JP2005533484A - Rna干渉のための方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
「RNA干渉」「転写後遺伝子サイレンシング」「抑止(quelling)」とは、導入遺伝子の過剰発現又は誤発現、あるいは細胞内への二本鎖RNAの意図的な導入が原因で起こる、同様の効果の異なる名称である[Fire A(1999)Trends Genet 15:358-363;Sharp PA(1999)Genes Dev 13:139-141;Hunter C(1999)Curr Biol 9:R440-R442;Baulcombe DC(1999)Curr Biol 9:R599-R601;Vaucheret他(1998)Plant J 16:651-659参照]。二本鎖RNAを例えば線虫C.エレガンス(Caenorhabditis elegans)に注入すると、相同な内因性RNAの転写後喪失が全身で起こる[Fire他(1998)Nature 391:806-811;及びMontgomery他(1998)PNAS 95:15502-15507参照]。RNA干渉(しばしばRNAiと称される)は、クローン化遺伝子を特異的かつ強力に不活性化する方法を提供し、又、遺伝子機能を研究するための強力な手段であることが判明しつつある。たとえその現象がそれ自体興味深いものであっても、その機能はまだ解明されていないが、例えばSmardon他(2000)Curr Biol 10:169-178などの近年の研究によって、RNAiの根底にある生物学的過程における性質と進化について、明らかになりつつある。
本発明の一つの特徴は、標的遺伝子の発現を減衰させるのに充分な量の二本鎖RNA(dsRNA)を細胞に導入することを包含する、培養細胞において標的遺伝子の発現を減衰させる方法にして、前記dsRNAが、標的遺伝子のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を包含することを特徴とする方法を提供する。
(i)細胞内でDicer活性又はArgonaut活性の片方又は両方を活性化し、そして
(ii)標的遺伝子の発現を減衰させるのに充分な量のdsRNAを細胞に導入する(ここでdsRNAは、標的遺伝子のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を包含する)
ことを含む方法を提供する。
ある態様においては、細胞は培養に懸濁される。他の態様においては、細胞は例えば非ヒト哺乳動物等の動物一個体内にある。
(i)二本鎖DNAを生成するためのプロモーターに対して一つの方向性を有する、細胞に由来する核酸配列の多彩なライブラリーを構築し;
(ii)該多彩なdsRNAライブラリーを標的細胞の培養物に導入し;
(iii)該細胞に特定の表現型を与えるライブラリーのメンバーを同定する
ことを含み、該ライブラリーのメンバーに対応する(同一又は相同であるなど)、細胞由来の配列を同定することを特徴とする当該アッセイを提供する。
(i)RNAiにより阻害されたときに表現型として望ましい応答を与える標的遺伝子を、主題のアッセイにより同定し;
(ii)標的遺伝子の発現又は標的遺伝子の発現産物の活性を阻害する能力により薬剤を同定し;
(iii)工程(b)で同定された薬剤又はその類似体の、動物における効力及び毒性についての治療剤プロファイリングを行ない;そして
(iv)工程(iii)で許容しうる治療剤プロフィルを有するとして同定された少なくとも一種の薬剤を含む医薬組成物を配合する
ことを含む当該方法を提供する。
(i)RNAiにより阻害されたときに表現型として望ましい応答を与える標的遺伝子を主題のアッセイにより同定し;
(ii)(適宜)該標的遺伝子の治療剤プロファイリングを、動物における効力と毒性について行ない;そして
(iii)該標的遺伝子の素外在の更なる開発の権利を第三者に許諾する。
図1:S2細胞におけるRNAi。(a)ショウジョウバエS2細胞を、コピアプロモーターからのlacZ発現を指示するプラスミドと、図に示すようにヒトCD8又はlacZのいずれかに相当するdsRNAとで、又はdsRNA無しで、トランスフェクトした。(b)S2細胞を、GFP−US9融合タンパク質の発現を指示するプラスミドと、図に示すようにlacZ又はサイクリンEのいずれかのdsRNAとで同時トランスフェクトした。上段は細胞群全体のFACSプロファイルを示し、下段はGFP陽性細胞のFACSプロファイルを示す。(c)図に示すようにlacZ、サイクリンE、fizzy又はサイクリンAdsRNAでトランスフェクトした細胞から全RNAを抽出した。ノーザンブロットは、トランスフェクトしたdsRNAに存在しない配列とハイブリダイズした。
図2:イン・ビトロRNAi。(a)ショウジョウバエサイクリンEの最初の600ヌクレオチド(E600)又はlacZの最初の800ヌクレオチド(Z800)のいずれかに相当する転写物を、図に示すようにlacZ又はサイクリンE(cycE)dsRNAのいずれかでトランスフェクトした細胞に由来する溶解物中でインキュベートした。インキュベート時間はサイクリンEについては0、10、20、30、40及び60分、lacZについては0、10、20、30及び60分とした。(b)転写物を、サイクリンEdsRNA(図下部の斜線部分)でトランスフェクトしたS2細胞抽出物内でインキュベートした。図に示すように、転写物はlacZの最初の800ヌクレオチドあるいはサイクリンEの最初の600、300、220又は100ヌクレオチドに相当した。 Eoutは、トランスフェクトしたdsRNAに含まれていない、サイクリンEcDNAの一部に由来する転写物である。E−dsはS2細胞にトランスフェクトしたdsRNAと同一である。インキュベート時間は0及び30分とした。(c)サイクリンEcDNA全体に相補的な合成転写物(Eas)、最後の600ヌクレオチドに相補的な合成転写物(Eas600)又は300ヌクレオチドに相補的な合成転写物(Eas300)を抽出物中で0又は30分間インキュベートした。
図3:RISCの基質必要条件。サイクリンEdsRNAでトランスフェクトした細胞から抽出物を調製した。アリコートを、サイクリンE(E600)又はlacZ(Z800)基質いずれかを加える前に、30℃で30分間インキュベートした。20μlのアリコートをそれぞれ、図に示すように、1mM CaCl2及び5mM EGTA;1mM CaCl2、5mM EGTA及び60U小球菌ヌクレアーゼ;1mM CaCl2及び60U小球菌ヌクレアーゼ;又は10UデオキシリボヌクレアーゼI(Promega)及び5mM EGTAと共に予備インキュベートした。30分の予備インキュベートの後、EGTAを含まない試料にEGTAを添加した。全ての試料に酵母tRNA(1μg)を添加した。インキュベート時間は0及び30分とした。
図4:RISCは潜在的なガイドRNAを含む。(a)未加工溶解物又はS100画分(可溶性ヌクレアーゼ活性物質を含む。「方法」の項参照)由来のRNAのノーザンブロットを、サイクリンEmRNAのセンス鎖に由来するリボプローブとハイブリダイズさせた。(b)「方法」の項に記載するように可溶性サイクリンE特異的ヌクレアーゼ活性物質を分別した。陰イオン交換樹脂で得た画分を、lacZ、対照基質(図上部)又はサイクリンE基質(図中央)と共にインキュベートした。サイクリンEcDNAのセンス鎖に由来する、一様に標識付けした転写物を用いたノーザンブロット法によって、各画分から得たRNAを分析した(図下部)。サイズマーカーとしてDNAオリゴヌクレオチドを用いた。
図5:22量体の産生及びmRNAの分解は、異なる酵素複合体によって行われる。(a)0−12時間のショウジョウバエ胚又はショウジョウバエS2細胞のいずれかから調製した抽出物(「方法」の項参照)を、ショウジョウバエサイクリンEコード領域の最初の500ヌクレオチドに相当する二本鎖RNAに一様に標識付けしたものと共に、0、15、30又は60分間(左から右)インキュベートした。Mは合成テンプレートのイン・ビトロ転写によって調製されたマーカーを示す。テンプレートは22ヌクレオチド転写物を産生するように設計されている。ダブレットの最も可能性のある原因としては、+1位置における不適当な開始が考えられる。(b)ルシフェラーゼコード領域の最初の500ntに相当するdsRNAでトランスフェクトしたS2細胞から、全細胞抽出物を調製した。S10抽出物を30,000xgで20分間回転させ、これを本願明細書における標準RISC抽出物とした。S10抽出物を更に60分間、100,000xgで遠心分離して、S100抽出物を調製した。図に示すように、一本鎖ルシフェラーゼmRNA又は一本鎖サイクリンEmRNAのそれぞれについて、(各組において左から右の順で)0、30又は60分間の、mRNA分解アッセイを前述のように実施した。(c)S10又はS100抽出物を、(左から右の順で)0、60又120分間、サイクリンEdsRNAと共にインキュベートした。
図6:組換えCG4792/Dicerによる22量体の生成。(a)T7エピトープ標識付けされたDrosha、CG4792/Dicer−1及びHomelessの発現を誘導するプラスミドで、ショウジョウバエS2細胞をトランスフェクトした。標識タンパク質を免疫沈降により細胞溶解物から精製し、サイクリンEdsRNAとインキュベートした。対照として、ショウジョウバエ胚及びS2細胞抽出物内でも反応を行った。負の対照として、β−ガラクトシダーゼ発現ベクターでトランスフェクトした細胞から免疫沈降物を調製した。各対のレーンは、0又は60分で行った反応を示す。合成マーカー(M)は、図5における符号の説明と同様である。(b)CG4792/Dicer−1、Drosha及びHomelessのドメイン構造の概略図を示す。(c)ショウジョウバエDicer−1(CG4792)のC末端8アミノ酸に対して作製した抗血清を用いて、S2細胞の洗浄剤溶解物から免疫沈降物を調製した。対照として、予免疫血清、並びに過剰の抗原性ペプチドで予備インキュベートした免疫血清を用いて、類似の調製物を作製した。これらの沈降物それぞれとショウジョウバエサイクリンEの〜500nt断片とを共にインキュベートした開裂反応を示す。比較として、ショウジョウバエ胚抽出物内の基質をインキュベートしたものを、平行に電気泳動した。(d)ATPの存在下又は非存在下で、Dicer免疫沈降物をdsRNA基質と共にインキュベートした。比較として、同一の基質を、ATPを付加したかあるいはグルコース及びヘキソキナーゼでATPを枯渇させたS2抽出物と共にインキュベートした(「方法」の項参照)。(e)GFPの最初の500ntに相当するdsRNAに一様に32P標識付けしたもので、ショウジョウバエS2細胞をトランスフェクトした。ヒスチジン標識したショウジョウバエAgo−2[最近同定されたRISC複合体成分の一つ(Hammond他、in prep)]を用いて、RISC複合体をアフィニティー精製した。リボソームに連結したままの条件下(ls、低塩分)又はリボソームからi+を可溶性の形状で抽出する条件下(hs、高塩分)のいずれかで、RISCを単離した。比較として、全溶解物中の標識RNAのスペクトルを示す。(f)dsRNAをDicer免疫沈降と共にインキュベートして作製したガイドRNAを、アフィニティー精製したRISC複合体に存在するガイドRNAと比較した。これらは1種類のヌクレオチドを分離することのできるゲル上で完全に一致して移動した。「対照」と記したレーンは、標識dsRNAでトランスフェクトしたがエピトープ標識付けされたショウジョウバエAgo−2ではトランスフェクトしていない細胞から、RISCについてアフィニティー精製したものである。
図7:DicerはRNAiに関与する。(a)ショウジョウバエS2細胞を、2種のショウジョウバエDicer(CG4792及びCG6493)に相当するdsRNAで又はマウスカスパーゼ9に相当する対照dsRNAでトランスフェクトした。これらの細胞の細胞質抽出物を、Dicer活性について調べた。Dicer dsRNAでトランスフェクトしたものについては、溶解物における活性が7.4分の1に低下した。(b)Dicer−1抗血清(CG4792)を用いて、上記したように処理したS2細胞から免疫沈降物を調製した。このアッセイにおいては、Dicer dsRNAはDicer−1の活性を6.2分の1に低下させた。(c)マウスカスパーゼ9 dsRNA又はDicer dsRNAのいずれかで2日前にトランスフェクトした細胞を、GFP発現プラスミドと、ルシフェラーゼdsRNA(対照)又はGFP dsRNAのいずれかとで同時トランスフェクトした。3つの異なる実験をFACSで定量化した。対照(カスパーゼ9)又はDicer dsRNAのいずれかで予めトランスフェクトした細胞中の、対照(GFPプラスミド+ルシフェラーゼdsRNA)又は発現抑制(GFPプラスミド+GFPdsRNA)細胞数を、GFP陽性細胞の相対百分率の比較で示す。
図8:Dicerは、進化的に保存されたリボヌクレアーゼである。(a)Dicerによる22量体作製のモデル。リボヌクレアーゼIIIの作用について提案されている機能に基づいて、本発明者らはDicerが基質に対して二量体として作用すると想定した。従って、酵素内での2個のリボヌクレアーゼドメイン(RIIIa及びRIIIb)の位置が、開裂産物の寸法を決めると考えられる。同様に妥当と思われる別のモデルとして、各Dicer酵素のRIIIa及びRIIIbドメインが、連動して単一位置で開裂するものが考えられる。このモデルにおいては、2個の隣接するDicer酵素間の相互作用によって、開裂産物の寸法が決定される。(b)様々な生物体(ショウジョウバエ−CG4792、CG6493、C.エレガンス−K12H4.8、シロイヌナズナ−CARPEL FACTORY、T25K16.4、AC012328_1、ヒトヘリカーゼ−MOI及びS.pombe−YC9A_SCHPO)において想定されるDicer同族体のドメイン構造の比較。Pfamによる各配列の分析及びPsi−blast検索の両方によって、ZAPドメインを同定した。推定S.pombe DicerにおけるZAPドメインは、Pfamによって検出されなかったが、Psi−Blastによって同定された(異なる色で示す)。比較として、RDE1/QDE2/ARGONAUTEファミリーのドメイン構造を示した。なおZAPドメインは、Dicer及びARGONAUTEファミリーそれぞれの内部において比較した方が、異なる2ファミリーからのZAPドメインを比較した場合よりも類似している。(c)選択されたDicer及びArgonauteファミリーにおけるZAPドメインの整列を示す。整列は、Clustal Wを用いて行った。
図9:RISCの精製方法。(RNAiモデルの第2段階)
図10:サイジングカラムによるRISC活性の分画。活性は、500KD複合体として分別された。又、ショウジョウバエ argonaute2に対する抗体も、活性と共に分別された。
図11〜13:monoS、monoQ、ヒドロキシアパタイトカラムによるRISCの分画。ショウジョウバエ argonaute2タンパク質も同時に分画された。
図14:ショウジョウバエ argonaute2と他ファミリーメンバーとのアラインメント。
図15:ショウジョウバエ argonaute2の確認。S2細胞を、標識dsRNA及びHis標識argonauteでトランスフェクトした。argonauteをニッケルアガロース上で分離し、RNA成分を15%アクリルアミドゲル上で同定した。
図16:S2細胞及び胚抽出物を、22量体産生活性についてアッセイした。
図17:RISCは、22量体産生活性分画(Dicer)から分離することができる。回転抽出物(S100)では、上清からRISC活性が除去されていたが(左パネル)、S100回転抽出物は依然としてDicer活性を含んでいた(右パネル)。
図18:DicerはdsRNAに対して特異性を有しており、長い基質を好む。
図19:Dicerを幾つかのカラムに分画した。
図20:dsRNAを22量体に加工することのできる酵素としてのDicerの同定。様々なリボヌクレアーゼIIIファミリーのメンバーをN末端標識と共に発現させ、免疫沈降して、22量体産生活性について調べた(左パネル)。右パネルにおいて、Dicerに対する抗体は、22量体産生活性を沈降させた。
図21:DicerはATPを必要とする。
図22:Dicerは、RISCに存在するRNAと同じサイズのRNAを産生した。
図23:発現され免疫沈降されたヒトDicer同族体は、22量体産生活性を有する。
図24:ショウジョウバエ argonaute2の配列。マイクロシーケンシングによって同定したペプチドを下線で示した。
図25:ショウジョウバエ argonaute2の分子特性。イントロンプローブを用いるノーザンブロット法によって、コード配列中のイントロンの存在を調べた。その結果、公知のゲノム配列のものとは異なる5’読み枠が確認された。ポリグルタミン反復配列の数は、ゲノムPCRによって調べた。
図26:Dicer活性物質は、ヒト細胞においてヒトDicer遺伝子を発現させることによって作り出すことができる。宿主細胞を293とした。粗抽出物はDicer活性を示したが、未トランスフェクト細胞は活性を示さなかった。活性は、ショウジョウバエ胚抽出物に観察されるものと異ならない。
