JP2006064659A - 光学的測定装置および光学的測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 プローブ光の調整のみで過渡回折格子法を用いた測定ができる光学的測定装置を提供する。
【解決手段】 交流電源と１９、液体試料を保持する容器１１と、電気力線密度が高い領域と電気力線密度の低い領域とが規則的に並ぶ電気力線分布を発生させる電極対１３、１４と、電極対１３、１４への交流電圧の印加による液体試料中の粒子の誘電泳動を利用した過渡回折格子の発生と電圧印加の停止に伴う液体試料中の粒子の拡散による過渡回折格子の消滅を制御する誘電泳動制御部１９と、過渡回折格子に向けて光を照射する光源１６と、過渡回折格子による回折光を検出する光検出器１８とを備え、過渡回折格子によって生じる回折光の強度変化から粒子に関する評価を行う。
【選択図】図１

Description

本発明は、液体中に存在する粒子（例えば蛋白などの生体分子、各種の微粒子など）の拡散に関する情報を、光学的手法を用いて計測する光学的測定装置に関し、さらに詳細には、液体中に存在する粒子により生じる過渡回折格子による回折光を利用して、その粒子の拡散に関する情報を計測する光学的測定装置に関する。
本発明の光学的測定装置は、例えば、創薬、バイオテクノロジー、食品などの分野での分子の調査、研究に適用することができる。また、拡散係数の計測により、粒子の粒径を計測する粒子計測分野に適用することができる。

粒子の拡散を測定する手法のひとつに過渡回折格子法がある。例えば、過渡解析格子法を用いて拡散定数を計測し、拡散定数変化による蛋白質の会合検出を行うことが開示されている（特許文献１参照）。
従来の過渡回折法では、図６に示すように、２つの同一波長のパルス励起光を、互いに交差するようにして試料に照射し、干渉縞を形成する。パルス励起光による干渉縞の明部分に存在する試料中の分子（粒子）は、局所的に光励起されるのに対し、干渉縞の暗部分に存在する試料中の分子（粒子）は、光励起されないことから、干渉縞領域では、励起分子と非励起分子とが交互に規則的に並ぶように存在し、一時的に回折格子（過渡回折格子という）が形成される。

この過渡回折格子が形成された領域に、別途にプローブ光を照射すると、プローブ光は過渡回折格子によって回折されることになる。そして、パルス励起光照射によって励起分子、非励起分子による過渡回折格子が形成された後、時間経過とともに励起分子、非励起分子が拡散することによって混ざり合い、過渡回折格子が崩れてくると、過渡回折格子によるプローブ光の回折光強度が減衰することになる。このときの回折光強度の減衰曲線は、試料中の分子の拡散定数（拡散係数）を現わしていることから、減衰曲線を測定することにより、試料中の分子の拡散係数を計算することができ、さらには、拡散係数から、試料中の粒子の大きさ（粒径）や形状、溶媒との相互作用に関する情報を取得することができる。
特開２００４−８５５２８号公報

上述した従来の過渡回折格子法では、同一波長の２本の励起光を交差させて干渉縞を形成するために、光路長を略揃えた２本の励起光を測定領域に導くととともに、発生した干渉縞に基づいて形成される回折格子に対し、特定の入射角を持ったプローブ光を入射させている。そのため、２本の励起光と１本のプローブ光とを、測定しようとする１点で交差させる必要があり、励起光、プローブ光の３本の光軸調整が必要になり、調整作業が困難である。

また、蛋白質などの分子（粒子）を試料とする場合に用いる励起光には、波長が短いエキシマレーザなどの大型のレーザが必要となるため、装置が大型化してしまう。
また、蛋白質などの分子（粒子）を試料とする場合には、通常、蛋白質分子（粒子）自体のみでは、励起光によって屈折率、吸収係数、拡散係数が変化することはないので、光励起される試薬（蛍光試薬など）により試料物質をラベル化する必要がある。
しかしながら、試料に対しラベル化処理を施すことにより、測定対象の蛋白質分子（粒子）の性質、特性が変化してしまうおそれがある。
また、一般に、ラベル化処理は、不可逆反応であるため、ラベル化処理により、試料中の分子（粒子）自体が破壊されてしまい、同一試料を用いた再測定ができず、また、回収して他の目的で再利用することもできない。さらに、過渡回折格子を形成するための光励起反応についても一般には不可逆反応であり、励起光が照射され一度測定された試料からは、それ以後は、弱い信号しか発生しなくなるので、再測定することができない。

