JP2005537029A - メチル化プロファイルを測定するための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
個体のメチル化プロファイルを測定するための方法および組成物、ならびに所望の形質を有するクローンを同定するためにプロファイルを用いる方法。
Description
本出願は、すべての目的のために参照として組み入れられている、2002年6月26日に出願された、米国仮出願第60/392,071号に関する優先権の恩典を主張する。
本発明は、メチル化プロファイルの測定に関する。
本発明は、米国科学財団により授与された認可番号NSF0077774による政府援助でなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
DNAメチル化は、細菌からヒトまでの範囲にわたる多様な生物体において起こる遍在性生物学的過程である。この過程の間、DNAメチルトランスフェラーゼは、アデニンのN6位へ、またはシトシンのC5もしくはN4位へ、メチル基の複製後付加を触媒し、S-アデノシルメチオニンがそのためのメチル基の普遍的供与体である。高等真核生物において、DNAメチル化は、ゲノム刷り込みおよび胚発生において役割を果たす。さらに、DNAメチル化における異常型は、老化および癌を含む様々な疾患に結びつけられてきた。
本発明は、細胞、組織または生物体のメチル化プロファイルを測定するための方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、以下の段階を含む:
a. 細胞、組織もしくは生物体由来のランダムに切断または剪断されたDNAの均一な大きさに形成された集団を供給する段階であって、DNAが第一部分および第二部分を含み、かつ各部分がメチル化および非メチル化ヌクレオチドを含む、段階;
b. 第二部分をメチル化DNA下位部分および非メチル化DNA下位部分へと分離する段階;
c. 第一部分、メチル化DNA下位部分および非メチル化DNA下位部分からなる群より選択される少なくとも2つのDNA試料において少なくとも1つの特定の配列の相対量を定量し、それにより細胞または生物体由来のいくつかのそのような核酸配列のメチル化プロファイルを測定する段階。
少なくとも2つのDNA試料を異なる標識で標識する段階、および
少なくとも2つのDNA試料を核酸へハイブリダイズさせる段階;ならびに
2つのハイブリダイズしている標識の比率を計算することにより、少なくとも2つのDNA試料の特定の配列への相対的ハイブリダイゼーションを測定する段階。
a. 親の個体を有性生殖的または無性生殖的に繁殖させた子孫のゲノムメチル化プロファイルを測定する段階;および
b. 均一または多様なメチル化プロファイルを示す子孫を選択し、それにより、1つまたは複数の親の個体からエピジェネティクス的に均一な集団を作製する段階。
a. 剪断またはランダムに切断された均一なDNA集団をメチル化および非メチル化画分へ分離する段階;
b. メチル化または非メチル化画分を第一標識で標識する段階;ならびに
c. メチル化または非メチル化画分を核酸へハイブリダイズさせる段階。
a. 細胞、組織もしくは生物体由来のランダムに切断または剪断されたDNAの均一な大きさに形成された集団を供給する段階であって、DNAが第一部分および第二部分を含み、かつ各部分がメチル化および非メチル化ヌクレオチドを含む、段階;
b. 第一部分を第一標識で標識する段階;
c. メチル化または非メチル化DNAを第二部分から削除させる段階;
d. この削除させられた第二部分を第一標識とは異なる第二標識で標識する段階;
e. 第一部分および削除させられた第二部分を核酸へハイブリダイズさせる段階;
f. 2つのハイブリダイズしている標識の比率を計算することによりDNAにおける相補核酸断片の相対的メチル化を測定し、それにより細胞、組織または生物体由来のいくつかのそのような核酸配列のメチル化プロファイルを測定する段階。
a. 細胞、組織もしくは生物体由来のランダムに切断または剪断されたDNAの均一な大きさに形成された集団を供給する段階であって、DNAが第一部分および第二部分を含み、かつDNAがメチル感受性またはメチル依存性制限酵素のメチル化および非メチル化認識配列を含む、段階;
