JP2006169176A - 抗コロナウイルス活性を有するインドリル−ペンテン−ジオン誘導体 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、抗ウイルス活性、詳しくは抗コロナウイルス活性を有し、動物薬または医薬として有用な化合物に関する。
ウイルス性疾患に対する有効な治療薬の開発は、医学及び薬学の分野において最も重要な課題の1つである。
コロナウイルス(CoV)は、1本鎖のRNAウイルスであり、血清学的に大きく3群に分けられている。コロナウイルスは哺乳動物や鳥類にさまざまな呼吸器系、消化官系、肝臓、神経系などで重篤な症状を発症させる疾病を引き起こすが、ヒトでは呼吸器や腸等で炎症を起こし、比較的軽度〜中等度の感冒の症状を引き起こすウイルスとして知られている。家畜・家禽に対してはワクチン使用が一般化しており、その有効性も確認されているケースが多い。これらのことからコロナウイルスに対する薬剤はこれまで開発されることはなかった。
コロナウイルス(CoV)は、1本鎖のRNAウイルスであり、血清学的に大きく3群に分けられている。コロナウイルスは哺乳動物や鳥類にさまざまな呼吸器系、消化官系、肝臓、神経系などで重篤な症状を発症させる疾病を引き起こすが、ヒトでは呼吸器や腸等で炎症を起こし、比較的軽度〜中等度の感冒の症状を引き起こすウイルスとして知られている。家畜・家禽に対してはワクチン使用が一般化しており、その有効性も確認されているケースが多い。これらのことからコロナウイルスに対する薬剤はこれまで開発されることはなかった。
しかし、最近、世界的に新型肺炎であるSARS(重症急性呼吸器症候群)が流行し、その原因病原体が、WHOにより新型のコロナウイルスであると決定され、SARSコロナウイルスと名付けられた(2003年4月)。そのため、コロナウイルス、特にSARSコロナウイルスに有効な薬剤の開発は世界的に緊急の課題であるが、今の所、有効な治療薬は上市されておらず、報告例も少数である。例えば、ライノウイルスのプロテアーゼ阻害剤をコロナウイルスのプロテアーゼ阻害剤として使用することができることが報告されている(特許文献1参照)。また、東京医科歯科大等の実験により、抗HIV薬であるネルフィナビルがSARSウイルスの増殖を抑制することが報告されている(非特許文献1参照)。その他、C型肝炎治療薬であるグリチルリチンやインターフェロンにも同様の作用が報告されている(非特許文献2及び3参照)。
国際公開第2004/093860号パンフレット
N, Yamamotoら、バイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ(Biochem Biophys Res Commun.)、318巻、719−725頁(2004)
Doerr, HWら、ザ ランセット(The LANCET)、361巻、2045−2046頁(2003)
Doerr, HWら、ザ ランセット(The LANCET)、362巻、293−294頁(2003)
本発明の目的は、抗ウイルス活性、詳しくは抗コロナウイルス活性を有し、動物薬または医薬として有用な新規化合物を提供することにある。
本発明者らは、鋭意研究の結果、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス(TGEV)に対して優れた抗ウイルス活性を有する化合物の合成に成功した。本発明の化合物は、ライノウイルスやHIV等、いくつかの他属のウイルスに対する活性について検索した結果、他属のウイルスに対しては抗ウイルス活性を示さず、特異性が高いことが確認された。これまで、抗コロナウイルス薬に関する報告は少なく、既存の薬剤の応用が多い。そのため、抗コロナウイルス活性を特異的に持つ新規化合物はコロナウイルスに関連する疾患の予防薬・治療薬に非常に有用である。
また、近年問題となっているSARSウイルスの増殖を阻害することが報告されている抗HIV薬であるネルフィナビルのTGEVに対する活性と本発明の化合物の活性は同程度であった。主要プロテアーゼの作用部位がTGEVとSARSコロナウイルスとの間で保存されていることが報告されており(Science,Vol.300,1763−1767(2003)、Biochemistry,Vol.43,4906−4912(2003))、本発明の化合物も、ネルフィナビルと同様、SARSコロナウイルスにも有効性を示すと考えられる。
本発明は、
(1)式(I):
(式中、R1は水素または低級アルキルであり、R2は水素、低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンであり、R3はそれぞれ独立して低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンであり、R4はそれぞれ独立して低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンであり、mは0〜2の整数であり、nは0〜4である)で示される化合物、その製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物、
