JP2005529080A - 腫瘍の増殖および脈管形成のサプレッサとしての新規のクルクミノイド−第ＶＩＩａ因子構築物 - Google Patents

腫瘍の増殖および脈管形成のサプレッサとしての新規のクルクミノイド−第ＶＩＩａ因子構築物 Download PDF

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Abstract

フッ素化クルクミノイドである（３，５−ビス−（２−フルオロベンジリデン）−ピペリジン−４−オン−アセテートは、腫瘍細胞の増殖の停止について、シスプラチンより約１０倍有効である。本発明は、細胞傷害性化合物（例えば、クルクミノイド）を、特に、癌細胞および固形腫瘍を栄養する血管内皮細胞に送達するための方法を提供する。この方法は、タンパク質（例えば、表面タンパク質組織因子に高い親和性を保持する第ＶＩＩａ因子）に薬物をテザリングする工程を包含する。複合体化の際に、得られるヘテロ二量体は、エンドサイトーシスされ、薬物は、タンパク質分解性切断を介して標的細胞内で実質的に遊離する。本発明はさらに、新規なクルクミノイド−テザー−リンカー−第ＩＩＶａ因子組成物の合成、および有効用量の新規組成物を、患者内の標的腫瘍または内皮細胞に送達する方法を提供する。

Description

本出願は、２００２年３月８日に提出された仮出願（米国番号６０／３６２，７６２）からの優先権の利益を主張する。
（フェデラル リサーチ サポート（Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｕｐｐｏｒｔ）への謝辞）
本発明は、少なくとも部分的には、国立衛生研究所からの出資（補助金 １ Ｒ２１ ＣＡ８２９９５−０１Ａ１）および国防総省陸軍省の補助金 ＤＡＭＤ１７−００−１−０２４１により、なされた。従って、本発明において、米国政府が、一定の権利を有する。
（発明の分野）
本発明は、クルクミノイドを標的細胞に選択的に送達するための新規の組成物に関する。本発明は、上記の新規の組成物を合成する方法およびそれらを組織因子を含む標的細胞へと送達する方法に、さらに関する。
（背景）
悪性疾患と凝固能が亢進した状態との間の関連は、１００年以上も前に記録されている。腫瘍に栄養を与える血管の形成における、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）のような腫瘍由来の血管作用性因子の重要な役割が、より近年の研究で強調されている。組織因子（ＴＦ）のような細胞に関連するプロコアギュラント（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）もまた、これらの出来事の病因に関与している。「組織因子」は、凝固因子ＶＩＩ（およびその活性化した形態である第ＶＩＩａ因子（ｆＶＩＩａ））に特異的な膜貫通タンパク質レセプターであり、血液凝固の最初のレギュレーターである。ＴＦの細胞外ドメインに結合した場合に、ｆＶＩＩａは、外部の経路を介して、第Ｘ因子（ｆＸ）を活性化する。あるいは、ＴＦ−ＶＩＩａは、内部の血液凝固経路中の第ＩＸ因子の活性化を介して、間接的にｆＸを活性化する。その潜在的なプロコアギュラント機能とは独立して、ＴＦは、ＶＥＧＦの発現のモジュレーターおよび細胞シグナルトランスデューサとして、機能し得る。これらの研究により、宿主の炎症細胞、腫瘍細胞および血管内皮細胞（ＶＥＣ）の間の動的な相互作用についての重要な証拠が、提供された。その結果のいくつかが、「漏れやすい血管」（フィブリノーゲンを伴った腫瘍の灌流）および局所的な腫瘍微小環境（ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）における、細胞に関連するプロコアギュラントによるフィブリノーゲンのフィブリンへの変換である。これらの出来事は、腫瘍が血液を介して拡大する間に、血管壁で発生し得、あるいは原発腫瘍または転移物が成長するにつれて、血管外の空間で発生し得る。フィブリンは、プロコアギュラント活性、特に腫瘍細胞、腫瘍に関連するマクロファージおよび腫瘍に関連するＶＥＣの表面に発現する組織因子の発現によって生成され得る。
増大した腫瘍による新脈管形成は、種々のヒト腫瘍における悪い予後に関連する。そのようなヒト腫瘍としては、浸潤性の乳癌、初期段階およびノード（ｎｏｄｅ）陰性の乳癌、前立腺癌および肺の腺癌が挙げられる。いわゆる腫瘍の微小血管密度と再発のない生存との間には、統計学的に有意な相関がある。腫瘍細胞は、多くの脈管形成因子（ＶＥＧＦ、インターロイキン−８（ＩＬ−８）および塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）が挙げられる）を分泌すること、ならびに腫瘍細胞における内皮細胞の増殖は、正常な組織と比較してより速いことが示されている。
腫瘍細胞は、脈管の透過性を増大させる因子を分泌する。脈管透過性因子（またはＶＥＧＦ）は、もともと腫瘍細胞から精製された因子であり、分子量４５ｋＤａを有し、詳細には、血管の透過性、内皮細胞の成長および新脈管形成を促進するために、ＶＥＣで機能している。ＶＥＧＦは、ＶＥＣおよび単球において、ＴＦ活性の発現を誘導し、そして単球、骨芽細胞、およびＶＥＣに対して化学走性である。ＶＥＧＦは、血漿フィブリノーゲン（ＴＦ依存的な機構によって、フィブリンに変換され得る）の血管外遊出を促進する。フィブリンの蓄積によって、腫瘍の細胞外マトリクスが変化し、マクロファージ、線維芽細胞および内皮細胞の移動が促進される。
