JP4442864B2 - リン脂質誘導体及び遺伝子導入キャリア - Google Patents
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R1,R2:炭素数12〜18の直鎖脂肪族炭化水素基
A1,A2:スペルミジンの1個の第1級アミノ基から1個の水素原子を除いた残基、スペルミンの1個の第1級アミノ基から1個の水素原子を除いた残基、トリスペルミンの1個の第1級アミノ基から1個の水素原子を除いた残基又は数平均分子量1000〜20000のポリエチレンイミンの1個の第1級アミノ基から1個の水素原子を除いた残基
1)化1中のR1がヘキサデシル基(セチル基)、A1がスペルミジンの1個の第1級アミノ基から1個の水素原子を除いた残基である場合の化1で示されるリン脂質誘導体(P−1)。そしてこのリン脂質誘導体(P−1)から成る遺伝子導入キャリア。
・ジセチルフォスフェート無水物の合成
ジセチルフォスフェート50mg(90μmol)と無水ピリジン1mlを反応容器に仕込み、均一に溶解した後、更に固体状の1,3,5−トリイソプロピルベンゼンスルフォニルクロライド277mg(0.91mmol)を加えた。反応容器内を窒素置換し、室温で数時間撹拌して、ジセチルフォスフェートの無水化反応を行った後、溶媒を減圧留去して反応生成物を得た。この反応生成物をクロロフォルムを溶離液としたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより単離してジセチルフォスフェート無水物44.3mg(41μmol)を得た。収率は90%であった。ここで、ジセチルフォスフェートからジセチルフォスフェート無水物への変換は、固定相シリカゲルの薄層クロマトグラフィーにより、モリブデンブルーによる呈色反応で確認した。ジセチルフォスフェート無水物の分析値は以下の通りであった。
元素分析(C64H132O7P2):
理論値;C71.46,H12.37
実測値;C71.49,H12.32
1H−NMRによるケミカルシフト(単位はppm):0.88(t,12H),1.25(broads,96H),1.37(m,8H),1.70(m,8H),4.0−4.2(m,8H)
31P−NMRによるケミカルシフト(単位はppm):−12.27,−0.13
13C−NMRによるケミカルシフト(単位はppm):14.01,22.68,
25.36,25.45,29.16,29.36,29.54,29.60,29.66,29.71,30.31,31.92,67.67,69.12
(C64H133O7P2)+に対するSIMS質量分析:
理論値;1075.9
実測値;1075.4
ジパルミトイルホスファチジン酸15mg(22μmol)と無水ピリジン0.5mlを反応容器に仕込み、均一に溶解した後、更に2−ブロモエタノール10μL(127μmol)と固体状の1,3,5−トリイソプロピルベンゼンスルフォニルクロライド30mg(100μmol)を加えた。反応容器内を窒素置換し、室温で5時間撹拌した後、水0.15mlを加えて反応を停止し、溶媒を減圧留去して反応生成物を得た。この反応生成物を固定相シリカゲルの薄層クロマトグラフィー{メルク社製のシリカゲル60F254、20cm×20cm、厚み0.25mm、展開液クロロホルム/メタノール=3/1(容量比)の混合液}に供し、Rf値0.5〜0.6の区分を単離して、1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−リン酸ブロモエチルエステル13mg(17.6μmol)を得た。収率は80%であった。1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−リン酸ブロモエチルエステルの分析値は以下の通りであった。
元素分析(C37H71BrNaO8P):
理論値;C57.13,H9.20
実測値;C57.18,H9.18
1H−NMRによるケミカルシフト(単位はppm):0.89(t,6H),1.26(s,48H),1.57(m,4H),2.28(m,4H),3.50(m,2H),3.8−4.5(bm,6H),5.25(m,1H)
(C37H71O8PBr79Na2)+に対するSIMS質量分析:
理論値;799.4
実測値;799.3
・実施例1{リン脂質誘導体(P−1)の合成}
スペルミジン6.74mg(46μmol)と無水ピリジン0.5mlを反応容器に仕込み、均一に溶解した後、更に試験区分1で得たジセチルフォスフェート無水物10mg(9.3μmol)を無水ピリジン0.1mlに溶解したものを加えた。反応容器内を窒素置換し、室温で5時間撹拌して反応させ、溶媒を留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供して、クロロホルム/メタノール/トリエチルアミン=10/1/0.1(容量比)の混合物からなる溶離液で副生成物を溶出させ、更にクロロホルム/メタノール/トリエチルアミン=10/1/0.02(容量比)の混合物からなる溶離液でリン脂質誘導体(P−1)を含む区分を溶出させた。溶出物から溶離液を減圧留去した後、真空乾燥して白色粉末状のリン脂質誘導体(P−1)4.9mgを得た。収率は78%であった。このリン脂質誘導体(P−1)は、下記の分析値から、化1中のR1がヘキサデシル基(セチル基)、A1がスペルミジンの1個の第1級アミノ基から1個の水素原子を除いた残基である場合の化1で示されるリン脂質誘導体であった。
元素分析(C39H84N3O3P):
理論値;C69.49,H12.56,N6.23
実測値;C69.45,H12.59,N6.27
IRの主なピーク(単位cm−1):3394,3244,2955,2917,2850,1647,1558,1467,1210,1012
1H−NMRによるケミカルシフト(単位はppm):0.88(t,6H),1.26(s,52H),1.56(m,4H),1.70(m,6H),2.61−3.12(bm,12H),3.98(bm,4H)
(C39H85N3O3P)+に対するSIMS質量分析:
理論値;674.6
実測値;674.8
スペルミン10mg(49μmol)と無水ピリジン0.5mlを反応容器に仕込み、均一に溶解した後、更に試験区分1で得たジセチルフォスフェート無水物10mg(9.3μmol)を無水ピリジン0.1mlに溶解したものを加えた。反応容器内を窒素置換し、室温で5時間撹拌して反応させ、溶媒を留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供して、クロロホルム/メタノール/トリエチルアミン=10/1/0.1(容量比)の混合物からなる溶離液で副生成物を溶出させ、更にクロロホルム/メタノール/トリエチルアミン=10/1/0.02(容量比)の混合物からなる溶離液でリン脂質誘導体(P−2)を溶出させた。溶出物から溶離液を減圧留去した後、真空乾燥して白色粉末状のリン脂質誘導体(P−2)4.5mgを得た。収率は66%であった。このリン脂質誘導体(P−2)は、下記の分析値から、化1中のR1がヘキサデシル基(セチル基)、A1がスペルミンの1個の第1級アミノ基から1個の水素原子を除いた残基である場合の化1で示されるリン脂質誘導体であった。
元素分析(C42H91N4O3P):
理論値;C68.99,H12.54,N7.66
実測値;C69.02,H12.59,N7.63
IRの主なピーク(単位cm−1):3426,3235,2955,2917,2850,1646,1558,1467,1208,1012
1H−NMRによるケミカルシフト(単位はppm):0.88(t,6H),1.26(s,52H),1.42(bm,8H),1.55(bm,4H),2.15(br,5H),3.17(bm,8H),3.63(bm,4H),3.97(m,4H)
31P−NMRによるケミカルシフト(単位はppm):9.76
(C42H92N4O3P)+に対するSIMS質量分析:
理論値;731.7
実測値;731.5
トリスペルミン6mg(8.7μmol)と無水ピリジン0.5mlを反応容器に仕込み、均一に溶解した後、更に試験区分1で得たジセチルフォスフェート無水物4mg(3.7μmol)を無水ピリジン0.1mlに溶解したものを加えた。反応容器内を窒素置換し、室温で24時間撹拌して反応させ、溶媒を留去した後、蒸留水及びリン酸緩衝溶液(pH7.0,10mM)で洗浄した。洗浄した残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(アミノ化シリカゲル1g)に供して、クロロホルム/メタノール/トリエチルアミン=10/1/0.1(容量比)の混合物からなる溶離液でリン脂質誘導体(P−3)を含む区分を溶出させた。溶出物から溶離液を減圧留去した後、真空乾燥して白色粉末状のリン脂質誘導体(P−3)4.8mgを得た。収率は85%であった。このリン脂質誘導体(P−3)は、下記の分析値から、化1中のR1がヘキサデシル基(セチル基)、A1がトリスペルミンの1個の第1級アミノ基から1個の水素原子を除いた残基である場合の化1で示されるリン脂質誘導体であった。
元素分析(C68H151N12O3P):
理論値;C67.17,H12.52,N13.82
実測値;C67.10,H12.59,N13.75
IRの主なピーク(単位cm−1):3440,3237,2956,2917,2850,1637,1558,1467,1208,1012
1H−NMRによるケミカルシフト(単位はppm):0.88(t,6H),1.26(s,52H),1.45(m,4H),1.69(bm,16H),1.91(br,57H),2.78(bm,12H),3.99(bm,4H)
(C68H151N12O3PNa)+に対するMALDI−TOF質量分析:
理論値;1238.2
実測値;1240.1
数平均分子量1800のポリエチレンイミン16.7mg(9.3μmol)と無水ピリジン0.5mlを反応容器に仕込み、均一に溶解した後、更に試験区分1で得たジセチルフォスフェート無水物10mg(9.3μmol)を無水ピリジン0.1mlに溶解したものを加えた。反応容器内を窒素置換し、室温で5時間撹拌して反応させ、溶媒を留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供して、クロロホルム/メタノール/トリエチルアミン=10/1/0.1(容量比)の混合物からなる溶離液で副生成物を溶出させ、更にクロロホルム/メタノール/トリエチルアミン=10/1/0.02(容量比)の混合物からなる溶離液でリン脂質誘導体(P−4)を溶出させた。溶出物から溶離液を減圧留去した後、真空乾燥して白色粉末状のリン脂質誘導体(P−4)3.5mgを得た。収率は20.7%であった。このリン脂質誘導体(P−4)は、下記の分析値から、化1中のR1がヘキサデシル基(セチル基)、R3が数平均分子量1800のポリエチレンイミンの1個の第1級アミノ基から1個の水素原子を除いた残基である場合の化1で示されるリン脂質誘導体であった。
元素分析(C116H276N42O3P):
理論値;C59.60,H11.90,N25.17
実測値;C59.55,H11.96,N25.10
IRの主なピーク(単位cm−1):3347,3273,2950,2917,2850,1633,1560,1467,1211,1012
1H−NMRによるケミカルシフト(単位はppm):0.88(t,6H),1.1−1.6(br,83H),1.65(bm,4H),2.5−3.1(bm,179H),4.1(m,4H)
スペルミジン8.5mg(58.5μmol)と無水ピリジン0.5mlを反応容器に仕込み、均一に溶解した後、更に試験区分1で得た1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−リン酸ブロモエチルエステル16.4mg(21.1μmol)を無水ピリジン0.5mlに溶解したものを加えた。反応容器内を窒素置換し、室温で24時間撹拌して反応させ、溶媒を留去した後、中性アルミナカラムクロマトグラフィーに供して、クロロホルム/メタノール=3/1(容量比)の混合物からなる溶離液でリン脂質誘導体(P−5)を含む区分を溶出させた。溶出物から溶離液を減圧留去した後、真空乾燥してリン脂質誘導体(P−5)1.3mgを得た。収率は7.5%であった。このリン脂質誘導体(P−5)は、下記の分析値から、化2中のR2がヘキサデカノイル基(パルミトイル基)、A2がスペルミジンの1個の第1級アミノ基から1個の水素原子を除いた残基である場合の化2で示されるリン脂質誘導体であった。
元素分析(C44H90N3O8P):
理論値;C64.43,H11.06,N5.12
実測値;C64.38,H11.10,N5.08
IRの主なピーク(単位cm−1):3299,2956,2918,2851,1729,1637,1558,1466,1217,1070
1H−NMRによるケミカルシフト(単位はppm):0.88(t,6H),1.25(s,48H),1.5−1.9(br,14H),2.30(bm,4H),2.5−3.0(bm,10H),3.69(br,2H),3.99(br,2H),4.41(m,2H),5.25(br,1H)
(C44H91N3O8P)+に対するSIMS質量分析:
理論値;820.6
実測値;820.6
スペルミン10.3mg(51μmol)と無水ピリジン0.25mlを反応容器に仕込み、均一に溶解した後、更に試験区分1で得た1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−リン酸ブロモエチルエステル16.4mg(21.1μmol)を無水ピリジン0.75mlに溶解したものを加えた。反応容器内を窒素置換し、室温で24時間撹拌して反応させ、溶媒を留去した後、リン脂質誘導体(P−5)の場合と同様に、中性アルミナカラムクロマトグラフィーに供して、リン脂質誘導体(P−6)を含む区分を溶出させた。溶出物から溶離液を減圧留去した後、真空乾燥してリン脂質誘導体(P−6)9.4mgを得た。収率は51%であった。このリン脂質誘導体(P−6)は、下記の分析値から、化2中のR2がヘキサデカノイル基(パルミトイル基)、A2がスペルミンの1個の第1級アミノ基から1個の水素原子を除いた残基である場合の化2で示されるリン脂質誘導体であった。
元素分析(C47H97N4O8P):
理論値;C64.35,H11.14,N6.39
実測値;C64.32,H11.19,N6.42
IRの主なピーク(単位cm−1):3400,3308,2947,2918,2850,1737,1640,1563,1468,1219,1063
1H−NMRによるケミカルシフト(単位はppm):0.88(t,6H),1.25(s,48H),1.4−1.9(m,16H),2.30(bm,4H),2.5−3.0(bm,16H),3.95(br,2H),4.15(br,2H),4.45(m,2H),5.25(bs,1H)
(C47H98N4O8P)+に対するSIMS質量分析:
理論値;877.7
実測値;877.7
