したイオンは、Ｖ0 の印加電圧によって図１における右
方向に引き出される。引き出されたイオンは、イオンレ
ンズ(6) 電圧ＶL を印加することにより、各イオン(7)
が平行飛行できるようになる。
一例を図１を参照して説明する。図１において、窒素レ
ーザー発振器(1) から窒素レーザー光（波長：３３７ｎ
ｍ）が発振される。レーザー光はミラー(2) で反射さ
れ、光学フィルター(3) によって調光され、光学レンズ
(4) で集光された後、サンプル(5) に照射される。発生
したイオンは、Ｖ0 の印加電圧によって図１における右
方向に引き出される。引き出されたイオンは、イオンレ
ンズ(6) 電圧ＶL を印加することにより、各イオン(7)
が平行飛行できるようになる。
【００２０】ここで、偏向板(8) 電圧ＶD ＝０かつリフ
レクター(9) 電圧ＶR ＝０の場合、イオンは直線飛行し
第１検出器(10)に到達する。この方法をリニアー型と呼
び、特に高感度の測定が可能である。これに対して、Ｖ
D ＝０かつリフレクター電圧（｜ＶR ｜＞｜Ｖ0 ｜）を
印加した場合、イオンはリフレクター内で折り返され、
第２検出器(11)に到達する。この方法をリフレクター型
と呼び、特に高精度・高分解能の測定が可能である。
レクター(9) 電圧ＶR ＝０の場合、イオンは直線飛行し
第１検出器(10)に到達する。この方法をリニアー型と呼
び、特に高感度の測定が可能である。これに対して、Ｖ
D ＝０かつリフレクター電圧（｜ＶR ｜＞｜Ｖ0 ｜）を
印加した場合、イオンはリフレクター内で折り返され、
第２検出器(11)に到達する。この方法をリフレクター型
と呼び、特に高精度・高分解能の測定が可能である。
【００２１】イオンは第１検出器(10)又は第２検出器(1
1)で検出増幅された後、電気信号（リニアー信号(12)、
リフレクター信号(13)）が測定回路へ導かれ、ＡＤ変換
器(14)によってデジタル信号に変換され、コンピュータ
(15)で処理される。
1)で検出増幅された後、電気信号（リニアー信号(12)、
リフレクター信号(13)）が測定回路へ導かれ、ＡＤ変換
器(14)によってデジタル信号に変換され、コンピュータ
(15)で処理される。
【００２２】飛行時間を測定するためには、時間の原点
（０点）を定めなければならないが、ＴＯＦＭＳでは通
常、イオンが発生した時間を０点とする。ＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦＭＳの場合、レーザー光発射とイオン発生が同時
とみなすことができるため、フォトダイオード(16)によ
るレーザー光検波信号を、ＴＯＦの基準時間（ＴＯＦ＝
０[s] ）を表すスタート信号(17)として扱うことができ
る。
（０点）を定めなければならないが、ＴＯＦＭＳでは通
常、イオンが発生した時間を０点とする。ＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦＭＳの場合、レーザー光発射とイオン発生が同時
とみなすことができるため、フォトダイオード(16)によ
るレーザー光検波信号を、ＴＯＦの基準時間（ＴＯＦ＝
０[s] ）を表すスタート信号(17)として扱うことができ
る。
【００２３】図１のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ装置で、ペ
プチド分子（Ｍ）のＭＳ／ＭＳ測定を行なう場合、通常
は偏向板(8) に電圧を印加（ＶD ≠０）しておき、図１
の下方にイオンを偏向させる。そして、注目しているイ
オン（［Ｍ＋Ｈ］＋）が偏向板(8) を通過する一瞬のみ
ＶD ＝０とする。なお、注目しているイオン（［Ｍ＋
Ｈ］＋）が飛行途中で分解したイオンも、分解しないイ
オンと同速度で飛行し、同一時刻に偏向板(8) を通過す
る。
プチド分子（Ｍ）のＭＳ／ＭＳ測定を行なう場合、通常
は偏向板(8) に電圧を印加（ＶD ≠０）しておき、図１
の下方にイオンを偏向させる。そして、注目しているイ
オン（［Ｍ＋Ｈ］＋）が偏向板(8) を通過する一瞬のみ
ＶD ＝０とする。なお、注目しているイオン（［Ｍ＋
Ｈ］＋）が飛行途中で分解したイオンも、分解しないイ
オンと同速度で飛行し、同一時刻に偏向板(8) を通過す
る。
【００２４】この操作によって、注目しているイオン及
びそれが分解したイオンのみが、図１の右方向に直線飛
行でき、リフレクター(9) に導入される（これが１段目
のＭＳとなる）。
びそれが分解したイオンのみが、図１の右方向に直線飛
行でき、リフレクター(9) に導入される（これが１段目
のＭＳとなる）。
【００２５】リフレクター電圧ＶR を印加した状態で
は、注目しているイオン及び分解したイオンすべてが折
り返すが、分解したイオンは途中で運動エネルギーの一
部を失っているため、エネルギー（ｍ／ｚ値）の小さい
順にリフレクター(9) 内で先に折り返し、分解しないイ
オン（［Ｍ＋Ｈ］＋）よりも早く第２検出器(11)に到達
する（これが２段目のＭＳとなる）。
は、注目しているイオン及び分解したイオンすべてが折
り返すが、分解したイオンは途中で運動エネルギーの一
部を失っているため、エネルギー（ｍ／ｚ値）の小さい
順にリフレクター(9) 内で先に折り返し、分解しないイ
オン（［Ｍ＋Ｈ］＋）よりも早く第２検出器(11)に到達
する（これが２段目のＭＳとなる）。
【００２６】図１の装置のリフレクター(9) では、分解
したイオンまでエネルギー収束できるため、ＶR 一定の
ままですべてのイオンを同時に検出することができる。
したイオンまでエネルギー収束できるため、ＶR 一定の
ままですべてのイオンを同時に検出することができる。
【００２７】このようにして、ペプチド分子をＭＡＬＤ
Ｉ法でイオン化させ、ＴＯＦＭＳによって、ポストソー
ス分解イオンを分離検出することができる。
Ｉ法でイオン化させ、ＴＯＦＭＳによって、ポストソー
ス分解イオンを分離検出することができる。
【００２８】本発明においては、分析すべきペプチド分
子の末端に、電荷を有するアミノ酸を予め結合させてお
