JP2005532278A - 治療分子の細胞内伝達のためのカチオン性両親媒質、その組成物、工程およびそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
非特許文献6〜非特許文献26参照。
本発明の主な目的は、極性環状頭基を含む新しいカチオン性両親媒化合物を提供することである。
本発明は、生物学的活性(治療上の)分子の前記細胞内伝達を促進する、新しいカチオン性両親媒化合物に関する。本発明はまた、生物学的活性治療分子の体細胞への伝達に有用であるカチオン性両親媒質を含む製薬組成物に関する。
本発明は、一般式(I)により表されるような、生物活性カチオン性親媒質を提供する。
本発明はまた、一般式(II)により表されるような、生物活性カチオン性親媒質を提供する。
n=1
R1=R2=CH3-(CH2)10CH2-、CH3-(CH2)12CH2-、CH3-(CH2)14CH2-、CH3-(CH2)16CH2-および/またはCH3-(CH2)7-CH=CH(CH2)7CH2
R3=R4=ヒドロキシル基。
(a)対応する脂肪族疎水性第2級アミンを得る為に、塩基存在下における極性非プロトン性溶媒中で、適切な飽和または不飽和脂肪好性脂肪族ブロマイドと、飽和または不飽和脂肪好性脂肪族アルキルアミンとをカップリングする工程、
(b)極性非プロトン性溶媒中で、追加の極性官能基性を含む脂肪族アルコールの末端第1級アルコール基を適切な保護基で保護する工程、
(c)第4級(quaternized)親媒質化合物を得る為、有機塩基存在下、極性非プロトン性溶媒中で、工程(b)で得られた前記第1級ヒドロキシルで保護された脂肪族極性中間体と、工程(a)で得られた前記第2級アミンとを反応させる工程、
(d)必要な前記カチオン性親媒質を得る為に、工程(c)で得られた前記第4級(quaternized)両親媒化合物をアニオン交換カラムクロマトグラフィーに通し、極性有機溶媒の混合物で溶離する工程。
(1)前記正電荷の窒素原子と直接連結している疎水性基の存在;
(2)前記正電荷の窒素原子は、前記環状頭基の一部である;および
(3)ここで開示されているカチオン性脂質は、遺伝子を細胞へ伝達するために使用する、他の多くの商業的に利用できるグリセロール骨格をベースとするカチオン性両親媒質と異なり、それらの分子構造にグリセロール骨格を有していない。これらの独特の構造的特長は、ここで開示される前記カチオン性両親媒質の遺伝子伝達能力の増加に非常に寄与すると考えられている。
表1は、5員環状頭基を含む本発明の前記カチオン性脂質の調製(共通の構造式(I)においてn=1)に用いられる合成ストラテジーの概要である。同様の合成スキームが、7および9員環状頭基カチオン性脂質の合成に用いられる(共通の構造式(I)においてそれぞれn=2および3)。
本発明は、また、ここで開示される前記カチオン性両親媒化合物、生物学的活性な分子および補脂質を治療上効果的な量含んでいる新しい治療製剤を提供する。一つまたはそれ以上の追加の生理学的に適切な物質は、前記製剤の貯蔵を安定させるため、または前記生物学的活性分子の細胞内伝達をうまく促進するための本発明の製薬製剤に含まれる。本発明の前記実施による補脂質は、一つまたはそれ以上のカチオン性両親媒質と混合するのに有用である。コレステロールは、前記生物学的活性分子の細胞内伝達をうまく促進するための前記カチオン性脂質との組み合わせに用いる優秀な補脂質である。カチオン性親媒質と補脂質のモル比の好ましい範囲は、1:0〜1:2.5である。前記範囲をかなり広い範囲に変更することは技術の範囲内である。
ここに開示された、様々なカチオン性両親媒質存在下における前記細胞の生存能力が、"動物細胞培養、2nd Edition. Ed. I. R. L. Press, Oxford University Press (1977)"で説明されている一般的なプロトコルによって検査された。前記カチオン性脂質のトランスフェクション能力は、0-10nmolの範囲において研究され、この制限内で、前記細胞細胞毒性は最小限度に観測され、前記細胞生存能力は80%以上であると決定された。前記カチオン性両親媒質は、前記中性補脂質としてコレステロールを用いて、脂質とDNAのモル比を変化させて使用した。