また、蛋白質などのラベル化処理が容易な分子以外を試料とする場合では、物質によってはラベル化処理ができず、励起光による粒子の光励起自体が困難であって、上述した過渡回折格子法による測定が困難なこともある。

そこで、本発明は、励起光が不要であり、また、２本の励起光、プローブ光間の光軸調整を行うことなく過渡回折格子法を用いた測定が可能な光学的測定装置を提供することを目的とする。
また、本発明は、試料のラベル化処理を行うことなく、過渡回折格子を用いて、試料の拡散に関する特性を測定することができる光学的測定装置を提供することを目的とする。

上記課題を解決するためになされた本発明の光学的測定装置は、交流電源と、液体試料を保持する容器と、電圧を印加することにより容器内の一部に電気力線密度が高い領域と電気力線密度の低い領域とが規則的に並ぶ電気力線分布を発生させる電極対と、電極対への交流電圧の印加による液体試料中の粒子の誘電泳動を利用した過渡回折格子の発生と電圧印加の停止に伴う液体試料中の粒子の拡散による過渡回折格子の消滅を制御する誘電泳動制御部と、過渡回折格子に向けて光を照射する光源と、過渡回折格子による回折光を検出する光検出器とを備え、過渡回折格子によって生じる回折光の強度変化から粒子に関する評価を行うようにしている。

本発明の光学的測定装置によれば、電極対に対して、交流電源から交流電圧を印加することにより、容器内の一部に、電気力線密度が高い領域と電気力線密度が低い領域とが規則的に並ぶ電気力線分布を発生させる。容器内の液体試料中に含まれる粒子には、この電気力線分布によって誘電泳動作用が生じ、粒子の移動が生じる。すなわち、容器内には、電極対の配置によって規則的に並ぶ電気力線分布が発生していることから、液体試料中の粒子が誘電泳動作用によって電気力線密度が高い領域に集中することによって、粒子の密な領域と疎な領域とが規則的に並ぶようになり、過渡回折格子が形成される。
この過渡回折格子に対して、光源からプローブ光を照射すれば、過渡回折格子により、特定方向に回折光が発生することになる。回折光は、誘電泳動作用によって、過渡回折格子が安定して発生しているときには強い回折光が生じている。交流電圧印加によって過渡回折格子が安定して発生している状態で、交流電圧印加を停止すると、電気力線が消滅し、誘電泳動が停止する。そのため、容器内の粒子には、拡散による移動が生じるようになり、過渡回折格子が崩れてぼやけるようになる。その結果、過渡回折格子によって生じる回折光の強度が、時間経過とともに減衰するようになるが、このときの減衰曲線は、拡散係数を現わしているので、回折光強度を光検出器により測定し、回折光強度の減衰曲線を得ることで、粒子の拡散係数、さらには、粒子の形状、粒子径、溶媒との相互作用の情報を得るようにする。

また、別の観点からなされた本発明の光学的測定方法は、電圧印加により液体試料中に電気力線密度が高い領域と電気力線密度の低い領域とが規則的に並ぶ電気力線分布を発生させる電極対を用い、電極対に交流電圧を印加して液体試料中の粒子に誘電泳動を引き起こして粒子による過渡回折格子を形成し、続いて電圧印加を停止して過渡回折格子を形成する液体試料中の粒子を拡散させ、このときの過渡回折格子による回折光の強度変化を検出することにより、粒子に関する評価を行うようにする。

この発明の光学的測定方法によれば、電極対に交流電圧を印加して液体試料中の粒子に誘電泳動を引き起こし、試料液体中の粒子を電気力線密度が高い領域に集中させて、粒子による過渡回折格子を形成する。続いて、電圧印加を停止して液体試料中の過渡回折格子を形成する粒子を拡散させ、過渡回折格子を時間経過とともに崩していく。このときの過渡回折格子の変化に伴う回折光の強度変化を検出することにより、粒子に関する評価を行うようにする。