(2)式:
で示される基が、式:
(式中、R5及びR6はそれぞれ独立して水素、低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンである)である、(1)記載の化合物、その製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物、
(3)R5及びR6はそれぞれ独立して低級アルコキシまたはヒドロキシである、(2)記載の化合物、その製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物、
(4)(1)〜(3)のいずれかに記載の化合物、その製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物を有効成分とする医薬組成物、
(5)(1)〜(3)のいずれかに記載の化合物、その製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物を含有することを特徴とする抗ウイルス剤、に関する。
(1)式(I):
(2)式:
(3)R5及びR6はそれぞれ独立して低級アルコキシまたはヒドロキシである、(2)記載の化合物、その製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物、
(4)(1)〜(3)のいずれかに記載の化合物、その製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物を有効成分とする医薬組成物、
(5)(1)〜(3)のいずれかに記載の化合物、その製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物を含有することを特徴とする抗ウイルス剤、に関する。
本発明の化合物は、強い抗コロナウイルス活性を示し、該誘導体から優れた抗CoV剤が得られる。
本明細書中において、「低級アルキル」とは、炭素数1〜8個の直鎖状又は分岐状のアルキル基を意味し、具体的にはメチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、n−ぺンチル、イソぺンチル、ネオぺンチル、tert−ぺンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル等が挙げられる。
「低級アルコキシ」とは、炭素数1〜6個の直鎖状又は分岐状のアルコキシ基を意味し、具体的にはメトキシ、エトキシ、n−プロポキシ、イソプロポキシ、n−ブトキシ、イソブトキシ、s−ブトキシ、t−ブトキシ、n−ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、n−ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシが挙げられる。
「ハロゲン」としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が挙げられる。
以下に本発明化合物の製造法について、記載する。
(式中、R1は水素または低級アルキルであり、R2は水素、低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンであり、R3はそれぞれ独立して低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンであり、R4はそれぞれ独立して低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンであり、mは0〜2の整数であり、nは0〜4である。)
第一工程
式(X1)で示される化合物と、式(X2)で示される化合物を反応させ、式(X3)で示される化合物を得る工程である。
式(X1)で示される化合物は、市販のものを用いるか、それらを当業者によく知られる方法で構造修飾することにより、容易に製造することができる。
溶媒としては、酢酸を用いることができる。
反応は、50〜200℃で行うことができる。たとえば、100〜120℃で行うことができる。
式(X1)で示される化合物と、式(X2)で示される化合物を反応させ、式(X3)で示される化合物を得る工程である。
式(X1)で示される化合物は、市販のものを用いるか、それらを当業者によく知られる方法で構造修飾することにより、容易に製造することができる。
溶媒としては、酢酸を用いることができる。
反応は、50〜200℃で行うことができる。たとえば、100〜120℃で行うことができる。
第二工程
式(X3)で示される化合物をエノラートにし、式(X4)で示される化合物を反応させ、ついで脱水することにより、式(I)で示される化合物を製造する工程である。