b. DNA集団の第一部分を第一標識で標識する段階;
c. 第二部分をメチル感受性またはメチル依存性制限酵素で切断する段階;
d. メチル化または非メチル化DNAを第二部分から削除させる段階;
e. 第二部分由来の切断されていないDNAを第一標識とは異なる第二標識で標識する段階;
f. 第一および第二部分由来の標識されたDNAを核酸へハイブリダイズさせる段階;ならびに
g. 核酸にハイブリダイズしている第一および第二標識を検出することにより核酸の相対的メチル化を測定し、それにより細胞、組織または生物体のメチル化プロファイルを測定する段階。
a. 細胞、組織もしくは生物体由来のランダムに切断または剪断されたDNAの均一な大きさに形成された集団を供給する段階であって、DNAが第一部分および第二部分を含み、かつ各部分がメチル化および非メチル化ヌクレオチドを含む、段階;
b. 第一部分を第一標識で標識する段階;
c. メチル化または非メチル化DNAを第二部分から削除させる段階;
d. 削除させられた第二部分を第一標識とは異なる第二標識で標識する段階;
e. 第一部分および削除させられた第二部分を核酸へハイブリダイズさせる段階;
f. 2つのハイブリダイズしている標識の比率を計算することによりDNAにおける相補核酸断片の相対的メチル化を測定し、それにより細胞、組織または生物体由来のいくつかのそのような核酸配列のメチル化プロファイルを測定する段階。
a. 細胞、組織もしくは生物体由来のランダムに切断または剪断されたDNAの均一な大きさに形成された集団を供給する段階であって、DNAが第一部分および第二部分を含み、かつDNAがメチル感受性またはメチル依存性制限酵素のメチル化および非メチル化認識配列を含む、段階;
b. DNA集団の第一部分を第一標識で標識する段階;
c. 第二部分をメチル感受性またはメチル依存性制限酵素で切断する段階;
d. メチル化または非メチル化DNAを第二部分から削除させる段階;
e. 第二部分由来の切断されていないDNAを第一標識とは異なる第二標識で標識する段階;
f. 第一および第二部分由来の標識されたDNAを核酸へハイブリダイズさせる段階;ならびに
g. 核酸にハイブリダイズしている第一および第二標識を検出することにより核酸の相対的メチル化を測定し、それにより細胞、組織または生物体のメチル化プロファイルを測定する段階。
「均一な」とは、集団内でほとんどまたは全く変異を示さない特定の形質を指す。典型的には、均一な集団内の個体は、特定の形質において、わずか約500 %しか変異しないものであり、いくつかの場合においては、集団において、特定の個体または平均個体の形質の約300 %、200 %、100 %、75 %、50 %、25 %、10 %、5 %または1 %だけ変異する。同様に、DNA集団におけるDNA断片に関連して用いられる場合、「均一な」または「均一な大きさに形成された」とは、断片長において、わずかに約500 %の変動(およびいくつかの場合、約300 %、200 %、100 %、75 %、50 %、25 %、10 %、5 %または1 %ほどの変動)をもつ集団を指す。例えば、DNA断片の平均の長さは、1,000個の塩基対であり、500 %変動をもつ均一な集団は、わずかに6,000個の塩基対をもつ個体を有するであろう。
1. 序論
DNAメチル化の遺伝子発現への影響は、領域性および深在性の両方である。ゲノムメチル化における変化は、隣接する遺伝子の不適当な発現を起こす。従って、ゲノムの複数領域のメチル化状態を調査する(または「メチル化プロファイル」)を測定する能力は、特定のメチル化状態の、遺伝子発現および/または形質との関連を可能にする。
本発明は、全ゲノムのメチル化プロファイルを含む、核酸のメチル化プロファイルを測定する方法を提供する。本発明の方法は、断片化DNAの均一な大きさに形成された集団を作製すること、ならびにメチル化および/または非メチル化DNAからなるDNA試料を作製することを含む。核酸のメチル化プロファイルは、その後、以下のいずれか2つの間の核酸の相対量を定量することにより測定されうる:全DNA、メチル化DNAまたは非メチル化DNA、すなわち、それぞれ、非メチル化またはメチル化DNAについて削除された試料。