本発明の前記工程は、極性環状頭基を備えるカチオン性トランスフェクション脂質の調製に利用できる。本発明の脂質は、ポリアニオン、ポリペプチドまたはヌクレオポリマーを細胞へ伝達するのに有用である。ここで開示される前記カチオン性脂質は、工業的または治療上の使用において、発現ベクターを細胞へ伝達する為に使用できる。前記発現ベクターは、公知の使用によるワクチンまたはその他の免疫調節(immunomodulatory)効果ためのホスト中での免疫応答を生じることができる、治療上有用なタンパク質を細胞へ伝達するため、または治療上有用なタンパク質分子をコードする核酸を伝達するための遺伝子治療プロトコルに用いられる。前記ベクター−形質転換細胞は、治療タンパク質または酵素(例えばエリトロポイエチン)、成長因子(例えばヒト成長ホルモン、G-CSFまたはインターロイキン)またはその他のタンパク質を製造する為のセルラインのような、商業的に有用なセルラインの製造に用いることができる。
以下の実施例は、本発明の例示の方法によって与えられている。従って、本発明の範囲を制限して解釈すべきでない。本発明によって開示された例示のカチオン性両親媒質1-5の合成手順は、以下の実施例1-5で説明している。カチオン性脂質1-5の構造を、以下に示す。
工程(a) 5gのn-ドデシルアミン(27mmol)を10mlのDMSOに溶かし、6.7gのn-ドデシルブロマイド(27mmol)および3.7gの炭酸カリウム(27mmol)を加えた。前記混合物を80℃で24時間撹拌し続けた。前記反応混合物をクロロホルム100ml中に入れ、水で洗浄し(2x150ml)、前記クロロホルム層を過剰の無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過を行った。クロロホルムをロータリー蒸発装置を用いて前記ろ液から除去し、クロロホルム中に1-2%のメタノールを含む溶媒を用いて前記残渣のカラムクロマトグラフィー精製(60-120メッシュサイズシリカを用いて)を行った。溶出液から前記所望の第2級アミン中間体、すなわち、N,N-ジ-n-ドデシルアミン(3.4g、収率35%)を与えた。
工程(a) 5gのn-テトラデシルアミン(23.4mmol)を10mlのDMSOに溶かし、6.4gのn-テトラデシルブロマイド(23.4mmol)および3.2gの炭酸カリウム(23.4mmol)を加えた。前記混合物は、80℃で24時間撹拌しつづけた。前記反応混合物をクロロホルム100ml中に入れ、水で洗浄し(2x150ml)、前記クロロホルム層を過剰の無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過を行った。クロロホルムをロータリー蒸発装置を用いて前記ろ液から除去し、クロロホルム中に1-2%のメタノールを含む溶媒を用いて前記残渣のカラムクロマトグラフィー精製(60-120メッシュサイズシリカを用いて)を行った。溶出液から前記所望の第2級アミン中間体、すなわち、N,N-ジ-n-テトラデシルアミン(3.4g、収率35%)を与えた。
工程(a) 5gのn-ヘキサデシルアミン(20.7mmol)を10mlのDMSOに溶かし、6.3gのn-ヘキサデシルブロマイド(20.7mmol)および2.9gの炭酸カリウム(20.7mmol)を加えた。前記混合物は、80℃で24時間撹拌しつづけた。前記反応混合物をクロロホルム100ml中に入れ、水で洗浄し(2x150ml)、前記クロロホルム層を過剰の無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過を行った。クロロホルムをロータリー蒸発装置を用いて前記ろ液から除去し、クロロホルム中に1-2%のメタノールを含む溶媒を用いて前記残渣のカラムクロマトグラフィー精製(60-120メッシュサイズシリカを用いて)を行った。溶出液から前記所望の第2級アミン中間体、すなわち、N,N-ジ-n-ヘキサデシルアミン(3.4g、収率35%)を与えた。