式(X4)で示される化合物は、市販のものを用いるか、それらを当業者によく知られる方法で構造修飾することにより、容易に製造することができる。
式(X3)で示される化合物をエノラートにするには、式(X3)で示される化合物にトリ-n-ブチルボレートを反応させればよい。本工程は、0〜100℃、たとえば、室温で行うことができる。溶媒は、無水のものが好ましく、たとえば、無水酢酸エチルエステルなどを用いることができる。また、無水ボロン酸の存在下で行うのが好ましい。
脱水工程は、塩基の存在下で行うことができる。塩基としては、n-ブチルアミンを用いることができる。塩基の量は、触媒量でもよいし、当量用いることもできる。脱水工程は、50〜200℃、たとえば、70〜90℃で行うことができる。また、TsOHなどの適当な酸触媒下または、水酸基をメシル基などの適当な脱離基で保護した後、塩基処理する事によっても行うことが出来る。
式(X3)で示される化合物をエノラートにし、式(X4)で示される化合物を反応させ、ついで脱水することにより、式(I)で示される化合物を製造する工程である。
式(X4)で示される化合物は、市販のものを用いるか、それらを当業者によく知られる方法で構造修飾することにより、容易に製造することができる。
式(X3)で示される化合物をエノラートにするには、式(X3)で示される化合物にトリ-n-ブチルボレートを反応させればよい。本工程は、0〜100℃、たとえば、室温で行うことができる。溶媒は、無水のものが好ましく、たとえば、無水酢酸エチルエステルなどを用いることができる。また、無水ボロン酸の存在下で行うのが好ましい。
脱水工程は、塩基の存在下で行うことができる。塩基としては、n-ブチルアミンを用いることができる。塩基の量は、触媒量でもよいし、当量用いることもできる。脱水工程は、50〜200℃、たとえば、70〜90℃で行うことができる。また、TsOHなどの適当な酸触媒下または、水酸基をメシル基などの適当な脱離基で保護した後、塩基処理する事によっても行うことが出来る。
本発明化合物の塩としては製薬上許容される塩が使用可能である。「製薬上許容される塩」は、以下の塩基性付加塩や酸付加塩を含有する。塩基性付加塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩;例えばカルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩;例えばアンモニウム塩;例えばトリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩;ジシクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ブロカイン塩等の脂肪族アミン塩;例えばN,N−ジベンジルエチレンジアミン等のアラルキルアミン塩;例えばピリジン塩、ピコリン塩、キノリン塩、イソキノリン塩等の複素環芳香族アミン塩;例えばテトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩等の第4級アンモニウム塩;アルギニン塩;リジン塩等の塩基性アミノ酸塩等が挙げられる。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、過塩素酸塩等の無機酸塩;例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩等の有機酸塩;例えばメタンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p−トルエンスルホン酸塩等のスルホン酸塩;例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等の酸性アミノ酸等を挙げることができる。
本発明化合物はその溶媒和物を包含し、化合物(I)に対し、任意の数の溶媒分子と配位していてもよい。好ましくは水和物である。
本発明は、一般式(I)で示される化合物の全ての立体異性体(ジアステレオマー、エピマー、エナンチオマー等)を包含する。本発明化合物は抗ウイルス作用を有するのでそれ自身が医薬として有用であり、また他の本発明化合物の合成中間体としても有用である。
本発明は、ウイルス、特に、コロナウイルス(CoV)に起因すると考えられる種々の感染症(例:コロナウイルス感染症等)の予防又は治療剤として使用できる。抗CoV剤は、単独使用でも十分効果があるが、他の抗CoV剤(ネルフィナビル、グリチルリチン等)等と併用してもよい。コロナウイルス(CoV)としては、例えば、TGEV、SARSコロナウイルスなどが例示される。