a. メチル化DNA下位部分と比較した第一部分;
b. 非メチル化DNA下位部分と比較した第一部分;または
c. メチル化DNA下位部分と比較した非メチル化DNA下位部分;
d. 第一部分と比較したメチル化DNA下位部分と比較した非メチル化DNA下位部分。
上で考察されているように、多くの態様において、出発のゲノムDNAは断片化される。断片化は、当業者に公知の任意の方法により(例えば、機械的な剪断、制限酵素またはデオキシリボヌクレアーゼIによる切断など)、行われうる。いくつかの態様において、断片の均一な大きさに形成された集団が単離される(例えば、アガロースゲル電気泳動および特定の範囲の断片サイズの溶出により)。例えば、断片の平均サイズは、例えば、約0.1 kb、0.5 kb、1 kb、2 kb、3 kb、4 kb、5 kbまたはそれ以上でありうる。いくつかの態様において、断片の平均サイズは、例えば、0.1〜1 kb、1〜2 kb、1〜3 kb、1〜5 kb、2〜4 kbまたは1〜10 kbの間の範囲である。
多数の方法がDNAをメチル化または非メチル化DNA下位部分へ分離するために用いられうる。
いったんDNA断片が全DNAならびにメチル化DNAおよび非メチル化DNA下位部分を含む第一部分へ分離されたならば、いずれかの特定の核酸が下位部分内で定量される前に各下位部分において断片を均一に増幅するための当業者に公知の多数の方法がある。例えば、断片の事前増幅は、下位部分内においていずれか特定の核酸からのシグナルを増加させ、存在する痕跡量の出発DNAにおいて特定の配列のメチル化プロファイリングを可能にする。そのような技術は、生検組織または切除された腫瘍からの試料においてのように、ゲノムDNAの小さい試料だけが利用可能である場合、有用である。一つの例において、二本鎖DNAアダプターが下位部分におけるDNA断片末端に連結される。その後、DNAアダプターへ特異的なオリゴヌクレオチドが各下位部分へ添加され、その後、下位部分におけるDNA断片の集団は、例えば、リニア(例えば、ローリングサークル)または指数関数的(例えば、PCR)DNA増幅技術を用いて増幅される。
DNA試料における核酸(すなわち、第一部分、メチル化DNA下位部分および/または非メチル化下位部分)の定量は、当業者に公知の任意の方法により行われうる。
例えば、簡単なハイブリダイゼーションがDNA試料において核酸配列を定量するために用いられうる。一つの例において、2つまたはそれ以上の試料が異なる標識(例えば、蛍光または別なふうに検出可能な標識)で標識され、異なる標識の相対的シグナルが、標識された試料の核酸へのハイブリダイゼーションの後に標準的方法により測定される。与えられたDNAプローブの特定のメチル化配列へのハイブリダイゼーションは、配列がメチル化していることを示す。プローブハイブリダイゼーションの非存在は、配列がメチル化されていないことを示す。同様に、個体由来の非メチル化DNAがターゲットとして用いられることができ、ハイブリダイゼーションは、配列が個体においてメチル化されていないことを示す。
DNA試料(例えば、下位部分の第一部分)内の核酸配列はまた、当業者に公知の多数の定量的増幅技術のいずれかにより測定されうる(例えば、定量的PCRまたは定量的リニア増幅)。定量的増幅の方法は、例えば、米国特許第6,180,349号;第6,033,854号;および第5,972,602号に、加えて、例えば、Gibsonら、Genome Research 6:995-1001 (1996);DeGravesら、Biotechniques 34(1):106-110, 112-115 (2003);Deiman Bら、Mol Biotechnol. 20(2):163-179 (2002)に開示されている。