工程(a) 5gのn-オクタデシルアミン(18.5mmol)を10mlのDMSOに溶かし、6.2gのn-オクタデシルブロマイド(18.5mmol)および2.6gの炭酸カリウム(18.5mmol)を加えた。前記混合物は、80℃で24時間撹拌しつづけた。前記反応混合物をクロロホルム100ml中に入れ、水で洗浄し(2x150ml)、クロロホルムをロータリー蒸発装置を用いて前記ろ液から除去し、クロロホルム中に1-2%のメタノールを含む溶媒を用いて前記残渣のカラムクロマトグラフィー精製(60-120メッシュサイズシリカを用いて)を行った。溶出液から前記所望の第2級アミン中間体、すなわち、N,N-ジ-n-オクタデシルアミン(3.6g、収率37%)を与えた。
工程(a) 5gのn-オレイルアミン(18.7mmol)を10mlのDMSOに溶かし、6.2gのn-オクタデシルブロマイド(18.7mmol)および2.6gの炭酸カリウム(18.7mmol)を加えた。前記混合物は、80℃で24時間撹拌しつづけた。前記反応混合物をクロロホルム100ml中に入れ、水で洗浄し(2x150ml)、クロロホルムをロータリー蒸発装置を用いて前記ろ液から除去し、クロロホルム中に1-2%のメタノールを含む溶媒を用いて前記残渣のカラムクロマトグラフィー精製(60-120メッシュサイズシリカを用いて)を行った。溶出液から前記所望の第2級アミン中間体、すなわち、N-n-オクタデシル-N-オレイルアミン(2.7g、収率27.8%)を与えた。
COS-1細胞は、前記トランスフェクションの18時間前に、96-ウェルプレートに15,000細胞/ウェルの濃度でシードされた。0.15μgのプラスミドDNAを、13μlの平らなDMEM培地において、30分間、様々な量の脂質(0.05-4.3ナノモル)と結合させた。前記電荷比は、前記脂質のこの範囲を超えて、0.1:1から9:1(+/-)へと変化させた。前記複合体は、平らなDMEMで100μlに希釈され、および前記ウェルに加えられた。培養から3時間後、10%FCS含有の100μlのDMEMを前記細胞に加えた。前記培地は、24時間後に10%完全培地へ移され、前記レポーター遺伝子活性が、48時間後に測定された。前記細胞を、PBSで2度洗浄し、50μlの溶解緩衝液(0.25M Tris.HCl、pH8.0および0.5% NP40)で溶解させた。注意すべき点は、完全な溶解を確実に行うことである。ウェルごとの前記β-ガラクトシダーゼ活性は、50μlの2X基質溶液(1.33mg/mlのONPG、0.2Mリン酸ナトリウム、pH7.15および2mM塩化マグネシウム)を96-ウェルプレート中の前記溶解物へ加えることにより測定された。405nmの吸収が、純粋な市販のβ-ガラクトシダーゼ酵素によって作成された検量線を用いて、β-ガラクトシダーゼユニットに変換された。
インターカレーション-起因性蛍光増加およびDNAと結合するカチオン性脂質との競合は、カチオン性脂質-DNA相互作用の研究を行う優れたツールであるエチジウムブロマイド(EtBr)を用いた。前記例示の本発明のカチオン性脂質の脂質:DNA相互作用を評価する為に、我々は、カチオン性脂質1-5の量を増加させてEtBr:pCMV β-gal複合体を滴定した。
MTTに基づいた生存能力分析は、以前説明されているCOS-1細胞を用いて(Banerjee, R. et al. 1999)、様々な脂質:DNA電荷比における前記脂質1-5の細胞毒性を評価する為に行われた。脂質1を除き、他の全ての脂質(2-5)について、9:1の脂質:DNA電荷比においてでさえ、わずかな細胞毒性を示した(図3)。3:1の電荷比での脂質1、4および5については、毒性を処理された細胞の15-25%に変化させた。前記脂質2(短いアルキル鎖を有する)の毒性は、おそらく洗浄のような細胞-溶解活性から起こる。図3で示されるように、前記本発明の脂質2-5の細胞毒性のグラフは、リポフェクチン(lipofectin)、リポフェクタミン(lipofectamine)およびDMRIEを含むいくつかの商業的に利用できるカチオン性トランスフェクション脂質のものよりも優れている。
1 本発明の新しいカチオン性脂質は、非ウイルス遺伝子治療により遺伝子の疾患を治療するのに特に有用である。
2 本発明のカチオン性両親媒質は、分子構造中にグリセロール骨格を有しない。
3 前記カチオン性両親媒質は、ポリアニオン、ポリペプチドおよびヌクレオポリマーを細胞へ伝達するのに有用である。
Claims (49)