く。ペプチド分子末端に、電荷を有するアミノ酸を結合
させておくことによって、ポストソース分解イオンの発
生を容易にできる。
子の末端に、電荷を有するアミノ酸を予め結合させてお
く。ペプチド分子末端に、電荷を有するアミノ酸を結合
させておくことによって、ポストソース分解イオンの発
生を容易にできる。
【００２９】ペプチド分子の末端に予め結合すべき電荷
を有するアミノ酸は、電荷を有するものであれば良く、
α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、δ−アミ
ノ酸のいずれであっても良い。α−アミノ酸としては、
例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ
酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン等の塩基性アミノ
酸を挙げることができる。
を有するアミノ酸は、電荷を有するものであれば良く、
α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、δ−アミ
ノ酸のいずれであっても良い。α−アミノ酸としては、
例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ
酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン等の塩基性アミノ
酸を挙げることができる。
【００３０】分析すべきペプチド分子の末端に、このよ
うな電荷を有するアミノ酸を結合させるには、従来より
公知のペプチド合成法を適用することができる。すなわ
ち、液相法、固相法のいずれの合成法によってもアミノ
酸を結合させることができる。
うな電荷を有するアミノ酸を結合させるには、従来より
公知のペプチド合成法を適用することができる。すなわ
ち、液相法、固相法のいずれの合成法によってもアミノ
酸を結合させることができる。
【００３１】本発明によれば、分析すべきペプチド分子
の末端に、電荷を有するアミノ酸を予め結合させておく
ことによって、ポストソース分解イオンの発生を容易に
できるので、従来、分析すべきペプチド分子そのままで
はポストソース分解イオンの発生が不十分なため分析不
可能又は困難であったペプチドをも分析することが可能
となる。
の末端に、電荷を有するアミノ酸を予め結合させておく
ことによって、ポストソース分解イオンの発生を容易に
できるので、従来、分析すべきペプチド分子そのままで
はポストソース分解イオンの発生が不十分なため分析不
可能又は困難であったペプチドをも分析することが可能
となる。
【００３２】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。ペプチドH-ＲＶＹＩＨＰＦ-OH と、この末端
にＤを結合させたペプチドH-ＤＲＶＹＩＨＰＦ-OH の分
析を行なった。
説明する。ペプチドH-ＲＶＹＩＨＰＦ-OH と、この末端
にＤを結合させたペプチドH-ＤＲＶＹＩＨＰＦ-OH の分
析を行なった。
【００３３】［実施例］この実施例においては、ペプチ
ドH-ＤＲＶＹＩＨＰＦ-OH のアミノ酸配列の分析を、図
１のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ装置によって行なった。
ドH-ＤＲＶＹＩＨＰＦ-OH のアミノ酸配列の分析を、図
１のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ装置によって行なった。
【００３４】レーザー：パルス窒素レーザー３３７ｎｍ マトリックス：α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸 サンプル：ペプチド分子（０．１％ＴＦＡ）溶液とマト
リックス（０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル＝５／５）
溶液とを、ペプチド：マトリックスのモル比で１：２０
００で混合後乾燥させて調製した。 Ｖ0 ：２００００Ｖ
リックス（０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル＝５／５）
溶液とを、ペプチド：マトリックスのモル比で１：２０
００で混合後乾燥させて調製した。 Ｖ0 ：２００００Ｖ
【００３５】得られたＭＳ／ＭＳスペクトルチャート
（分解イオン強度出力：×２）を図２に示す。ペプチド
分子末端に電荷を有するＤが結合しているために、ＴＯ
ＦＭＳにおいて、ポストソース分解イオンが十分発生し
ている。図２の分解物ピーク上に示された［アルファベ
ット１文字＋数字］は、ペプチド結合（−ＣＲＨ−ＣＯ
−ＮＨ−ＣＲ' Ｈ−）の切れた部位を示す。アルファベ
ットａ，ｂ，ｃはＮ末端側、ｘ，ｙ，ｚはＣ末端側が残
っているシリーズであり、数字は残っているアミノ酸残
基の数を表す。
（分解イオン強度出力：×２）を図２に示す。ペプチド
分子末端に電荷を有するＤが結合しているために、ＴＯ
ＦＭＳにおいて、ポストソース分解イオンが十分発生し
ている。図２の分解物ピーク上に示された［アルファベ
ット１文字＋数字］は、ペプチド結合（−ＣＲＨ−ＣＯ
−ＮＨ−ＣＲ' Ｈ−）の切れた部位を示す。アルファベ
ットａ，ｂ，ｃはＮ末端側、ｘ，ｙ，ｚはＣ末端側が残
っているシリーズであり、数字は残っているアミノ酸残
基の数を表す。
【００３６】このＭＳ／ＭＳスペクトルチャートから、
分析を行なったペプチドのアミノ酸配列は、H-ＤＲＶＹ
ＩＨＰＦ-OH であることが明らかである。
分析を行なったペプチドのアミノ酸配列は、H-ＤＲＶＹ
ＩＨＰＦ-OH であることが明らかである。
【００３７】［比較例］ペプチドH-ＲＶＹＩＨＰＦ-OH
の分析を、実施例と同様の条件で、図１のＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦＭＳ装置によって行なったところ、図３に示すＭ
Ｓ／ＭＳスペクトルチャート（分解イオン強度出力：×