メチル化プロファイルは、当業者に公知の多数の追加の方法において検出されうる。例えば、メチル感受性またはメチル依存性制限エンドヌクレアーゼで切断される核酸の簡単なハイブリダイゼーション分析(例えば、サザンブロッティング)が、メチル化パターンを検出するために用いられうる。典型的には、これらの方法は、メチル化されうる少なくとも1つの配列にハイブリダイズする1つまたは複数のターゲットの使用を含む。制限酵素切断配列のメチル化の存在または非存在は、プローブにハイブリダイズしているポリヌクレオチドの長さにより測定される。亜硫酸水素塩シーケンシングのような、DNAメチル化を検出するためのこれを始めとする方法は、例えば、Thomassinら、Methods 19(3):465-475 (1999)に記載されている。
A. 一般的方法
メチル化プロファイリングは、特定のメチル化パターンに関連した任意の表現型を予測するために有用である。いったんそのような関係が確立されたならば、メチル化プロファイリングは、所望の表現型を有する個々の細胞または生物体を同定するために有効な方法である。例えば、メチル化プロファイルは、植物もしくは動物において栽培学的に有用な形質と関連しうる、または医学的分野において、特定の癌型と関連しうり、それにより診断または治療を可能にする。
この設計によって、各試料は各色素で標識され、相対的な色素の取り込みが考慮されるのを可能にする。4つのアレイのみが用いられ、従って、個体間におけるゲノム全体に渡るメチル化プロファイル差異を分析するために必要とされる時間および物資の量を最小限にする。または、4つの異なる色素を用いることは、同じデータが単一のアレイのハイブリダイゼーションから生じることを可能にするものと思われる。
エピジェネティクス的に均一な集団は、個体のメチル化プロファイルを測定し、その後、類似したプロファイルをもつそれらの個体を選択することにより、同定かつ選択されうる。これらの方法は、例えば、所望の表現型をもつ個体の無性生殖によるクローンを単離し、それにより同じ表現型をもつクローンを同定するのに有用である。いくつかの態様において、選択されたクローンの少なくとも約80 %、85 %、90 %、95 %、98 %または99 %が、無性の親と実質的に同一のメチル化プロファイルを有する。
伝統的育種技術は、可能性のある育種ペアのメチル化プロファイルを測定することにより向上しうる。メチル化パターンを雑種強勢形質と関連させることにより、育種家は、子孫に所望のメチル化パターンを生じさせる育種ペアを選択することができ、それゆえに、結果として強勢の子孫を生じる。
以下の実施例は、例証としてのみ提供され、限定として提供されない。当業者は、本質的に類似した結果を生じるために変化または改変されうる様々な重要ではないパラメーターを容易に認識するものと思われる。
20マイクログラムの全ゲノムDNAを1〜10 kbのサイズ範囲へ剪断する。剪断されたDNAを2つの等しい部分へ分け、その一つを80ユニットのmcrBCで、少なくとも12時間、37 Cで消化し完了させる。噴霧の目的は、ゲノム全体が、すべての断片サイズ1 kb〜10 kbに等しく表されるようにゲノムDNAをランダムに剪断することである。さらに、小さい断片サイズはまた、ゲル精製およびCy-色素取り込みを容易にする(下記参照)。その後、2つの試料をサイズ標準と共に0.8 % アガロースゲル上で分解する。その後、1 kbおよびそれより大きいサイズ範囲におけるゲルスライスを切り取り、DNAをQiagen Qiaquickゲル抽出スピンカラムを用いて、製造会社のプロトコールに従い、精製する。
染色体4上のシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)ヘテロクロマチンの瘤領域の1.7 Mbのひと配列のメチル化プロファイルは、実施例1において特定された技術を用いて確立された。ここで、本発明者らは、この領域のDNAメチル化パターンがそれの遺伝子発現のパターンと相関したことを実証する。本発明者らはまた、突然変異分析を用いて、その領域についてのDNAメチル化のパターンを遺伝子的に改変することがその遺伝子座からの遺伝子発現のパターンを著しく改変することを示す。最後に、本発明者らは、その領域におけるクロマチン改変(異なる分析により測定される)が、DNAメチル化と遺伝子発現の本発明者らの相関を独立して確認することを示す。