- Xが、ハロゲン原子、トシル基およびアセタート基から選択される、請求項1に記載の化合物。
- R1が水素であり、R2がC8-22の飽和アルキル基または1から3の不飽和度を有する不飽和アルキル基である、請求項1に記載の化合物。
- R1がC8-22飽和アルキル基または1から3の不飽和度を有する不飽和アルキル基であり、R2が水素原子またはC8-22の飽和アルキル基または1から3の二重不飽和度を有する不飽和アルキル基である、請求項1に記載の化合物。
- R3およびR4が、それぞれ水素、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキルおよびアミノまたは第1級アミンから選択される基による組み合わせのいずれかを表す、請求項1に記載の化合物。
- ヒドロキシアルキルおよび第1級アミンが、1-5の炭素原子からなる、請求項5に記載の化合物。
- それぞれ、R1が水素原子を表し、R2が飽和アルキルまたは1から3の二重結合を有する不飽和アルキル鎖から選択されるC8-22炭素原子により表される、請求項4に記載の化合物。
- それぞれ、R1が飽和アルキルまたは1から3の二重結合を有する不飽和アルキル鎖から選択されるC8-22炭素原子を表し、R2が水素原子を表す、請求項4に記載の化合物。
- R1およびR2が共に、飽和アルキルまたは1から3の二重結合を有する不飽和アルキル鎖から選択されるC8-22炭素原子を表す、請求項4に記載の化合物。
- 疎水性基を有する前記化合物が、極性置換基を含む環の一部により、正電荷の窒素原子と直接連結している、請求項1に記載の化合物。
- 以下の工程を含む、式(I-II)の生体活性カチオン性両親媒質の調製方法。
(a)対応する脂肪族疎水性第2級アミンを得る為に、塩基存在下、極性非プロトン性溶媒中で、適切な飽和または不飽和脂肪好性脂肪族ブロマイドと、飽和または不飽和脂肪好性脂肪族アルキルアミンとをカップリングする工程、
(b)極性非プロトン性溶媒中で、追加の極性官能基性を含む脂肪族アルコールの末端第1級アルコール基を適切な保護基で保護する工程、
(c)第4級(quaternized)親媒質化合物を得る為、有機塩基存在下、極性非プロトン性溶媒中で、工程(b)で得られた前記第1級ヒドロキシルで保護された脂肪族極性中間体と、工程(a)で得られた前記第2級アミンとを反応させる工程、
(d)必要な前記カチオン性親媒質を得る為、工程(c)で得られた前記第4級(quaternized)両親媒化合物をアニオン交換カラムクロマトグラフィーに通し、極性有機溶媒の混合物で溶離する工程。 - 前記脂肪族飽和アルキルブロマイドが、10-30炭素原子からなる群から選択される、請求項12に記載の工程。
- 前記脂肪族飽和アルキルアミンが、10-30炭素原子からなる群から選択される、請求項12に記載の工程。
- 使用される前記脂肪族不飽和アルキルアミンが、10-30炭素原子からなる群から選択される、請求項12に記載の工程。
- 工程(c)の置換された第1級ヒドロキシル基が、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、アミノまたは第1級アミノからなる群から選択され、最も好ましくはヒドロキシルまたはアミノである、請求項12に記載の工程。
- 前記アミノ基が、t-boc、f-mocまたはその他のいずれかの適切な保護試薬で保護されている、請求項12に記載の工程。
- 反応が行われる前記極性非プロトン性溶媒が、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、トリエチルアミンを含む群から選択される、請求項12に記載の工程。
- 前記反応が、無機アルカリ金属炭酸塩から選択される弱塩基存在下において行われる、請求項12に記載の工程。
- 前記第1級アルコール保護基が、トシルクロライド、メシルクロライドから選択される、請求項12に記載の工程。
- 工程(a)で用いられる前記極性非プロトン性溶媒が、ジメチルスルホキシド、N,N-ジメチルホルムアミド、酢酸エチル、テトラヒドロフランから選択される、請求項12に記載の工程。
- 工程(a)の前記反応が、50℃から100℃の間の温度において行われる、請求項12に記載の工程。