本発明の光学的測定装置および光学的測定方法によれば、誘電泳動を利用して過渡回折格子を形成するようにしているので、過渡回折格子を発生させるときに、励起光を用いることがない。そのためプローブ光だけを測定位置に光軸調整すれば足り、励起光の光軸調整を行う必要がなく、容易に、過渡回折格子法を用いた測定を行うことができる。
また、本発明の光学的測定装置および光学的測定方法によれば、試料のラベル化処理を行うことなく、光励起することなく、過渡回折格子を用いて、試料の拡散しやすさなどの特性を測定することができるので、試料の再測定が可能であり、また、試料自体の再利用が可能である。

上記光学的測定装置において、電極対を構成するそれぞれの電極が、一定間隔を空けて並ぶ複数の電極片とこの電極片どうしを電気的に接続する接続部とからなり、一方の電極における各電極片の片側端が、間隙を空けて他方の電極における各電極片の片側端に対向するように配置されるようにすれば、電気力線密度の高い領域は、各電極片の片側端どうしが対向する間隙の位置に集中し、その隣接領域に電気力線密度の低い領域が集中することにより、各電極片の片側端どうしが対向する間隙の位置に沿って、過渡回折格子が生じるので、電極対が存在しない領域（対向する電極の間の間隙部分）に過渡回折格子が発生することになり、電極対による影響を受けることなく、過渡回折格子のみによる回折光強度の変化を測定することができる。

また、上記光学的測定装置において、少なくとも容器の一部が光源光を透過する材料で形成されるとともに、この光源光を透過する容器部分に電極対が形成されており、電極対に向けて光源光を入射させ、光検出器は液体試料を透過した回折光または液体試料で反射した回折光を検出するようにすれば、透過回折光または反射回折光を簡単に得ることができる。ここで、光源光を透過する容器部分は底面であってもよいし、側壁面であってもよい。

以下、本発明の実施形態について図面を用いて説明する。なお、本発明は、以下に説明するような実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々の態様が含まれることはいうまでもない。

図１は、本発明の一実施形態である光学的測定装置の構成を示す斜視図であり、図２はその電極部分の構成を示す平面図である。この光学的測定装置は、誘電泳動作用を利用しつつ光学的測定を行うものであり、粒子を含む液体試料を保持する容器１１、容器１１の底面となる底板１２aに形成される一対の電極１３、１４と、電極１３および電極１４に交流電圧を印加する交流電源１５と、光源１６と、光源光を収束するレンズ光学系１７と、回折光を検出する光検出器１８と、交流電源１５から電極１３、１４への電圧印加を制御する誘電泳動制御部１９とからなる。

容器１１は、底板１２ａの上に、側壁となる枠体１２ｂを貼り付けることにより形成してある。この容器１１は、ガラス等の光透過性の材料が用いられ、底板１２ａを通して、入射光が電極１３、１４の間の間隙部分に照射できるようにしてある。なお、入射光が照射される部分以外の容器部分は、光透過性材料以外のものを用いてあるいは遮光部材を設けて、不要な光の入射を遮断し、検出感度を高めるようにしてもよい。

電極１３、１４は、マスクパターニング手法を用いて，底板１２ａ上に形成される。なお、本実施形態では、底板１２ａに電極１３、１４を形成しているが、容器１１が十分に深い場合には、底板１２ａに代えて、側壁となる枠体１２ｂに電極１３、１４を形成してもよい。
電極１３は、平行な直線状の電極片１３ａ、１３ｂ、１３ｃ、１３ｄが一定間隔を空けて平行に並べられるとともに、これらの直線状電極片の片側端どうしを電気的に接続する接続部１３ｅが設けられ、いわゆる櫛型電極を形成している。
電極１４についても同様であり、平行な直線状の電極片１４ａ、１４ｂ、１４ｃ、１４ｄが一定間隔を空けて平行に並べられるとともに、これらの直線状電極片の片側端どうしを電気的に接続する接続部１４ｅが設けられ、いわゆる櫛型電極を形成している。
そして、電極１３と電極１４とは、直線状電極片１３ａ、１４ａの片側端どうし、直線状電極片１３ｂ、１４ｂの片側端どうし、直線状電極片１３ｃ、１４ｃの片側端どうし、直線状電極片１３ｄ、１４ｄの片側端どうしが、それぞれ、間隙Ｓを空けて対向配置するようにしてある。