５０）が得られた。このチャートから分かるように、こ
の比較例ではペプチド分子末端に電荷を有するアミノ酸
が結合していないために、ポストソース分解イオンの発
生がイオン種及びイオン感度の両面において不十分であ
り、アミノ酸配列の決定を行うことは困難であった。
の分析を、実施例と同様の条件で、図１のＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦＭＳ装置によって行なったところ、図３に示すＭ
Ｓ／ＭＳスペクトルチャート（分解イオン強度出力：×
５０）が得られた。このチャートから分かるように、こ
の比較例ではペプチド分子末端に電荷を有するアミノ酸
が結合していないために、ポストソース分解イオンの発
生がイオン種及びイオン感度の両面において不十分であ
り、アミノ酸配列の決定を行うことは困難であった。
【００３８】
【発明の効果】本発明のペプチドのアミノ酸配列決定方
法によれば、上述のように、分析すべきペプチド分子の
末端に、電荷を有するアミノ酸を予め結合させておくこ
とによって、ポストソース分解イオンの発生を容易にで
きるので、従来、分析すべきペプチド分子そのままでは
ポストソース分解イオンの発生が不十分なため分析不可
能であったペプチドをも分析することが可能となる。そ
の結果、広範な種類のペプチドに、本発明の方法を適用
してアミノ酸配列を決定することがてきる。
法によれば、上述のように、分析すべきペプチド分子の
末端に、電荷を有するアミノ酸を予め結合させておくこ
とによって、ポストソース分解イオンの発生を容易にで
きるので、従来、分析すべきペプチド分子そのままでは
ポストソース分解イオンの発生が不十分なため分析不可
能であったペプチドをも分析することが可能となる。そ
の結果、広範な種類のペプチドに、本発明の方法を適用
してアミノ酸配列を決定することがてきる。
【００３９】また、本発明の方法は、各種のペプチド合
成法によって合成されたペプチド分子のアミノ酸配列を
確認したい場合にも有用である。
成法によって合成されたペプチド分子のアミノ酸配列を
確認したい場合にも有用である。
【図１】 本発明の方法に適用し得るＭＡＬＤＩ−ＴＯ
ＦＭＳ装置の一例を示す概略図である。
ＦＭＳ装置の一例を示す概略図である。
【図２】 本発明の方法により得られたペプチドH-ＤＲ
ＶＹＩＨＰＦ-OH のＭＳ／ＭＳスペクトルチャートであ
る。
ＶＹＩＨＰＦ-OH のＭＳ／ＭＳスペクトルチャートであ
る。
【図３】 従来法により得られたペプチドH-ＲＶＹＩＨ
ＰＦ-OH のＭＳ／ＭＳスペクトルチャートである。
ＰＦ-OH のＭＳ／ＭＳスペクトルチャートである。
(1) …窒素レーザー発振器 (2) …ミラー (3) …光学フィルター (4) …光学レンズ (5) …サンプル (6) …イオンレンズ (7) …飛行イオン (8) …偏向板 (9) …リフレクター (10)…第１検出器 (11)…第２検出器 (12)…リニアー信号 (13)…リフレクター信号 (14)…ＡＤ変換器 (15)…コンピュータ (16)…フォトダイオード (17)…スタート信号
Claims (3)
- 【請求項１】 分析すべきペプチド分子の末端に、電荷
を有するアミノ酸を結合させ、このアミノ酸が結合した
ペプチド分子をイオン化させると共に分解イオンを発生
させ、これらのイオンを質量分析法により分離検出する
ことによって、ペプチドのアミノ酸配列を決定する方
法。 - 【請求項２】 アミノ酸が結合したペプチド分子をマト
リックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）に
よってイオン化させる、請求項１に記載のペプチドのア
ミノ酸配列を決定する方法。 - 【請求項３】 飛行時間型質量分析法（ＴＯＦＭＳ）に
よって、イオンを分離検出する、請求項２に記載のペプ
チドのアミノ酸配列を決定する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26346096A JP3785695B2 (ja) | 1996-09-11 | 1996-09-11 | ペプチドのアミノ酸配列決定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26346096A JP3785695B2 (ja) | 1996-09-11 | 1996-09-11 | ペプチドのアミノ酸配列決定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1090226A true JPH1090226A (ja) | 1998-04-10 |
| JP3785695B2 JP3785695B2 (ja) | 2006-06-14 |
Family
ID=17389824
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26346096A Expired - Fee Related JP3785695B2 (ja) | 1996-09-11 | 1996-09-11 | ペプチドのアミノ酸配列決定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3785695B2 (ja) |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004072106A1 (ja) * | 2003-02-14 | 2004-08-26 | Shimadzu Corporation | ペプチドのリン酸基を脱離する方法及びペプチドの解析方法 |
| JP2005139174A (ja) * | 2003-10-16 | 2005-06-02 | Shimadzu Corp | タンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する方法 |
| JP2005148054A (ja) * | 2003-10-24 | 2005-06-09 | Shimadzu Corp | 生体分子の標識アミド化法及び生体分子の解析法 |