マウス腫瘍細胞におけるＴＦ遺伝子の過剰発現により、ＶＥＧＦの増大および内因性の抗新脈管形成因子であるトロンボスポンジン（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）（ＴＳＰ）の転写の減少が、誘導される。免疫欠失マウス中で増殖させた場合、ＴＦ生産細胞は、新脈管形成をおよそ２倍、刺激する。一方、少しのＴＦを生産する細胞は、新脈管形成を阻害する。ＴＦのこの効果は、その血液凝固を促進する活性化したプロコアギュラント活性とは、独立している。ＴＦを過剰発現するようにトランスフェクトされたヒト黒色腫細胞は、ＴＦの発現量が低いヒト黒色腫細胞よりも大きな転移可能性を示した。ＴＦのこの転移促進効果には、ＴＦの細胞外ドメインおよびその細胞質ドメインのプロコアギュラント機能が必要である。このように、組織因子は、ＶＥＣ上で機能し得る増殖制御分子の生産を調節することで、腫瘍細胞の新脈管形成的特質を調節する。また、マウス胚およびヒト胚の両方で、血管の成長において、ＴＦの発現が重要な役割を果たす。ＴＦは、新脈管形成および脈管形成を調節するという２つの機能を有しているようである。
悪性のヒト乳癌およびヒト黒色腫は、高いレベルのＴＦおよびＶＥＧＦを発現する。ＴＦはまた、浸潤性の乳癌および肺の腺癌の腫瘍微小環境内の血管内皮細胞（ＶＥＣ）の表面上で発現している。ヒト乳癌細胞系とヒト黒色腫細胞系において、ＴＦの合成レベルとＶＥＧＦの合成レベルとの間には強い相関があり、ＴＦ特異的ｍＲＮＡおよびＶＥＧＦ特異的ｍＲＮＡは共局在（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）する。
癌細胞におけるＶＥＧＦ合成のシグナルは、プロテインキナーゼＣの基質であり得る２つのセリン残基を含むＴＦの細胞質テイルのセリン残基を介して、媒介される。癌細胞内でのＴＦおよびＶＥＧＦの発現は、低酸素状態の下でさらに増強され、そしてＴＦは成長因子レセプターとして機能し得る。第ＶＩＩａ因子は、ＰＫＣ依存性のリン酸化、マイトジェンにより活性化されるプロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路およびそれに続く転写因子ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１を介して、細胞のシグナル伝達を誘導し得る。
クルクミン（カレーに使用される黄色の香辛料であり、ウコンから得られる産物）は、転写因子であるＮＦ−κＢ、ＡＰ−１およびＥｇｒ−１を阻止することにより、腫瘍壊死因子およびホルボールエステルによって誘導されるＶＥＣ中でのＴＦの合成を阻害する。クルクミンはまた、ヒト黒色腫細胞系およびヒト前立腺癌細胞系でのＴＦおよびＶＥＧＦの合成、ならびにｂＦＧＦに誘導される新脈管形成を阻害し得る。
クルクミンをＴＦの特異的なリガンドである第ＶＩＩａ因子に結合させる一方で結合したＶＩＩａのＴＦに対する親和性を維持する方法が、必要とされている。
クルクミンおよびクルクミン誘導体（クルクミノイド（ｃｕｒｃｕｍｉｎｏｉｄ））を特定の標的、すなわち腫瘍微小環境中の腫瘍細胞および血管内皮細胞で異常に発現しているＴＦに送達する方法もまた、必要とされている。ＴＦの合成を阻害することによって、ＶＥＧＦの合成および腫瘍の新脈管形成を阻止する。そのために、クルクミノイドを活性部位が不活性化された第ＶＩＩａ因子（ＴＦの特異的なリガンド）に結合する一方で結合したＶＩＩａのＴＦに対する親和性を維持する方法もまた、必要とされている。
（発明の要旨）
本発明の１つの局面は、表面に結合した組織因子を有する癌細胞および血管内皮細胞に特異的に細胞傷害性化合物を送達し得る、タンパク質送達ビヒクルに連結された、細胞傷害性化合物（例えば、合成抗腫瘍クルクミンアナログ（クルクミノイド）および合成抗新脈管形成クルクミンアナログ）を含む、新規の組成物を提供する。本発明の新規の組成物は、テザーに共有結合によって連結されたクルクミノイドを含み得る。ここでこのテザーは、ジカルボン酸（例えば、スクシネート）であり得るが、これに限定はされない。このテザーは、そのＣ末端のアミノ酸がメチルケトンを含むペプチジルリンカー（例えば、フェニルアラニン―フェニルアラニン―アルギニン）のＮ末端のアミノ酸に共有結合される。メチルケトン基は、その結合体の構築物が、細胞膜上に発現する組織因子に選択的に結合するのを妨げない、第ＶＩＩａ因子（ｆＶＩＩａ）のアミノ酸側鎖と共有結合を形成する。好ましくは、クルクミノイド―テザー―リンカーは、ｆＶＩＩａのセリンプロテアーゼドメインのアミノ酸に結合し、それによって新規の治療的組成物の血液凝固を促進する活性が阻止される。本発明はまた、細胞傷害性化合物−タンパク質結合体の合成方法を提供する。本発明の組成物および方法は、薬剤を特定の標的細胞に送達することで、細胞傷害性薬剤の効力を増大させ得、その副作用を減少させ得る。クルクミンアナログの１つであるＥＦ２４（本発明において有用である）は、現在、臨床的に使用されている周知の抗癌薬剤である、シスプラチンよりも約１０倍、強力であった。本発明の結合体ＥＦ２４−ＦＦＲｃｋ−ｆＶＩＩａの構築物は、その細胞表面に組織因子を発現する癌細胞株および血管内皮細胞（例えば、ＨＵＶＥＣ）を殺す。結合体は、組織因子を発現しない正常細胞は殺さない。ｆＶＩＩａと結合していないＥＦ２４−ＦＦＲｃｋは、いかなる細胞とも結合できないために、細胞表面での組織因子の発現の有無に関係なく、癌細胞または正常細胞のいずれも殺さない。結合体化していない単独のＥＦ２４は、細胞表面上の組織因子の発現レベルに関係なく、無差別に正常細胞および癌細胞を殺す。
本発明の方法は、癌細胞に栄養を与える血管に薬物を送達し、それによって栄養素および酸素の供給をさえぎり、癌細胞を餓死させるために、特に有用である。本方法はまた、癌およびその転移性病巣のほとんどが、直接的な注入によって接近できないために、静脈注射によって薬剤または遺伝子を送達できないという、現在の癌の遺伝子治療の欠点を克服するために、有用である。
