JP2006288353A - 高感度な既知変異遺伝子検出方法、およびegfr変異遺伝子検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】標的部位に対して、野生型遺伝子の配列を有するPNAからなるクランププライマーと、LNAを含み変異遺伝子の配列を有する変異プローブと、が競合してハイブリダイゼーションするように両者の配列を設計し、遺伝子増幅反応を行うことによって、既知変異遺伝子の検出を高感度で得る「PNA−LNA−PCRクランプ法」を提供する。また、この方法を用いて既知のEGFR遺伝子の変異を特異的、かつ高感度に検出できる検出法と、それに使用する変異プライマーとクランププライマーを提供する。
【選択図】図1
Description
この場合は、変異プローブの5'側である上流にハイブリダイゼーションする増幅プライマーが無いことが好ましい。また、この場合には、プライマーの配列中に標的部位を含んでいてもよい。増幅プライマーの数は、標的部位を含む検出領域を前記遺伝子増幅法によって増幅可能であれば特に問わない。例えば、1つのプライマーが、伸長する方向が向かい合うように単独でハイブリダイゼーションできる場合には、増幅プライマーの数は1つであってもよい。また、伸長する方向がお互いに向かい合う形で鋳型にハイブリダイゼーションできるばあいであれば、異なる1つの増幅プライマーであってもよい。増幅プライマーの塩基数は、10塩基から40塩基の範囲であれば特に問わないが、好ましくは15塩基から30塩基であり、特に好ましくは18塩基から25塩基である。増幅プライマー間の距離、すなわち検出領域は100塩基から5000塩基(5kb:以下1000塩基を1kbで表す)の範囲であれば特に問わないが、好ましくは150塩基から2kbである。増幅プライマーの配列は、標的部位を含む検出領域を前記遺伝子増幅法によって増幅可能であり、Tm値が50℃から65℃の範囲内であり、好ましくは55℃から60℃の範囲内であれば特に問わない。増幅プライマーの配列のデザインは、マニュアルで行ってもよいし、適当なプライマーデザイン用のソフトウェアを用いてもよい。例えば、Primer3 software (http://frodo.wi.mit.edu/cgi−bin/primer3/primer3.cgi)等を用いてもよい。前記変異プローブが増幅プライマーとして機能してもよい。
バッファーは、前記DNAポリメラーゼの活性が得られる至適pH、および至適塩濃度を有する。使用する遺伝子増幅法によっては、さらにリボヌクレアーゼH(RNaseH)や逆転写酵素(RT)等を含んでいてもよい。また、遺伝子増幅用反応液は、各遺伝増幅法の反応用として様々なタイプが市販されているが、そのような市販のキットに添付されたものを用いてもよい。Taq DNAポリメラーゼを酵素とする場合、当該遺伝子増幅用反応液の組成の基本的な一例を挙げれば、10mM Tris−HCL(pH8.3)/50mM KCl/2mM MgCl2/2.5U Taq DNAポリメラーゼである。もちろん、この条件に限られるものではない。
上記塩基配列のうちAがLNAに置換されているものであり、請求項12に関する。当該塩基配列は、前記G719Cの点突然変異遺伝子において2140番塩基から2163番塩基のアンチセンス側の配列に該当する。LNAで構成されているAは、G719C変異の原因である2155番塩基に相当する。したがって、当該G719Cp変異プローブは、実施形態11の方法によりG719Cの点突然変異遺伝子を特異的に検出可能なポリヌクレオチドである。なお、当該塩基配列は、DNAを基礎として構成されているが、一部がRNAから構成されていてもよい。
上記塩基配列のうちTがLNAに置換されているものであり、請求項13に関する。当該塩基配列は、前記G719Cの点突然変異遺伝子において2140番塩基から2163番塩基のアンチセンス側の配列に該当する。LNAで構成されているTは、G719S変異の原因である2155番塩基に相当する。したがって、当該G719Sp変異プローブは、実施形態11の方法によりG719Sの点突然変異遺伝子を特異的に検出可能なポリヌクレオチドである。なお、当該塩基配列は、DNAを基礎として構成されているが、一部がRNAから構成されていてもよい。
上記塩基配列のうちCがLNAに置換されているものであり、請求項14に関する。当該塩基配列は、前記L858Rの点突然変異遺伝子において2566番塩基から2580番塩基のアンチセンス側の配列に該当する。LNAで構成されているCは、L858R変異の原因である2573番塩基に相当する。したがって、当該L858Rp変異プローブは、実施形態11の方法によりL858Rの点突然変異遺伝子を特異的に検出可能なポリヌクレオチドである。なお、当該塩基配列は、DNAを基礎として構成されているが、一部がRNAから構成されていてもよい。
上記塩基配列のうちTがLNAに置換されているものであり、請求項15に関する。当該塩基配列は、前記L861Qの点突然変異遺伝子において2575番塩基から2589番塩基のアンチセンス側の配列に該当する。LNAで構成されているCは、L861Q変異の原因である2582番塩基に相当する。したがって、当該L861Qp変異プローブは、実施形態11の方法によりL861Qの点突然変異遺伝子を特異的に検出可能なポリヌクレオチドである。なお、当該塩基配列は、DNAを基礎として構成されているが、一部がRNAから構成されていてもよい。