図27:発現抑制される遺伝子の約500ntの断片(X)を、標準的クローニング法を用いて、安定した直列反復として改変ベクター内に挿入した。市販のcreレコンビナーゼで処理してloxP部位(L)内で配列を反転し、逆向きの反復配列を作製した。これはsbc突然変異細菌株(DL759)内で安定に保持され増幅されうる。選択したプロモーター(P)からのイン・ビボでの転写により、サイレンシングを引き起こすヘアピンRNAが得られる。直接及び逆向き反復構造の保持を確実にするためにゼオシン耐性マーカーを含有させたが、これはイン・ビボでは必須条件ではなく、所望であれば、予じめmRNAスプライシングして除去することができる[Smith他(2000)Nature 407、319-20]。
図28:胎生期癌細胞P19におけるRNAi。10センチメートルのプレート中のP19細胞を、5μgのGFPプラスミド及び40μgの示したdsRNAを利用して(又は、RNAなしで)、トランスフェクトした。細胞を、蛍光により(上段パネル)及び位相差顕微鏡により(下段パネル)、トランスフェクションの72時間後に写真撮影し、サイレンシングも又、トランスフェクションの48時間後に明らかであった。
図29:ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼのP19細胞におけるRNAi。(A及びB) P19細胞を、ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼの発現を指示するプラスミド及びdsRNA500量体(A及びBでそれぞれ示したように25又は250ng)でトランスフェクトした(それらは、ホタルルシフェラーゼmRNAに相同であり(dsFF)又は相同でなかった(dsGFP))。ルシフェラーゼ活性を、示したように、トランスフェクション後の様々な時点でアッセイした。ホタル対ウミシイタケの活性の比は、dsGFP対照に対して標準化してある。(C及びD) 12ウェルの培養ディッシュ(2mlの培地)中のP19細胞を、pGL3−ControlとpRL−SV40の9:1混合物0.25μg及び示したRNA2μgでトランスフェクトした。抽出物をトランスフェクションの9時間後に調製した。(C)ホタル対ウミシイタケルのシフェラーゼの比を示してある。(D)ウミシイタケ対ホタルのルシフェラーゼの比を示してある。値は、dsGFPに対して標準化してある。3つの独立した実験の平均を示してあり;エラーバーは、標準偏差を示している。
図30:右側のパネルは、野生型P19細胞への一時的トランスフェクション後のRFP又はGFPの発現を示している。左側のパネルは、500ntの二本鎖GFPヘアピンを安定に発現するP19クローンにおけるGFP発現の特異的抑制を示している。二本鎖GFPヘアピンを安定に発現するP19クローンを、RFP又はGFPで一時的にトランスフェクトして、RFP又はGFPの発現を視覚的検査により評価した。
図31:マウス胚性幹細胞におけるルシフェラーゼ発現のdsRNAによる特異的サイレンシング。12ウェル培養ディッシュ(1mlの培地)中のマウス胚性幹細胞を、1.5μgのdsRNAと、レポータープラスミドpGL3−Control及びpRL−SV40の10:1混合物0.25μgとでトランスフェクトした。トランスフェクションの20時間後に、抽出物を調製してアッセイした。ホタル対ウミシイタケのルシフェラーゼ比を、FFds500につき示してあり;ウミシイタケ対ホタルの比をRen ds500につき示してある。両方とも、dsGFPトランスフェクションからの比に対して標準化してある。3つの独立した実験の平均を示してあり;エラーバーは、標準偏差を示している。
図32:C2C12マウス筋芽細胞におけるRNAi。(A)12ウェル培養ディッシュ(1mlの培地)中のマウスC2C12細胞を、1μgの示したdsRNAと、0.250μgのレポータープラスミドpGL3−Control及びpRL−SV40とでトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、抽出物を調製してアッセイした。ホタル対ウミシイタケのルシフェラーゼの比を示してあり;値は、dsRNAなしの対照からの比に対して標準化してある。3つの独立した実験の平均を示してあり;エラーバーは、標準偏差を示している。(B)1μgのプラスミドだけで又はワクシニアウイルスK3Lの活動亢進変異体(Kawagishi-Kobayashi等、2000, Virology 276:424-434)を含むプラスミドで同時トランスフェクトされたC2C12細胞。ウミシイタケ及びホタルのルシフェラーゼ活性の絶対計数を示している。(C)dsRNAなしの対照に対して標準化したBからのホタル/ウミシイタケ活性の比。
図33:フォティナス・ピラリス(ホタル)及びレニラ・レニフォルミス(ウミシイタケ)ルシフェラーゼを発現するプラスミドと、ホタルルシフェラーゼmRNAと相同な(dsLUC)又は相同でない(dsGFP)dsRNA500量体(400ng)とでトランスフェクトしたHela、チャイニーズハムスター卵巣、及びP19(多能性のマウス胎生期癌)細胞株。二連のルシフェラーゼアッセイを、アナリティカル・サイエンティフィック・インストゥルメンツモデル3010ルミノメーターを利用して行なった。このアッセイにおいて、ウミシイタケルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ活性のdsRNA特異的抑制についての内部対照として役立つ。これらのデータは、500量体dsRNAが、同起源の遺伝子のイン・ビボでの発現を特異的に抑制することができることを示している。
図34:ヘアピンRNAの発現は、GFPを安定にサイレントにするP19EC細胞株を生成する。(A)GFPヘアピンを構築するのに用いたFLIPカセットの略画。GFPは、GFPは、EGFPの第一の500のコード塩基対を表している。Zeo、ゼオシン耐性遺伝子;L,Lox;P、発現プラスミドpcDNA3中のサイトメガロウイルスプロモーター。相同なGFP断片が、先ず、直列反復としてFLIPカセット中にクローン化される。ヘアピン生成のための逆向き反復を造るために、第二の反復をCreレコンビナーゼを利用することによりひっくり返す。転写されたときに、この逆向き反復は、ヘアピンループを有するGFPdsRNAを形成する。(B)このGFPヘアピンプラスミドを安定に発現するP19細胞株。GFPhp.1(クローン10)及びGFPhp.2(クローン12)を、wtP19と共に、0.25μgの各GFP及びRFPレポーター遺伝子でトランスフェクトした。蛍光顕微鏡写真を、GFP及びRFPに適したフィルターを利用して撮った。倍率は、200×である。(C)P19 GFPhp.1細胞を、pEGFP及び0、0.5又は1μgのDicer又はホタルdsRNAでトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に蛍光顕微鏡写真を撮って、明視野イメージと重ねて、GFPを発現していない細胞を示した。倍率は、100×である。(D)P19細胞のdsRNAのイン・ビトロ及びイン・ビボでのプロセッシング。イン・ビトロDicerアッセイを、S2細胞及び3つの独立に調製したP19抽出物について、32P標識したdsRNAを利用することにより行なった(30℃、30分間)。対照及びGFPhp.1 P19細胞から抽出したRNAのノーザンブロットは、約22量体のRNA種の生成をヘアピン発現細胞において示しているが、対照用細胞では示していない。ブロットを、32P標識した「センス」GFP転写物によりプローブ検査した。
図35:dsRNAは、転写後レベルでサイレンシングを誘導する。P19細胞抽出物を、ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼmRNA(各100ng)のイン・ビトロ翻訳のために利用した。翻訳反応を、様々な量のホタルルシフェラーゼmRNAと相同な(dsLUC)又は相同でない(dsGFP)dsRNA500量体を用いて計画した。ルシフェラーゼアッセイを、1時間、30℃でのインキュベーション後に行なった。ホタル及びウミシイタケの活性の比は、dsRNA対照に対して標準化してある。平均からの標準偏差を示してある。
図36:P19細胞溶解物に由来するS10画分を、フォティナス・ピラリス(ホタル)及びレニラ・レニフォルミス(ウミシイタケ)のルシフェラーゼmRNAのイン・ビトロ翻訳に利用した。翻訳反応は、ホタルルシフェラーゼmRNAに相補的なdsRNA、ssRNA又はasRNA500量体(dsFF、ssFF、又はasFF)、ウミシイタケルシフェラーゼに相補的なdsRNA、ssRNA又はasRNA500量体(dsREN、ssREN又はasREN)又は相補的でないdsRNA、ssRNA又はasRNA500量体(dsGFP)を用いて計画した。反応を、dsRNA、ssRNA又はasRNAとの30分間の予備インキュベーションの後に、30℃で1時間行なった。二連のルシフェラーゼアッセイを、アナリティカル・サイエンティフィック・インストゥルメンツモデル3010ルミノメーターを利用して行なった。左側において、ウミシイタケルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ活性のdsRNA特異的な抑制についての内部対照として役立つ。右側において、ホタルルシフェラーゼは、ウミシイタケルシフェラーゼ活性のdsRNA特異的な抑制についての内部対照として役立つ。これらのデータは、500量体の二本鎖RNA(dsRNA)が、同起源の遺伝子の発現をイン・ビトロで、転写後遺伝子サイレンシングと一致する方法で抑制するが、一本鎖(ssRNA)又はアンチセンスRNA(asRNA)は抑制しないことを示している。
図37:P19細胞を、6ウェル組織培養プレート中で、約60%集密まで生育させた。様々な量のdsRNA{ホタルルシフェラーゼmRNAに相同なもの(dsLUC)又は相同でないもの(dsGFP)}を各ウェルに加えて、12時間、通常の組織培養条件下でインキュベートした。次いで、細胞を、フォティナス・ピラリス(ホタル)及びレニラ・レニフォルミス(ウミシイタケ)ルシフェラーゼを発現するプラスミドとdsRNA500量体(500ng)とでトランスフェクトした。二連のルシフェラーゼアッセイを、トランスフェクションの12時間後に、アナリティカル・サイエンティフィック・インストゥルメンツモデル3010ルミノメーターを利用して行なった。このアッセイにおいて、ウミシイタケルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ活性のdsRNA特異的な抑制についての内部対照として役立つ。これらのデータは、500量体dsRNAが、同起源の遺伝子の発現を、通常の組織培養条件下でトランスフェクションなしで、イン・ビボで特異的に抑制することができることを示している。
図38:siRNAを生成する以前の方法は、高価な化学合成を要した。この発明は、siRNA合成のための、標準的RNA転写反応を利用するイン・ビトロの方法を提供する。
図39:短いヘアピンは、ショウジョウバエのS2細胞において、遺伝子転写を抑制する。(A)典型的な化学合成されたRNAの配列及び予想される二次構造。pGL3−Control上に担われるホタルルシフェラーゼの112〜134位(siRNA)及び463〜491位(shRNA)に対応する配列。このルシフェラーゼ配列の463〜485位を標的とするsiRNAは、発現の抑制において事実上112〜134siRNAと同じであったが、示さない。(B)外因的に供給された短いヘアピンは、標的のホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現をイン・ビボで抑制する。6ウェルプレートのS2細胞を、250ng/ウェルの、ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼの発現を指示するプラスミド及び500ng/ウェルの示したRNAを用いてトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性を、トランスフェクションの48時間後にアッセイした。ホタル対ウミシイタケのルシフェラーゼ活性の比を、グリーン蛍光タンパク質(GFP)に向けられたsiRNAでトランスフェクトした対照に対して標準化した。3つの独立した実験の平均を示してあり;エラーバーは、標準偏差を示している。(C)短いヘアピンは、ショウジョウバエのDicer酵素により処理される。T7転写されたヘアピンshFfL22、shFfL29及びshFfS29を、0−2−hショウジョウバエ胚抽出物を伴って(+)又は伴わないで(−)インキュベートした。抽出物とインキュベートされたものは、約22ntのsiRNAを生成し、これは、これらのヘアピンのRNA干渉を誘導する能力と一致する。長いdsRNA投入物(サイクリンE500量体)を対照として利用した。開裂反応を、Bernstein等、2001, Nature, 409:363-366に記載されたように行なった。
図40:哺乳動物細胞における短いヘアピンの機能。HEK 293T、HeLa、COS−1及びNIH3T3細胞を、図1におけるように、プラスミド及びRNAを用いてトランスフェクトして、トランスフェクションの48時間後に二連のルシフェラーゼアッセイにかけた。ホタル対ウミシイタケのルシフェラーゼ活性の比は、グリーン蛍光タンパク質(GFP)に向けられたsiRNAでトランスフェクトした対照に対して標準化してある。3つの独立した実験の平均を示してあり;エラーバーは、標準偏差を示している。
図41:イン・ビトロで転写されたsiRNA及び短いヘアピンは、哺乳動物細胞中で遺伝子発現を抑制する。(A)代表的なイン・ビトロ転写されたsiRNAの配列及び予想された二次構造。pGL3−Control上に担われるホタルルシフェラーゼの112〜134位(siRNA)及び463〜491位(shRNA)に対応する配列。(B)イン・ビトロ転写されたsiRNAは、標的のホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現をイン・ビボで抑制する。HEK293T細胞を、図2におけるように、プラスミドでトランスフェクトした。siRNAの5’末端の塩基対形成してないグアノシン残基の存在は、予想された末端構造を有意に変えて、siRNA活性を完全に破壊する。(C)典型的なイン・ビトロ転写されたshRNAの配列及び予想された二次構造。pGL3−Control上に担われたホタルルシフェラーゼの112〜141位に対応する配列。(D)イン・ビトロで転写された短いヘアピンは、標的のホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現をイン・ビボで抑制する。HEK293T細胞を、図2におけるように、プラスミドでトランスフェクトした。
図42:機能的shRNAのイン・ビボでの転写。(A)pShh1ベクターの概略図。標的遺伝子に相同な19〜29塩基を有するshRNAをコードする配列を、60〜75bpの二本鎖DNAオリゴヌクレオチドとして合成して、U6プロモーターの直ぐ下流のEcoRV部位に連結する。(B)Ff1ヘアピンの配列及び予想された二次構造。(C)pShh1ベクターから発現されたshRNAは、ルシフェラーゼの哺乳動物細胞における発現を抑制する。HEK 293T、HeLa、COS−1及びNIH3T3細胞を、図1におけるようなレポータープラスミドと、示したようなpShh1ベクター、ホタルsiRNA又はpShh1ホタルshRNA構築物とでトランスフェクトした。ホタル対ウミシイタケのルシフェラーゼ活性の比を、トランスフェクションの48時間後に測定し、3つの独立した実験の平均を示してあり;エラーバーは、標準偏差を示している。
図43:Dicerは、shRNA媒介の遺伝子サイレンシングに必要である。HEK293T細胞を、ルシフェラーゼレポータープラスミド並びにpShh1−Ff1及びヒトのDicerを標的とするsiRNAでトランスフェクトした(示したように、単独で又は組み合わせて)。このDicersiRNA配列(TCA ACC AGC CAC TGC TGG A)は、ヒトのDicer配列の対応する3137〜3155に対応する。ホタル対ウミシイタケのルシフェラーゼ活性の比を、トランスフェクションの26時間後に測定して、3つの独立した実験の平均を表し;エラーバーは、標準偏差を示している。
図44:内因性遺伝子の安定なshRNA媒介の遺伝子サイレンシング。(A)p53ヘアピンの配列及び予想された二次構造。5’shRNA幹は、マウスp53に由来する27nt配列(ヌクレオチド166〜192)を含み、3’幹は、相補的なアンチセンス配列を有する。(B)p53を標的としたshRNAを発現する初代マウス繊維芽細胞(MEF)は、老化を回避する。野生型MEF(5回継代)を、対照用プラスミド又はp53と共にpBabe−RasV12でトランスフェクトした(各5μg、FuGENE;Roche使用)。トランスフェクションの2日後に、細胞をトリプシン処理し、計数して、2.0μg/mLのピューロマイシンを含む培地に1×105/10cmプレートの密度でプレートした。対照用細胞は、増殖を止めて、老化した表現型を示している(左側パネル)。p53ヘアピンを発現している細胞は、成長し続けている(右側パネル)。写真を、トランスフェクションの14日後に撮った。