本発明の技術によって、標的細胞が表面に結合する組織因子を発現している場合、静脈注入、腹腔内注入、皮下的注入、および腫瘍内への注入によって、体内の任意の場所の腫瘍および転移性病巣の中の癌細胞、血管内皮細胞のみに治療的薬剤を送達し得る。本アナログはまた、ｆＶＩＩａに結合されて、ｆＶＩＩａの活性部位を不活性化する。その結果、このクルクミノイドと結合体化した不活性化ｆＶＩＩａは、抗癌薬剤としての機能に加えて、ネイティブのｆＶＩＩａと競合することで、血液凝固を阻害し得る。これは、癌患者にとっての治療的利点である。なぜなら、そのような患者は、血液循環中に逃げ出し、血液凝固を引き起こす組織因子を発現する癌細胞に起因して、血液凝固の問題を経験するためである。
本発明の組成物および方法は、抗新脈管形成治療（冠状動脈の再閉塞が挙げられるが、これに限定はされない）の標的化送達を必要とする、任意の疾患を処置するために有用である。再狭窄は、血管形成術の症例の５０％において発生し、心筋梗塞または狭心症を導く。血管形成術では、処置される血管の最も内側の層（血管内皮細胞）が、露出させられる。次いで、増殖し、しばしば冠状動脈を再び閉塞させる曝露された平滑筋層で、組織因子が発現する。そのため、本発明の方法は、組織因子を発現する血管平滑筋細胞に薬物を特異的に送達し、その細胞増殖を阻害するために有用である。
本発明の組成物および方法を使用して調節され得る、他の病的状態としては、糖尿病性網膜症が挙げられるが、これに限定はされない。この糖尿病性網膜症もまた、網膜における制御不能な血管（組織因子を発現する）の増殖を伴い、糖尿病患者の失明を導く。脳梗塞は、アテローム性動脈硬化および脈管炎（組織因子が発現されるようである）によって引き起こされる血液凝固によって生じる。慢性関節リウマチの初期病巣の血管もまた、組織因子を発現する。
そのため、本発明の１つの局面は、動物またはヒトの患者に投与するために、薬学的に受容可能なキャリア（添加物）および／あるいは希釈剤の１つ以上と共に、治療的有効量の細胞傷害性組成物−タンパク質結合体を含む、薬学的に受容可能な組成物を提供する。好ましい投与経路は、脈管内注射であり、クルクミノイドの効果的用量が、脈管系を介して腫瘍に送達され得る。効果的な治療的組成物の希釈を軽減するため、および組織因子を含む標的腫瘍および／または血管細胞に対する組成物のより速い適用を達成するために、皮下注射、腹腔内注射、腫瘍または腫瘍に栄養を与える近位の血管への直接的注射によって、この用量が送達され得る。増殖する腫瘍細胞および腫瘍の脈管形成に寄与する内皮細胞を選択的に標的化するため、および腫瘍細胞の転移を予防するために、ｆＶＩＩａキャリアポリペプチドの組織因子への親和性によって、治療的組成物の有効量を局在化する。
そのため、本発明の別の側面は、第ＶＩＩａ因子によってヒト細胞および動物細胞に送達されるクルクミン誘導体による、組織因子および血管内皮成長因子の調節である。本発明は、クルクミンおよびクルクミン誘導体を特定の標的（すなわち、腫瘍微小環境中の腫瘍細胞および血管内皮細胞で異常に発現する、組織因子）に送達するための、組成物および方法を提供する。組織因子の合成の阻害によって、ＶＥＧＦの合成および腫瘍の新脈管形成が阻止される。
（発明の詳細な説明）
言及が、ここで、本発明の現在好ましい実施形態に対して詳細になされる。種々の改変、組み合わせ、付加、削除およびバリエーションが、本発明の範囲または精神から逸脱することなしに、本発明においてなされ得ることが、当業者に明らかである。例えば、１つの実施形態の一部として例示または記載される特徴は、別の実施形態において使用されて、なおさらなる実施形態を生じ得る。本発明は、添付の特許請求の範囲およびその等価物の範囲内に入るような、このような改変、組み合わせ、付加、削除およびバリエーションをカバーすることが意図される。
本明細書を通じて、種々の刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、本発明が属する分野の技術水準をより完全に記載するために、本明細書中でその全体が参考として援用される。
簡便さのために、本明細書中、実施例および添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語を、ここに集める。
（定義）
本明細書中および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）」は、その文脈が明確にそうでないことを示さない限り、複数形の言及を含む。従って、例えば、「１つのキャリア（ａ ｃａｒｒｉｅｒ）」に対する言及は、２つ以上のキャリアの混合物を含む。
本明細書中で使用する場合、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、ペプチド結合を介して連結された、連続配列の３つ以上のアミノ酸のアミノ酸ポリマーをいう。用語「ポリペプチド」は、タンパク質、タンパク質フラグメント、タンパク質アナログ、オリゴペプチドなどを含む。用語「ポリペプチド」はまた、組換え技術によって産生されるか、適切な供給源から単離されるか、または合成される、核酸によってコードされた上記定義のようなポリペプチドを意図する。用語「ポリペプチド」はさらに、化学的に改変されたアミノ酸、または標識リガンドに共有結合もしくは非共有結合により連結されたアミノ酸を含む、上記定義のようなポリペプチドを意図する。