上記塩基配列のうち少なくとも一つ以上がLNAに置換されているものであり、請求項16に関する。当該塩基配列は、前記E746−A750del−1の欠失変異遺伝子に基づく配列であり、野生型遺伝子の2228番塩基から2234番塩基と、2250番塩基から2264番塩基のセンス側の配列に該当する。このうち少なくとも一つ以上がLNAで構成されていればよいが、特に2250番塩基aがLNAで構成されていることが好ましい。当該LE746−A750del−1p変異プローブは、実施形態11の方法によりE746−A750del−1の欠失突然変異遺伝子を特異的に検出可能なポリヌクレオチドである。なお、当該塩基配列は、DNAを基礎として構成されているが、一部がRNAから構成されていてもよい。
上記塩基配列のうち少なくとも一つ以上がLNAに置換されているものであり、請求項17に関する。当該塩基配列は、前記E746−A750del−2の欠失変異遺伝子に基づく配列であり、野生型遺伝子の2226番塩基から2235番塩基と、2251番塩基から2259番塩基のセンス側の配列に該当する。このうち少なくとも一つ以上がLNAで構成されていればよいが、特に2226番塩基gがLNAで構成されていることが好ましい。当該LE746−A750del−1p変異プローブは、実施形態11の方法によりE746−A750del−2の欠失突然変異遺伝子を特異的に検出可能なポリヌクレオチドである。なお、当該塩基配列は、DNAを基礎として構成されているが、一部がRNAから構成されていてもよい。
上記塩基配列のうち少なくとも一つ以上がLNAに置換されているものであり、請求項18に関する。当該塩基配列は、前記L747−A750delT751Sの欠失変異遺伝子に基づく配列であり、野生型遺伝子の2228番塩基から2239番塩基と、2252番塩基から2258番塩基のセンス側の配列に該当する。このうち少なくとも一つ以上がLNAで構成されていればよいが、特に2239番塩基tと2252番塩基cがLNAで構成されていることが好ましい。当該L747−A750delT751Sp変異プローブは、実施形態11の方法によりL747−A750delT751Sの欠失突然変異遺伝子を特異的に検出可能なポリヌクレオチドである。なお、当該塩基配列は、DNAを基礎として構成されているが、一部がRNAから構成されていてもよい。
上記塩基配列のうち少なくとも一つ以上がLNAに置換されているものであり、請求項19に関する。当該塩基配列は、前記L747−S752delP753Sの欠失変異遺伝子に基づく配列であり、野生型遺伝子の2228番塩基から2239番塩基と、2258番塩基から2266番塩基のセンス側の配列に該当する。このうち少なくとも一つ以上がLNAで構成されていればよいが、特に2258番塩基cがLNAで構成されていることが好ましい。当該L747−S752delP753Sp変異プローブは、実施形態11の方法によりL747−S752delP753Sの欠失突然変異遺伝子を特異的に検出可能なポリヌクレオチドである。なお、当該塩基配列は、DNAを基礎として構成されているが、一部がRNAから構成されていてもよい。
上記塩基配列のうち少なくとも一つ以上がLNAに置換されているものであり、請求項20に関する。当該塩基配列は、前記L747−E740delA750Pの欠失変異遺伝子に基づく配列であり、野生型遺伝子の2230番塩基から2239番塩基と、2248番塩基から2258番塩基のセンス側の配列に該当する。このうち少なくとも一つ以上がLNAで構成されていればよいが、特に2248番塩基cがLNAで構成されていることが好ましい。当該L747−E740delA750Pp変異プローブは、実施形態11の方法によりL747−E740delA750Pの欠失突然変異遺伝子を特異的に検出可能なポリヌクレオチドである。なお、当該塩基配列は、DNAを基礎として構成されているが、一部がRNAから構成されていてもよい。
上記塩基配列のうち少なくとも一つ以上がLNAに置換されているものであり、請求項21に関する。当該塩基配列は、前記L747−S752delE746Vの欠失変異遺伝子に基づく配列であり、野生型遺伝子の2229番塩基から2237番塩基と、2256番塩基から2266番塩基のセンス側の配列に該当する。このうち少なくとも一つ以上がLNAで構成されていればよいが、特に2257番塩基cがLNAで構成されていることが好ましい。当該L747−S752delE746Vp変異プローブは、実施形態11の方法によりL747−S752delE746Vの欠失突然変異遺伝子を特異的に検出可能なポリヌクレオチドである。なお、当該塩基配列は、DNAを基礎として構成されているが、一部がRNAから構成されていてもよい。
上記塩基配列のうち少なくとも一つ以上がLNAに置換されているものであり、請求項22に関する。当該塩基配列は、前記S752−I759delの欠失変異遺伝子に基づく配列であり、野生型遺伝子の2242番塩基から2253番塩基と、2278番塩基から2283番塩基のセンス側の配列に該当する。このうち少なくとも一つ以上がLNAで構成されていればよいが、特に2249番塩基cと2252番塩基cがLNAで構成されていることが好ましい。当該S752−I759delp変異プローブは、実施形態11の方法によりS752−I759delの欠失突然変異遺伝子を特異的に検出可能なポリヌクレオチドである。なお、当該塩基配列は、DNAを基礎として構成されているが、一部がRNAから構成されていてもよい。