図45:2つの短いヘアピン(共に、ホタルのルシフェラーゼに対応)の混合物は、遺伝子発現の相乗的な抑制を生じない。ホタルのルシフェラーゼ遺伝子の発現の、2つの異なる短いヘアピン(HP#1及びHP#2)の混合物のトランスフェクションによる抑制を調べた。HP#1及びHP#2の混合物は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子発現の抑制に対してHP#1だけの発現よりも一層強い効果を有しなかった。
図46:コードされた短いヘアピンは、遺伝子発現をイン・ビボで特異的に抑制する。ホタルルシフェラーゼに対応する29ヌクレオチドのヘアピンをコードするDNAオリゴヌクレオチドを、U6プロモーターを含むベクターに挿入した。3つの独立した構築物を、293T細胞におけるホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現を特異的に抑制するそれらの能力について調べた。siOligo1−2、siOligo1−6及びsiOligo1−19(正しい向きの構築物)の各々は、遺伝子発現を、siRNAと同じくらい効果的に抑制した。対照的に、siOligo1−10(正しくない向きの構築物)は、遺伝子発現を抑制しなかった。ホタルルシフェラーゼ遺伝子の異なる部分を標的とする独立した構築物は、何れの向きであっても遺伝子発現を効果的に抑制しなかった(siOligo2−23、siOligo2−36)。
図47〜49:短いdsRNAの安定な発現のためのストラテジー。
図50:二連のルシフェラーゼアッセイを、図28〜35で詳細に記載したように行なったが、これらの実験で用いた細胞は、PKR−/−マウス胎児繊維芽細胞(MEF)であった。簡単にいえば、長いdsRNAを利用するRNAiは、典型的に、MEFにおいて非特異的応答を引き起こす(PKR活性のために)。長いdsRNA構築物の、MEFにおける遺伝子発現を特異的に阻害する効果を評価するために、RNAiを、PKR−/−MEFにて調べた。かかる細胞は、非特異的応答を伴うdsRNAに応答しない。この図にまとめたデータは、非特異的PKR応答の非存在下では、長いdsRNA構築物は、MEFにおける遺伝子発現を特異的に抑制することを示している。
図51:マウスチロシナーゼプロモーターの概略的表示である。プライマーを利用して、近いプロモーター中の3つの別々の領域を増幅し、又は約12kb上流に位置するエンハンサーに対応する配列を増幅した。
図52:図X及びYにおいて用いたレポーター発現用プラスミド及びsiRNA配列。PGL3−Control及びPluc−NS5Bは、マウス肝臓へのトランスフェクションに用いた発現用プラスミドである。この研究で用いたsiRNAのヌクレオチド配列を、下に示してある。
図53:siRNAを利用する成体マウスにおけるRNA干渉。(a)ルシフェラーゼプラスミドpGL3−controlだけをトランスフェクトされたマウス又は、ルシフェラーゼプラスミドpGL3−controlと、ルシフェラーゼsiRNA若しくは未処理siRNAとを同時トランスフェクトされたマウスから放出された光の代表的イメージ。グレースケール参照イメージ(基準用)の上に重ねた放射光の強さ(赤が最も強く;青は最も弱い)を表す擬似色彩イメージは、RNAiが成体マウスにおいて機能することを示している。アニールした21ヌクレオチドのsiRNA(40μg;Dharmacon)を、マウスの肝臓に、2μgのpGL3−controlDNA(Promega)及び800単位のRNasin(Promega)(1.8mlPBS緩衝液中)と同時に注入した(5−7s)。72時間後に、マウスを麻酔して、3mgのルシフェリンをイメージングの15分前に腹腔内投与した。(b)siRNAが、典型的実験から生じる(グループ当たり6匹のマウス)。ルシフェラーゼsiRNAを受けたマウスは、レポーターだけの対照より有意に弱い光を放出した(ポストホック フィッシャー検定を用いる一方向ANOVA)。レポーターだけの及び無関係siRNAについての結果は、統計的に同じであった。動物を、動物の世話に関する米国立衛生研究所のガイドライン及びスタンフォード大学のガイドラインに従って処理した。
図54:成体マウスにおけるshRNAを利用するRNA干渉。(a)ルシフェラーゼプラスミドcontrol、pShh1−Ff1及びpShh1−Ff1revを同時トランスフェクトされたマウスから放出された光の典型的イメージ。pShh1−Ff1は、マウスにおけるルシフェラーゼ発現をレポーターだけの対照と比較して低下させたが、pShh1−Ff1revは、該発現を低下させなかった。pShh1−Ff1又はpShh1−rev(10μg)を、2μgのpGL3−control(1.8mlPBS緩衝液中)と同時に注射した。(b)3つの独立したshRNA実験(n=5)の平均。レポーターだけのグループの平均値を、3つの実験の各々において100%と称する。動物を、動物の世話に関する米国立衛生研究所のガイドライン及びスタンフォード大学のガイドラインに従って処理した。
図55:幾つかの組織におけるRNAiによるNeil1発現の遺伝的抑制。(a)3匹のNeil1 shRNA導入遺伝子を含むマウス(shRNA陽性)又は該導入遺伝子を欠く3匹の兄弟(shRNA陰性)の肝臓におけるNeil1mRNAの発現を、RT−PCRによりアッセイした(最上段は、Neil1)。β−アクチンのRT−PCRを行なって、等量のmRNAが各マウスにつき試験されたことを確実にした(第二段)。shRNAベクターに担われるネオマイシン耐性遺伝子(neo)の発現を同様に試験した(第三段)。最後に、これらのマウスの遺伝子型を、ベクター特異的なプライマーを用いてPCR増幅されたゲノムDNAを利用して分類した(最下段)。(b)同様の研究を心臓において行なった。(c)同様の研究を脾臓において行なった。動物の処置は、SUNY, Stony Brook Institutional Animal Care and Use Comunittee (IACUC)により承認されたものである。
図56:Neil1タンパク質の減少は、siRNAの存在と相関する。(a)Neil1タンパク質の発現を、shRNA導入遺伝子を有するマウス(shRNA陽性)又は該導入遺伝子を欠く兄弟(shRNA陰性)の肝臓に由来するタンパク質抽出物にて、Neil1特異的抗血清を用いるウエスタンブロットにより調べた。PCNAのウエスタンブロットを、ローディングを標準化するために利用した。(b)トランスジェニックマウスの肝臓に由来するRNA中のsiRNAの存在(一部がshRNA配列と相補的である300ntプローブを利用するノーザンブロッティングによりアッセイ)。我々は、shRNA発現カセットにつきトランスジェニックなマウスにおいてのみsiRNAに注目する。
1.概観
本発明は、遺伝子を標的とする二本鎖RNA(dsRNA)を用いて、細胞における遺伝子発現を減衰させる方法を提供する。dsRNAは、阻害対象となる遺伝子(「標的」遺伝子)の少なくとも一部分のヌクレオチド配列に、細胞の生理的条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。このヌクレオチド配列は、標的遺伝子のコード配列又は非コード配列にハイブリダイズすることができる。
簡便のために、本願明細書、実施例及び付属の請求項で用いた特定の用語をここにまとめる。
本発明の一つの特徴は、(イン・ビボ又はイン・ビトロの)細胞において又は細胞を含まない混合物において、RNAi酵素を誘導する又は異所的に活性化することによって、RNAiを強化する方法を提供する。好ましい態様においては、RNAi活性物質は、活性化されるか、イン・ビトロで又は生物体一個体の部分として供することのできる哺乳類細胞(例えばヒト細胞)に添加される。他の態様においては、培養中の真核細胞一般(卵母細胞を除く)を用いて主題の方法を実施する。例えば、組換えを行って発現することによって、Dicer酵素を活性化することもできるし、あるいは、(i)内因性遺伝子の発現を誘導し、(ii)分解を防ぐようにタンパク質を安定させ及び/又は(iii)(Kcat、Km又はその両方を変化させることによって)活性を増加するようにアロステリックに酵素を改変する、作用物質を用いて活性化することもできる。
ある態様においては、活性化されたRNAi酵素の少なくとも1個がDicer又はその同族体である。ある好ましい態様においては本発明の方法は、Dicerの異所的活性化を提供する。ここでいう「Dicer」とは、(a)RNAi応答の媒介となり、(b)配列番号2又は4に対して少なくとも50%の、より好ましくは少なくとも75、85、90又は95%の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質、及び/又は2×SSC、22℃さらに好ましくは0.2×SSC、65℃の洗浄条件下で配列番号1又は3で表されるヌクレオチドとハイブリダイズする核酸によってコードされうるタンパク質のことをいう。従って本方法は、Dicerが組換えにより発現されたさもなくば異所的に活性化された細胞に、dsRNA構築物を導入することを包含する。
標的遺伝子を有する細胞は、あらゆる生物体(例えば植物、動物、原生動物、ウイルス、バクテリア又は真菌)に由来するものであってもよいし、あるいはあらゆる生物体に含んだ状態で用いてもよい。dsRNA構築物はイン・ビボ又はイン・ビトロのいずれで合成してもよい。細胞の内因性RNAポリメラーゼはイン・ビボでの転写を媒介することができるし、あるいはクローニングしたRNAポリメラーゼを用いてイン・ビボ又はイン・ビトロで転写することもできる。イン・ビボで導入遺伝子から二本鎖転写物を作製する際には、調節領域を用いて(複数の)RNA鎖を転写してもよい。その上、dsRNAは、ヘアピンを形成するRNA鎖を転写し、そうして、dsRNAを生成することによって生成することができる。
標的遺伝子は、細胞由来の遺伝子、内因性遺伝子、導入遺伝子であってもよいし、或いは病原体に感染した後の細胞内に存在する、病原体の遺伝子であってもよい。本方法を行うと、標的遺伝子の種類及び運搬される二本鎖RNA物質の量に応じて、標的遺伝子の機能が部分的に又は完全に喪失しうる。物質投与をより少ない量で行い、dsRNA投与後により長い時間置くことで、より少ない量の細胞が阻害される。細胞内における遺伝子発現を定量することによって、標的mRNAの蓄積レベル又は標的タンパク質の翻訳のレベルにおける阻害量が同様に示されうる。
dsRNA構築物は、1種以上の重合リボヌクレオチド鎖を包含してもよい。構築物は、リン酸−糖主鎖又はヌクレオシドのどちらかの改変を含んでいてもよい。例えば、天然RNAのホスホジエステル結合を改変して、少なくとも1個の窒素又は硫黄ヘテロ原子を含ませるようにすることができる。dsRNAによってある種の生物体中に起こる一般的なパニック応答を回避しつつ、特異的な遺伝子阻害を可能にするように、RNA構造の改変を調整することができる。同様に、アデノシンデアミナーゼの活性物質を阻害するように、塩基を改変してもよい。dsRNA構築物は、酵素によってあるいは部分的/全体的有機合成によって産生することもできる。イン・ビトロの酵素的又は有機的合成によって、あらゆる改変リボヌクレオチドを導入することができる。
本発明の1つの用途としては、二本鎖RNAを用いて未知の機能を有する標的遺伝子の活性を阻害することを包含する、生物体、特に高等真核生物における遺伝子機能を同定する方法が挙げられる。突然変異体の単離に時間と手間のかかる従来の遺伝子スクリーニングの代わりに、本発明を用いて標的遺伝子活性の量を低減し及び/又はその活性の時期を変えることによって、機能ゲノム化学から未知の遺伝子機能を調べることができる。本発明を用いることで、製薬の潜在的な標的の調査、発生に関連した通常及び病理事象の理解、出生後発達/エイジングに関与するシグナル経路の決定などが可能になる。哺乳動物ゲノムの全配列などの、ゲノム及び発現遺伝子源からのヌクレオチド配列情報が急速に解明されているが、細胞又は生物体一個体における遺伝子機能の調査に、本発明を組み合わせることができる。特定のコドンを用いるのに適した生物体を選択し、配列データベースから関連の遺伝子産物を探し出し、遺伝特性の連鎖地図をヌクレオチド配列の由来する物理的地図に関連させ、人工知能法を用いることによって、そのような配列決定で得られたヌクレオチド配列から、推定の開いた読み枠を定義することができる。
ここまで一般的に説明した本発明を、下記実施例を参照してより詳しく説明するが、実施例は単に本発明の特定の特徴及び態様を例証するのが目的であって、本発明を限定すると解されるべきではない。
C.エレガンス、ショウジョウバエ、プラナリア、ヒドラ、トリパノソーマ、菌類及び植物を含む様々な生物体において、二本鎖RNAを導入すると配列特異的に遺伝子発現が阻害される(Sharp (1999) Gene and Development 13, 139-141;Sanchez-Alvarado 及び Newmark (1999) PNAS 96, 5049-5054;Lohmann等 (1999) Developmental Biology 214, 211-214;Cogoni及びMacino (1999) Nature 399, 166-169;Waterhouse等 (1998) PNAS 95, 13959-13964;Montgomery及びFire (1998) Trends Genet. 14, 225-228;Ngo等 (1998)PNAS 95, 14687-14692)。RNA干渉又は転写後遺伝子サイレンシングと呼ばれるこれらの応答は、ウイルスに対する防御を提供するか、転位を調節するか、あるいは遺伝子発現を調節する(Sharp (1999) Gene and Development 13, 139-141;Montgomery及びFire (1998) Trends Genet. 14, 225-228;Tabara等 (1999) Cell 99, 123-132;Ketting等 (1999) Cell 99, 133-141;Ratcliff等 (1997) Science 276, 1558-1560)。この遺伝子現象の機構を解明するために、本発明者らは生化学的方法を用いた。本実施例では、特異的な二本鎖RNAでショウジョウバエ培養細胞をトランスフェクトすることによって「機能損失」表現型が得られることを示す。これは同族の細胞メッセンジャーRNAのレベルが顕著に低減することに一致する。トランスフェクト細胞の抽出物は、トランスフェクト二本鎖RNAに相同性を有する外因性転写物を特異的に分解するヌクレアーゼ活性物質を含む。この酵素は必須RNA成分を含む。部分的に精製した後、基質mRNAとの相同性を通じて酵素に特異性を与える別個の〜25ヌクレオチドRNAと共に、配列特異的ヌクレアーゼを分別した。
細胞培養及びRNA法 S2細胞(Schneider (1972) J. Embryol. Exp. Morpho. 27, 353-365)を、90%シュナイダー昆虫培養基(Sigma)、10%熱不活化胎児ウシ血清(FBS)において27℃で培養した。リン酸カルシウム共沈によって、細胞をdsRNA及びプラスミドDNAでトランスフェトした(Di Nocera及びDawid (1983) PNAS 80, 7095-7098)。脂質試薬(例えばSuperfect、Qiagen)を用いて細胞をトランスフェクトした場合と、同一の結果が得られた。FACS分析用に、緑色蛍光タンパク質(GFP)−US9融合タンパク質の発現を誘導するベクターで細胞を更にトランスフェクトした(Kalejta等 (1999) Exp. Cell. Res. 248, 322-328)。これらの細胞を90%氷冷エタノール内で固定し、ヨウ化プロピジウムで25μg/mlにて染色した。Eliteフローサイトメーター(Coulter)を用いてFACSを行った。ノーザンブロット用に、対照の相補的DNA(RP49)を用いたオーバープローブ(over-probing)ブロットによって等量を保持した。dsRNAの作製では、テンプレートの各末端にT7プロモーター配列を含むように、ポリメラーゼ連鎖反応によって転写テンプレートを作製した。RNAはRiboMaxキット(Promega)を用いて調製した。RNAが二本鎖であることを、リボヌクレアーゼIII(A.Nicholsonによる寄贈)に対して完全な感応性を有することから確認した。標的mRNA転写物を、リボプローブキット(Promgega)を用いて合成し、使用前にゲルで精製した。