電極１３、１４の寸法は、直線状電極片の電極幅ｄ１、直線状電極片間の間隔ｄ２のいずれについても、０．５μｍ〜２０μｍ程度でそれぞれ一定寸法にするのが好ましいが、一定間隔ごとに各間隙Ｓが配置され、電圧を印加したときに各間隙Ｓの部分に電気力線密度が高い領域が発生し、その隣に電気力線密度が低い領域が発生するものであれば、形状や寸法は、特に限定されない。例えば、電極幅ｄ１と電極間隔ｄ２とが異なる寸法になるようにしてもよいし、電極片の形状が直線状でなくてもよい。

交流電源１５には、液体中の粒子に誘電泳動を引き起こすことができる電圧、周波数の交流電源が用いられる。具体的には、１〜１００Ｖ、１０ＫＨｚ〜１０ＭＨｚ程度の交流電圧が印加できる交流電源を使用する。なお、一般的には、高周波電源を用いるのが好ましい。

プローブ光を照射するための光源１６は、測定対象となる液体試料に応じて種類を選択すればよいが、例えば、Ｈｅ−Ｎｅレーザ光源（波長６３３ｎｍ）や、その他のレーザ光源を用いるのが好ましい。
レンズ光学系１７は、光源光を収束し、電極１３、１４の間の間隙Ｓを含む過渡回折格子が形成される領域Ａに、光源光が照射できるように光軸が調整される。なお、光源光の入射角度が調整できるようにして、測定対象、測定目的に応じて、透過回折光、反射回折光のいずれでも、取得できるようにするのが好ましい。例えば、透過回折光による測定を行う場合は、入射角は、容器底面と液体試料との界面で全反射が生じない条件に設定される。

光検出器１８は、透過回折光を検出する場合は、液体試料の上部側に配置する。光検出器１８には、回折角を測定するための角度調整機構が設けられており、回折光の強度とともに回折角が検出できるようにしてある。この光検出器１８には、フォトダイオードやＣＣＤが用いられる。なお、角度調整機構を設ける代わりに、複数の素子を並べたアレイセンサを用いて、回折角が計測できるようにしてもよい。

誘電泳動制御部１９は、いわゆるＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭなどからなるコンピュータにより構成され、予め記憶されたプログラムにより、交流電源１５から電極１３、１４に対して、過渡回折格子を形成するために必要な交流電圧を、必要な時間だけ印加し、その後、電圧印加を停止して粒子の拡散を引き起こす制御を行う。

次に、上記装置の計測動作について説明する。予め、光源１６から領域Ａに入射光が照射できるように光学系を調整しておく。
まず、誘電泳動制御部１９の制御により、交流電源１５から電極１３、電極１４間に交流電圧Ｖ_０を印加する。液体試料中に粒子（例えば蛋白質など）が存在すると、交流電圧による誘電泳動作用が働き、粒子は電気力線が集中する領域に移動する。図３は、交流電圧を印加したときの粒子の状態を説明する図である。図に示すように、電気力線が集中する間隙Ｓ部分に粒子が移動することにより、粒子が密な領域Ｂと疎な領域Ｃとが交互に並び、粒子による過渡回折格子が形成される。
このとき、領域Ａに入射した光源１６からの入射光は、過渡回折格子によって回折され、特定方向に回折光を生じる。交流電圧が継続して印加されているときは、過渡回折格子は、安定して存在しているので、過渡回折格子による強い強度の回折光が光検出器１８により検出される。これを基準値として計測しておく。

続いて、誘電泳動制御部１９の制御により、電極１３、１４への交流電圧の印加を停止する。これにより、誘電泳動作用が停止することになり、間隙Ｓに集中していた粒子は、拡散により、しだいに広がっていく。その結果、過渡回折格子が崩れて、しだいに薄くぼやけるようになり、やがて図４に示すように、過渡回折格子が消滅する。過渡回折格子が薄くなっていく課程で、回折光の強度が弱くなるので、回折光強度の強度変化を光検出器１８で測定する。