上記塩基配列の全てがPNAからなるポリヌクレオチドであり、請求項23に関する。当該塩基配列は野生型遺伝子に基づく配列であり、2146番塩基から2159番塩基のアンチセンス側の配列に該当する。当該G179cは、実施形態11の方法により前記G719C、またはG719Sの点突然変異遺伝子を検出する上で、いずれの点突然変異遺伝子の検出用クランププライマーとしても使用できるポリヌクレオチドである。
上記塩基配列の全てがPNAからなるポリヌクレオチドであり、請求項24に関する。当該塩基配列は野生型遺伝子に基づく配列であり、2239番塩基から2256番塩基のセンス側の配列に該当する。当該Delc1は、実施形態11の方法により欠失変異遺伝子を検出する上で、前記7種類のいずれの欠失変異遺伝子の検出用のクランププライマーとしても使用できるポリヌクレオチドである。
上記塩基配列の全てがPNAからなるポリヌクレオチドであり、請求項25に関する。当該塩基配列は野生型遺伝子に基づく配列であり、2568番塩基から2583番塩基のアンチセンス側の配列に該当する。当該L858cは、実施形態11の方法により前記L858Rの点突然変異遺伝子を検出する上で、検出用クランププライマーとしても使用できるポリヌクレオチドである。
上記塩基配列の全てがPNAからなるポリヌクレオチドであり、請求項25に関する。当該塩基配列は野生型遺伝子に基づく配列であり、2575番塩基から2589番塩基のアンチセンス側の配列に該当する。当該L861cは、実施形態11の方法により前記L861Qの点突然変異遺伝子を検出する上で、検出用クランププライマーとしても使用できるポリヌクレオチドである。
請求項12に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、請求項23に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項11に記載の変異遺伝子検出方法であり、請求項27に関する。当該変異プローブとクランププライマーの組み合わせによる実施形態1から10のいずれか一に記載の方法は、EGFRの点突然変異G719Cを検出する上で好適である。
請求項13に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、請求項23に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項11に記載の変異遺伝子検出方法であり、請求項28に関する。当該変異プローブとクランププライマーの組み合わせによる実施形態1から10のいずれか一に記載の方法は、EGFRの点突然変異G719Sを検出する上で好適である。
請求項14に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、請求項25に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項11に記載の変異遺伝子検出方法であり、請求項29に関する。当該変異プローブとクランププライマーの組み合わせによる実施形態1から10のいずれか一に記載の方法は、EGFRの点突然変異L858Rを検出する上で好適である。
請求項15に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、請求項26に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項11に記載の変異遺伝子検出方法であり、請求項30に関する。当該変異プローブとクランププライマーの組み合わせによる実施形態1から10のいずれか一に記載の方法は、EGFRの点突然変異L861Qを検出する上で好適である。
請求項16に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、請求項24に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項11に記載の変異遺伝子検出方法であり、請求項31に関する。当該変異プローブとクランププライマーの組み合わせによる実施形態1から10のいずれか一に記載の方法は、EGFRの欠失変異E746−A750del−1を検出する上で好適である。
請求項17に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、請求項24に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項11に記載の変異遺伝子検出方法であり、請求項32に関する。当該変異プローブとクランププライマーの組み合わせによる実施形態1から10のいずれか一に記載の方法は、EGFRの欠失変異E746−A750del−2を検出する上で好適である。
請求項18に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、請求項24に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項11に記載の変異遺伝子検出方法であり、請求項33に関する。当該変異プローブとクランププライマーの組み合わせによる実施形態1から10のいずれか一に記載の方法は、EGFRの欠失変異L747−A750delT751Sを検出する上で好適である。
請求項19に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、請求項24に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項11に記載の変異遺伝子検出方法であり、請求項34に関する。当該変異プローブとクランププライマーの組み合わせによる実施形態1から10のいずれか一に記載の方法は、EGFRの欠失変異L747−S752delC753Sを検出する上で好適である。
請求項20に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、請求項24に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項11に記載の変異遺伝子検出方法であり、請求項35に関する。当該変異プローブとクランププライマーの組み合わせによる実施形態1から10のいずれか一に記載の方法は、EGFRの欠失変異L747−E740delA750Pを検出する上で好適である。
請求項21に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、
請求項24に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項11に記載の変異遺伝子検出方法であり、請求項36に関する。当該変異プローブとクランププライマーの組み合わせによる実施形態1から10のいずれか一に記載の方法は、EGFRの欠失変異L747−S752delE746Vを検出する上で好適である。
請求項22に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、請求項24に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項11に記載の変異遺伝子検出方法であり、請求項37に関する。当該変異プローブとクランププライマーの組み合わせによる実施形態1から10のいずれか一に記載の方法は、EGFRの欠失変異S752−I759delを検出する上で好適である。
している点と、さらに実施形態1、および2が配列の少なくとも一部がLNAにより構成されている変異プローブに対して、本実施形態では「前記クランププライマーよりも優先的にハイブリダイゼーションする変異プローブ」としている2点である。分子生物学の技術の進展は著しいものがあり、例えば一の分子ツールが開発されても極めて性質の良く似た別種の分子が直ちに市場に現れることは珍しくない。本実施形態では、かかる事態に備えPNAと類似の性質を有し、かつPNA誘導体でもない他の物質が開発され、あるいはLNAと類似の性質を有し、かつLNA誘導体ではない他の物質が開発されることを予期したものである。本発明は、PNAのような強い相補配列親和性を有し、特定の配列のクランピングが可能で、プライマーとして機能せず、また5'→3'ヌクレアーゼ耐性を有する性質の核酸類似体と、LNAのような強い相補配列親和性を有し、プライマーとして機能し、さらに5'→3'ヌクレアーゼ耐性を有しない性質の核酸類似体との組み合わせに大きな意味をもつためである。
なお、以下の実施例は、本発明の特定の態様の例示を提供するものであり、本発明の範囲を制限するためのものではない。
Sarkar G。 and Sommer S.S.、1990 Biotechniques,8:404−407
25mM TAPS(pH9.3)/50mM KCl/2mM MgCl2/1mM 2−mercaptoethanol/ 200μM 各dNTP(=dATP,dTTP,dGTP,dCTP)/1.25U TAKARA Ex Taq HS(タカラ バイオ)。上記「遺伝子増幅用反応液」に、「増幅プライマー」1組(ex21−F & ex21−B)をそれぞれ200mM添加した。この「増幅プライマー」は、L858Rの変異が存在する第21エクソン内の領域を増幅する。配列は以下の通り。ex21−F:5'−gcatgaactacttggaggac−3' ex21−B:5'−acctaaagccacctccttac−3'。これらの増幅プライマーは、Tm値が55℃から60℃の範囲になるようにデザインした。
(A)PNA(-)LNA(+):上記「遺伝子増幅用反応液」に、末端蛍光標識したE746−A750del−1用の「変異プローブ(E746−A750del−1pF)」のみを100nM添加した。配列は以下の通り。E746−A750del−1pF:5'−(6−FAM)ctatcaaAaCatctccgaaagc(BHQ1)−3'。ここで、配列の小文字はDNAを、大文字CはLNAを、6−FAMは蛍光色素を、BHQ1は蛍光抑制物質を、それぞれ示す。E746−A750del−1pFはIDT社に合成委託した。
(B)PNA(+)LNA(-):上記「遺伝子増幅用反応液」に、欠失変異共用の「クランププライマー(Delc1)」のみを5μM添加した。配列は実施形態11に示した通りである。Delc1はグライナージャパン社に合成委託した。
(C)PNA(+)LNA(+):上記「遺伝子増幅用反応液」に、E746−A750del−1用の前記「変異プローブ(E746−A750del−1pF)」100nMと、欠失変異共用の前記「クランププライマー(Delc1)」5μMを共に添加した。
PCR増幅産物のシークエンスニに用いたプライマーは前記F19である。その他は実施例1と同じであることから、その説明を省略する。
PNA−LNA PCR遺伝子増幅用反応液は実施例2(A)から(C)と同じなので省略する。
上記(A)から(C)のそれぞれに、前記2で調製したE746−A750del−2型遺伝子を含む各混合比の遺伝子プールを鋳型として25μg加えて、次のリアルタイムPCR反応に用いた。
0102 変異遺伝子の標的部位
0103 野生型遺伝子
0104 変異遺伝子
0105 クランププライマー
0106 変異プローブ
0107 増幅プライマー
0208 DNAポリメラーゼの5'→3'エキソヌクレアーゼ活性
0209 蛍光物質
0210 クエンチャー
Claims (39)
- 遺伝子プールに混在する既知の変異遺伝子の有無を検出する方法であって、
野生型遺伝子の配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションするPNAからなるクランププライマーと、
変異遺伝子の配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションし、配列の少なくとも一部がLNAにより構成されている変異プローブと、
前記遺伝子プールと
を遺伝子増幅用反応液中に共存させ、
遺伝子増幅法により変異遺伝子の標的部位を含む検出領域を選択的に増幅させることで、該変異遺伝子の有無を検出する変異遺伝子検出方法。 - 遺伝子プールに混在する既知の変異遺伝子の有無を検出する方法であって、
野生型遺伝子に相補的な配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションするPNAからなるクランププライマーと、
変異遺伝子に相補的な配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションし、配列の少なくとも一部がLNAにより構成されている変異プローブと、
前記遺伝子プールと
を遺伝子増幅用反応液中に共存させ、
遺伝子増幅法により変異遺伝子の標的部位を含む検出領域を選択的に増幅させることで、該変異遺伝子の有無を検出する変異遺伝子検出方法。 - 前記遺伝子増幅法はPCR法である請求項1または2に記載の変異遺伝子検出方法。
- 前記変異プローブはRNAを含む請求項1から3のいずれか一に記載の変異遺伝子検出方法。
- 前記変異プローブは一の末端が蛍光物質により標識され、他の末端が前記蛍光物質を抑制するクエンチャーにより標識されている請求項1から4のいずれか一に記載の変異遺伝子検出方法。
- 前記変異遺伝子の検出領域の増幅産物を核酸染色剤で染色する請求項1から4のいずれか一に記載の変異遺伝子検出方法。
- 前記変異遺伝子の検出領域の増幅産物の増加を蛍光強度の増加によって経時的に検出する請求項1から6のいずれか一に記載の変異遺伝子検出方法。
- 前記変異が点突然変異である請求項1から7のいずれか一に記載の変異遺伝子検出方法。
- 前記変異が欠失変異である請求項1から8のいずれか一に記載の変異遺伝子検出方法。
- 前記クランププライマーの鎖長が14塩基から18塩基である請求項1から9のいずれか一に記載の変異遺伝子検出方法。
- 前記変異遺伝子は、ヒト上皮成長因子受容体の変異遺伝子である請求項1から10のいずれか一に記載の変異遺伝子検出方法。
- 請求項11に記載の方法に用いる変異プローブであって、5'−accggagcAcagcactt−3'なる配列のうちAがLNAに置換されたポリヌクレオチド
- 請求項11に記載の方法に用いる変異プローブであって、5'−accggagcTcagcactt−3'なる配列のうちTがLNAに置換されたポリヌクレオチド
- 請求項11に記載の方法に用いる変異プローブであって、5'− tttggccCgcccaa−3'なる配列のうちCがLNAに置換されたポリヌクレオチド
- 請求項11に記載の方法に用いる変異プローブであって、5'−acccagcTgtttGg−3'なる配列のうちTとGがLNAに置換されたポリヌクレオチド
- 請求項11に記載の方法に用いる変異プローブであって、5'− ctatcaaaacatctccgaaagc−3'なる配列のうち少なくとも1つ以上がLNAに置換されたポリヌクレオチド
- 請求項11に記載の方法に用いる変異プローブであって、5'−cgctatcaagacatctccg−3'なる配列のうち少なくとも1つ以上がLNAに置換されたポリヌクレオチド
- 請求項11に記載の方法に用いる変異プローブであって、5'− ctatcaaggaatcatctcc−3'なる配列のうち少なくとも1つ以上がLNAに置換されたポリヌクレオチド
- 請求項11に記載の方法に用いる変異プローブであって、5'−ctatcaaggaatcgaaagcca−3'なる配列のうち少なくとも1つ以上がLNAに置換されたポリヌクレオチド
- 請求項11に記載の方法に用いる変異プローブであって、5'−atcaaggaaccaacatctcc−3'なる配列のうち少なくとも1つ以上がLNAに置換されたポリヌクレオチド
- 請求項11に記載の方法に用いる変異プローブであって、5'−tatcaaggttccgaaagcca−3'なる配列のうち少なくとも1つ以上がLNAに置換されたポリヌクレオチド
- 請求項11に記載の方法に用いる変異プローブであって、5'−agagaagcaacactcgat−3'なる配列のうち少なくとも1つ以上がLNAに置換されたポリヌクレオチド
- 請求項11に記載の方法に用いるクランププライマーであって、NH2−GAGCCCAGCACTTT−CONH2なる配列の全てがPNAからなるポリヌクレオチド
- 請求項11に記載の方法に用いるクランププライマーであって、NH2− AGATGTTGCTTCTCTTAA−CONH2なる配列の全てがPNAからなるポリヌクレオチド
- 請求項11に記載の方法に用いるクランププライマーであって、NH2−CAGTTTGGCCAGCCCA−CONH2なる配列の全てがPNAからなるポリヌクレオチド
- 請求項11に記載の方法に用いるクランププライマーであって、NH2−ACCCAGCAGTTTGGC−CONH2なる配列の全てがPNAからなるポリヌクレオチド
- 請求項12に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、
請求項23に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項11に記載の変異遺伝子検出方法。 - 請求項13に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、
請求項23に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項11に記載の変異遺伝子検出方法。 - 請求項14に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、
請求項25に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項11に記載の変異遺伝子検出方法。 - 請求項15に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、
請求項26に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項11に記載の変異遺伝子検出方法。 - 請求項16に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、
請求項24に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項11に記載の変異遺伝子検出方法。 - 請求項17に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、
請求項24に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項11に記載の変異遺伝子検出方法。 - 請求項18に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、
請求項24に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項11に記載の変異遺伝子検出方法。 - 請求項19に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、
請求項24に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項11に記載の変異遺伝子検出方法。 - 請求項20に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、
請求項24に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項11に記載の変異遺伝子検出方法。 - 請求項21に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、
請求項24に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項11に記載の変異遺伝子検出方法。 - 請求項22に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、
請求項24に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項11に記載の変異遺伝子検出方法。 - 遺伝子プールに混在する既知の変異遺伝子の有無を検出する方法であって、
野生型遺伝子に相補的な配列を有する標的部位の全部または一部に後述する変異プローブよりも優先的にハイブリダイゼーションするクランププライマーと、
変異遺伝子に相補的な配列を有する標的部位の全部または一部に前記クランププライマーよりも優先的にハイブリダイゼーションする変異プローブと、
前記遺伝子プールと
を遺伝子増幅用反応液中に共存させ、
遺伝子増幅法により変異遺伝子の標的部位を含む検出領域を選択的に増幅させることで、該変異遺伝子の有無を検出する変異遺伝子検出方法。 - 遺伝子プールに混在する既知の変異遺伝子の有無を検出する方法であって、
野生型遺伝子の配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションするPNAからなるクランププライマーと、
変異遺伝子の配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションし、配列の少なくとも一部がLNAにより構成されている変異プローブと、
前記遺伝子プールと
を遺伝子増幅用反応液中に共存させ、
遺伝子増幅法により変異遺伝子の標的部位を含む検出領域を選択的に増幅させることで、該変異遺伝子の有無を検出する変異遺伝子検出方法。
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