蠕虫、菌類及び植物における遺伝子学的研究によって、二本鎖RNAに誘導される遺伝子サイレンシングに必須のタンパク質群がこれまでに同定されている。これらには、ARGONAUTEファミリー(例えばRDE1、QDE2)(Tabara等 (1999) Cell 99, 123-132;Catalanotto等 (2000) Nature 404, 245;Fagard等 (2000) PNAS 97, 11650-11654)、recQファミリーヘリカーゼ(MUT−7、QDE3)(Ketting等 (1999) Cell 99, 133-141;Cogoni及びMacino. (1999) Science 286, 2342-2344)及びRNA依存性RNAポリメラーゼ(例えばEGO−1、QDE1、SGS2/SDE1)(Cogoni及びMacino (1999) Nature 399, 166-169;Smardon等 (2000) Current Biology 10, 169-178;Mourrain等 (2000) Cell 101, 533-542;Dalmay等 (2000) Cell 101, 543-553)がある。これらの役割と考えられるものがこれまでに提案されてはいるが、これらの遺伝子のいずれについてもサイレンシング工程における機能は確定していない。これまでの生化学的研究では、mRNAを標的として分解する多成分ヌクレアーゼによってPTGSが行われるということが示唆されている(Hammond等 (2000) Nature 404,293-296;Zamore等 (2000) Cell 101, 25-33;Tuschl等 (1999) Genes and Development 13, 3191-3197)。本発明者らは、この複合体の特異性が、mRNA基質に相同な性を有する小さなガイド配列の組み込みに由来するであろうことを示した(Hammond等 (2000) Nature 404,293-296)。元々は植物において、積極的な発現抑制導入遺伝子であると同定された(Hamilton及びBaulcombe (1999) Science 286, 2950-2)これらの〜22ntRNAを、ショウジョウバエ胚から調製した抽出物を用いてイン・ビトロRNAiの間に作製することが行われている(Zamore等 (2000) Cell 101, 25-33)。推定ガイドRNAもショウジョウバエS2細胞からの抽出物内に作製することができる(図5a)。転写後遺伝子サイレンシングの機構を理解するという目的から、RNAiの各段階を実施する酵素を同定するために、生化学分画と候補遺伝子の両方の方法を用いた。
プラスミド構築物。バークレー・ショウジョウバエゲノム計画で配列決定されたESTから、Droshaをコードする全長cDNAをPCRによって得た。HomelessクローンはGillespie及びBerg(ワシントン大学)により寄贈されたものを用いた。T7エピトープ標識をPCRにより各アミノ末端に添加し、特に昆虫細胞内での発現用として企図されたレトロウイルスベクター(E.Bernstein、未発表)であるpRIP内に、標識cDNAをクローンした。このベクターでは、発現はOrgyia pseudotsugataIE2プロモーター(Invitrogen)によって誘導される。CG4792/DicerのcDNAが入手できないので、ゲノムクローンをバクミド(BACR23F10;ロズウエルパーク癌研究所人類遺伝学部のBACPACリソースセンターより入手)から増幅した。ここでも増幅中に、T7エピトープ標識をコード配列のアミノ末端に付加した。HaCaT細胞(GJH、未発表)より調製したcDNAライブラリーから、ヒトDicer遺伝子を単離した。T7標識付けされた全コード配列を、ヒト細胞(LinX−A)内で発現するために、pCDNA3(Invitrogen)内にクローンした。
多くのモデル生物体において、二本鎖RNAが効率的で特異的に遺伝子機能を抑制することが示されている(Bosher及びLabouesse (2000) Nature Cell Biology 2, E31-E36)。RNA干渉又は転写後遺伝子サイレンシングと称されるこの応答は、C.エレガンス、ショウジョウバエ、植物及び他の数多くの系において、非常に効率的な逆遺伝学的手段として用いられている。これらの場合において、二本鎖RNAは注入、トランスフェクション又は食物供給として導入することができる。しかし全ての場合において、応答は一過的かつ全身性である。近年、遺伝子発現を用いた安定した干渉が、スナップバック又はヘアピン構造を形成するRNA発現によって達成されている(Fortier及びBelote (2000) Genesis 26, 240-244;Kennerdell及びCarthew (2000) Nature Biotechnology 18, 896-898;Lam及びThummel (2000) Current Biology 10, 957-963;Shi等 (2000) RNA 6, 1069-1076;Smith等 (2000) Nature 407:319-320;Tavernarakis等 (2000) Nature Genetics 24:180-183)。この構造は、遺伝子発現の安定したサイレンシングを可能にするだけでなく、トリパノソーマ及びショウジョウバエ成虫について報告されている誘導性サイレンシングを可能にする潜在能力がある(Fortier及びBelote (2000) Genesis 26, 240-244;Lam及びThummel (2000) Current Biology 10, 957-963;Shi等 (2000) RNA 6, 1069-1076)。サイレンシング誘導に必要な長い逆向き反復配列を含む菌プラスミドの作製が困難なことから、この方法は幾分実施しにくい。最近の報告では、望ましい構築物を同定するために1,000個以上の推定クローンをスクリーンしたとある(Tavernarakis等 (2000) Nature Genetics 24:180-183)。
ヘアピンRNAを発現するプラスミドを、GFPコード領域の最初の500塩基対をpRIP−FLIPのFLIPカセット中に直列反復としてクローン化することによって構築した。このFLIPカセットは、2つの有向クローニング部位を含み、その2番目のものはLoxP部位と隣接している。これらのクローニング部位の間に存在するゼオシン遺伝子は、選択及び安定性を維持する。ヘアピン生成のための逆向き反復を造るために、直列反復クローンを、イン・ビトロでCreレコンビナーゼ(Stratagene)に曝し、その後、DL759大腸菌にトランスフォームした。これらの細菌は、十字形構造を含むDNAの複製を可能にし、それらは、逆向き反復を形成する傾向がある。
以前の実験は、ヘアピンの構築によるものを含む様々な方法を利用して生成されたdsRNAがショウジョウバエ細胞における遺伝子発現を抑制することができることを示した。我々は、今や、dsRNAが培養哺乳動物細胞における遺伝子発現をも抑制することができるということを示す。加えて、RNAiの遺伝学的ツールとしての力は、遺伝子発現の安定なサイレンシングを工学処理する能力によって大いに増進される。それ故、我々は、長いdsRNAをRNAiトリガーとして利用することのできる哺乳動物細胞を同定する努力を、それらの同じ細胞株が安定なサイレンシングストラテジーの開発の基盤を提供することを期待して引き受けた。我々は、RNA抑制が、長いヘアピンの哺乳動物細胞株における安定な発現によって媒介されうることを示す。培養哺乳動物細胞における遺伝子発現の安定なサイレンシングを工学処理する能力は、一時的な遺伝子発現のサイレンシングを引き起こす能力に加えて、多くの重要な応用を有する。
我々は、先ず、このアプローチを遺伝子機能を調べるためのツールとして開発すること及びdsRNAに誘導されるサイレンシングの機械論的研究が哺乳動物の系に広がること可能にすることの両方のために、長いdsRNAトリガーが、培養マウス細胞において配列特異的なサイレンシングを誘導することができるかどうか測定することを探索した。それ故、我々は、前のマウス胎児における研究(Wianny等、2000, Nat. Cell Biol. 2:70-75
;Svoboda等、2000, Development 127:4147-4156)を、多能性の胎児細胞型におけるRNAi様機構を探索することにより広げることを試みた。我々は、胎児起源の多くの細胞株を、遺伝子発現の一般化された抑制がdsRNAの導入に際して起きる程度について調べた。アッセイ時に、我々は、dsRNAの、GFPの発現に対する効果を試験した(蛍光細胞の計数によりイン・シトゥーで測定)。予想されるように、ヒト胎児の腎臓細胞(293)及びマウス胎児繊維芽細胞の両者において、GFP発現が、同時トランスフェクトされたdsRNAの配列に関係なく、事実上排除された。幾つかの多能性の奇形癌腫及び奇形腫細胞株(例えば、N−Teral、F9)において、PKR応答が減衰されたが、依然として明らかであった。しかしながら、対照的に、非相同性のdsRNAのトランスフェクションは、マウス胎児幹細胞又はp19胎児癌細胞において、レポーター遺伝子(例えば、GFP又はルシフェラーゼ)の発現に対して効果を有しなかった(図28)。
dsRNAに対する配列特異的応答の存在がP19細胞の特性であるのかどうか、又はそれは正常なマウス胎児細胞にも拡張されるのかどうかを評価するために、我々は、類似のサイレンシングアッセイをマウス胎児幹細胞において行なった。同起源でないdsRNA(例えば、GFP)による胎児幹細胞の同時トランスフェクションは、再び、絶対値においても、ウミシイタケのホタルに対するルシフェラーゼ活性の比についても劇的効果を有しなかった(図31)。しかしながら、ホタル又はウミシイタケの何れかのルシフェラーゼdsRNAのトランスフェクションは、劇的且つ特異的に、標的酵素の活性を減少させた(図31)。
RNAiエフェクター経路が哺乳動物の体細胞に存在することは、siRNAの一過性サイレンシングを誘導する能力に基づいて、ありそうなことである(Elbashir等、2001, Nature 411:494-498)。その上、我々は、RNAiイニシエーター及びエフェクター経路が長いdsRNAトリガーに応答してサイレンシングを実施することのできる胎児細胞に明らかに存在することを示した。それ故、我々は、RNAi機構が幾つかの体細胞株において無傷で存在しうるかどうかを試験することを求めている。
今日まで、dsRNAは、培養哺乳動物細胞又は胎児において、配列特異的な遺伝子サイレンシングを誘導するために一過性の様式でのみ利用されてきた。しかしながら、遺伝子操作の最も強力な応用は、安定な変異体の創生によってのみ実現される。長いdsRNAの利用によってサイレンシングを誘導する能力は、ヘアピンRNAの強化された発現によって安定なサイレンシグが達成されたショウジョウバエ、植物及びC.エレガンスなどのモデル系(Kennerdell等、2000, Nat.Biotechnol.18:896-898;Smith等、2000, Nature 407:319-320;Tavernarakis等、2000, Nat.Genet.24:180-183)から哺乳動物細胞の仕事へ移行する機会を与える。
RNAiの鍵となる特徴は、それが、その効果を、標的mRNAの破壊によって、転写後レベルで発揮することである(Hammond等、2001, Nat.Rev.Genet.2:110-119)。dsRNAがマウス細胞において転写後機構によってサイレンシングを誘導したかどうかを試験するために、我々は、最初にショウジョウバエ胚抽出物におけるRNAi応答を特性決定するために用いられたもの(Tuschl等、1999, Genes Dev.13:3191-3197)と同じアッセイを利用した。我々は、ウミシイタケ及びホタルのルシフェラーゼに対応するキャップを有するmRNAのイン・ビトロ翻訳についてコンピテントなP19細胞ECから溶解物を調製した。これらの抽出物への非特異的dsRNAの添加は、ルシフェラーゼ発現の絶対量又はホタル対ウミシイタケのルシフェラーゼの比に対して実質的な効果を有しなかった(図35)。対照的に、ホタルルシフェラーゼと相同なdsRNAの添加は、劇的な投与量依存性の抑制活性を誘導した。dsRNAのアンチセンス鎖にのみ対応するRNAの添加は、殆ど効果を有しなかったし(非特異的dsRNA対照に匹敵)、dsRNAサイレンシングトリガーのRNアーゼIIIによる前処理は、イン・ビトロでサイレンシングを誘導するその潜在能力を大いに低下させた。RNAiの第二の顕著な特徴は、サイレンシングの特異性を決定する小さいsiRNA(約22nt)の生成である。我々は、かかるRNA種がP19細胞抽出物においてdsRNAから生成されることを見出した(図34D、イン・ビトロ)が、これは、マウスのDicer活性の存在を示している。これらの種は又、GFPヘアピンRNAを安定に発現する細胞においても生成された(図34D、イン・ビボ)。総合して考えると、dsRNA誘導されるサイレンシングの転写後の性質(サイレンシングの約22ntのsiRNAの生成との関連、及びこの応答の、RNAi経路の重要な参加者であるDicerに対する依存性)は、dsRNAがマウス細胞において月並みなRNAi機構によって遺伝子発現を抑制することを強く示唆する。
我々は、実験を行なって、イン・ビトロ系で認められた抑制的効果が二本鎖RNAに特異的であることを確認した。簡単にいえば、上で概説した方法に従って実験を行なった。ホタル(FF)又はウミシイタケ(Ren)ルシフェラーゼに対応するdsRNA(ds)、一本鎖RNA(ss)又はアンチセンスRNA(as)の何れかを翻訳反応に加えた。30℃で1時間行なった反応の後に、二連のルシフェラーゼアッセイを、アナリティカル・サイエンティフィック・イントゥルメンツ・モデル3010ルミノメーターを利用して行なった。
無脊椎動物における転写後サイレンシングの研究は、dsRNAのトランスフェクション又はインジェクションが抑制作用を達成するのに必須でないはことを示した。例えば、C.エレガンスにおけるdsRNA抑制は、線虫をdsRNAに浸すか又は関心あるdsRNAを発現する細菌を給餌することによって認められうる。我々は、哺乳動物細胞におけるdsRNA抑制がdsRNAのトランスフェクションなしで認められうるかどうかの問題を扱った。かかる結果は、dsRNA抑制を哺乳動物細胞において容易に利用するための更なる潜在的能力を与え、トランスフェクトするのが困難であった細胞型(即ち、低いトランスフェクション効率を有する細胞型、又はトランスフェクトするのが全く困難であることが判明した細胞型)における遺伝子発現を抑制するためのdsRNAの利用をも可能にするであろう。
細胞培養。P19マウス胎生期癌細胞(American Type Culture Collection, CRL-1825)を10%熱不活化FBS及び1%抗生物質/抗真菌性溶液(GIBCO/BRL)を補ったα−MEM(GIBCO/BRL)中で培養した。マウス胚性幹細胞(J1、S.Kim, Cold Spring Harbor Laboratory提供)を、ESgro(Chemicon)を含むDMEM中で、製造者の指示に従って培養した。C2C12マウス筋芽細胞(N.Tonks, Cold Spring Harbor Laboratory寄贈)を10%熱不活化FBS及び1%抗生物質/抗真菌性溶液(GIBCO/BRL)を補ったDMEM(GIBCO/BRL)中で培養した。
以前の結果は、短い合成RNA(siRNA)が効率的にRNA抑制を誘導することができるということを示していた。短いRNAは非特異的PKR応答を活性化しないので、それらは、ある範囲の細胞型における遺伝子発現を効率的にスクリーニングする手段を提供する。しかしながら、siRNAに関する当分野の現状は、幾つかの制約を有している。第一に、siRNAは、現在、高いコスト(約400ドル/siRNA)で化学合成されている。かかる高コストは、siRNAを、小さい研究室又は大規模なスクリーニングにとって実際的でないものにしている。従って、当分野には、siRNAを低コストで生成する方法に対する要求がある。
小さい、内因的にコードされるヘアピンRNAは、RNAi機構のエレメントによって遺伝子発現を調節することができるという理解の後に、我々は、この生物学的機構を所望の標的遺伝子の調節のために利用することを探求してきた。ここに、我々は、短いヘアピンRNA(shRNA)が配列特異的な遺伝子サイレンシングを哺乳動物細胞において誘導することができることを示す。これは、通常、siRNAを用いて行なわれるので、サイレンシングを、外因的に合成されたヘアピンを細胞にトランスフェクトすることによって引き起こすことができる。しかしながら、サイレンシングは又、shRNAの内因性の発現によっても引き金を引かれうる。この観察は、哺乳動物細胞における遺伝子発現を安定に抑制するためにRNAiが利用される連続的細胞株の生成への扉を開く。その上、類似のアプローチが、トランスジェニック動物の創出に効力があること及び、潜在的に、所望の効果を生じるために遺伝子機能の長期間の抑制が必須である治療ストラテジーにおいて効力があることが判るであろう。
我々は、我々がこれらの小さい、内因的にコードされたヘアピンRNAを新しい目標として、選択した遺伝子を調節することができる可能性を試験することを望んだ(哺乳動物細胞株及びトランスジェニック動物において安定に遺伝子発現を操作するためのこの調節システムを打倒する最終的ゴールを伴って)。長いdsRNAが引き金を引くかsiRNAが引き金を引くかによらず、一般に、RNAiは、哺乳動物細胞よりもショウジョウバエS2細胞での遺伝子発現の抑制において一層強力である。それ故、我々は、このモデル系を、短いヘアピンRNA(shRNA)の遺伝子サイレンシングのインデューサーとしての効力を試験するために選択する。