用語「短縮された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）」は、本明細書中で使用する場合、親ポリペプチドまたは親タンパク質よりもアミノ酸が少ないポリペプチドまたはタンパク質をいう。アミノ酸配列における差異は、親アミノ酸配列と比較して、アミノ酸配列の末端の一方もしくは両方であり得るか、またはその配列の内部から欠失されたアミノ酸に起因し得ることが意図される。
用語「リンカー」は、本明細書中で使用する場合、タンパク質のアミノ酸側鎖に細胞傷害性化合物を共有結合させ得る分子をいう。用語「リンカー」は、非ペプチジルリンカーまたはペプチジルリンカーであり得る。このリンカーは、このリンカーに細胞傷害性化合物を共有結合させるために、これに共有結合したテザー（以下に定義される）を、必要に応じて有し得る。用語「ペプチジルリンカー」は、本明細書中で使用する場合、少なくとも２つのアミノ酸を含み、かつタンパク質のアミノ酸側鎖に連結され得るペプチドをいう。このリンカーは、カルボキシ末端において、クロロメチルケトン（これに限定されない）のような反応性の基を有し得る。ペプチジルリンカーのペプチドは、細胞内に見出されるタンパク質分解酵素によって切断可能であり得る。
用語「テザー」は、本明細書中で使用される場合、加水分解可能な結合（例えば、限定しないが、カルバメート、アミド、エステル、カーボネートまたはスルホネート）、細胞傷害性化合物（例えば、限定しないが、クルクミノイド）との結合、およびペプチジルリンカーを含むリンカー（例えば、限定しないが、リンカーのＮ末端）にも共有結合し得る結合を形成し、それによって、このリンカーに細胞傷害性化合物を接続し得る分子をいう。本発明における使用に適切なテザーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ジカルボン酸、ジスルホン酸、ω−アミノカルボン酸、ω−アミノスルホン酸、ω−アミノカルボキシスルホン酸またはこれらの誘導体。ここで、このテザーは、任意の配置（例えば、直鎖状、分枝鎖または環状の配置）で２〜６個の炭素を含み得、そしてこのテザーは、加水分解可能な結合を形成し得る。
用語「細胞傷害性化合物」は、本明細書中で使用する場合、標的細胞の内部または細胞表面のいずれかに対して、細胞に送達された場合に、その細胞を殺傷し得るか、またはそうではなしに標的細胞の増殖を阻害し得る化合物をいう。細胞傷害性化合物は、アミド結合もしくはエステル結合を形成し得るか、またはそうではなしにテザーもしくはペプチジルリンカーに共有結合され得、それによって、細胞の表面マーカーに選択的に結合し得るタンパク質に接続される、任意のこのような分子であり得る。
用語「細胞表面抗原」および「細胞表面マーカー」は、本明細書中で使用する場合、細胞の表面上の任意の抗原性構造であり得る。細胞表面抗原としては、以下が挙げられ得るが、これらに限定されない：腫瘍関連抗原、増殖因子レセプター、ウイルスによりコードされる表面発現抗原、癌遺伝子産物によってコードされる抗原、表面エピトープ、従来のまたは非典型的な多剤耐性を媒介する膜タンパク質、腫瘍形成性表現型を媒介する抗原、転移性表現型を媒介する抗原、腫瘍形成性表現型を抑制する抗原、転移性表現型を抑制する抗原、Ｔ細胞のような特異的な免疫学的エフェクター細胞により認識される抗原、およびマクロファージ細胞またはナチュラルキラー細胞のような非特異的な免疫学的エフェクター細胞により認識される抗原。本発明の範囲内の「細胞表面抗原」の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＤ５、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤｗ６５、ＣＤ９０（Ｔｈｙ−１）抗原、ＣＤ１１７、ＣＤ３８およびＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３４＋細胞のサブセットを規定するＡＣ１３３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ３３ならびにＨＬＡ−ＤＲ。リガンドまたは標識された分子に選択的に結合することによって、フローサイトメトリー、ＦＲＩＭ、蛍光顕微鏡および免疫組織化学のような方法（これらに限定されない）によって検出され得る、細胞表面分子（炭化水素、タンパク質、リポタンパク質もしくは任意の他の分子またはこれらの組み合わせを含む）もまた、本発明の範囲内であることが意図される。
用語「組織因子」は、本明細書中で使用する場合、凝固因子ＶＩＩ（およびその活性化形態である第ＶＩＩａ因子（ｆＶＩＩａ））に対する膜貫通タンパク質レセプターをいい、血液凝固の主要な調節因子である。
用語「ｆＶＩＩ」は、配列番号１のアミノ酸配列またはその短縮形態もしくは改変形態を有し得る、「一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ）」凝固因子ＶＩＩを意味する。
用語「第ＶＩＩａ因子」または「ｆＶＩＩａ」は、Ａｒｇｌ５２−Ｉｌｅｌ５３ペプチド結合における特異的切断によって切断された、「二本鎖（ｔｗｏ ｃｈａｉｎ）」活性化凝固因子ＶＩＩを意味する。未切断の第ＶＩＩ因子は、図１に示されるような連続配列を有する。第ＶＩＩａ因子は、血液から精製され得るか、または組換え手段によって産生され得る。本明細書中に記載される方法の実施は、精製された第ＶＩＩａ因子がどのように誘導されるかと無関係であることが明らかであり、従って、本発明は、本明細書中で使用するのに適切な任意の第ＶＩＩａ因子調製物の使用をカバーすることが意図される。ポリペプチドへのリンカーの共有結合は、１５２〜１５３アミノ酸位置の間で引き続いて切断される未切断の第ＶＩＩ因子であり得るか、または切断されたｆＶＩＩａであり得ることが、予測される。