本発明化合物は、経口的又は非経口的に投与することができる。経口投与による場合、本発明化合物は通常の製剤、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等の固形剤;水剤;油性懸濁剤;又はシロップ剤もしくはエリキシル剤等の液剤のいずれかの剤形としても用いることができる。非経口投与による場合、本発明化合物は、水性又は油性懸濁注射剤、点鼻液として用いることができる。その調製に際しては、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、水性溶剤、油性溶剤、乳化剤、懸濁化剤、保存剤、安定剤等を任意に用いることができる。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、トリ等の哺乳動物に対して投与することができる。
本発明化合物の投与量は、投与方法、患者の年齢、体重、状態及び疾患の種類によっても異なるが、通常、経口投与の場合、成人1日あたり約0.05mg〜5g、好ましくは、約0.1mg〜1000mgを1〜5回に分割して投与すればよい。また、非経口投与の場合、成人1日あたり約0.01mg〜2g、好ましくは、約0.05mg〜500mgを1〜5回に分割して投与する。
以下に実施例を挙げて本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
1-(5-クロロ-1-メチル-1H-インドール-3-イル)-5-(3-ヒドロキシ-4-メトキシ-フェニル)-ペント-4-エン-1,3-ジオン
工程1
無水ジメチルホルムアミド(30 mL)に水素化ナトリウム(1.53g, 38.3 mmol)を加え、氷冷下、撹拌しながら5-クロロインドール(5.1g, 33 mmol)を加えた。室温で30分間撹拌後、再び氷冷し、ヨウ化メチル(5.6g, 39.6 mmol)を滴下した。さらに室温で30分間撹拌後、反応液を氷水に投入し、ジエチルエーテルで抽出した。抽出液を水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた油状物を、シリカゲルクロマトグラフィーに付し、精製した。ヘキサン- 酢酸エチル(3:1, v/v)で溶出して得られた目的物の画分を減圧下、濃縮することにより、化合物2(5.6g, 33.8mmol)を収率 88.3%で得た。
工程2
第1工程で得られた化合物2(2.48g, 15 mmol)、ジケテン(1.8 mL, 15 mmol)及び酢酸(10mL)の混合物を120℃で100分間撹拌後、冷却し、減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルで抽出、水洗後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーに付し、精製した。ヘキサン−酢酸エチル(1:1, v/v)で溶出される目的物画分を、減圧下濃縮することより、化合物3(1.9g, 7.7 mmol)を収率 51.3%で得た。
第1工程で得られた化合物2(2.48g, 15 mmol)、ジケテン(1.8 mL, 15 mmol)及び酢酸(10mL)の混合物を120℃で100分間撹拌後、冷却し、減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルで抽出、水洗後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーに付し、精製した。ヘキサン−酢酸エチル(1:1, v/v)で溶出される目的物画分を、減圧下濃縮することより、化合物3(1.9g, 7.7 mmol)を収率 51.3%で得た。
工程3
室温下、3-ヒドロキシ-4-アニスアルデヒド(610 mg, 4 mmol)とトリ-n-ブチルボレート(1.8g, 8 mmol)を無水酢酸エチル(10 mL)に溶解、撹拌した。次いで工程2で得られた化合物3(1.0 g, 4.0 mmol)の無水酢酸エチル溶液(5 mL)に無水ボロン酸(195 mg, 2.8 mmol)を加えて調整した懸濁液を上記反応液に加え、5分間撹拌した。さらに反応液にn-ブチルアミン(5 μL)を4回(計20 μL)加え、90分間室温で反応後、反応液を80℃に加熱しながら、常圧で濃縮した。黄色の懸濁液は徐々に橙色の油状物に変化し、さらに赤色の油状物に変化した。この状態で60分間加熱撹拌後、反応液を60℃まで冷却し、0.4N HCl(10 mL)と酢酸エチル(30 mL)を加え20分間撹拌した。反応液を酢酸エチルで抽出し、順次、水、飽和食塩水で洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去することにより粗結晶を得た。本品をメタノールから再結晶することにより表題化合物I-1(900 mg, 2.3 mmol)を淡黄色結晶として、収率58.6%で得た。
融点 : 188 -190 ℃, 再結晶溶媒 : メタノール
NMR(d6-DMSO) δ: 3.83 (3H, s), 3.91 (3H, s), 6.45 (1H, s), 6.60 (1H, d, J=15.6 Hz), 6.94-7.16(3H, m), 7.30-7.48 (2H, m), 7.60-7.68 (1H, m), 8.22-8.50 (1H, m), 8.48 (1H, s), 9.24 (1H, brs).