哺乳動物細胞は、RNAiの適用を妨げることが予想される幾つかの内因性システムを含んでいる。これらの内の主たるものは、dsRNA活性化プロテインキナーゼ、PKRであり、これは、EIF−2αのリン酸化によって翻訳の一般的抑制を達成する(Williams 1997, Biochem.Soc.Trains.25:509-513;Gil等、2000, Apoptosis 5:107-114)。これらの活性化及び他のdsRNA応答性経路は、一般に、おそらくアロステリックアクチベーター上での二量体形成を可能にする30bpを超える長さの二本鎖を必要とする(例えば、Clarke等、1995, RNA 1:7-20)。Dicer生成物を模倣する小さいRNAのsiRNAは、おそらく、少なくとも部分的にそれらのサイズの故に、この制限を逃れて、特異的サイレンシングの引き金を引く。しかしながら、siRNAの特徴を欠く短い二本鎖RNAは、効率的に、ショウジョウバエS2細胞においてサイレンシングを誘導することができるが、哺乳動物細胞ではできない(A.A. Caudy, 未公開データ)。内因的にコードされたmiRNAも又、ので、それらのサイズの故に、そしておそらくそれらの二本鎖構造の不連続性の故にも、PKR監視機構を回避することができる。30bp未満のshRNAがショウジョウバエS2細胞におけるRNAiの効果的なインデューサーであると仮定して、我々は、これらのRNAが配列特異的なサイレンシングを哺乳動物細胞においても誘導することができるかどうかを試験した。
遺伝子サイレンシングを引き起こすためのsiRNAの利用は、哺乳動物細胞における遺伝子機能を研究するための標準的方法論に発展しつつある。今まで、siRNAは、専ら化学合成により生成されてきた(例えば、Caplen等、2001, Proc.Natl.Acad.Sci.98:9742-9747;Elbashir等、2001, Nature 411:494-498)。しかしながら、このアプローチに関するコストは、重大であり、多数の遺伝子の機能を並行して研究するためのツールとしてのその潜在的有用性を制限している。短いヘアピンRNAは、おそらくイン・ビボでDicerによりプロセッシングを受けて活性なsiRNAになる。そうして、これらは、ヌクレオチドオーバーハング及びホスフェート末端の両者に関して、一層許容されうる末端構造でありうる。それ故、我々は、shRNAが、T7RNAポリメラーゼによるイン・ビトロ転写によって調製されうるかどうかを試験した。
siRNAが哺乳動物細胞における遺伝子機能をプローブ検査するための紛れもなく有効なツールであるにもかかわらず、それらの抑制効果は、限られた持続時間の限定によるものである。siRNAの送達は、多くの一過性トランスフェクション方法論の何れかにより達成することができ、抑制ピークのタイミング及びサイレンシングが崩壊するにつれてのタンパク質レベルの回復の両者は、細胞型及び標的遺伝子の両者によって変化しうる。それ故、siRNAに対する一つの限界は、所望の標的の発現が安定に抑制される連続的細胞株の開発である。
プラスミドにコードされたshRNAが哺乳動物RNAi経路を介して遺伝子サイレンシングをもたらすかどうかの限定試験として、我々は、抑制の、RNAi経路の必須構成要素への依存性を評価した。我々は、pShh1−Ff1を、ヒトのDicerと相同なsiRNAと共にトランスフェクトした。図43は、Dicer siRNAによる細胞の処理が、pShh1−Ff1により誘導されたサイレンシングを完全に低下させることができることを示している。無関係のsiRNAの添加は、pShh1−Ff1による抑制の程度に影響を有しなかった。重要なことに、Dicer siRNAは、ホタルルシフェラーゼのsiRNA誘導されたサイレンシングに対して何の効果も有しなかった。これらの結果は、stRNA及び長いdsRNAにより引き起こされるものと類似するRNAi経路を介したshRNAの作用と一致している。その上、それは、siRNA媒介のサイレンシングがDicer酵素の涸渇に対して一層感受性でないことを示唆している。
コードされた短いヘアピンの最終的有用性は、生じた表現型の研究を可能にする安定な変異体の創出にある。それ故、我々は、我々が、安定な抑制によって細胞表現型を造ることができるかどうかを試験した。一次マウス胎児繊維芽細胞(MEF)におけるrasオンコジーンの活性化されたアレルの発現は、最終的表現型としての複製老化に似た安定な成長停止状態を誘導する(Serrano等、1997, Cell 88:593-602)。細胞は、分裂を止めて、典型的な大きい平らな形態を呈している。老化は、p53腫瘍サプレッサー経路を不活性化する突然変異によって計数することができる(Serrano等、1997, 前出)。ベクターにコードされたshRNAの内因性細胞遺伝子を安定に抑制する能力の試験として、我々は、マウスp53遺伝子を標的とするヘアピンを生成した。図44に示したように、pBabe−RasV12をトランスフェクトしたMEFは、空の対照用ベクターを同時トランスフェクトした場合、増殖できず、老化した形態を示している。Serrano等によって以前に注意されたように、最終的に停止した状態は、培養において薬物選択した細胞の100%において、トランスフェクション後8日までに達成される。しかしながら、活性化ras発現用構築物のpShh−p53との同時トランスフェクションに際しては、細胞は、培養において、老化した形態を採用できないだけでなく増殖する能力を最低数週間維持する薬物選択から現れた(図44)。これらのデータは、shRNA発現構築物を、選択した標的遺伝子が安定に抑制される連続的哺乳動物細胞株の創出のために利用することができることを強く示唆している。
短いヘアピンが遺伝子発現を抑制する機構を更に理解することを意図して、我々は、細胞を、ホタルルシフェラーゼに対応する2つの異なる短いヘアピンの混合物でトランスフェクトすることの効果を調べた。図45は、細胞をかかる短いヘアピンの混合物に曝した場合に得られるホタルルシフェラーゼ遺伝子発現の抑制に対する相乗作用がないことを示唆する実験結果をまとめたものである。
細胞培養。HEK293T、HeLa、COS−1、MEF及びIMR90細胞を、10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)及び1%抗生物質/抗真菌性溶液(GIBCO BRL)を補ったDMEM(GIBCO BRL)中で培養した。NIH3T3細胞を、10%熱不活化仔ウシ血清及び1%抗生物質/抗真菌性溶液を補ったDMEM中で培養した。
本発明の目的は、遺伝子発現の特異的抑制において利用するためのsiRNA及び短いヘアピンを生成する方法を改良することである。実施例6は、siRNA及び短いヘアピンが、遺伝子発現の特異的抑制に大いに効果的であることを示している。従って、短いヘアピン及びsiRNAを利用して達成することのできる遺伝子発現の効率的抑制を、かかるRNAをプラスミド上にコードして一時的又は安定に発現させる方法と合わせることは有利であろう。
幾つかの細胞型における遺伝子発現を抑制するためのRNAiの利用に対する一つの潜在的障害は、長いdsRNAによって引き金を引かれうる非特異的PKR応答である。多くの哺乳動物ウイルスは、潜在的宿主細胞への感染を助けるために、PKRをブロックする能力を隠してきた。例えば、アデノウイルスは、dsRNAを模倣するがPKR応答を活性化しないRNAを発現する。ワクシニアウイルスは、次の2つのストラテジーを利用してPKRを回避する:dsRNAに結合してマスクするE3Lの発現;天然のPKR基質のeIF2αを模倣するK3Lの発現。
RNAiを駆動する機構の現在のモデルは、dsRNA構築物が、関心ある遺伝子に対応するコード配列を含まなければならないことを示唆してきた。証拠は、かかるコード配列が内因性コード配列に対して完全にマッチする必要はない(即ち、類似でよい)ことを示してきたが、dsRNA構築物がコード配列に対応しなければならないと広く考えられてきた。我々は、従来技術の教示に反対する証拠を提供し、遺伝子の非コード領域に対応するdsRNAが遺伝子機能をイン・ビボで抑制することができることを示す。これらの結果は、それらが非コード配列(即ち、プロモーター配列、エンハンサー配列又はイントロン配列)と同じか又は類似するdsRNAが抑制を媒介することができることを示すからだけでなく、我々がdsRNA技術をマウスモデルにおいて利用して遺伝子発現のイン・ビボでの抑制を示すので重要である。
チロシナーゼ遺伝子の非コードプロモーター領域からのdsRNA。マウスチロシナーゼ遺伝子プロモーターの4つのセグメントを、T7RNAポリメラーゼプロモーターをPCR生成物に組み込むプライマー(太字で表示−図51)を利用してPCRによって増幅した。マウスチロシナーゼ遺伝子の5’隣接領域の配列は、GeneBankから得た(受入れ番号D00439及びX51743)。チロシナーゼエンハンサーの配列(転写開始部位の約12kb上流に位置)も又、GenBankから得た(受入れ番号X76647)。
(a)チロシナーゼエンハンサー(約12kb上流):
RNA干渉は、相同な遺伝子の配列特異的サイレンシングによって二本鎖RNAに応答する進化的に保存された監視機構である。ここで、我々は、導入遺伝子の発現を成体マウスにおいて、合成の小型干渉性RNAにより及びDNAテンプレートからイン・ビボで転写された小さいヘアピンRNAによって抑制することができることを示す。我々は又、イン・ビボでのRNA干渉によりC型肝炎ウイルスに由来する配列の効果的なターゲティングを示すことにより、この技術の治療用潜在能力をも示す。
マイクロRNA分子(miRNA)は、哺乳動物を含む多くの真核生物で見出されている小さい、非コードRNA分子である。miRNAは、特徴的な二次構造を共有し、短い「ヘアピン」RNAを形成している。遺伝学的及び生化学的研究は、miRNAがDicer(RNアーゼIIIファミリーのヌクレアーゼ)により処理されて成熟型になり、RNAに媒介される干渉(RNAi)及び関連する経路によって機能して、標的遺伝子の発現を調節するということを示してきた(Hannon 2002, Nature 418:244-251;Pasquinelli等、2002, Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.18:495-513)。最近、我々及び他の研究者は、miRNAを改造して、哺乳動物細胞における遺伝子発現の実験操作をできるようにし、これらの合成のサイレンシングトリガーを「短いヘアピンRNA」(shRNA)と名付けた(Paddison等、2002, Cancer Cell 2:17-23)。shRNAによるサイレンシングは、RNAi機構を必要とし、RNAiの特徴である小さい干渉性RNA(siRNA)の生成と相関する。
当業者は、ここに記載したこの発明の特定の具体例に対する多くの同等物を認識し、日常的実験を利用して確認することができよう。かかる同等物は、後記の請求の範囲に包含されるものである。
上で引用した参考文献及び刊行物のすべてを、参考として、本明細書中に援用する。
Claims (53)
- 宿主細胞における標的遺伝子の発現を減衰させる方法であって、該方法は、二本鎖RNA(dsRNA)を宿主細胞に、標的遺伝子の発現を減衰させるのに十分な量で導入することを含み、該dsRNAが、ストリンジェントな条件下で標的遺伝子の非翻訳配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする当該方法。
- 宿主細胞における標的遺伝子の発現を減衰させる方法であって、該方法は、二本鎖RNA(dsRNA)を宿主細胞に、標的遺伝子の発現を減衰させるのに十分な量で導入することを含み、該dsRNAが、ストリンジェントな条件下で標的遺伝子のイントロン配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする当該方法。
- 標的遺伝子の発現を減衰させるための組成物であって、ストリンジェントな条件下で標的遺伝子の非翻訳配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する二本鎖RNA(dsRNA)を含む当該組成物。
- 標的遺伝子の発現を減衰させるための組成物であって、ストリンジェントな条件下で標的遺伝子の非翻訳配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する二本鎖RNA(dsRNA)を、発現時に生成する発現ベクターを含む当該組成物。
- 標的遺伝子の発現を減衰させるための組成物であって、ストリンジェントな条件下で標的遺伝子のイントロン配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する二本鎖RNA(dsRNA)を含む当該組成物。
- 標的遺伝子の発現を減衰させるための組成物であって、ストリンジェントな条件下で標的遺伝子のイントロン配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する二本鎖RNA(dsRNA)を、発現時に生成する発現ベクターを含む当該組成物。
- dsRNAがハイブリダイズする標的遺伝子の非翻訳配列を、プロモーター配列及びエンハンサー配列よりなる群から選択する、請求項1に記載の方法又は請求項3若しくは4に記載の組成物。
- 宿主細胞を培養に懸濁させる、請求項1及び2の何れかに記載の方法。
- 宿主細胞が一動物個体内にある、請求項1及び2の何れかに記載の方法。
- 標的遺伝子が、宿主細胞のゲノムに組み込まれた遺伝子である、請求項1及び2の何れかに記載の方法。
- 標的遺伝子が、異種遺伝子である、請求項1及び2の何れかに記載の方法。
- 標的遺伝子が、ウイルス遺伝子である、請求項11に記載の方法。
- 宿主細胞が、霊長類細胞である、請求項1及び2の何れかに記載の方法。
- 宿主細胞が、ヒトの細胞である、請求項13に記載の方法。
- dsRNAが、短い干渉性の二本鎖RNAであって、該RNAが宿主細胞において、標的遺伝子の発現を減衰させるのに有効な濃度で有意のPKR依存性応答を生じないことを特徴とする、請求項1及び2の何れかに記載の方法又は請求項3若しくは5に記載の組成物。
- dsRNAが、15〜45塩基対長である、請求項15に記載の方法又は組成物。
- dsRNAが、19〜30塩基対長である、請求項15に記載の方法又は組成物。
- dsRNAが、少なくとも一の転写産物を生成するコード配列を有する発現ベクターによって細胞内で生成され、該転写産物が宿主細胞によりプロセッシングを受けてsiRNAになることを特徴とする、請求項1及び2の何れかに記載の方法。
- dsRNAが、ヘアピンRNAであって、該RNAが宿主細胞によりプロセッシングを受けてsiRNA種になることを特徴とする、請求項1及び2の何れかに記載の方法又は請求項3若しくは5に記載の組成物。
- 標的遺伝子の発現が、少なくとも10倍減衰される、請求項1及び2の何れかに記載の方法。
- 下記:
哺乳動物細胞内の短い干渉性二本鎖RNA(siRNA)であり又は該RNAを生じさせて標的遺伝子の発現を減衰させる二本鎖RNA(DSRNA)の医薬製剤;及び
該製剤を患者に投与するためのラベル又は使用説明書(書面及び/又は図解)
を含む医薬パッケージであって、このdsRNAは、哺乳動物細胞において、標的遺伝子の発現を減衰させるのに効果的な濃度で有意のPKR依存性応答を生じない当該医薬パッケージ。 - siRNAが、標的遺伝子の非転写配列又は非コード配列にハイブリダイズする、請求項21に記載の医薬パッケージ。
- 請求項3〜6の何れかに記載の組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の細胞内の標的遺伝子の発現を減衰させる方法。
- 標的遺伝子の発現を減衰させることが、細胞の望ましくない増殖又は分化を減少させる、請求項23に記載の方法。
- 短い干渉性二本鎖RNA(siRNA)を生成する方法であって、下記を含む当該方法:
(i)下記:
相補的なセンス及びアンチセンス標的配列を含む二本鎖核酸
RNAポリメラーゼ
を含むイン・ビトロ転写系を用意し、
該標的配列は、RNAポリメラーゼのためのプロモーターと隣接し、センス及びアンチセンス標的配列は転写されてアニールしてsiRNAを形成することができ;そして
(ii)該siRNAを該イン・ビトロ転写系から単離する。 - RNAポリメラーゼが、バクテリオファージRNAポリメラーゼである、請求項25に記載の方法。
- RNAポリメラーゼを、T3ポリメラーゼ、T7ポリメラーゼ及びSP6ポリメラーゼよりなる群から選択する、請求項26に記載の方法。
- イン・ビトロ転写系が、siRNA種の多彩なライブラリーを生成する標的配列の多彩なライブラリーを含む、請求項25に記載の方法。
- 短い干渉性二本鎖RNA(siRNA)の送達事業を行なう方法であって、下記を含む当該方法:
(i)ユーザーにより指名された配列を有するsiRNA種の注文を受理し;
(ii)下記:
該ユーザーが指名したsiRNA種についての相補的なセンス及びアンチセンス配列の標的配列を有する二本鎖核酸、及び
RNAポリメラーゼ
を含むイン・ビトロ転写系を用意し、該標的配列は、RNAポリメラーゼのためのプロモーターと隣接し、センス及びアンチセンス標的配列は転写され、アニールしてsiRNAを形成することができ;
(iii)該siRNAを該イン・ビトロ転写系から単離し;そして
(iv)該siRNAを梱包して該ユーザーに送付する。 - ドナー幹細胞又はその子孫のMHC表現型を変える方法であって、二本鎖RNA(dsRNA)を幹細胞に、該RNAを導入しなければ該幹細胞又はその子孫によって発現されたMHC遺伝子の発現を減衰させるのに十分な量で導入することを含む当該方法。
- dsRNAが、少なくとも一つのヒト白血球抗原(HLA)の発現を減少させる、請求項30に記載の方法。