- 工程(b)の末端第1級ヒドロキシル基の保護が、-10℃から50℃の間の温度において行われる、請求項12に記載の工程。
- 第1級アルコールが、エリトリトールまたはその同族体から選択される、請求項12に記載の工程。
- 工程(c)で用いられる前記極性非プロトン性溶媒が、ジメチルスルホキシド、N,N-ジメチルホルムアミド、酢酸エチル、テトラヒドロフランから選択される、請求項12に記載の工程。
- 工程(c)で用いられる前記有機塩基が、トリエチルアミン、ピリジン、ピペリジンから選択される、請求項12に記載の工程。
- 工程(c)の前記反応が、50℃から100℃の間の温度において行われる、請求項12に記載の工程。
- 工程(d)で用いられる前記アニオン交換樹脂が、交換に有利なクロライドまたはブロマイドイオンを有する樹脂から選択される、請求項12に記載の工程。
- 工程(d)において前記極性溶出液の成分として用いられる前記有機溶媒が、メタノール、エタノール、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチルから選択される、請求項12に記載の工程。
- 生物学的活性分子の細胞内伝達の為の製薬組成物であり、少なくともカチオン性親媒質、生体活性分子、補脂質(colipid)および任意の添加物を含む組成物。
- 前記生物活性分子が、治療上重要なタンパク質、核酸、オリゴヌクレオチドおよびペプチドをコードする、リボソームRNA、DNAまたはRNAのアンチセンスポリヌクレオチド、ゲノムDNAのポリヌクレオチド、cDNAまたはmRNAからなる群から選択される、請求項30に記載の製薬組成物。
- 前記核酸が、環状、鎖状プラスミドまたはRNAである、請求項30に記載の製薬組成物。
- 前記補脂質が、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロールからなる群から選択される、請求項30に記載の製薬組成物。
- カチオン性親媒質および補脂質の好ましい範囲が、1:0-1:2.5の比である、請求項30に記載の製薬組成物。
- 投与される前記組成物が、in vitro系の50000個の細胞について0.1-0.5 μgの範囲の実質的な量のDNAを含む、請求項32に記載の製薬組成物。
- 前記組成物を、静脈内、筋肉内および腹腔内(intraperitonially)に投与することができる、請求項30に記載の製薬組成物。
- 前記添加物が、生理学的に許容できる添加物から選択される、請求項30に記載の製薬組成物。
- 前記添加物が、前記組成物(formulation)の安定化および生物活性分子の効果的な伝達に用いられる、請求項30に記載の製薬組成物。
- 前記組成物が、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル(docetaxel)および5-フルオロウラシルから選択される、脂肪好性治療抗がん剤に処方される、請求項30に記載の製薬組成物。
- 前記組成物が、アシクロビアから選択されるウイルス製剤に処方される、請求項30に記載の製薬組成物。
- 前記組成物が、アンフォテリシンBから選択される抗生物質に処方される、請求項30に記載の製薬組成物。
- 前記組成物が、感染症の第1部位である肺に伝達する為の抗インフルエンザ剤に処方される、請求項30に記載の製薬組成物。
- 前記被検体が、ヒトおよびネズミ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジを含むその他の種または非ヒト霊長類から選択される、請求項44に記載の使用。
- 前記使用が、非ウイルス遺伝子治療により遺伝子の疾患の治療に用いられる、請求項44に記載の使用。
- 前記組成物を、静脈内、筋肉内および腹腔内(intraperitonially)に投与することができる、請求項44に記載の使用。
- 細胞毒性が、最低限であり、前記細胞生存度が80%以上である、請求項44に記載の使用。
- 前記使用が、前記被検体における遺伝子治療適用のためのセルラインを構築するために使用される、請求項44に記載の使用。
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