室温下、3-ヒドロキシ-4-アニスアルデヒド(610 mg, 4 mmol)とトリ-n-ブチルボレート(1.8g, 8 mmol)を無水酢酸エチル(10 mL)に溶解、撹拌した。次いで工程2で得られた化合物3(1.0 g, 4.0 mmol)の無水酢酸エチル溶液(5 mL)に無水ボロン酸(195 mg, 2.8 mmol)を加えて調整した懸濁液を上記反応液に加え、5分間撹拌した。さらに反応液にn-ブチルアミン(5 μL)を4回(計20 μL)加え、90分間室温で反応後、反応液を80℃に加熱しながら、常圧で濃縮した。黄色の懸濁液は徐々に橙色の油状物に変化し、さらに赤色の油状物に変化した。この状態で60分間加熱撹拌後、反応液を60℃まで冷却し、0.4N HCl(10 mL)と酢酸エチル(30 mL)を加え20分間撹拌した。反応液を酢酸エチルで抽出し、順次、水、飽和食塩水で洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去することにより粗結晶を得た。本品をメタノールから再結晶することにより表題化合物I-1(900 mg, 2.3 mmol)を淡黄色結晶として、収率58.6%で得た。
融点 : 188 -190 ℃, 再結晶溶媒 : メタノール
NMR(d6-DMSO) δ: 3.83 (3H, s), 3.91 (3H, s), 6.45 (1H, s), 6.60 (1H, d, J=15.6 Hz), 6.94-7.16(3H, m), 7.30-7.48 (2H, m), 7.60-7.68 (1H, m), 8.22-8.50 (1H, m), 8.48 (1H, s), 9.24 (1H, brs).
5-(3-ヒドロキシ-4-メトキシ-フェニル)-1-(1H-インドール-3-イル)-ペント-4-エン-1,3-ジオン
実施例1の合成法に準じて化合物I-2を合成した.
融点 : 175 -177 ℃, 再結晶溶媒 : メタノール
元素分析 : C20H17NO4 ・0.35H2Oとして
計算値 (%) : C, 70.31; H, 5.22; N, 4.10.
分析値 (%) : C, 70.14; H, 5.37; N, 4.04.
NMR (d6-DMSO) δ: 3.82 (3H, s), 6.53 (1H, s), 6.58 (1H, d, J=15.6 Hz), 6.94-7.30(5H, m), 7.39 (1H, d, J=15.6 Hz), 7.48-7.58 (1H, m), 8.20-8.32 (1H, m), 8.41 (1H, s), 9.22 (1H, brs), 12.10 (1H, brs).