| JP2005166639A (ja) * | 2003-10-14 | 2005-06-23 | Micromass Uk Ltd | 質量分析計 |
| JP2005302728A (ja) * | 2004-04-13 | 2005-10-27 | Kratos Analytical Ltd | イオンセレクタ |
| JP2006292602A (ja) * | 2005-04-13 | 2006-10-26 | Shimadzu Corp | 還元性物質を用いるタンパク質又はペプチドの構造解析手法 |
| JP2007115556A (ja) * | 2005-10-21 | 2007-05-10 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 質量分析方法 |
| WO2008038642A1 (fr) * | 2006-09-27 | 2008-04-03 | Riken | Procédé d'analyse d'échantillon et appareil d'analyse |
| JP2010156719A (ja) * | 2003-10-24 | 2010-07-15 | Shimadzu Corp | 糖鎖のアミド化法及び糖鎖の解析法 |
| JP2014514591A (ja) * | 2011-05-13 | 2014-06-19 | コリア リサーチ インスティチュート オブ スタンダーズ アンド サイエンス | 超高速マルチモード質量分析のための飛行時間に基づく質量顕微鏡システム |
-
1996
- 1996-09-11 JP JP26346096A patent/JP3785695B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004072106A1 (ja) * | 2003-02-14 | 2004-08-26 | Shimadzu Corporation | ペプチドのリン酸基を脱離する方法及びペプチドの解析方法 |
| JP2005166639A (ja) * | 2003-10-14 | 2005-06-23 | Micromass Uk Ltd | 質量分析計 |
| JP2005139174A (ja) * | 2003-10-16 | 2005-06-02 | Shimadzu Corp | タンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する方法 |
| JP2005148054A (ja) * | 2003-10-24 | 2005-06-09 | Shimadzu Corp | 生体分子の標識アミド化法及び生体分子の解析法 |
| JP2010156719A (ja) * | 2003-10-24 | 2010-07-15 | Shimadzu Corp | 糖鎖のアミド化法及び糖鎖の解析法 |
| JP4551160B2 (ja) * | 2003-10-24 | 2010-09-22 | 株式会社島津製作所 | 標識アミド化を用いたタンパク質又はペプチドの解析法 |
| JP2005302728A (ja) * | 2004-04-13 | 2005-10-27 | Kratos Analytical Ltd | イオンセレクタ |
| JP2006292602A (ja) * | 2005-04-13 | 2006-10-26 | Shimadzu Corp | 還元性物質を用いるタンパク質又はペプチドの構造解析手法 |
| JP4517925B2 (ja) * | 2005-04-13 | 2010-08-04 | 株式会社島津製作所 | 還元性物質を用いるタンパク質又はペプチドの構造解析手法 |
| JP2007115556A (ja) * | 2005-10-21 | 2007-05-10 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 質量分析方法 |
| WO2008038642A1 (fr) * | 2006-09-27 | 2008-04-03 | Riken | Procédé d'analyse d'échantillon et appareil d'analyse |
| JP2014514591A (ja) * | 2011-05-13 | 2014-06-19 | コリア リサーチ インスティチュート オブ スタンダーズ アンド サイエンス | 超高速マルチモード質量分析のための飛行時間に基づく質量顕微鏡システム |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3785695B2 (ja) | 2006-06-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2721029B2 (ja) | 生体分子のレーザ脱着方法および装置 | |
| Overberg et al. | Matrix‐assisted laser desorption of large biomolecules with a TEA‐CO2‐laser | |
| US5965884A (en) | Atmospheric pressure matrix assisted laser desorption | |
| Demirev et al. | Matrix‐assisted laser desorption with ultra‐short laser pulses | |
| Spengler et al. | Ultraviolet laser desorption/ionization mass spectrometry of proteins above 100,000 daltons by pulsed ion extraction time-of-flight analysis | |