以上の計測動作により得られる回折光の強度変化のタイムチャートを、印加電圧の波形とともに図５に示す。誘電泳動を停止した後の減衰曲線は、拡散係数に依存するので、減衰曲線から拡散係数を求めることで、粒子の拡散に関する情報を得ることができる。

（他の実施形態）
上記実施形態では、透過回折光を検出したが、反射回折光を検出してもよい。反射回折光を利用すれば、光吸収性のある液体試料についても、回折光の検出を容易に行うことができる。
なお、反射回折光を測定する光学的測定装置の場合は、図１に示した装置構成において、光検出器１８の位置を、底板１２ａの下部側に配置するようにする。
反射回折光測定の場合、好ましくは、光源１６から照射される入射光の入射角を、全反射が生じる条件にして、反射する回折光の光量をできるだけ増やすようにする。例えば、容器１１が、ガラス製であり、液体試料として水系試料が保持されている場合、入射角を４６度前後にするのが好ましい。

また、上記実施形態では、電極１３、１４はそれぞれの直線状の電極片の片側端どうしが対向するようにし、電極間の間隙部分に過渡回折格子を形成するようにしたが、電極の形状パターンはこれに限られず、要するに、電圧を印加したときに、電気力線密度が高い領域と電気力線密度が低い領域とが交互に規則的に並ぶ形状であれば、誘電泳動による過渡回折格子を形成することができるので、本発明を実施することができる。

本発明は、液体試料中の粒子の光学的測定を行う光学的測定装置に利用することができる。

本発明の一実施形態である光学的測定装置の構成を示す斜視図。 図１の光学的測定装置の電極部分の形状を示す平面図。 電極に交流電圧を印加したときに形成される過渡回折格子を説明する図。 過渡回折格子を形成後に電圧印加を停止して粒子を拡散させたときの状態を説明する図。 本発明の光学的測定装置による印加電圧波形（ａ）と回折光強度（ｂ）のタイムチャートを示す図。 従来からの過渡回折格子法を説明する図。

符号の説明

１１： 容器
１２ａ： 底板
１２ｂ： 枠体
１３、１４ 電極
１３ａ〜１３ｄ、１４ａ〜１４ｄ： 直線状電極片
１３ｅ、１４ｅ：接続部
１５： 交流電源
１６： 光源
１７： レンズ光学系
１８： 光検出器
１９：誘電泳動制御部

Claims (4)

1. 交流電源と、液体試料を保持する容器と、電圧を印加することにより容器内の一部に電気力線密度が高い領域と電気力線密度の低い領域とが規則的に並ぶ電気力線分布を発生させる電極対と、電極対への交流電圧の印加による液体試料中の粒子の誘電泳動を利用した過渡回折格子の発生と電圧印加の停止に伴う液体試料中の粒子の拡散による過渡回折格子の消滅を制御する誘電泳動制御部と、過渡回折格子に向けて光を照射する光源と、過渡回折格子による回折光を検出する光検出器とを備え、
   過渡回折格子によって生じる回折光の強度変化から粒子に関する評価を行うことを特徴とする光学的測定装置。
2. 電極対を構成するそれぞれの電極は、一定間隔を空けて並ぶ複数の電極片とこの電極片どうしを電気的に接続する接続部とからなり、
   一方の電極における各電極片の片側端が、間隙を空けて他方の電極における各電極片の片側端に対向するように配置されることを特徴とする請求項１に記載の光学的測定装置。
3. 少なくとも容器の一部が光源光を透過する材料で形成されるとともに、この光源光を透過する容器部分に電極対が形成されており、過渡回折格子に向けて光源光を透過する容器部分から光源光を入射させ、光検出器は液体試料を透過した回折光または液体試料で反射した回折光を検出することを特徴とする請求項１に記載の光学的測定装置。
4. 電圧印加により液体試料中に電気力線密度が高い領域と電気力線密度の低い領域とが規則的に並ぶ電気力線分布を発生させる電極対を用い、電極対に交流電圧を印加して液体試料中の粒子に誘電泳動を引き起こして粒子による過渡回折格子を形成し、
   続いて電圧印加を停止して過渡回折格子を形成する液体試料中の粒子を拡散させ、
   このときの過渡回折格子による回折光の強度変化を検出することにより、粒子に関する評価を行うことを特徴とする光学的測定方法。