抗TGEVアッセイ(MTT法)
(1) 日生研豚TGE生ワクチン(母豚用)を使用説明書に従い、添付溶解用液を用いて調製し、使用まで−80℃で保存した。被検化合物をMedium 199にウシ胎児血清(FCS)5%(v/v)およびカナマイシン60μg/mlで加えた培養液にて所定の濃度になるように希釈し、96穴マイクロプレートに50μlずつ分注する。次に LLC-PK1細胞浮遊液を100μl(2×104 細胞)ずつを分注し、37℃、1時間培養後、更に上記TGE生ワクチンをFCS無添加培養液(Medium 199)培地で希釈したものを50μlずつ加えた。
(2) 炭酸ガス培養器内37℃で2日間培養した後、全てのウェルに MTT(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド)5mg/mlのPBS溶液を30μlずつ加え、4−5時間培養した。このとき、生存する細胞はMTTを還元してフォルマザンを析出させる。全てのウェルから培養上清を 150μlずつ取り除き、代わりに150μlの溶解液(10%トリトンX-100及び0.4%(V/V)HCl添加イソプロパノール)を加え、プレートミキサーで振とうしてフォルマザンを溶出した。フォルマザンをOD560nmで測定し、結果を被対照と比較した。ウイルスによる細胞傷害を50%抑制する化合物濃度をEC50とした。
(3) 上記(1)において、TGEV含有上清(ウイルス液)の代わりに各ウェルに培養培地50μlずつ加え、(2)と同様に処理し化合物の細胞毒性を調べた。化合物による細胞毒性が50%である化合物濃度をCC50とした。
抗TGEVアッセイの結果を表1に示す。
(1) 日生研豚TGE生ワクチン(母豚用)を使用説明書に従い、添付溶解用液を用いて調製し、使用まで−80℃で保存した。被検化合物をMedium 199にウシ胎児血清(FCS)5%(v/v)およびカナマイシン60μg/mlで加えた培養液にて所定の濃度になるように希釈し、96穴マイクロプレートに50μlずつ分注する。次に LLC-PK1細胞浮遊液を100μl(2×104 細胞)ずつを分注し、37℃、1時間培養後、更に上記TGE生ワクチンをFCS無添加培養液(Medium 199)培地で希釈したものを50μlずつ加えた。
(2) 炭酸ガス培養器内37℃で2日間培養した後、全てのウェルに MTT(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド)5mg/mlのPBS溶液を30μlずつ加え、4−5時間培養した。このとき、生存する細胞はMTTを還元してフォルマザンを析出させる。全てのウェルから培養上清を 150μlずつ取り除き、代わりに150μlの溶解液(10%トリトンX-100及び0.4%(V/V)HCl添加イソプロパノール)を加え、プレートミキサーで振とうしてフォルマザンを溶出した。フォルマザンをOD560nmで測定し、結果を被対照と比較した。ウイルスによる細胞傷害を50%抑制する化合物濃度をEC50とした。
(3) 上記(1)において、TGEV含有上清(ウイルス液)の代わりに各ウェルに培養培地50μlずつ加え、(2)と同様に処理し化合物の細胞毒性を調べた。化合物による細胞毒性が50%である化合物濃度をCC50とした。
抗TGEVアッセイの結果を表1に示す。
上記結果は、本発明化合物がTGEVに対して、in vitro において良好な抗ウイルス活性を有することを示す。
上記に示した化合物の誘導体も、上記同等あるいはそれ以上のTGEV阻害活性を示した。
上記に示した化合物の誘導体も、上記同等あるいはそれ以上のTGEV阻害活性を示した。
抗ライノウイルスアッセイ(MTT法)
(1) 被検化合物をDMEM培地にウシ胎児血清(FCS)10%(v/v)およびカナマイシン60μg/mlで加えた培養液にて所定の濃度になるように希釈し、96穴マイクロプレートに50μlずつ分注する。次に HeLa Ohio細胞浮遊液を100μl(2×104 細胞)ずつを分注し、37℃、1時間培養後、ライノウイルスHRV14を40mM HEPES、60mM MgCl2を含むDMEM培地で希釈したものを50μlずつ加えた。
(2) 炭酸ガス培養器内33℃で2日間培養した後、全てのウェルに MTT(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド)5mg/mlのPBS溶液を30μlずつ加え、2時間30分培養した。このとき、生存する細胞はMTTを還元してフォルマザンを析出させる。全てのウェルから培養上清を150μlずつ取り除き、代わりに150μlの溶解液 (10%トリトンX-100及び 0.4%(V/V) HCl添加イソプロパノール)を加え、プレートミキサーで振とうしてフォルマザンを溶出した。フォルマザンをOD560nmで測定し、結果を被対照と比較した。ウイルスによる細胞傷害を50%抑制する化合物濃度をEC50とした。