女性の胎盤のヒトゲノムDNA(Sigma)をGeneMachines Hydroshearを用いて1 Kbと4 Kbの間の均一な大きさの範囲へ剪断した。DNAを電気泳動後、低融解アガロースゲルのスライスから単離した。溶離されたDNAの濃度をNanodropスキャニング分光光度計を用いて測定した。約1 μgのDNAをBioprime-kit(Invitrogen)でのCy3-dCTPの直接的取り込みを用いてランダム-プライム標識をし、並行反応はCy5-dCTPを取り込んだ。標識されたDNAを合成反応後、精製し、Cy色素の取り込みをスペクトルスキャニング1000(NanoDrop)を用いてモニターした。ハイブリダイゼーション反応混液は、両方の合成反応、バックグラウンドを抑制するための非標識ヒトC0t-1 DNA(Invitrogen)、Agilent/Operon陽性対照オリゴヌクレオチド、およびcDNA上に存在する任意のポリA(またはT)へのハイブリダイゼーションを抑制するためのオリゴヌクレオチドを含んだ。Agilentヒト1カタログcDNAアレイを65℃でAgilentの使用説明書に従って、一晩、ハイブリダイズさせた。
メチル化プロファイリング技術は、同じヒト女性胎盤のゲノムDNAに適用された。メチル化プロファイリングは、比率が1.0直線(紺青色)からはずれる場合メチル化(赤色)を予想し、t検定は、フューチャーの75 %より多くが、容認できる小さい標準偏差(SD)をもつことを明らかにした。これらの観察は、その技術がヒトゲノムにおいてメチル化されている配列を再現性をもって検出していることを示唆している。
メチル化プロファイリングが予想どおりに働く場合には、色素比率シグナルは、メチラーゼでDNAをインビトロ前処理をし、それにより人工的に5mC含有量を増加させることにより変化するはずである。メチル化プロファイリングは、3ポイントのメチラーゼ反応混液タイムコース(1 U/μgあたり0分、3分、および15分)にかけられたヒト女性胎盤のゲノムDNAにおいて行われた。DNAは、メチル基をCpG配列におけるシトシンへ転移するM.SssI、および同様に、メチル基をゲノムのCCGG部位の外側のシトシンへ転移するM.MspIに曝された(http://rebase.neb.com)。定量的測定は、メチラーゼ反応が完了に達する前のタイムポイントを選択することにより検査された。工程は、色素交換はないが、前に記載されているように行われた。未処理の試料は、各アレイについて赤色(Cy5)に標識された。4つの異なるアレイ上における同じ1,500個のフューチャーの結果は、本発明のメチル化プロファイリング方法がインビトロでメチル化された一連のDNA試料内におけるメチル化の増加している存在を検出したことを明らかに実証している。さらに、多くの遺伝子座は、内因性メチル化を含む。表1は、女性胎盤のゲノム内にメチル化を含むと予想される上位16個の遺伝子座を列挙している。
*表1は、各フューチャーから得られた平均(n=8(4つの色素交換))5mC強度比率をt検定p値により、およびその後、全体の比率により選別されたものを列挙している。比率は、メチル化削除の色素チャネルで割られた未処理の色素チャネルから得られた平均強度を反映している。比率範囲もまた示されている。
**t検定p値は、GeneSpring(v5.0)内のシグナルチャネル精度(ピクセルハイブリダイゼーション強度/フューチャーのSD)を利用することにより決定された。それとして、表は、16個の最も再現性が高く得られた測定からのフューチャー同定および対応するメチル化分配を示す。
Claims (64)
- 以下の段階を含む、細胞、組織または生物体のメチル化プロファイルを測定するための方法:
a. 細胞もしくは生物体由来のランダムに切断または剪断されたDNAの均一な集団を提供する段階であって、DNAが第一部分および第二部分を含み、かつ各部分がメチル化および非メチル化ヌクレオチドを含む段階;
b. 該第二部分をメチル化DNA下位部分および非メチル化DNA下位部分へと分離する段階;
c. 該第一部分、メチル化DNA下位部分および非メチル化DNA下位部分からなる群より選択される少なくとも2つのDNA試料において、少なくとも1つの特定の配列の相対量を定量し、それにより細胞、組織または生物体由来のいくつかのそのような核酸配列のメチル化プロファイルを測定する段階。 - 以下の段階を含む、請求項1記載の方法:
少なくとも2つのDNA試料を異なる標識で標識し、少なくとも2つの該DNA試料を核酸へハイブリダイズさせる段階;および
ハイブリダイズしている2つの標識の比率を計算することにより、少なくとも2つの該DNA試料の特定の配列への相対的ハイブリダイゼーションを測定する段階。 - 定量する段階が定量的増幅を含む、請求項1記載の方法。
- 少なくとも2つのDNA試料がメチル化DNA下位部分および非メチル化DNA下位部分である、請求項1記載の方法。
- 少なくとも2つのDNA試料が第一部分およびメチル化DNA下位部分である、請求項1記載の方法。
- 少なくとも2つのDNA試料が第一部分および非メチル化DNA下位部分である、請求項1記載の方法。
- ランダムに切断または剪断されたDNAがメチル感受性制限酵素のメチル化および非メチル化認識配列を含み、かつ分離する段階が第二部分をメチル感受性制限酵素で切断する段階を含む、請求項1記載の方法。
- ランダムに切断または剪断されたDNAがメチル依存性制限酵素のメチル化および非メチル化認識配列を含み、かつ分離する段階が第二部分をメチル依存性制限酵素で切断する段階を含む、請求項1記載の方法。
- 核酸が固体支持体に連結されている、請求項2記載の方法。
- 固体支持体がマイクロアレイである、請求項9記載の方法。
- 固体支持体がビーズである、請求項9記載の方法。
- 固体支持体がマトリックスである、請求項9記載の方法。
- 生物体が植物である、請求項1記載の方法。
- 生物体が真菌である、請求項1記載の方法。
- 生物体が原核生物である、請求項1記載の方法。
- 原核生物が細菌病原体である、請求項15記載の方法。
- 細菌病原体がグラム陽性種、グラム陰性種および放線菌からなる群より選択される、請求項16記載の方法。
- 生物体が動物である、請求項1記載の方法。
- 動物がヒトである、請求項18記載の方法。
- 細胞が幹細胞である、請求項1記載の方法。
- 細胞がトランスジェニックであり、かつ核酸が導入遺伝子の挿入部位に対応している、請求項1記載の方法。
- 組織が血液である、請求項1記載の方法。
- 組織が生検組織である、請求項1記載の方法。
- 組織が切除された組織である、請求項1記載の方法。
- 組織が正常である、請求項1記載の方法。
- 組織が前癌性である、請求項1記載の方法。
- 細胞がトランスジェニックであり、かつ核酸が導入遺伝子の挿入部位に対応している、請求項1記載の方法。いくつかの態様において、組織は血液である。いくつかの態様において、組織は生検組織である。いくつかの態様において、組織は切除された組織である。いくつかの態様において、組織は正常である。
- 核酸のメチル化プロファイルを核酸の転写と比較し、それにより核酸のメチル化と転写の間の関係を測定する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 核酸の転写がマイクロアレイで検出される、請求項28記載の方法。
- 細菌病原体の検体のメチル化プロファイルを病原体の参照菌株と比較する段階をさらに含み、メチル化パターンの類似性が検体および参照菌株の共通の起源を示している、請求項1記載の方法。
- 第一および第二の標識されたDNA部分にハイブリダイズするポリヌクレオチドマイクロアレイであって、該部分が細胞もしくは生物体由来のランダムに切断または剪断されたDNAの均一な集団由来であり;
該第一DNA部分が第一標識で標識された非メチル化およびメチル化DNAを含み;かつ、
該第二DNA部分が非メチル化DNAまたはメチル化DNAのいずれかについて削除され、かつDNAの第二部分が第一標識とは異なる第二標識で標識されている、
ポリヌクレオチドマイクロアレイ。 - 第二試験DNA部分がメチル化DNAについて削除されている、請求項31記載のポリヌクレオチドマイクロアレイ。
- 第二試験DNA部分が非メチル化DNAについて削除されている、請求項31記載のポリヌクレオチドマイクロアレイ。
- 第二DNA部分が、ランダムに切断または剪断されたDNAをメチル感受性またはメチル依存性制限酵素で処理し、切断されていないDNAを選択することにより削除させられている、請求項31記載のポリヌクレオチドマイクロアレイ。