用語「脈管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）インヒビター」は、本明細書中で使用する場合、動物またはヒトに対して有効用量で投与された場合に、血管内皮細胞の増殖を阻害または低減し、それによって新生の毛細血管の形成を低減する、化合物または組成物をいう。
脈管形成インヒビターは、少なくとも２つのクラスに分割され得る。第一のクラスは、直接的脈管形成インヒビターであり、これには、内皮細胞に対して比較的特異的であり、かつ腫瘍細胞に対してほとんど影響のない因子が挙げられる。これらの例としては、可溶性血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプターアンタゴニストおよびアンギオスタチンがあげられる。
間接的インヒビターは、内皮細胞に対して直接的な影響を有さなくてもよいが、脈管形成刺激因子（例えば、ＶＥＧＦ）の産生をダウンレギュレートし得る（Ａｒｂｉｓｅｒら、Ｍｏｌｅｃ．Ｍｅｄ．４：３７６−３８３（１９９８））。ＶＥＧＦは、化学的に誘導された皮膚の発癌の間にアップレギュレートされることが示されている；これは、おそらく、Ｈ−ｒａｓのような癌遺伝子の活性化に起因する（Ａｒｂｉｓｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：８６１−８６６（１９９７））；（Ｌａｒｃｈｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：５３９１−５３９６（１９９６））；（Ｋｏｈｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１：７９２−７９７（１９９５））。脈管形成の間接的インヒビターの例としては、ｒａｓ媒介性シグナル伝達のインヒビター（例えば、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター）が挙げられる。
内皮細胞増殖の直接的阻害は、細胞培養系においてアッセイされ得、ここで、脈管形成の複雑なプロセスを制御する特定の因子の影響が、研究され得る。このようなインビトロの系において発見された影響は、次いで、例えば、Ｋｅｎｙｏｎら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．３７：１６２５−１６３２（１９９６）によって記載されるようなインビボの系において研究され得る。
用語「クルクミン（ジフェルロイルメタン（ｄｉｆｅｒｕｌｏｙｌｍｅｔｈａｎｅ））」およびその特定のアナログ（共に、本明細書中で使用する場合、「クルクミノイド」と称する）は、ヒトを含む哺乳動物による摂取およびそれらへの投与について安全であると認識される、周知の天然産物をいう（Ｂｉｌｌｅら、Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２３：９６７−９７１（１９８５））。用語「クルクミノイド」はまた、本明細書中で使用する場合、合成のクルクミン誘導体をいうが、ＰＣＴ出願番号ＷＯ０１／４０１８８（これは、本明細書中でその全体が参考として援用される）において開示されたものに限定されない。
クルクミンは、スパイスであるターメリックの供給源のＣｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａの根茎において見出された黄色色素である。ターメリックは、数百年にわたってインド亜大陸の食事の主要な成分であり、クルクミンの一日平均消費量は、報告された有害な影響を伴わずに、ある個体については、０．６グラムまでの範囲であることが見出されている。食品等級のクルクミンは、以下の相対量の、３種のクルクミノイドからなる：７７％のクルクミン、１７％のデメトキシクルクミンおよび３％のビスデメトキシクルクミン。
完全に飽和した誘導体であるテトラヒドロクルクミンもまた、用語クルクミノイドに含まれる。クルクミンは、多数の供給業者（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．を含む）から入手され得る。クルクミンアナログであるデメトキシクルクミン、ビスデメトキシクルクミンおよびテトラヒドロクルクミンもまた、多数の供給業者から入手され得るか、または当業者によってクルクミンから容易に調製され得る。
クルクミンは、数百年にわたって、インド固有の医学において、健康を促進し、そして消化障害および他の障害を処置するための経口投与に加えて、捻挫および炎症状態についての局所的薬剤として使用されてきた。摂取または経口投与されたクルクミンの吸収は、限定的であることが公知であり、そして吸収されたクルクミンは、迅速に代謝される（Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊａｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ Ｎｕｔｒ．１２：１９９−３０１（１９８０）；Ｒａｏら、Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．７５：５７４−５７８（１９８２））。
クルクミノイドの摂取または経口投与の多数の効果が、制御された研究、集団研究、症例報告および逸話による情報に基づいて、報告されている。経口投与されたクルクミンの化学予防活性の証拠は、癌の予防に関する、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって助成された臨床試験を導いた（Ｋｅｌｌｏｆｆら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．２６：１−２８（１９９６））。皮膚および結腸が化学発癌物質で処理されたマウスへのクルクミンの経口投与は、コントロールマウスと比較して、誘導された腫瘍の発生率およびサイズの減少を生じることが示されている（Ｈｕａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：５８４１−５８４７（１９９４）；Ｈｕａｎｇら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １６：２４９３−２４９７（１９９５）；Ｈｕａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．６４：１１７−１２１；Ｒａｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：２５９−２６６（１９９５）；Ｃｏｎｎｅｙら、Ａｄｖ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ．３１：３８５−３９６（１９９１））。
Ｈｕａｎｇらは、３種のクルクミノイド化合物（クルクミン、デメトキシクルクミンおよびビスデメトキシクルクミン）の経口投与が、ホルボールエステルによって刺激されるオルニチンデカルボキシラーゼの誘導、および７，１２−ジメチルベンズアントラセン（ＤＭＢＡ）で開始されたマウス皮膚の促進を阻害し得ることを見出した。これらの化合物はまた、ホルボールエステルによって媒介されるＪＢ６細胞の形質転換を阻害した。飽和誘導体テトラヒドロクルクミンは、これらのアッセイにおいて、不飽和アナログよりも活性が低かった（Ｈｕａｎｇら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １６：２４９３−２４９７（１９９５））。
クルクミンの化学予防活性の機構は、正確に理解されていなかったが、クルクミンは、抗酸化剤と認識されており、Ａｍｅｓ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ試験において抗変異誘発活性を示し、そしてポリフェノール（緑茶において見出された化学予防因子）と類似の生化学的効果を生じることが公知であった（Ｓｔｏｎｅｒ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．２２：１６９−１８０（１９９５））。クルクミンは、いくつかのシグナル伝達経路（プロテインキナーゼ、転写因子ＮＦ−κＢ、ホスファターゼＡ２生体活性、アラキドン酸代謝、抗酸化活性、および上皮増殖因子（ＥＧＦ）レセプターの自己リン酸化が関与するものを含む）を阻害することが実証されている（Ｌｕら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １５：２３６３−２３７０（１９９４）；Ｓｉｎｇｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２４９９５−２５０００（１９９５）；Ｈｕａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：５２９２−５２９６（１９９１）；Ｋｏｒｕｔｌａら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １６：１７４１−１７４５（１９９５）；Ｒａｏら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １４：２２１９−２２２５（１９９３））。
脈管形成を調節するかまたは脈管形成をもたらす因子の複雑性、ならびにそれらの組織間での、および状況に従った特定のバリエーションに起因して、特定の因子に対する応答は、異なる組織において、異なる生理学的もしくは病理学的条件下で、そしてインビトロおよびインビボの条件において、異なるかまたは反対であり得る。例えば、米国特許第５，４０１，５０４号（Ｄａｓら）は、ヒトを含む動物へのターメリックの経口投与または局所投与が、創傷治癒を促進し、そして脈管形成の刺激を介して一部作用することを仮定するが、この仮定は、実験的に確認されていなかった。クルクミンの投与は、インビトロで平滑筋細胞の増殖を阻害することが報告されている（Ｈｕａｎｇら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃ．２２１：３８１−３８４（１９９２））。米国特許第５，８９１，９２４号（Ａｇｇａｒｗａｌ）は、動物へのクルクミンの経口投与が、転写因子ＮＦ−κＢの活性化を阻害することを開示しており、そして病態生理学的状態、特に免疫系が関与する特定の状態におけるその使用を特許請求している。クルクミンのいくつかの生化学的作用は、詳細に研究されたが、クルクミンのこれらの効果を説明する単一の作用は、報告されていない。Ｓｉｎｇｈらは、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．１０７：１０９−１１５（１９９６）において、クルクミンが、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のインビトロでの増殖を阻害することを報告しており、そしてクルクミンが、抗脈管形成活性を有し得ることを示唆した。しかし、この阻害は、内皮細胞の増殖の塩基性繊維芽細胞増殖因子刺激とは無関係であり、インビボの研究は報告されていなかった。毛細脈管新生のモデルにおける、ＨＵＶＥＣ増殖およびマトリゲル上での管構造の形成の、クルクミンによる阻害は、ＨＵＶＥＣのメタロプロテイナーゼの調節に帰されている（Ｔｈａｌｏｏｒら、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．９：３０５−３１２（１９９８））。
用語「プロドラッグ」は、生理学的条件下で、薬学的に活性なクルクミノイドに転換し得る本発明の化合物を包含することが意図される。プロドラッグを作製するための通常の方法は、生理学的条件下で加水分解されて所望の生物学的の活性な薬物を提供する部分を選択することである。他の実施形態において、プロドラッグは、レシピエントの動物または細胞の酵素活性によって転換され得る。
用語「メチルケトン」および「クロロメチルケトン」とは、本明細書中において使用される場合、ペプチドリンカーとレシピエントポリペプチドのアミノ酸側鎖との間で共有結合を形成し得る、カルボキシ末端反応性部分をいう。連結反応の間、クロロ基が除去される。従って、連結していないペプチドリンカーは、クロロメチルケトン部分を有し、そして共有結合したペプチドは、ハロゲン元素を含まないメチルケトン部分を有する。
用語「脂肪族基」とは、本明細書中において使用される場合、直鎖、分枝鎖、または環式の脂肪族炭化水素基をいい、そして飽和または不飽和の脂肪族基（例えば、アルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基）が挙げられる。
用語「アルキル」とは、本明細書中において使用される場合、飽和脂肪族基のラジカルをいい、直鎖アルキル基、分枝鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換されたシクロアルキル基、およびシクロアルキル置換されたアルキル基が挙げられる。好ましい実施形態において、直鎖または分枝鎖のアルキルは、その骨格中に、３０個以下の炭素原子（例えば、直鎖についてはＣ１〜Ｃ３０、分枝鎖についてはＣ３〜Ｃ３０）、そしてより好ましくは、２０個以下の炭素原子を有する。同様に、好ましいシクロアルキルは、その環構造中に、３〜１０個の炭素原子、そしてより好ましくは、その環構造中に、５個、６個、または７個の炭素原子を有する。さらに、用語「アルキル」（または「低級アルキル」）とは、本明細書、実施例、および特許請求の範囲全体にわたって使用される場合、「非置換アルキル」と「置換アルキル」との両方を包含することが意図され、これらの後者は、炭化水素骨格の１つ以上の炭素を水素に置き換えている置換基を有するアルキル部分をいう。このような置換基としては、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル（例えば、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、またはアシル）、チオカルボニル（例えば、チオエステル、チオアセテート、またはチオホルメート）、アルコキシル、ホスホリル、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、スルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ヘテロシクリル、アラルキル、または芳香族部分もしくはヘテロ芳香族部分が挙げられ得る。炭化水素鎖上で置換される部分は、適切である場合、それら自体が置換され得ることが、当業者によって理解される。例えば、置換されたアルキル置換基としては、アミノ基、アジド基、イミノ基、アミド基、ホスホリル（ホスホネートおよびホスフィネートが挙げられる）基、スルホニル（スルフェート、スルホンアミド、スルファモイルおよびスルホネートが挙げられる）基、およびシリル基、ならびにエーテル、アルキルチオ、カルボニル（ケトン、アルデヒド、カルボキシレート、およびエステルが挙げられる）、−ＣＦ３、−ＣＮなどが挙げられ得る。例示的な置換されたアルキルは、以下に記載される。シクロアルキルは、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、カルボニル置換アルキル、−ＣＦ３、−ＣＮなどの置換および非置換の形態でさらに置換され得る。
用語「アラルキル」とは、本明細書中において使用される場合、アリール基（例えば、芳香族基またはヘテロ芳香族基）で置換されたアルキル基をいう。
用語「アルケニル」および「アルキニル」とは、上記アルキルと長さが類似であり、そして上記アルキルに対する可能な置換であるが、それぞれ少なくとも１つの二重結合または三重結合を含む、不飽和脂肪族基をいう。
炭素の数が他に特定されない限り、「低級アルキル」とは、本明細書中において使用される場合、上記のようなアルキルであるが、１〜１０個の炭素、より好ましくは、１〜６個の炭素原子を、その骨格構造中に有する、アルキル基を意味する。同様に、「低級アルケニル」および「低級アルキニル」は、類似の鎖長を有する。本願全体にわたって、好ましいアルキル基は、低級アルキルである。好ましい実施形態において、本明細書中でアルキルとして指定される置換基は、低級アルキルである。
用語「アリール」とは、本明細書中において使用される場合、０〜４個のヘテロ原子を含み得る、５員環、６員環、および７員環の、単環芳香族基（例えば、ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジンおよびピリミジンなど）を含む。環構造中にヘテロ原子を含むアリール基はまた、「アリール複素環」または「ヘテロ芳香族」と称され得る。用語「アリール」とは、置換芳香族環と非置換芳香族環との両方をいう。芳香族環は、１つ以上の環位置で、上記のような置換基（例えば、ハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族部分もしくはヘテロ芳香族部分、−ＣＦ３、−ＣＮなど）で置換され得る。用語「アリール」はまた、２つ以上の炭素が２つの隣接する環に共通である（これらの環が「縮合環」である）２つ以上の環式環を有し、これらの環のうちの少なくとも１つが芳香族であり、例えば、他の環式環は、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、および／またはヘテロシクリルであり得る、多環式環系を包含する。