(3) 上記(1)において、ライノウイルス含有上清(ウイルス液)の代わりに各ウェルにウイルスの希釈に用いた培養培地50μlずつ加え、(2)と同様に処理し、化合物の細胞毒性を調べた。化合物による細胞毒性が50%である化合物濃度をCC50とした。
抗ライノウイルスアッセイの結果を表2に示す。
(1) 被検化合物をDMEM培地にウシ胎児血清(FCS)10%(v/v)およびカナマイシン60μg/mlで加えた培養液にて所定の濃度になるように希釈し、96穴マイクロプレートに50μlずつ分注する。次に HeLa Ohio細胞浮遊液を100μl(2×104 細胞)ずつを分注し、37℃、1時間培養後、ライノウイルスHRV14を40mM HEPES、60mM MgCl2を含むDMEM培地で希釈したものを50μlずつ加えた。
(2) 炭酸ガス培養器内33℃で2日間培養した後、全てのウェルに MTT(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド)5mg/mlのPBS溶液を30μlずつ加え、2時間30分培養した。このとき、生存する細胞はMTTを還元してフォルマザンを析出させる。全てのウェルから培養上清を150μlずつ取り除き、代わりに150μlの溶解液 (10%トリトンX-100及び 0.4%(V/V) HCl添加イソプロパノール)を加え、プレートミキサーで振とうしてフォルマザンを溶出した。フォルマザンをOD560nmで測定し、結果を被対照と比較した。ウイルスによる細胞傷害を50%抑制する化合物濃度をEC50とした。
(3) 上記(1)において、ライノウイルス含有上清(ウイルス液)の代わりに各ウェルにウイルスの希釈に用いた培養培地50μlずつ加え、(2)と同様に処理し、化合物の細胞毒性を調べた。化合物による細胞毒性が50%である化合物濃度をCC50とした。
抗ライノウイルスアッセイの結果を表2に示す。
上記結果は、本発明化合物がライノウイルスに対して、in vitroにおいて抗ウイルス活性保有しないことを示す。
上記に示した化合物の誘導体も、上記化合物以上のライノウイルス阻害活性を示さなかった。
上記に示した化合物の誘導体も、上記化合物以上のライノウイルス阻害活性を示さなかった。
抗HIVアッセイ(MTT法)
(1) HIV持続感染ヒトT細胞株 Molt-4を10%牛胎児血清添加 RPMI−1640培地で培養し、上清を濾過してウイルスの力価を測定し、−80℃で保存した。他方、被検化合物を上記の培養培地で所定の濃度になるように希釈し、96穴マイクロプレートに50μlずつ分注する。次に MT-4細胞浮遊液を100μl(2.5×104細胞)ずつを分注し、更に上記 HIV含有上清を上記の培養培地で希釈したものを50μl(4-10 TCID50/50μl)ずつ加えた。(1TCID50=50%に細胞を死滅させるウイルスの濃度)
(2) 炭酸ガス培養器内で37℃で4日間培養した後、全てのウェルにMTT(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド)5mg/ml, PBSを30μlずつ加え、更に1時間培養した。このとき、生存する細胞はMTTを還元してフォルマザンを析出させる。全てのウェルから培養上清を150μlずつ取り除き、代わりに150μlの溶解液(10%トリトンX-100及び 0.4%(V/V) HCl添加イソプロパノール)を加え、プレートミキサーで振とうしてフォルマザンを溶出した。フォルマザンをOD560nmで測定し、結果を被対照と比較した。ウイルスによる細胞傷害を50%抑制する化合物濃度をEC50とした。
(3) 上記(1)において、HIV含有上清(ウイルス液)の代わりに各ウェルに培養培地 50μlずつ加え、(2)と同様に処理し、化合物の細胞毒性を調べた。化合物による細胞毒性が50%である化合物濃度をCC50とした。
抗HIVアッセイの結果を表3に示す。
(1) HIV持続感染ヒトT細胞株 Molt-4を10%牛胎児血清添加 RPMI−1640培地で培養し、上清を濾過してウイルスの力価を測定し、−80℃で保存した。他方、被検化合物を上記の培養培地で所定の濃度になるように希釈し、96穴マイクロプレートに50μlずつ分注する。次に MT-4細胞浮遊液を100μl(2.5×104細胞)ずつを分注し、更に上記 HIV含有上清を上記の培養培地で希釈したものを50μl(4-10 TCID50/50μl)ずつ加えた。(1TCID50=50%に細胞を死滅させるウイルスの濃度)
