JP4551160B2 - 標識アミド化を用いたタンパク質又はペプチドの解析法 - Google Patents
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下記は、本発明の解析法に用いられる標識アミド化法に向けられる。
生体分子が有するカルボキシル基に、窒素原子同位体15Nで標識されたアミド化試薬を作用させることにより、前記生体分子の標識アミド化体を得る、標識アミド化法。
すなわち、タンパク質又はペプチドが有するカルボキシル基に、窒素原子同位体15Nで標識されたアミド化試薬を作用させることにより、標識アミド化タンパク質又は標識アミド化ペプチドを得る、標識アミド化法。
前記カルボキシル基が、タンパク質又はペプチドの酸性アミノ酸残基が有するカルボキシル基である、上記の標識アミド化法。
前記酸性アミノ酸残基が、グルタミン酸残基及びアスパラギン酸残基から選ばれる、上記の標識アミド化法。
(1)タンパク質又はペプチドが有するカルボキシル基に、標識アミド化試薬である塩化[ 15 N]アンモニウムを作用させることにより、前記タンパク質又はペプチドの標識アミド化体を得て、前記標識アミド化体を質量分析法によって解析する、タンパク質又はペプチドの解析方法。
(2)前記カルボキシル基が、タンパク質又はペプチドの酸性アミノ酸残基が有するカルボキシル基である、(1)に記載の解析法。
(3)前記酸性アミノ酸残基が、グルタミン酸残基及びアスパラギン酸残基から選ばれる、(2)に記載の解析法。
本発明は、生体分子が有するカルボキシル基(−COOH基)を15N標識アミド化して15N標識カルバモイル基(−CO15NH2基)に変換する方法である。生体分子としては、タンパク質・ペプチドや糖鎖等が挙げられる。なお本明細書において、「生体分子」とは生体高分子を含む意味で用いる。
本発明は、カルボキシル基が15N標識アミド化された、生体分子のアミド化体である。このアミド化体は、上記の標識アミド化法において記載したように、生体分子を標識アミド化することによって得ることができる。生体分子としては、タンパク質、ペプチド、糖鎖等が挙げられる。解析したい生体分子の標識アミド化体である場合は、質量分析によって解析する場合に特に有用に用いられる。
本発明は、生体分子が有するカルボキシル基(−COOH基)をアミド化してカルバモイル基(−CONH2基)に変換する処理を行うことにより生体分子の解析を行う方法である。解析すべき生体分子としては、タンパク質・ペプチドや糖鎖等が挙げられる。
ミオグロビンに対し、塩化[14N]アンモニウム及び塩化[15N]アンモニウムを用いて、アミド化が行われることを質量分析によって確認する実験をそれぞれ行った。
ミオグロビン600pmolを、5M 塩酸グアニジン/1M 14NH4Cl 50μlに溶解した。この溶液に、5M 塩酸グアニジン/0.4M1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDAC)を15μl添加して反応液を調製し、得られた反応液を室温で2時間インキュベーションした。マイクロコンYM−10(ミリポア社製)に反応液を加え、さらに0.001M HClを335μl加え、14000rpm、4℃で70分遠心した。さらに0.001M HClを400μl加え、14000rpm、4℃で70分遠心した。その後、50mM NH4HCO3を加え、溶液の全量が100μlになるように調製した。これに1MDDTを1μl添加し、56℃で1時間インキュベーションした。さらに1Mヨードアセトアミドを5.5μl添加し、室温で45分インキュベーションした。その後、100mM CaCl2を5μl加えた。Sequencing Grade Modified Trypsin(プロメガ社製)を6pmol添加し、37℃で16時間インキュベーションした。0.1重量%TFAを10μl添加し、ZipTip μ-C18(ミリポア社製)を用いて脱塩精製を行うことにより、ミオグロビンのトリプシン消化断片を得た。
シアル酸含有糖鎖であるシアリルラクト−N−フコペンタオース(Sialyllacto-N-Fucopentaose;SLNFP、Exact Mass:1144.40)に対し、塩化[14N]アンモニウム及び塩化[15N]アンモニウムを用いて、アミド化が行われることを質量分析によって確認する実験をそれぞれ行った。なお、SLNFPは、N−アセチルノイラミン酸(NeuNAc)、ガラクトース(Galactose)、N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)、グルコース(Glucose)、及びフコース(Fucose)を構成糖とする糖鎖である。SLNFPの構造は、後述の図2中に記載した。
1nmol/μl Sialyllacto-N-Fucopentaose IV(SLNFP)水溶液1μlを、50μlの1M 14NH4Cl水溶液に添加し、15μlの1M 4−(4,6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリニウム=クロリドn水和物(DMT−MM)水溶液を加え(pH4.2)、37℃で24時間インキュベーションした。
直径1cm×高さ5.5cmのリアクションベッセル(島津製作所製)にSephadex G-10(アマシャムバイオサイエンス製)を2.3ml充填し、大気圧下で、生成物のゲルろ過クロマトグラフィーを行った。26〜28drop目(1drop≒40μl)を回収し、遠心乾燥を行った。
乾燥した回収物を5μlのH2Oに溶解し、1μlを非標識アミド化SLNFPの質量分析測定用試料とした。
Claims (3)
- タンパク質又はペプチドが有するカルボキシル基に、標識アミド化試薬である塩化[ 15 N]アンモニウムを作用させることにより、前記タンパク質又はペプチドの標識アミド化体を得て、前記標識アミド化体を質量分析法によって解析する、タンパク質又はペプチドの解析法。
- 前記カルボキシル基が、タンパク質又はペプチドの酸性アミノ酸残基が有するカルボキシル基である、請求項1に記載の解析法。
- 前記酸性アミノ酸残基が、グルタミン酸残基及びアスパラギン酸残基から選ばれる、請求項2に記載の解析法。
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