- DNA集団が植物由来である、請求項31記載のポリヌクレオチドマイクロアレイ。
- DNA集団が動物由来である、請求項31記載のポリヌクレオチドマイクロアレイ。
- DNA集団が真菌由来である、請求項31記載のポリヌクレオチドマイクロアレイ。
- DNA集団が原核生物由来である、請求項31記載のポリヌクレオチドマイクロアレイ。
- 原核生物が細菌病原体である、請求項31記載のポリヌクレオチドマイクロアレイ。
- 細菌病原体がリステリア(Listeria)、大腸菌(E. coli)、サルモネラ(Salmonella)、エルシニア(Yersinia)およびナイセリア(Neisseria)からなる群より選択される、請求項39記載のポリヌクレオチドマイクロアレイ。
- DNA集団がトランスジェニック生物体またはトランスジェニック細胞由来である、請求項31記載のポリヌクレオチドマイクロアレイ。
- メチル化された場合、隣接する遺伝子発現を沈黙させる遺伝子プロモーターおよび/またはポリヌクレオチド配列を含む、請求項31記載のポリヌクレオチドマイクロアレイ。
- 以下の段階を含む、1つまたは複数の親の個体からエピジェネティクス的に均一または多様な子孫の集団を作製するための方法:
a. 親の個体を有性生殖的または無性生殖的に繁殖させた子孫のゲノムメチル化プロファイルを測定する段階;および
b. 均一または多様なメチル化プロファイルを示す子孫を選択し、それにより、1つまたは複数の親の個体からエピジェネティクス的に均一な集団を作製する段階。 - 親の個体のメチル化プロファイルを測定する段階をさらに含み、かつ選択する段階が親の個体のメチル化プロファイルを示す子孫を選択する段階を含む、請求項43記載の方法。
- 親がF1ハイブリッドである、請求項44記載の方法。
- 子孫が有性生殖的に繁殖される、請求項43記載の方法。
- 子孫が無性生殖的に繁殖される、請求項43記載の方法。
- 親の個体が植物である、請求項43記載の方法。
- 親の個体が動物である、請求項43記載の方法。
- 親の個体が真菌である、請求項43記載の方法。
- 親の個体が原核生物である、請求項43記載の方法。
- 子孫が親のクローンである、請求項43記載の方法。
- ゲノムメチル化プロファイルが固体支持体上で測定される、請求項43記載の方法。
- 固体支持体が膜である、請求項53記載の方法。
- 固体支持体がメチル結合カラムである、請求項53記載の方法。
- 固体支持体がマイクロアレイである、請求項53記載の方法。
- 固体支持体がビーズである、請求項53記載の方法。
- 測定する段階が、ランダムに切断または剪断された均一なDNA集団をメチル化および非メチル化画分へ分離する段階;メチル化または非メチル化画分を第一標識で標識する段階;ならびに、メチル化または非メチル化画分を核酸にハイブリダイズさせる段階を含む、請求項43記載の方法。
- 第二標識で標識された全ゲノムDNAを供給する段階、および全ゲノムDNAを核酸にハイブリダイズさせ、それにより第一標識由来のシグナルを正規化する段階をさらに含む、請求項58記載の方法。
- ランダムに切断または剪断されたDNAがメチル感受性制限酵素のメチル化および非メチル化認識配列を含み、かつ削除させる段階が第二部分をメチル感受性制限酵素で切断する段階を含む、請求項43記載の方法。
- ランダムに切断または剪断されたDNAがメチル依存性制限酵素のメチル化および非メチル化認識配列を含み、削除させる段階が第二部分をメチル依存性制限酵素で切断する段階を含む、請求項43記載の方法。
- 子孫を群においてスクリーニングする、請求項43記載の方法。
- 以下の段階を含む、雑種強勢をメチル化プロファイルと関連させる方法:
子孫を生じるために個体を交雑させる段階;
該個体および該子孫のメチル化プロファイルを測定する段階;ならびに
該子孫の形質を該個体のメチル化プロファイルと比較し、それにより該形質の出現を該メチル化プロファイルと関連させる段階。 - 個体が異なる雑種強勢群由来である、請求項63記載の方法。
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