(2) 炭酸ガス培養器内で37℃で4日間培養した後、全てのウェルにMTT(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド)5mg/ml, PBSを30μlずつ加え、更に1時間培養した。このとき、生存する細胞はMTTを還元してフォルマザンを析出させる。全てのウェルから培養上清を150μlずつ取り除き、代わりに150μlの溶解液(10%トリトンX-100及び 0.4%(V/V) HCl添加イソプロパノール)を加え、プレートミキサーで振とうしてフォルマザンを溶出した。フォルマザンをOD560nmで測定し、結果を被対照と比較した。ウイルスによる細胞傷害を50%抑制する化合物濃度をEC50とした。
(3) 上記(1)において、HIV含有上清(ウイルス液)の代わりに各ウェルに培養培地 50μlずつ加え、(2)と同様に処理し、化合物の細胞毒性を調べた。化合物による細胞毒性が50%である化合物濃度をCC50とした。
抗HIVアッセイの結果を表3に示す。
上記結果は、本発明化合物がヒト免疫不全ウイルスに対して、in vitro において抗ウイルス活性保有しないことを示す。
本発明の化合物は、抗ウイルス活性、詳しくは抗コロナウイルス活性を有し、医薬として有用な化合物にである。本発明の化合物を含有する抗CoV剤はコロナウイルスに関連する疾患の予防薬・治療薬に非常に有用である。
Claims (5)
- R5及びR6はそれぞれ独立して低級アルコキシまたはヒドロキシである、請求項2記載の化合物、その製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の化合物、その製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物を有効成分とする医薬組成物。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の化合物、その製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物を含有することを特徴とする抗ウイルス剤。
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JP2004365430A JP2006169176A (ja) | 2004-12-17 | 2004-12-17 | 抗コロナウイルス活性を有するインドリル−ペンテン−ジオン誘導体 |
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JP2004365430A JP2006169176A (ja) | 2004-12-17 | 2004-12-17 | 抗コロナウイルス活性を有するインドリル−ペンテン−ジオン誘導体 |
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Cited By (3)
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---|---|---|---|---|
CN112618540A (zh) * | 2020-12-23 | 2021-04-09 | 中国医学科学院医药生物技术研究所 | 一种取代吲哚类化合物在制备抗冠状病毒制剂中的应用 |
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-
2004
- 2004-12-17 JP JP2004365430A patent/JP2006169176A/ja active Pending
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US11312704B2 (en) | 2020-04-17 | 2022-04-26 | Pardes Biosciences, Inc. | Inhibitors of cysteine proteases and methods of use thereof |
US11472793B2 (en) | 2020-04-17 | 2022-10-18 | Pardes Biosciences, Inc. | Inhibitors of cysteine proteases and methods of use thereof |
US11524940B1 (en) | 2020-06-09 | 2022-12-13 | Pardes Biosciences, Inc. | Inhibitors of cysteine proteases and methods of use thereof |
CN112618540A (zh) * | 2020-12-23 | 2021-04-09 | 中国医学科学院医药生物技术研究所 | 一种取代吲哚类化合物在制备抗冠状病毒制剂中的应用 |
CN112618540B (zh) * | 2020-12-23 | 2022-02-11 | 中国医学科学院医药生物技术研究所 | 一种取代吲哚类化合物在制备抗冠状病毒制剂中的应用 |
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