数平均分子量1800のポリエチレンイミン11.6mg(6.4μmol)と無水ピリジン0.5mlを反応容器に仕込み、均一に溶解した後、更に試験区分1で得た1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−リン酸ブロモエチルエステル5mg(6.4μmol)を無水ピリジン3mlに溶解したものを加えた。反応容器内を窒素置換し、室温で24時間撹拌して反応させ、溶媒を留去した後、中性アルミナカラムクロマトグラフィーに供して、クロロホルムの溶離液でリン脂質誘導体(P−7)を含む区分を溶出させた。溶出物から溶離液を減圧留去した後、真空乾燥してリン脂質誘導体(P−7)5.3mgを得た。収率は32%であった。このリン脂質誘導体(P−7)は、下記の分析値から、化2中のR2がヘキサデカノイル基(パルミトイル基)、A2が数平均分子量1800のポリエチレンイミンの1個の第1級アミノ基から1個の水素原子を除いた残基である場合の化2で示されるリン脂質誘導体であった。
元素分析(C122H284N42O8P):
理論値;C58.64,H11.46,N23.55
実測値;C58.60,H11.50,N23.50
IRの主なピーク(単位cm−1):3407,3306,2950,2923,2850,1737,1640,1562,1468,1219,1063
1H−NMRによるケミカルシフト(単位はppm):0.86(t,6H),1.24(s,48H),1.60(m,4H),2.32(br,4H),2.3−3.1(bm,184H),3.25−4.58(bm,37H),5.19(br,1H)
試験区分2で合成したリン脂質誘導体の遺伝子導入キャリアとしての評価を下記の通り行った。遺伝子導入効率は蛍光強度の大きさで評価した。蛍光強度が大きいほど遺伝子導入効率が高いことを意味する。
1次血管平滑筋細胞は、ウイスターラットの胸腹神経大動脈から取りだすことにより得た。内皮細胞と外膜細胞を分離し、平均的な血管平滑筋細胞を、ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水[20%ウシ胎仔血清(FBS),ペニシリン200units/mL,ストレプトマイシン200mg/mlを含有する溶液]中にて37℃で5%二酸化炭素存在下に保存した。コンフルエント時には0.25mg/mlトリプシン/EDTA溶液で細胞をはがした。
トランスフェクションの24時間前に96個のくぼみを持つプレート中に前記で培養した細胞を入れた。β−ガラクトシダーゼプラスミドDNA(Clontech Labtories Inc)を血清を含有していない培養液で20mg/mlにまで希釈した。遺伝子導入キャリアをダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水に1mg/mlの濃度で懸濁させた懸濁液を、該懸濁液と同体積のβ−ガラクトシダーゼプラスミドDNA溶液で希釈して、遺伝子導入キャリア/β−ガラクトシダーゼプラスミドDNA=1/3(重量比)からなる複合体とした。この複合体を15分間室温でインキュベーションした後、細胞培地に添加して、血清非存在下のトランスフェクション評価試験を実施した。血清存在下のトランスフェクション評価試験は、20%FBSを含む細胞培地に添加する以外は血清非存在下のトランスフェクション評価試験と同様に行った。トランスフェクション試験開始後24時間において、内因性の酵素活性を失活させるための加熱(50℃で45分間)を加えるように改良されたマイクロプレート蛍光アッセイを用い、細胞のβ−ガラクトシダーゼ活性を次の手順で測定した。プレートのそれぞれくぼみから培養液を取り除き、細胞をPBS溶液で一度洗い、100mlの溶解用緩衝溶液[硫酸マグネシウム0.1mMと塩化カリウム1mMと4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル―エタンスルホン酸100mM(pH7.8)に溶かした0.03%トリトンX−100溶液]を加えることにより細胞を溶解した。このプレートを50℃で45分間保ち、その後室温まで放冷した。プレートのそれぞれのくぼみに10mlのフルオレセインジβ−D−ガラクトピラノシド(FDG,100mM)を加えた。37℃で一晩インキュベーションし、マイクロプレート蛍光光度計(Model 7620,Cambridge Technology Inc.)で蛍光強度を測定した。結果を表1及び表2に示した。
A−1:スペルミジンの1個の第1級アミノ基から1個の水素原子を除いた残基
A−2:スペルミンの1個の第1級アミノ基から1個の水素原子を除いた残基
A−3:トリスペルミンの1個の第1級アミノ基から1個の水素原子を除いた残基
A−4:数平均分子量1800のポリエチレンイミンの1個の第1級アミノ基から1個の水素原子を除いた残基
Claims (4)
- 化1で示されるリン脂質誘導体であって且つ化1中のR1がヘキサデシル基である場合のものである請求項1記載のリン脂質誘導体。
- 化2で示されるリン脂質誘導体であって且つ化2中のR2がヘキサデカノイル基である場合のものである請求項1記載のリン脂質誘導体。
- 請求項1〜3のいずれか一つの項記載のリン脂質誘導体から成る遺伝子導入キャリア。
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