| Hettich et al. | Investigation of UV matrix-assisted laser desorption Fourier transform mass spectrometry for peptides | |
| US20090039282A1 (en) | Matrix-assisted laser desorption with high ionization yield | |
| Salehpour et al. | Laser‐induced desorption of proteins | |
| Muddiman et al. | Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Instrumentation and applications | |
| JP3785695B2 (ja) | ペプチドのアミノ酸配列決定方法 | |
| Chevrier et al. | A matrix‐assisted laser desorption time‐of‐flight mass spectrometer based on a 600ps, 1.2 mJ nitrogen laser | |
| JP4052094B2 (ja) | レーザー脱離イオン化質量分析における試料作成方法とそれに用いるサンプルプレート | |
| WO2004068531A1 (de) | Time-of-flight massenspektrometer | |
| US8110795B2 (en) | Laser system for MALDI mass spectrometry | |
| Creaser et al. | Atmospheric pressure matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry: A review | |
| US7060974B2 (en) | Laser desorption ionization mass spectrometric method and sample plate used in such a method | |
| Perera et al. | Coumarin laser dyes as matrices for matrix assisted UV laser desorption/ionization mass spectrometry | |
| James et al. | The basics of matrix-assisted laser desorption, ionisation time-of-flight mass spectrometry and post-source decay analysis | |
| Spengler | New instrumental approaches to collision-induced dissociation using a time-of-flight instrument | |
| JP3541573B2 (ja) | レーザー脱離イオン化質量分析装置 | |
| Wattenberg et al. | Laser desorption mass spectrometry on liquid beams | |
| GB2453407A (en) | Matrix-assisted laser desorption with high ionization yield | |
| Karas et al. | Matrix-assisted laser desorption-ionization (MALDI) mass spectrometry: Principles and applications | |
| Wait | Introduction to mass spectrometry | |
| Ens et al. | Suppression of metastable interference in matrix‐assisted laser desorption/ionization (MALDI) spectra in a reflecting time‐of‐flight mass spectrometer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20041124 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050510 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20060228 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20060313 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100331 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100331 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110331 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110331 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120331 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120331 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130331 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140331 Year of fee payment: 8 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |