JP2006265286A - ポリマー被覆磁性粒子およびその製造方法、生化学用担体、ならびにビオチン類捕捉用粒子 - Google Patents
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Abstract
【課題】 非特異吸着性が低減されたポリマー被覆磁性粒子およびその製造方法、生化学用担体、ならびにビオチン類捕捉用粒子を提供する。
【解決手段】 本発明のポリマー被覆磁性粒子は、水系媒体中に分散した磁性粒子(M)の存在下、25℃における水への溶解度が10g/100cc未満であるモノマー(A)を重合し、次に、25℃における水への溶解度がモノマー(A)より大きく、かつモノマー(C)未満であるモノマー(B)を重合し、次に、25℃における水への溶解度が10g/100cc以上である前記モノマー(C)を重合して得られる。
【選択図】 なし
【解決手段】 本発明のポリマー被覆磁性粒子は、水系媒体中に分散した磁性粒子(M)の存在下、25℃における水への溶解度が10g/100cc未満であるモノマー(A)を重合し、次に、25℃における水への溶解度がモノマー(A)より大きく、かつモノマー(C)未満であるモノマー(B)を重合し、次に、25℃における水への溶解度が10g/100cc以上である前記モノマー(C)を重合して得られる。
【選択図】 なし
Description
本発明は、非特異吸着性が低減されたポリマー被覆磁性粒子に関する。
近年、平均粒径が小さい磁性粒子は、その単位重量当たりの表面積が大きいため、抗原と抗体との免疫反応やDNA同士またはDNAとRNAとのハイブリダイゼーションにおいて優れた反応場を提供できることから、特に診断薬や医薬品研究用などへの応用が活発になっている。
中でも、生化学用担体粒子としては、物理吸着感作用として主にポリスチレン粒子が、化学結合感作用として主にカルボキシル基変性ポリスチレン粒子が広く使用されている。しかしながら、これらの粒子は、細胞、タンパク、DNAなどの試験検体中に存在する、目的としない他の生理活性物質等の吸着(以下、本明細書において「非特異吸着」という)が大きく、この非特異吸着が感作粒子の性能を阻害する。すなわち、非特異吸着はこれらの粒子を使用するうえでの大きな障害になっていた。
この非特異吸着の問題を解決するため、グリシジル基(特開平10−195099号公報)、ポリエチレングリコール基(特開2002−121549号公報、特開2004−61301号公報)、水酸基またはメトキシ基(特開2003−231648号公報)、多量のカルボキシル基(特開2003−277455号公報)などの種々の親水性官能基を粒子表面に導入する試みがなされている。
磁性粒子に関しても同様に、非特異吸着性を低減させることが求められており、例えば、特開平10−270233号公報では、アルキル(メタ)アクリレートおよび不飽和カルボン酸を必須成分とする磁性粒子が提案されているが、非特異吸着性をさらに低減させることが求められている。
特開平10−195099号公報
特開2002−121549号公報
特開2004−61301号公報
特開2003−231648号公報
特開2003−277455号公報
特開平10−270233号公報
本発明は、非特異吸着性が低減されたポリマー被覆磁性粒子およびその製造方法、生化学用担体、ならびにビオチン類捕捉用粒子を提供することを目的とする。
本発明のポリマー被覆磁性粒子は、水系媒体中に分散した磁性粒子(M)の存在下、25℃における水への溶解度が10g/100cc未満であるモノマー(A)を重合し、
次に、25℃における水への溶解度がモノマー(A)より大きく、かつモノマー(C)未満であるモノマー(B)を重合し、
次に、25℃における水への溶解度が10g/100cc以上である前記モノマー(C)を重合して得られる。
次に、25℃における水への溶解度がモノマー(A)より大きく、かつモノマー(C)未満であるモノマー(B)を重合し、
次に、25℃における水への溶解度が10g/100cc以上である前記モノマー(C)を重合して得られる。
本発明において、「25℃における水へのモノマーの溶解度」は、目視で溶けなくなる量のモノマーを水に添加し、25℃で平衡状態とした後、該水相中のモノマー量をクロマトグラフ法で定量して得られるモノマーの溶解度をいう。
ここで、上記本発明のポリマー被覆磁性粒子において、前記モノマー(C)がカルボキシル基を有することができる。この場合、上記本発明のポリマー被覆磁性粒子の表面に、ビオチン類結合部位を有する物質を固定化させることにより、本発明のビオチン類捕捉用粒子を得ることができる。
ここで、上記本発明のポリマー被覆磁性粒子において、前記前記モノマー(B)がエポキシ基を有することができる。
ここで、上記本発明のポリマー被覆磁性粒子において、前記磁性粒子(M)は、一次粒径50nm以下の磁性微粒子と、非磁性の有機物とを含むことができる。
本発明の生化学用担体は、上記本発明のポリマー被覆磁性粒子を用いることができる。
本発明のポリマー被覆磁性粒子の製造方法は、
水系媒体中に分散した磁性粒子(M)の存在下、25℃における水への溶解度が10g/100cc未満であるモノマー(A)を重合する工程と、
次に、25℃における水への溶解度がモノマー(A)より大きく、かつモノマー(C)未満であるモノマー(B)を重合する工程と、
次に、25℃における水への溶解度が10g/100cc以上である前記モノマー(C)を重合する工程とを含む。
水系媒体中に分散した磁性粒子(M)の存在下、25℃における水への溶解度が10g/100cc未満であるモノマー(A)を重合する工程と、
次に、25℃における水への溶解度がモノマー(A)より大きく、かつモノマー(C)未満であるモノマー(B)を重合する工程と、
次に、25℃における水への溶解度が10g/100cc以上である前記モノマー(C)を重合する工程とを含む。
本発明のポリマー被覆磁性粒子によれば、親水性を発現するモノマーが粒子表面に高密度に効率よく重合されることが可能となることにより、本発明のポリマー被覆磁性粒子は非特異吸着性が低い。本発明のポリマー被覆磁性粒子は、診断薬用担体などの生化学用担体、塗料、紙、電子材料、電子写真、化粧品、医薬品、農薬、食品、触媒など広い分野で利用できる。応用例としては医療用診断薬用途、特に自動測定器対応粒子に応用が可能である。
本発明のポリマー被覆磁性粒子の製造方法によれば、非特異吸着性が低い磁性粒子を効率的に作製することができる。
本発明のビオチン類捕捉用粒子によれば、優れたビオチン類捕捉能を有する。
以下、本発明のポリマー被覆磁性粒子およびその製造方法、生化学用担体、ならびにビオチン類捕捉用粒子について詳細に説明する。
1.ポリマー被覆磁性粒子およびその製造方法
本発明のポリマー被覆磁性粒子は、水系媒体中に分散した磁性粒子(M)の存在下、モノマー(A)を重合し、次に、モノマー(B)を重合し、次に、モノマー(C)を重合して得られる。以下、本発明のポリマー被覆磁性粒子の製造に使用される物質について詳細に説明する。
本発明のポリマー被覆磁性粒子は、水系媒体中に分散した磁性粒子(M)の存在下、モノマー(A)を重合し、次に、モノマー(B)を重合し、次に、モノマー(C)を重合して得られる。以下、本発明のポリマー被覆磁性粒子の製造に使用される物質について詳細に説明する。
本発明のポリマー被覆磁性粒子の粒子径は、0.02〜10μmであることが好ましく、0.2〜5μmであることがより好ましい。前記粒子径が0.02μm未満である場合、十分な磁気応答性が発現されず、当該粒子を分離するために相当に長い時間を要し、また、分離するために相当に大きい磁力が必要となるため好ましくない。一方、前記粒子径が10μmを超える場合、当該粒子が分散媒中で沈降しやすくなるため、標的物質を捕捉する際に分散媒を攪拌する操作が必要となり、また、粒子の重量に対する表面積の割合が小さくなるため、十分な量の標的物質を捕捉することが困難となることがある。
本発明のポリマー被覆磁性粒子は、分散媒に分散させて使用することができる。分散媒としては、例えば水系媒体が挙げられる。水系媒体は特に限定されないが、例えば、水、水系溶剤を含む水が挙げられる。水系溶剤としては、例えば、アルコール類(例えば、エタノール、アルキレングリコール、モノアルキルエーテルなど)が挙げられる。
1.1.磁性粒子(M)
磁性粒子(M)としては、水に分散し、かつ、磁石よって分離することができる粒子であれば、特に制限はない。磁性粒子(M)の好ましい粒径は、0.01〜10μm、さらに好ましい粒径は0.1〜5μm、最も好ましい粒径は0.8〜3μmである。
磁性粒子(M)としては、水に分散し、かつ、磁石よって分離することができる粒子であれば、特に制限はない。磁性粒子(M)の好ましい粒径は、0.01〜10μm、さらに好ましい粒径は0.1〜5μm、最も好ましい粒径は0.8〜3μmである。
磁性粒子(M)は、無機物のみで形成されていてもよいが、低比重にすることにより水中での沈降を遅らせ、水への分散が容易になるため、有機物が含まれていることが好ましい。
磁性粒子(M)の内部組成は、一次粒径50nm以下の磁性体微粒子と、非磁性の有機物とからなることが好ましく、一次粒径30nm以下の磁性体微粒子と、非磁性の有機物とからなることがより好ましい。磁性粒子(M)の内部組成に、一次粒径が50nmを超える磁性体微粒子が含まれると、磁気分離後の再分散性に劣る場合がある。
磁性粒子(M)の内部組成は均質であってもよく、あるいは不均質であってもよい。しかしながら、上記の好ましい粒径範囲にある均質な磁性粒子(M)は、磁力による分離精製を繰り返すと媒質への再分散が困難になる場合がある。このため、磁性粒子(M)は、残留磁化が少ない、磁性体微粒子を含む不均質な粒子であるのがより好ましい。このような不均質な内部組成を有する磁性粒子(M)の内部構造としては、磁性体微粒子が非磁性の有機物の連続相中に分散した構造や、磁性体微粒子の2次凝集体をコアとして非磁性の有機物をシェルとする構造、非磁性の有機物をコアとして磁性体微粒子の2次凝集体をシェルとする構造などが挙げられる。
磁性体微粒子が非磁性の有機物の連続相中に分散した構造を有する磁性粒子の好ましい製造方法としては、例えば、特開平9−208788号公報で開示された方法が挙げられる。また、非磁性の有機物をコアとし、磁性体微粒子の2次凝集体をシェルとする構造を有する磁性粒子の好ましい製造方法としては、例えば、特開昭61−93603号公報で開示された方法が挙げられる。
一次粒径50nm以下の磁性微粒子の組成としては、特に制限はないが、酸化鉄系の物質が代表的であり、例えば、MFe2O4(M=Co、Ni、Mg、Cu、Li0.5Fe0.5等)で表現されるフェライト、Fe3O4で表現されるマグネタイト、あるいはγFe2O3が挙げられる。特に、飽和磁化が強く、かつ残留磁化が少ない磁気材料としてγFe2O3、Fe3O4が好ましい。このような一次粒径50nm以下の磁性体微粒子は、磁性流体として工業的に入手することができる。
非磁性の有機物としては、好ましくはポリマーであり、その内容は、例えば、特開平9−208788号公報、特開昭61−93603号公報、特開2004−205481号公報などで開示された通りである。非磁性の有機物としては、他に、上記磁性体微粒子の表面処理剤として使用されるシランカップリング剤や界面活性剤も好ましく、具体的には、工業的に入手できる表面処理された磁性流体を乾燥し、所望の粒径に粉砕、分球することで、磁性体微粒子および非磁性の有機物(シランカップリング剤や界面活性剤)が複合化した磁性粒子を得ることができる。
1.2.モノマー(A)
モノマー(A)は、25℃における水への溶解度が10g/100cc未満であり、好ましくは2g/100cc未満であり、最も好ましくは1g/100cc未満である。モノマー(A)の25℃における水への溶解度が10g/100cc以上であると、得られるポリマー被覆磁性粒子の非特異吸着性が大きくなる。モノマー(A)の量は、磁性粒子(M)100重量部に対し、好ましくは10〜500重量部、さらに好ましくは25〜100重量部である。
モノマー(A)は、25℃における水への溶解度が10g/100cc未満であり、好ましくは2g/100cc未満であり、最も好ましくは1g/100cc未満である。モノマー(A)の25℃における水への溶解度が10g/100cc以上であると、得られるポリマー被覆磁性粒子の非特異吸着性が大きくなる。モノマー(A)の量は、磁性粒子(M)100重量部に対し、好ましくは10〜500重量部、さらに好ましくは25〜100重量部である。
25℃における水への溶解度が10g/100cc未満であるモノマー(A)としては、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸−n−ブチル、アクリル酸−t−ブチル、アクリル酸グリシジル、エチレングリコールジアクリル酸エステル、アクリル酸トリブロモフェニル、アクリル酸ラウリル、アクリル酸トリデシル、アクリル酸ステアリル、アクリル酸−2−エチルヘキシル、アクリル酸シクロヘキシル、アクリル酸ベンジル等のアクリル酸エステル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸−n−ブチル、メタクリル酸−t−ブチル、メタクリル酸グリシジル、エチレングリコールジメタクリル酸エステル、メタクリル酸トリブロモフェニル、メタクリル酸ラウリル、メタクリル酸トリデシル、メタクリル酸ステアリル、メタクリル酸−2−エチルヘキシル、メタクリル酸シクロヘキシル、メタクリル酸ベンジル等のメタクリル酸エステル、スチレン、ビニルナフタレン、ビニルアントラセン、クロルスチレン、クロロメチルスチレン、α−メチルスチレン、ジビニルベンゼン等の芳香族ビニル化合物、アクリロニトリル、メタアクリロニトリル、各種フッ素モノマーなどを挙げることができる。
モノマー(A)は、25℃における水への溶解度が10g/100cc未満である限り、混合物であってもよく、後述のモノマー(C)を含んでいてもよい。モノマー(A)が混合物である場合、25℃における水への溶解度が10g/100cc未満のみのモノマーで構成することが好ましい。
1.3.モノマー(B)
モノマー(B)は、25℃における水への溶解度がモノマー(A)より大きく、かつモノマー(C)未満である。モノマー(B)としては、上述のモノマー(A)および後述のモノマー(C)から溶解度に応じて適宜選択すればよい。
モノマー(B)は、25℃における水への溶解度がモノマー(A)より大きく、かつモノマー(C)未満である。モノマー(B)としては、上述のモノマー(A)および後述のモノマー(C)から溶解度に応じて適宜選択すればよい。
モノマー(B)の量は、磁性粒子(M)100重量部に対し、好ましくは5〜200重量部、さらに好ましくは10〜50重量部である。モノマー(B)は、溶解度の条件を満たす限り、混合物であってもよい。モノマー(B)としては、エポキシ基を有することが好ましく、この場合、非特異吸着性をさらに低減させることができる。このようなエポキシ基を有するモノマーとしては、アクリル酸グリシジル、メタクリル酸グリシジル、アリルグリシジルエーテル、アクリル酸エポキシシクロヘキシル、メタクリル酸エポキシシクロヘキシル、エポキシ化ブタジエンなどを挙げることができる。モノマー(B)の25℃における水への溶解度は、好ましくは1g/100cc〜10g/100ccである。
1.4.モノマー(C)
モノマー(C)は、25℃における水への溶解度が10g/100cc以上であり、好ましくは50g/100cc以上であり、最も好ましくは1000g/100cc以上である。モノマー(C)の量は、磁性粒子(M)100重量部に対し、好ましくは1〜100重量部、さらに好ましくは5〜30重量部である。
モノマー(C)は、25℃における水への溶解度が10g/100cc以上であり、好ましくは50g/100cc以上であり、最も好ましくは1000g/100cc以上である。モノマー(C)の量は、磁性粒子(M)100重量部に対し、好ましくは1〜100重量部、さらに好ましくは5〜30重量部である。
25℃における水への溶解度が10g/100cc以上であるモノマー(C)としては、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸などのカルボキシル基を有するモノマー、アクリル酸−2−ヒドロキシエチル、アクリル酸ポリオキシエチレン、メタクリル酸−2−ヒドロキシエチル、メタクリル酸ポリオキシエチレン、アクリルアミド、N-メチロールアクリルアミド、ダイアセトンアクリルアミド、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、イソプレンスルホン酸、スチレンスルホン酸アルキル金属塩、2-アクリルアミド-2-メチルプロパン-スルホン酸、アリルアミンなどを挙げることができ、好ましくは、カルボキシル基を有するモノマーである。モノマー(C)は、25℃における水への溶解度が10g/100cc以上である限り、混合物であってもよく、モノマー(A)を含んでいてもよい。
1.5.用途
本発明のポリマー被覆磁性粒子は、生化学分野、塗料、紙、電子写真、化粧品、医薬品、農薬、食品、触媒など広い分野で利用できる。
本発明のポリマー被覆磁性粒子は、生化学分野、塗料、紙、電子写真、化粧品、医薬品、農薬、食品、触媒など広い分野で利用できる。
本発明のポリマー被覆磁性粒子の主たる用途は、非特異吸着性が低い生化学用担体である。また、カルボキシル基を有するモノマー(C)を用いて得られた本発明のポリマー被覆磁性粒子の表面に、ビオチン類(後述するビオチンまたはビオチン誘導体)結合部位を有する物質を固定化させることにより、ビオチン類捕捉用粒子として使用できる。
ビオチン類結合部位を有する物質としては、例えば、アビジンや、ストレプトアビジンなどのアビジン誘導体(以下、「アビジン類」ともいう)が挙げられる。このビオチン類捕捉用粒子は、非特異吸着性を低減させることができ、かつ、ビオチン類捕捉量を高めることができる。本発明のポリマー被覆磁性粒子にアビジンまたはストレプトアビジンを固定化させる方法としては、例えば、特開2001−158800号公報などに記載された公知の方法を用いることができる。例えば、本発明のポリマー被覆磁性粒子の表面にカルボキシル基が露出している場合、水溶性カルボジイミドなどの脱水縮合剤の存在下に、アビジン類の分子中のアミノ基を前記カルボキシル基に反応させてアミド結合を形成することにより、本発明のポリマー被覆磁性粒子の表面にアビジン類を固定化することができる。この方法においては、あらかじめ、本発明のポリマー被覆磁性粒子の表面に露出しているカルボキシル基に脱水縮合剤を反応させ、その後、アビジン類を加えて反応させることもできる。
本発明のビオチン類捕捉用粒子によれば、その表面にアビジン類が固定化されているため、ビオチンによって標識された標的物質、例えば核酸やタンパク質などを確実に捕捉することができる。また、本発明のポリマー被覆粒子を製造する際に、カルボキシル基を有するモノマーをポリマー(C)として使用することにより、カルボキシル基との化学的結合によって、アビジン類を固定化させることができるため、使用条件が制限されることが少ない。したがって、本発明のビオチン類捕捉用粒子は、診断薬担体、細菌分離担体、細胞分離担体、核酸分離精製担体、タンパク質分離精製担体、固定化酵素担体、ドラッグデリバリーなどとして有用である。
本発明のポリマー被覆磁性粒子を診断薬用担体粒子として使用する場合、例えば、本発明のポリマー被覆磁性粒子にタンパク質等の抗原あるいは抗体を結合して、測定対象である抗体あるいは抗原との抗原抗体反応に基づく受身凝集反応による溶液の濁度変化を利用した定量・定性検出用途,本発明のポリマー被覆磁性粒子に抗体を結合して、抗原であるウイルス・細菌・細胞・ホルモン・ダイオキシン類等の化学物質などを前記抗体に結合させて回収・濃縮する用途,本発明のポリマー被覆磁性粒子にDNAなどの核酸アナログを結合して、ハイブリダイゼーションを利用して該核酸アナログに核酸を結合させて回収・検出したり、核酸に結合するタンパク質や色素等の化学物質を前記核酸アナログに結合させて回収・検出したりする用途,上述した本発明のポリマー被覆磁性粒子にアビジン類またはビオチン類を結合し、前記アビジン類またはビオチン類にビオチン類あるいはアビジン類を有する分子を結合させて回収して検出する用途,本発明のポリマー被覆磁性粒子に抗体や抗原を結合し、比色法や化学発光を利用した酵素免疫測定法用の担体として本発明のポリマー被覆磁性粒子を使用する用途などが挙げられる。従来、96穴プレート等を担体として用いていた診断項目であれば、本発明のポリマー被覆磁性粒子を用いることによって、磁性を利用した自動分析機に置き換えて使用できる。診断の対象となる物質としては、生体由来のタンパク質、黄体形成ホルモン、甲状腺刺激ホルモン等のホルモン、各種ガン細胞や、前立腺特異マーカー、膀胱ガンマーカー等のガンのマーカーとなるタンパク質、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルスなどのウイルス、淋菌、MRSA等の細菌、カンジダ、クリプトコックス等の真菌、トキソプラズマ等の原虫・寄生虫、あるいはそれらウイルス・細菌・真菌・原虫・寄生虫などの構成要素であるタンパク質や核酸、ダイオキシン類等の環境汚染物質、抗生物質や抗てんかん剤など医薬品等の化学物質などがあげられる。
なお、本発明のポリマー被覆磁性粒子の用途は生化学用担体用途に限定されるわけではなく、例えば、上述した各分野で使用可能である。
2.ポリマー被覆磁性粒子の製造方法
本発明のポリマー被覆磁性粒子は、水系媒体中に分散した磁性粒子(M)の存在下、モノマー(A)を重合し、次に、モノマー(B)を重合し、次に、モノマー(C)を重合して得られる。水系媒体としては、「1.ポリマー被覆磁性粒子」の欄で上述したものを使用することができる。モノマー(B)の重合を開始する際に、モノマー(A)の重合は必ずしも完結している必要はないが、モノマー(A)の転化率は60%以上であることが好ましい。同様に、このとき、モノマー(C)の重合を開始する際に、モノマー(A)およびモノマー(B)の重合は必ずしも完結している必要はないが、モノマー(A)の転化率は80%以上、モノマー(B)の転化率は60%以上であることが好ましい。このような条件を満たすことにより、非特異吸着性の低減についての再現性が良好となる。
本発明のポリマー被覆磁性粒子は、水系媒体中に分散した磁性粒子(M)の存在下、モノマー(A)を重合し、次に、モノマー(B)を重合し、次に、モノマー(C)を重合して得られる。水系媒体としては、「1.ポリマー被覆磁性粒子」の欄で上述したものを使用することができる。モノマー(B)の重合を開始する際に、モノマー(A)の重合は必ずしも完結している必要はないが、モノマー(A)の転化率は60%以上であることが好ましい。同様に、このとき、モノマー(C)の重合を開始する際に、モノマー(A)およびモノマー(B)の重合は必ずしも完結している必要はないが、モノマー(A)の転化率は80%以上、モノマー(B)の転化率は60%以上であることが好ましい。このような条件を満たすことにより、非特異吸着性の低減についての再現性が良好となる。
重合方法としては、バッチ法、モノマーインクレ法、プレエマルジョンインクレ法などを組み合わせることができる。重合安定性や磁性粒子へのポリマー被覆性などの点で、モノマー(A)、モノマー(B)の重合に際しては、プレエマルジョンインクレ法が好ましく、具体的には、磁性粒子(M)を分散剤水溶液に分散した後、この分散液の温度をコントロールしながら、別の容器で作製したモノマー(A)の分散液(プレエマルジョン)を前記磁性粒子(M)分散剤液へ滴下・重合し、滴下終了後に、別の容器で作製したモノマー(B)の分散液(または水溶液)を滴下・重合し、滴下終了後に、さらに、モノマー(C)(の水溶液)をブーストまたは滴下して重合を完結させる方法が挙げられる。
重合に際しては、開始剤、分散剤など、乳化重合で使用される公知の薬品を適宜選択することができる。
開始剤は、磁性粒子(M)の分散剤含有水系媒体に始めから添加しておいてもよく、各モノマーと同時に添加してもよく、各モノマーに予め溶解しておいてもよい。モノマー(B)の重合に際しては、モノマー(A)の重合のために添加した残余の開始剤により重合を進めてもよい。同様にモノマー(C)の重合に際しては、モノマー(A)やモノマー(B)の重合のために添加した残余の開始剤により重合を進めてもよい。
開始剤としては、油溶性開始剤および水溶性開始剤を使用することができる。油溶性開始剤としては、ベンゾイルペルオキシド、ラウロイルペルオキシド、ターシャリーブチルペルオキシ2−エチルヘキサネート、3,5,5−トリメチルヘキサノイルペルオキシド等の過酸化化合物、アゾビスイソブチロニトリル等のアゾ化合物が挙げられる。水溶性開始剤としては、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、過硫酸ナトリウム等の過硫酸塩、過酸化水素、2,2−アゾビス(2−アミノプロパン)鉱酸塩、アゾビスシアノ吉草酸およびそのアルカリ金属塩およびアンモニウム塩等があげられ、また、過硫酸塩、過酸化水素塩と重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、塩化第一鉄等を組み合わせたレドックス開始剤が挙げられ、中でも過硫酸塩が好適に用いられる。これらの重合開始剤のモノマー全体に対する割合は0.01〜8重量%の範囲が好適に用いられる。モノマー(A)およびモノマー(B)の重合については、油溶性開始剤が好ましい。水溶性の重合開始剤を用いると磁性粒子表面での重合でなく、磁性粒子を含まない疎水性重合モノマーのみが重合した新粒子が多量に生じる傾向がある。
分散剤としては、通常使用されている陰イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤等を単独もしくは組み合わせて用いることができる。例えば陰イオン性界面活性剤としては、高級アルコール硫酸エステルのアルカリ金属塩、アルキルベンゼンスルホン酸のアルカリ金属塩、コハク酸ジアルキルエステルスルホン酸のアルカリ金属塩、アルキルジフェニルエーテルジスルホン酸のアルカリ金属塩、ポリオキシエチレンアルキル(またはアルキルフェニル)エーテルの硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキル(またはアルキルフェニル)エーテルのリン酸エステル塩、ナフタレンスルホン酸ナトリウムのホルマリン縮合物などの陰イオン性界面活性剤の他、ラテムルS−180A(花王(株)製)、エレミノールJS−2(三洋化成(株)製)、アクアロンHS−10、KH−10(第一工業製薬(株)製)、アデカリアソープSE−10N、SR−10(旭電化工業(株)製)などの反応性界面活性剤を挙げることができる。
また、非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルなどのほか、アクアロンRS−20(第一工業製薬(株)製)、アデカリアソープNE−20、RN−20(旭電化工業(株)製)などの反応性非イオン性界面活性剤を挙げることができる。
重合温度は重合開始剤によって異なるが、通常10〜90℃であり、好ましくは30〜85℃であり、重合に要する時間は通常1〜30時間程度である。
3.実施例
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
3.1.評価方法
本実施例および比較例において、得られたポリマー被覆磁性粒子の評価は以下の方法によって測定された。また、粒子の粒径は、特に説明がない限り以下の方法により測定された。
本実施例および比較例において、得られたポリマー被覆磁性粒子の評価は以下の方法によって測定された。また、粒子の粒径は、特に説明がない限り以下の方法により測定された。
3.1.1.非特異吸着性の評価1(タンパク吸着)
1%ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝塩溶液0.5mLを、各実施例および比較例の磁性粒子5μgに加え、25℃で2時間転倒混和を行った。次に、磁気分離により該磁性粒子を分離し、緩衝リン酸塩溶液で2回洗浄した後、該磁性粒子に非特異吸着したウシ血清アルブミンをドデシル硫酸ナトリウム(SDS)水溶液で溶出し、SDSゲル電気泳動で分離してから銀染色にて発色させた。各実施例および比較例の磁性粒子について、発色の少ない順、すなわち、非特異吸着の少ない順に番号を付した結果を表1に示す。
1%ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝塩溶液0.5mLを、各実施例および比較例の磁性粒子5μgに加え、25℃で2時間転倒混和を行った。次に、磁気分離により該磁性粒子を分離し、緩衝リン酸塩溶液で2回洗浄した後、該磁性粒子に非特異吸着したウシ血清アルブミンをドデシル硫酸ナトリウム(SDS)水溶液で溶出し、SDSゲル電気泳動で分離してから銀染色にて発色させた。各実施例および比較例の磁性粒子について、発色の少ない順、すなわち、非特異吸着の少ない順に番号を付した結果を表1に示す。
3.1.2.非特異吸着性の評価2(細胞吸着)
クエン酸採血した血液5mLを遠心分離し、バフィーコートを採取した。これに0.17M塩化アンモニウム水溶液10mLを加え室温で10分間放置した後遠心分離し、得られた沈殿をリン酸緩衝塩溶液で2回洗浄して、4.5×106個の有核細胞を得た。次に、この細胞を4.5mLの0.2%ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝塩溶液で浮遊させ、各実施例および比較例の磁性粒子1mgを加え、30分間4℃で転倒混和を行った。次いで、磁気分離により磁性粒子を分離し、0.2%ウシ血清アルブミンを含有する緩衝リン酸塩溶液で2回洗浄した後、該磁性粒子に非特異吸着した細胞からスマイテストEX R&Dを用いてゲノムDNAを抽出した。このゲノムDNAについて、β−グロビン遺伝子を用いた定量PCR法で定量することにより、該磁性粒子に非特異吸着した細胞数を評価した。
クエン酸採血した血液5mLを遠心分離し、バフィーコートを採取した。これに0.17M塩化アンモニウム水溶液10mLを加え室温で10分間放置した後遠心分離し、得られた沈殿をリン酸緩衝塩溶液で2回洗浄して、4.5×106個の有核細胞を得た。次に、この細胞を4.5mLの0.2%ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝塩溶液で浮遊させ、各実施例および比較例の磁性粒子1mgを加え、30分間4℃で転倒混和を行った。次いで、磁気分離により磁性粒子を分離し、0.2%ウシ血清アルブミンを含有する緩衝リン酸塩溶液で2回洗浄した後、該磁性粒子に非特異吸着した細胞からスマイテストEX R&Dを用いてゲノムDNAを抽出した。このゲノムDNAについて、β−グロビン遺伝子を用いた定量PCR法で定量することにより、該磁性粒子に非特異吸着した細胞数を評価した。
3.1.3.ビオチン類捕捉量の評価
実施例および比較例で得られたビオチン類捕捉用粒子1mgを水1mlに分散させた後、4000pmolの蛍光ビオチン(Lucifer yellow cadaverine biotin-X, dipotassium salt)を加えて37℃で15分間転倒混和を行った。次に、磁気分離により前記粒子を分離し、上清の蛍光強度を蛍光分光光度計(PF−777,JASCO社)で測定することにより、未反応の蛍光ビオチンの濃度を決定し、この濃度および溶液の体積から、未反応の蛍光ビオチンの量を算出した。さらに、得られた未反応の蛍光ビオチンの量と、ビオチン類捕捉用粒子と結合させる前(結合前)の蛍光ビオチン溶液の量(4000pmol)との差を求め、この差を粒子の質量で除することにより、ビオチン類捕捉量(pmol/mg)を求めた。
実施例および比較例で得られたビオチン類捕捉用粒子1mgを水1mlに分散させた後、4000pmolの蛍光ビオチン(Lucifer yellow cadaverine biotin-X, dipotassium salt)を加えて37℃で15分間転倒混和を行った。次に、磁気分離により前記粒子を分離し、上清の蛍光強度を蛍光分光光度計(PF−777,JASCO社)で測定することにより、未反応の蛍光ビオチンの濃度を決定し、この濃度および溶液の体積から、未反応の蛍光ビオチンの量を算出した。さらに、得られた未反応の蛍光ビオチンの量と、ビオチン類捕捉用粒子と結合させる前(結合前)の蛍光ビオチン溶液の量(4000pmol)との差を求め、この差を粒子の質量で除することにより、ビオチン類捕捉量(pmol/mg)を求めた。
すなわち、各実施例または比較例で得られた磁性粒子のビオチン類捕捉量は、以下の式(1)より算出された。
ビオチン類捕捉量(pmol/mg)=
{(結合前の蛍光標識化ビオチンの量(pmol))−(未反応蛍光標識化ビオチンの量(pmol))}/(磁性粒子の質量(1mg)) ・・・・・(1)
ビオチン類捕捉量(pmol/mg)=
{(結合前の蛍光標識化ビオチンの量(pmol))−(未反応蛍光標識化ビオチンの量(pmol))}/(磁性粒子の質量(1mg)) ・・・・・(1)
3.1.4.粒径
透過型電子顕微鏡(日本電子(株)製100SX)を用いて、測定対象のポリマー被覆磁性粒子を撮影した。得られた写真内の300個の粒子の粒径を定規で計測し、その平均を求めて数平均粒径とした。
透過型電子顕微鏡(日本電子(株)製100SX)を用いて、測定対象のポリマー被覆磁性粒子を撮影した。得られた写真内の300個の粒子の粒径を定規で計測し、その平均を求めて数平均粒径とした。
3.1.5.モノマーの溶解度
約25℃の室温で、2Lのエーレンマイヤーに入れた100ccの純水に、目視で不溶のモノマーが分離するまでモノマーを添加した(ただし、モノマー量が1000gを超えても不溶のモノマーが分離しない場合、溶解度を1000g超とし、以下の操作は行わなかった)。エーレンマイヤーにふたをして、25.0℃の恒温水槽で24時間静置後、水相から1ccをサンプリングし、これをジメチルホルムアミド100ccで希釈した。Agilent Technologies社製ガスクロマトグラフ6890Nを用いて、ウンデカンを内部標準とし、インジェクション温度200℃、ディテクター温度280℃で上記希釈サンプル1μLを注入し、モノマー量を定量した。別に既知量のモノマーをジメチルホルムアミドに溶解したものを同様の方法で測定して、検量線を作成し、モノマー溶解度を算出した。
約25℃の室温で、2Lのエーレンマイヤーに入れた100ccの純水に、目視で不溶のモノマーが分離するまでモノマーを添加した(ただし、モノマー量が1000gを超えても不溶のモノマーが分離しない場合、溶解度を1000g超とし、以下の操作は行わなかった)。エーレンマイヤーにふたをして、25.0℃の恒温水槽で24時間静置後、水相から1ccをサンプリングし、これをジメチルホルムアミド100ccで希釈した。Agilent Technologies社製ガスクロマトグラフ6890Nを用いて、ウンデカンを内部標準とし、インジェクション温度200℃、ディテクター温度280℃で上記希釈サンプル1μLを注入し、モノマー量を定量した。別に既知量のモノマーをジメチルホルムアミドに溶解したものを同様の方法で測定して、検量線を作成し、モノマー溶解度を算出した。
3.2.実施例および比較例
3.2.1.調製例1(磁性粒子(M)の調製)
特開平07−238105号公報記載の重合方法を参考に、スチレン/ジビニルベンゼン=95/5共重合体粒子(平均粒子径1.5μm)を作製し、遠心分離により粒子のみ取り出したものをさらに水洗し、次いで乾燥した後、粉砕した。これをコア粒子(1)とする。
3.2.1.調製例1(磁性粒子(M)の調製)
特開平07−238105号公報記載の重合方法を参考に、スチレン/ジビニルベンゼン=95/5共重合体粒子(平均粒子径1.5μm)を作製し、遠心分離により粒子のみ取り出したものをさらに水洗し、次いで乾燥した後、粉砕した。これをコア粒子(1)とする。
次に、油性磁性流体(商品名:「EXPシリーズ」,(株)フェローテック製)にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、疎水化処理された表面を有するフェライト系の磁性体微粒子(平均一次粒子径:0.02μm)を得た。
次いで、コア粒子(1)15gおよび上記疎水化された磁性体微粒子15gをミキサーでよく混合し、この混合物をハイブリダイゼーションシステムNHS−0型(奈良機械製作所(株)製)を使用して、羽根(撹拌翼)の周速度100m/秒(16200rpm)で5分間処理し、粒径1.6μmの磁性粒子(M−1)を得た。
3.2.2.実施例1
ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム0.5重量%およびノニオン性乳化剤(商品名:「エマルゲン150」,花王(株)製)0.5重量%を含む水溶液750gを1Lセパラブルフラスコに投入し、次に磁性粒子(M−1)30gを投入して、ホモジナイザーで分散した後、70℃に加熱した。次に、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム0.5重量%およびノニオン性乳化剤(商品名:「エマルゲン150」,花王(株)製)0.5重量%を含む水溶液75gに、メタクリル酸シクロヘキシル15gおよびターシャリーブチルペルオキシ2−エチルヘキサネート(商品名:「パーブチルO」,日本油脂(株)製)0.3gを入れて分散したプレエマルジョンを、70℃にコントロールした前記1Lセパラブルフラスコに1時間かけて滴下した(以上、1段目)。
ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム0.5重量%およびノニオン性乳化剤(商品名:「エマルゲン150」,花王(株)製)0.5重量%を含む水溶液750gを1Lセパラブルフラスコに投入し、次に磁性粒子(M−1)30gを投入して、ホモジナイザーで分散した後、70℃に加熱した。次に、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム0.5重量%およびノニオン性乳化剤(商品名:「エマルゲン150」,花王(株)製)0.5重量%を含む水溶液75gに、メタクリル酸シクロヘキシル15gおよびターシャリーブチルペルオキシ2−エチルヘキサネート(商品名:「パーブチルO」,日本油脂(株)製)0.3gを入れて分散したプレエマルジョンを、70℃にコントロールした前記1Lセパラブルフラスコに1時間かけて滴下した(以上、1段目)。
次に、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム0.5重量%およびノニオン性乳化剤(商品名:「エマルゲン150」,花王(株)製)0.5重量%を含む水溶液75gに、メタクリル酸グリシジル15gおよびターシャリーブチルペルオキシ2−エチルヘキサネート(商品名:「パーブチルO」,日本油脂(株)製)0.3gを入れて分散させたプレエマルジョンを、前記1Lセパラブルフラスコに1時間かけて滴下した(以上、2段目)。
次いで、メタクリル酸2gを水18gに溶解したものを前記1Lセパラブルフラスコにブーストし、80℃に昇温した後さらに2時間重合を続けて、反応を完了させた(以上、3段目)。
得られたポリマー被覆磁性粒子の水分散体を磁気精製および重力沈降精製してから、固形分濃度1%の水分散体とした。これをポリマー被覆磁性粒子(1)の水分散体とする。ポリマー被覆磁性粒子(1)の数平均粒径は2.1μmであった。収率は約50%であった。
なお、25℃における各モノマーの溶解度は以下の通りである(メタクリル酸シクロヘキシル:1g/100cc未満、メタクリル酸グリシジル:2.5g/100cc、メタクリル酸:水と任意に相溶(>>10g/100cc))。ポリマー被覆磁性粒子(1)の非特異吸着性の評価を表1に示す。
ポリマー被覆磁性粒子(1)50mgを含む水分散体1mLに、1−エチル−3−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩((株)同仁化学研究所製)5mgを溶解させた0.1mM HCl溶液0.1mLを添加し、室温で2時間回転攪拌した後、さらに、ストレプトアビジン(シグマ社製)1mgを溶解させた0.1mM HCl溶液0.1mLを添加して、室温で8時間回転攪拌することより、粒子の表面にストレプトアビジンを固定化させたビオチン類捕捉用粒子を調製した。次いで、このビオチン類捕捉用粒子を含む溶液を磁気分離処理して得られた固形物(ビオチン類捕捉用粒子)に、0.1%牛血清アルブミンを含むリン酸塩緩衝液(PBS,0.1%BSA/PBS,pH=7.2)を添加して遠心分離処理する操作を3回繰り返すことにより、未反応のストレプトアビジンを除去し、ビオチン類捕捉量を評価した。その結果を表1に示す。
3.2.3.実施例2,3および比較例1〜4
表1に示されるモノマーを使用した以外は、実施例1と同様の方法にてポリマー被覆磁性粒子を作製し、非特異吸着性を評価した。実施例2,3および比較例2,3については、実施例1と同様の方法にてビオチン類捕捉用粒子を作製し、ビオチン類捕捉量を評価した。その結果を表1に示す。
表1に示されるモノマーを使用した以外は、実施例1と同様の方法にてポリマー被覆磁性粒子を作製し、非特異吸着性を評価した。実施例2,3および比較例2,3については、実施例1と同様の方法にてビオチン類捕捉用粒子を作製し、ビオチン類捕捉量を評価した。その結果を表1に示す。
表1においては、重合1段目から3段目までの各段階におけるモノマー種および仕込み重量を示した。表1において、()内の値は、25℃で100ccの水に溶解するモノマーの重量(溶解度)を示す。
実施例1〜5のポリマー被覆粒子によれば、比較例1〜3の粒子と比較して、タンパク質吸着および細胞吸着個数が少なかった。以上の結果から、実施例1〜5のポリマー被覆粒子は、非特異吸着性が低いことが確認された。
また、実施例1〜3のビオチン類捕捉用粒子によれば、比較例2,3の粒子と比較して、ビオチン類捕捉量が多かった。以上の結果により、実施例1〜3のビオチン類捕捉用粒子は、優れたビオチン類捕捉能を有することが確認された。
Claims (7)
- 水系媒体中に分散した磁性粒子(M)の存在下、25℃における水への溶解度が10g/100cc未満であるモノマー(A)を重合し、
次に、25℃における水への溶解度がモノマー(A)より大きく、かつモノマー(C)未満であるモノマー(B)を重合し、
次に、25℃における水への溶解度が10g/100cc以上である前記モノマー(C)を重合して得られる、ポリマー被覆磁性粒子。 - 請求項1において、
前記モノマー(C)がカルボキシル基を有する、ポリマー被覆磁性粒子。 - 請求項1または2において、
前記モノマー(B)がエポキシ基を有する、ポリマー被覆磁性粒子。 - 請求項1ないし3のいずれかにおいて、
前記磁性粒子(M)は、一次粒径50nm以下の磁性微粒子と、非磁性の有機物とを含む、ポリマー被覆磁性粒子。 - 請求項1ないし4のいずれかに記載のポリマー被覆磁性粒子を用いた、生化学用担体。
- 請求項2に記載のポリマー被覆磁性粒子の表面に、ビオチン類結合部位を有する物質が固定化されている、ビオチン類捕捉用粒子。
- 水系媒体中に分散した磁性粒子(M)の存在下、25℃における水への溶解度が10g/100cc未満であるモノマー(A)を重合する工程と、
次に、25℃における水への溶解度がモノマー(A)より大きく、かつモノマー(C)未満であるモノマー(B)を重合する工程と、
次に、25℃における水への溶解度が10g/100cc以上である前記モノマー(C)を重合する工程と、
を含む、ポリマー被覆磁性粒子の製造方法。
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2005
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