- 少なくとも一つのMHC遺伝子の発現の、二本鎖RNA(dsRNA)のドナー幹細胞への導入による安定な減衰から生じる変化したMHC表現型を有するドナー幹細胞又はその子孫の培養物。
- 患者の移植の方法であって、下記を含む当該方法:
(i)少なくとも一つのMHC遺伝子の発現の、二本鎖RNA(dsRNA)のドナー幹細胞への導入による安定な減衰から生じた変化したMHC表現型を有するドナー幹細胞又はその子孫のエキス・ビボ細胞又は組織培養を生成し
(ii)該患者に、該細胞又は組織培養物を移植する。 - 患者への移植のための細胞性医薬の製造における幹細胞の利用であって、該細胞性医薬が、幹細胞又はその子孫を含み、それらが、少なくとも一つのMHC遺伝子の発現の、二本鎖RNA(dsRNA)の幹細胞への導入による安定な減衰から生じた変化したMHC表現型を有する当該利用。
- 請求項3〜6の何れかに記載の組成物の、少なくとも一つの遺伝子の発現をイン・ビボで減衰させる医薬の製造における利用。
- 宿主細胞の病原体の感染に対する罹病性を低下させる方法であって、二本鎖RNA(dsRNA)を該宿主細胞に、該病原体の発現に必要な少なくとも一つの遺伝子の発現を減衰させるのに十分な量で導入することを含む当該方法。
- 病原体がウイルスであり、dsRNAが、該ウイルスの宿主細胞への感染に必要な細胞表面タンパク質の発現を減衰させる、請求項36に記載の方法。
- 二本鎖RNA転写産物をコードする導入遺伝子を含む生殖細胞系列及び/又は体細胞を有する非ヒトトランスジェニック動物であって、該転写産物は、プロセッシングを受けて短い干渉性の二本鎖RNA(siRNA)種になり、該導入遺伝子の転写が、該動物の少なくとも一つの細胞型において、内因性標的遺伝子の発現を減衰させることを特徴とする当該トランスジェニック動物。
- 前記の導入遺伝子についてキメラである、請求項38に記載のトランスジェニック動物。
- 前記の導入遺伝子が、染色体に組み込まれている、請求項38に記載のトランスジェニック動物。
- 導入遺伝子が、別個の相補的転写物を転写し、該転写物はアニールして前記のsiRNAを形成し、該siRNAが、標的遺伝子の発現を減衰させるのに有効な濃度で、有意のPKR依存性応答を生じないことを特徴とする、請求項38に記載のトランスジェニック動物。
- 導入遺伝子が、ヘアピンRNAを転写し、該RNAがプロセッシングを受けて前記のsiRNAになる、請求項38に記載のトランスジェニック動物。
- ストリンジェントな条件下で標的遺伝子のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第一のヌクレオチド配列、及び該第一のヌクレオチド配列の相補的逆向き反復であって該第一のヌクレオチド配列とハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する第二のヌクレオチド配列を含むヘアピンRNAであって、このヘアピンRNAは、該標的遺伝子の発現を減衰させて、標的遺伝子の発現を減衰させるのに有効な濃度で有意のPKR依存性応答を生じないことを特徴とする当該ヘアピンRNA。
- ヘアピンRNAが、化学合成されたものである、請求項43に記載のヘアピンRNA。
- ヘアピンRNAが、イン・ビトロで酵素により合成されたものである、請求項43に記載のヘアピンRNA。
- ヘアピンRNAが、イン・ビトロでT7RNAポリメラーゼにより合成されたものである、請求項45に記載のヘアピンRNA。
- ヘアピンRNAが、イン・ビボで酵素により合成されたものである、請求項43に記載のヘアピンRNA。
- ヘアピンRNAが、イン・ビボでRNAポリメラーゼIIIにより合成されたものである、請求項47に記載のヘアピンRNA。
- ヘアピンRNAが、ベクターにより生成されたものである、請求項43に記載のヘアピンRNA。
- ヘアピンRNAが、約20〜50ヌクレオチドのサイズを有する、請求項43に記載のヘアピンRNA。
- ヘアピンRNAが、約50〜100ヌクレオチドのサイズを有する、請求項43に記載のヘアピンRNA。
- ヘアピンRNAが、約100〜500ヌクレオチドのサイズを有する、請求項43に記載のヘアピンRNA。
- ヘアピンのループ内に制限酵素部位を含む、請求項43に記載のヘアピンRNA。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009152387A3 (en) * | 2008-06-11 | 2010-04-29 | Intradigm Corporation | Compositions comprising cmyc sirna and methods of use thereof |
JP2015112062A (ja) * | 2013-12-11 | 2015-06-22 | 国立大学法人豊橋技術科学大学 | Rna分子にヌクレアーゼ耐性能を付与する方法、ヌクレアーゼ耐性能を有するキメラrna分子 |
Families Citing this family (105)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6939712B1 (en) * | 1998-12-29 | 2005-09-06 | Impedagen, Llc | Muting gene activity using a transgenic nucleic acid |
EP1147204A1 (en) * | 1999-01-28 | 2001-10-24 | Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. | Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna |
WO2000063364A2 (en) * | 1999-04-21 | 2000-10-26 | American Home Products Corporation | Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences |
US20040138168A1 (en) * | 1999-04-21 | 2004-07-15 | Wyeth | Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences |
GB9925459D0 (en) * | 1999-10-27 | 1999-12-29 | Plant Bioscience Ltd | Gene silencing |
US20030181412A1 (en) * | 1999-12-21 | 2003-09-25 | Ingeneus Corporation | Method for modifying transcription and/or translation in an organism for therapeutic, prophylactic and/or analytic uses |
US8202846B2 (en) * | 2000-03-16 | 2012-06-19 | Cold Spring Harbor Laboratory | Methods and compositions for RNA interference |
US20030084471A1 (en) * | 2000-03-16 | 2003-05-01 | David Beach | Methods and compositions for RNA interference |
EP1272630A2 (en) * | 2000-03-16 | 2003-01-08 | Genetica, Inc. | Methods and compositions for rna interference |
AU2001249622B2 (en) | 2000-03-30 | 2007-06-07 | Massachusetts Institute Of Technology | RNA sequence-specific mediators of RNA interference |
HU230458B1 (hu) | 2000-12-01 | 2016-07-28 | Europäisches Laboratorium für Molekularbiologie (EMBL) | Az RNS interferenciát közvetítő kis RNS molekulák |
ES2566561T3 (es) * | 2001-07-12 | 2016-04-13 | University Of Massachusetts | Producción in vivo de ARN pequeños de interferencia que median el silenciamiento génico |
PT2280070E (pt) | 2001-07-23 | 2015-10-29 | Univ Leland Stanford Junior | Métodos e composições para inibição mediada por iarn da expressão génica em mamíferos |
US10590418B2 (en) * | 2001-07-23 | 2020-03-17 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and compositions for RNAi mediated inhibition of gene expression in mammals |
US7737124B2 (en) | 2001-09-13 | 2010-06-15 | California Institute Of Technology | Method for expression of small antiviral RNA molecules with reduced cytotoxicity within a cell |
US7919309B2 (en) * | 2001-09-13 | 2011-04-05 | California Institute Of Technology | Method for expression of small antiviral RNA molecules within a cell |
WO2003046173A1 (fr) * | 2001-11-28 | 2003-06-05 | Center For Advanced Science And Technology Incubation, Ltd. | Systeme d'expression d'arn si et procede de production de cellules d'inactivation de genes fonctionnelles et analogues au moyen de ce systeme |
WO2003064625A2 (en) | 2002-02-01 | 2003-08-07 | Sequitur, Inc. | Oligonucleotide compositions with enhanced efficiency |
US20030166282A1 (en) | 2002-02-01 | 2003-09-04 | David Brown | High potency siRNAS for reducing the expression of target genes |
US20060009409A1 (en) | 2002-02-01 | 2006-01-12 | Woolf Tod M | Double-stranded oligonucleotides |
EP1483281B2 (en) * | 2002-02-14 | 2012-09-05 | City of Hope | Methods for producing interfering rna molecules in mammalian cells and therapeutic uses for such molecules |
EP1572923A4 (en) * | 2002-03-06 | 2007-10-31 | Rigel Pharmaceuticals Inc | NEW METHOD FOR THE INTRODUCTION AND INTRA-CELLULAR SYNTHESIS OF SIRNA MOLECULES |
US7274703B2 (en) * | 2002-03-11 | 2007-09-25 | 3Com Corporation | Stackable network units with resiliency facility |
US20030180756A1 (en) * | 2002-03-21 | 2003-09-25 | Yang Shi | Compositions and methods for suppressing eukaryotic gene expression |
WO2003093430A2 (en) * | 2002-05-03 | 2003-11-13 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and compositions for use in preparing sirnas |
US20040106566A1 (en) * | 2002-05-17 | 2004-06-03 | Shi-Lung Lin | RNA-splicing and processing-directed gene silencing and the relative applications thereof |
US7399586B2 (en) | 2002-05-23 | 2008-07-15 | Ceptyr, Inc. | Modulation of biological signal transduction by RNA interference |
WO2004001013A2 (en) * | 2002-06-24 | 2003-12-31 | Baylor College Of Medicine | Inhibition of gene expression in vertebrates using double-stranded rna (rnai) |
WO2004014933A1 (en) | 2002-08-07 | 2004-02-19 | University Of Massachusetts | Compositions for rna interference and methods of use thereof |
US20050196862A1 (en) * | 2002-08-30 | 2005-09-08 | Wooddell Christine I. | DNA cassette for cellular expression of small RNA |
CA2497913C (en) | 2002-09-05 | 2014-06-03 | California Institute Of Technology | Use of chimeric nucleases to stimulate gene targeting |
CA2881743A1 (en) * | 2002-09-25 | 2004-04-08 | University Of Massachusetts | In vivo gene silencing by chemically modified and stable sirna |
AU2003272147A1 (en) * | 2002-10-15 | 2004-05-04 | Phytovation B.V. | Expressional enhancers from viruses |
US20050071893A1 (en) * | 2002-10-17 | 2005-03-31 | Jost Seibler | SiRNA mediated gene silencing in transgenic animals |
EP1551971B1 (en) * | 2002-10-17 | 2008-12-24 | TaconicArtemis GmbH | Sirna mediated gene silencing in transgenic animals |
US9719094B2 (en) | 2002-11-14 | 2017-08-01 | Thermo Fisher Scientific Inc. | RNAi targeting SEC61G |
US9771586B2 (en) | 2002-11-14 | 2017-09-26 | Thermo Fisher Scientific Inc. | RNAi targeting ZNF205 |
US9879266B2 (en) | 2002-11-14 | 2018-01-30 | Thermo Fisher Scientific Inc. | Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality |
WO2006006948A2 (en) | 2002-11-14 | 2006-01-19 | Dharmacon, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY |
US10011836B2 (en) | 2002-11-14 | 2018-07-03 | Thermo Fisher Scientific Inc. | Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality |
US9839649B2 (en) | 2002-11-14 | 2017-12-12 | Thermo Fisher Scientific Inc. | Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality |
US9719092B2 (en) | 2002-11-14 | 2017-08-01 | Thermo Fisher Scientific Inc. | RNAi targeting CNTD2 |
US9228186B2 (en) | 2002-11-14 | 2016-01-05 | Thermo Fisher Scientific Inc. | Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality |
JP2006509504A (ja) * | 2002-12-11 | 2006-03-23 | ユニバーシティー オブ マサチューセッツ | 脂肪細胞へのsiRNAの導入方法 |
AU2004228684A1 (en) * | 2003-04-10 | 2004-10-21 | Intellectual Property Bank Corp. | Biological information monitoring system |
EP1628628A4 (en) * | 2003-05-05 | 2007-03-21 | Genzyme Corp | METHODS FOR REDUCING AN IMMUNE RESPONSE |
US20040224405A1 (en) * | 2003-05-06 | 2004-11-11 | Dharmacon Inc. | siRNA induced systemic gene silencing in mammalian systems |
CN1780920B (zh) * | 2003-05-12 | 2012-03-28 | 波多玛克制药有限公司 | 基因表达抑制剂 |
US20060178327A1 (en) * | 2003-05-30 | 2006-08-10 | Yeung Wah Hin A | Inhibition of gene expression by delivery of specially selected double stranded or other forms of small interfering RNA precursors enabling the formation and function of small interfering RNA in vivo and in vitro |
CN101961497A (zh) | 2003-07-03 | 2011-02-02 | 宾夕法尼亚大学理事会 | 对Syk激酶表达的抑制 |
US20070202505A1 (en) * | 2003-09-08 | 2007-08-30 | Alex Chenchik | Methods for gene function analysis |
US20050053971A1 (en) * | 2003-09-08 | 2005-03-10 | Alex Chenchik | Methods and constructs for developing cell lines for biological assays |
US20050059019A1 (en) * | 2003-09-11 | 2005-03-17 | Sven Bulow | Gene-related RNAi transfection method |
DE10351149A1 (de) * | 2003-11-03 | 2005-06-30 | Beiersdorf Ag | Oligoribonukleotide zur Behandlung von unerwünschter Pigmentierung der Haut und der Haare durch RNA-Interferenz |
EP1734811A4 (en) * | 2003-11-21 | 2009-03-25 | Revivicor Inc | USE OF INTERFERENCE RNA IN TRANSGENIC ANIMAL PRODUCTION |
WO2005059120A1 (en) * | 2003-12-19 | 2005-06-30 | Stem Cell Australia Pty Lyd | Methods of preventing transplantation rejection by creating immunologically neutral stem cells using gene silencing technology |
SG188122A1 (en) * | 2004-01-23 | 2013-03-28 | Advanced Cell Tech Inc | Improved modalities for the treatment of degenerative diseases of the retina |
WO2005097817A2 (en) | 2004-04-05 | 2005-10-20 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Process and reagents for oligonucleotide synthesis and purification |
EP1586654A1 (en) * | 2004-04-15 | 2005-10-19 | Vereniging voor christelijk hoger onderwijs, wetenschappelijk onderzoek en patiëntenzorg | Replication competent viruses capable of silencing virus inhibitory factor expression |
US20050277139A1 (en) * | 2004-04-26 | 2005-12-15 | Itzhak Bentwich | Methods and apparatus for the detection and validation of microRNAs |
JP4584986B2 (ja) * | 2004-04-27 | 2010-11-24 | アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド | 2−アリールプロピル部分を含む1本鎖及び2本鎖オリゴヌクレオチド |
EP1750776A2 (en) * | 2004-04-30 | 2007-02-14 | Alnylam Pharmaceuticals Inc. | Oligonucleotides comprising a c5-modified pyrimidine |
WO2005108572A1 (de) * | 2004-05-06 | 2005-11-17 | Medizinische Hochschule Hannover | Verbindungen und verfahren zur immunsuppression |
US8236771B2 (en) * | 2004-05-18 | 2012-08-07 | National Institute Of Transplantation Foundation | Vectors and methods for long-term immune evasion to prolong transplant viability |
EP2471922A1 (en) | 2004-05-28 | 2012-07-04 | Asuragen, Inc. | Methods and compositions involving microRNA |
US20050277121A1 (en) * | 2004-06-11 | 2005-12-15 | Ambion, Inc. | Crude biological derivatives competent for nucleic acid detection |
WO2006088490A2 (en) * | 2004-06-30 | 2006-08-24 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides comprising a non-phosphate backbone linkage |
WO2006093526A2 (en) | 2004-07-21 | 2006-09-08 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides comprising a modified or non-natural nucleobase |
AU2005330637B2 (en) | 2004-08-04 | 2012-09-20 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides comprising a ligand tethered to a modified or non-natural nucleobase |
CN101389755B (zh) | 2004-09-24 | 2014-06-11 | J.R.西姆普罗特公司 | 基因沉默 |
JP4991547B2 (ja) | 2004-09-28 | 2012-08-01 | クアーク・ファーマスーティカルス、インコーポレイテッド | 脱毛症、急性腎不全および他の疾患の治療のためのオリゴリボヌクレオチドおよびその使用の方法 |
WO2008073922A2 (en) * | 2006-12-08 | 2008-06-19 | Asuragen, Inc. | Functions and targets of let-7 micro rnas |
US8173611B2 (en) | 2004-11-12 | 2012-05-08 | Asuragen Inc. | Methods and compositions involving miRNA and miRNA inhibitor molecules |
AU2006277679B2 (en) * | 2005-03-31 | 2012-08-02 | Ronen Kahana | Creating poultry and other animals resistant to viral disease |
US20060234973A1 (en) * | 2005-04-14 | 2006-10-19 | Kevin Fitzgerald | Transcription factor RNA interference reagents and methods of use thereof |
US20070087985A1 (en) * | 2005-04-19 | 2007-04-19 | Gundersen Gregg G | MRCK-related compositions and methods |
WO2006130560A2 (en) * | 2005-05-31 | 2006-12-07 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Manipulation of pten in t cells as a strategy to modulate immune responses |
US9121008B2 (en) * | 2005-08-31 | 2015-09-01 | University Of Utah Research Foundation | Development of natural killer cells and functional natural killer cell lines |
JP2007104969A (ja) * | 2005-10-13 | 2007-04-26 | Bio Think Tank Co Ltd | ショートヘアピン型RNA(shRNA)前駆体を産生するための核酸及びその利用 |
US7825099B2 (en) | 2006-01-20 | 2010-11-02 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | Treatment or prevention of oto-pathologies by inhibition of pro-apoptotic genes |
NL2000439C2 (nl) | 2006-01-20 | 2009-03-16 | Quark Biotech | Therapeutische toepassingen van inhibitoren van RTP801. |
WO2007091269A2 (en) * | 2006-02-08 | 2007-08-16 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | NOVEL TANDEM siRNAS |
CA2663962A1 (en) * | 2006-09-19 | 2008-03-27 | Asuragen, Inc. | Mir-15, mir-26, mir-31,mir-145, mir-147, mir-188, mir-215, mir-216, mir-331, mmu-mir-292-3p regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention |
AU2007333107A1 (en) * | 2006-12-08 | 2008-06-19 | Asuragen, Inc. | miR-21 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention |
CA2671270A1 (en) * | 2006-12-29 | 2008-07-17 | Asuragen, Inc. | Mir-16 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention |
US20090131354A1 (en) * | 2007-05-22 | 2009-05-21 | Bader Andreas G | miR-126 REGULATED GENES AND PATHWAYS AS TARGETS FOR THERAPEUTIC INTERVENTION |
PT2170403E (pt) | 2007-06-27 | 2014-07-17 | Quark Pharmaceuticals Inc | Composições e métodos para inibição da expressão de genes pró-apoptóticos |
US8361714B2 (en) | 2007-09-14 | 2013-01-29 | Asuragen, Inc. | Micrornas differentially expressed in cervical cancer and uses thereof |
CN104946591A (zh) | 2007-10-12 | 2015-09-30 | 奥卡塔治疗公司 | 制备rpe 细胞和rpe 细胞的组合物的改良方法 |
WO2009070805A2 (en) * | 2007-12-01 | 2009-06-04 | Asuragen, Inc. | Mir-124 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention |
WO2009086156A2 (en) * | 2007-12-21 | 2009-07-09 | Asuragen, Inc. | Mir-10 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention |
US20090263803A1 (en) * | 2008-02-08 | 2009-10-22 | Sylvie Beaudenon | Mirnas differentially expressed in lymph nodes from cancer patients |
WO2009111643A2 (en) * | 2008-03-06 | 2009-09-11 | Asuragen, Inc. | Microrna markers for recurrence of colorectal cancer |
US20090253780A1 (en) * | 2008-03-26 | 2009-10-08 | Fumitaka Takeshita | COMPOSITIONS AND METHODS RELATED TO miR-16 AND THERAPY OF PROSTATE CANCER |
WO2009126726A1 (en) * | 2008-04-08 | 2009-10-15 | Asuragen, Inc | Methods and compositions for diagnosing and modulating human papillomavirus (hpv) |
WO2009137807A2 (en) | 2008-05-08 | 2009-11-12 | Asuragen, Inc. | Compositions and methods related to mirna modulation of neovascularization or angiogenesis |
WO2010056737A2 (en) * | 2008-11-11 | 2010-05-20 | Mirna Therapeutics, Inc. | Methods and compositions involving mirnas in cancer stem cells |
CN101525388B (zh) * | 2009-02-20 | 2012-02-01 | 中国人民解放军第四军医大学 | 特异性双链rna结合蛋白嵌合体及其在病毒感染性疾病中的应用 |
US20100257634A1 (en) * | 2009-04-03 | 2010-10-07 | Venganza Inc. | Bioassay for gene silencing constructs |
WO2013040251A2 (en) | 2011-09-13 | 2013-03-21 | Asurgen, Inc. | Methods and compositions involving mir-135b for distinguishing pancreatic cancer from benign pancreatic disease |
CN110229839B (zh) * | 2019-06-04 | 2021-06-08 | 中国农业大学 | 一种提升大肠杆菌dsRNA表达产率的方法 |
EP3760718A1 (en) | 2019-07-04 | 2021-01-06 | Medizinische Hochschule Hannover | Tissue for use as allogeneic or xenogeneic transplant and method for its production |
AU2020329166A1 (en) | 2019-08-09 | 2022-03-03 | Nutcracker Therapeutics, Inc. | Microfluidic apparatus and methods of use thereof |
WO2023118546A2 (en) | 2021-12-23 | 2023-06-29 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | METHODS AND MOLECULES FOR RNA INTERFERENCE (RNAi) |
CN115011584A (zh) * | 2022-06-23 | 2022-09-06 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 青虾Cathepsin D基因及其dsRNA的应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999032619A1 (en) * | 1997-12-23 | 1999-07-01 | The Carnegie Institution Of Washington | Genetic inhibition by double-stranded rna |
WO2001068836A2 (en) * | 2000-03-16 | 2001-09-20 | Genetica, Inc. | Methods and compositions for rna interference |
WO2003046186A1 (en) * | 2001-11-28 | 2003-06-05 | Toudai Tlo, Ltd. | siRNA EXPRESSION SYSTEM AND METHOD FOR PRODUCING FUNCTIONAL GENE KNOCK-DOWN CELLS USING THE SYSTEM |
JP2005501557A (ja) * | 2001-09-01 | 2005-01-20 | ガラパゴス・ジェノミックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ | siRNAノックアウトアッセイ法およびコンストラクト |
Family Cites Families (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5614395A (en) | 1988-03-08 | 1997-03-25 | Ciba-Geigy Corporation | Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof |
US5789214A (en) | 1988-03-08 | 1998-08-04 | Novartis Finance Corporation | Method of inducing gene transcription in a plant |
US5639949A (en) | 1990-08-20 | 1997-06-17 | Ciba-Geigy Corporation | Genes for the synthesis of antipathogenic substances |
WO1992009696A1 (en) | 1990-11-23 | 1992-06-11 | Plant Genetic Systems, N.V. | Process for transforming monocotyledonous plants |
US6270989B1 (en) | 1991-11-05 | 2001-08-07 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Protein production and delivery |
US5641670A (en) | 1991-11-05 | 1997-06-24 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Protein production and protein delivery |
NZ245015A (en) | 1991-11-05 | 1995-12-21 | Transkaryotic Therapies Inc | Delivery of human growth hormone through the administration of transfected cell lines encoding human growth hormone, which are physically protected from host immune response; the transfected cells and their production |
US5593874A (en) | 1992-03-19 | 1997-01-14 | Monsanto Company | Enhanced expression in plants |
TW402639B (en) | 1992-12-03 | 2000-08-21 | Transkaryotic Therapies Inc | Protein production and protein delivery |
US6130092A (en) * | 1994-07-04 | 2000-10-10 | Max-Planck Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. | Ribozyme gene library and method for making |
US5693512A (en) | 1996-03-01 | 1997-12-02 | The Ohio State Research Foundation | Method for transforming plant tissue by sonication |
US6025192A (en) | 1996-09-20 | 2000-02-15 | Cold Spring Harbor Laboratory | Modified retroviral vectors |
US6255071B1 (en) | 1996-09-20 | 2001-07-03 | Cold Spring Harbor Laboratory | Mammalian viral vectors and their uses |
CA2278734A1 (en) * | 1997-01-23 | 1998-07-30 | Immusol Incorporated | Gene functional analysis and discovery using randomized or target-specific ribozyme gene vector libraries |
AUPP249298A0 (en) * | 1998-03-20 | 1998-04-23 | Ag-Gene Australia Limited | Synthetic genes and genetic constructs comprising same I |
EP1147204A1 (en) * | 1999-01-28 | 2001-10-24 | Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. | Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna |
US5998148A (en) * | 1999-04-08 | 1999-12-07 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense modulation of microtubule-associated protein 4 expression |
US6326193B1 (en) * | 1999-11-05 | 2001-12-04 | Cambria Biosciences, Llc | Insect control agent |
US20030084471A1 (en) * | 2000-03-16 | 2003-05-01 | David Beach | Methods and compositions for RNA interference |
AU2001249622B2 (en) * | 2000-03-30 | 2007-06-07 | Massachusetts Institute Of Technology | RNA sequence-specific mediators of RNA interference |
HU230458B1 (hu) * | 2000-12-01 | 2016-07-28 | Europäisches Laboratorium für Molekularbiologie (EMBL) | Az RNS interferenciát közvetítő kis RNS molekulák |
US20050164210A1 (en) * | 2004-01-23 | 2005-07-28 | Vivek Mittal | Regulated polymerase III expression systems and related methods |
-
2002
- 2002-01-22 US US10/055,797 patent/US20030084471A1/en not_active Abandoned
-
2003
- 2003-01-22 WO PCT/US2003/001963 patent/WO2003062394A2/en active Search and Examination
- 2003-01-22 ES ES03732052T patent/ES2368039T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-01-22 AT AT03732052T patent/ATE513911T1/de active
- 2003-01-22 SI SI200332042T patent/SI1546174T1/sl unknown
- 2003-01-22 CA CA002473944A patent/CA2473944A1/en not_active Abandoned
- 2003-01-22 JP JP2003562262A patent/JP4758067B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2003-01-22 EP EP03732052A patent/EP1546174B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-01-22 DK DK03732052.0T patent/DK1546174T3/da active
-
2005
- 2005-08-08 HK HK05106782.4A patent/HK1073660A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2011
- 2011-02-03 JP JP2011021889A patent/JP2011135882A/ja active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999032619A1 (en) * | 1997-12-23 | 1999-07-01 | The Carnegie Institution Of Washington | Genetic inhibition by double-stranded rna |
WO2001068836A2 (en) * | 2000-03-16 | 2001-09-20 | Genetica, Inc. | Methods and compositions for rna interference |
JP2005501557A (ja) * | 2001-09-01 | 2005-01-20 | ガラパゴス・ジェノミックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ | siRNAノックアウトアッセイ法およびコンストラクト |
WO2003046186A1 (en) * | 2001-11-28 | 2003-06-05 | Toudai Tlo, Ltd. | siRNA EXPRESSION SYSTEM AND METHOD FOR PRODUCING FUNCTIONAL GENE KNOCK-DOWN CELLS USING THE SYSTEM |
Non-Patent Citations (7)
Title |
---|
JPN6009024562, Genetics, 1999, vol. 153, 1245−1256 * |
JPN6009024564, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2001, vol. 287, 1099−1104 * |
JPN6009024565, Nature, 2000, vol. 407, 319−320 * |
JPN6009024567, Nature, 2001, vol. 411, 494−498 * |
JPN6009024568, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, vol. 98, 9742−9747 * |
JPN6009024570, Hum. Mol. Genet., 20020115, vol. 11, 175−184 * |
JPN6010044408, Science, 200204, vol. 296, 550−553 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009152387A3 (en) * | 2008-06-11 | 2010-04-29 | Intradigm Corporation | Compositions comprising cmyc sirna and methods of use thereof |
JP2015112062A (ja) * | 2013-12-11 | 2015-06-22 | 国立大学法人豊橋技術科学大学 | Rna分子にヌクレアーゼ耐性能を付与する方法、ヌクレアーゼ耐性能を有するキメラrna分子 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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