用語オルト、メタおよびパラは、それぞれ１，２−二置換ベンゼン、１，３−二置換ベンゼン、および１，４−二置換ベンゼンに対して適用される。例えば、名称１，２−ジメチルベンゼンとオルト−ジメチルベンゼンとは、同義である。
用語「ヘテロシクリル」または「複素環」とは、環構造が１〜４個のヘテロ原子を含む、４員環〜１０員環の構造、より好ましくは、３員環〜７員環をいう。複素環もまた、多環であり得る。ヘテロシクリル基としては、例えば、チオフェン、チアントレン、フラン、ピラン、イソベンゾフラン、クロメン、キサンテン、フェノキサチン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、キノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、フェナジン、フェナルサジン、フェノチアジン、フラザン、フェノキサジン、ピロリジン、オキソラン、チオラン、オキサゾール、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ラクトン、ラクタム（例えば、アゼチジノンおよびピロリジノン）、スルタム、スルトンなどが挙げられる。複素環式環は、１つ以上の位置で、上記のような、例えば、ハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族部分またはヘテロ芳香族部分、−ＣＦ３、−ＣＮなどのような置換基で置換され得る。
用語「ポリシクリル」または「多環式基」とは、２つ以上の炭素が２つの隣接する環に共通である（例えば、これらの環が「縮合環」である）２つ以上の環（例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、および／またはヘテロシクリル）をいう。隣接していない原子を介して接合している環は、「有橋」環と称される。多環の環の各々は、上記のような置換基（例えば、ハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エーテル、ヘテロシクリル、芳香族部分もしくはヘテロ芳香族部分、−ＣＦ３、−ＣＮなど）で置換され得る。
用語「炭素環」とは、本明細書中において使用される場合、環の各原子が炭素である、芳香族環または非芳香族環をいう。
語句「縮合環」は、当該分野で認識されており、そしてその環構造中に４〜８個の原子を含み得、そしてまた、置換または非置換であり得（例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、または複素環式環）、１対の炭素原子を別の環と共有している、環式部分をいう。説明のために、縮合環系は、イソベンゾフランおよびイソベンゾフラノンであり得る。
本明細書中において使用される場合、用語「ニトロ」とは、−ＮＯ２を意味する；用語「ハロゲン」とは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉを表す；用語「スルフヒドリル」とは、−ＳＨを意味する；用語「ヒドロキシル」とは、−ＯＨを意味する；そして用語「スルホニル」とは、−ＳＯ２−を意味する。
用語「アミン」および「アミノ」は、当該分野において認識されており、そして非置換アミンと置換アミンとの両方をいう。用語「アルキルアミン」とは、本明細書中において使用される場合、置換アルキルまたは非置換アルキルが付着した、上で定義されるようなアミン基を意味する。
用語「アミド」は、アミノ置換カルボニルとして当該分野において認識されている。
用語「アルキルチオ」とは、硫黄ラジカルが付着した、上で定義されたようなアルキル基をいう。好ましい実施形態において、「アルキルチオ」部分は、−Ｓ−アルキル、−Ｓ−アルケニル、−Ｓ−アルキニル、および−Ｓ−（ＣＨ２）ｍのうちの１つによって表される。代表的なアルキルチオ基としては、メチルチオ、エチルチオなどが挙げられる。
用語「アルコキシル」または「アルコキシ」とは、本明細書中において使用される場合、酸素ラジカルが付着した、上で定義されたようなアルキル基をいう。代表的なアルコキシル基としては、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシなどが挙げられる。「エーテル」とは、酸素によって共有結合された２つの炭化水素である。従って、アルキルをエーテルにするアルキルの置換基は、アルコキシであるか、またはアルコキシルに類似し、例えば、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アルケニル、−Ｏ−アルキニル、−Ｏ−（ＣＨ２）ｍの１つによって表され得る。
類似の置換が、アルケニル基およびアルキニル基に対してなされて、例えば、アミノアルケニル、アミノアルキニル、アミドアルケニル、アミドアルキニル、イミノアルケニル、イミノアルキニル、チオアルケニル、チオアルキニル、カルボニル置換アルケニルまたはカルボニル置換アルキニルを生じ得る。
本明細書中において使用される場合、各表現の定義（例えば、アルキル、ｍ、ｎなど）は、任意の構造において１回より多く出現する場合、同じ構造の他の位置のその定義とは独立していることが意図される。
本発明の特定の化合物は、特定の幾何学的形態または立体異性形態で存在し得る。本発明は、全てのこのような化合物を包含し、シス−異性体およびトランス−異性体、Ｒ−エナンチオマーおよびＳ−エナンチオマー、ジアステレオマー、（Ｄ）−異性体、（Ｌ）−異性体、これらのラセミ混合物、およびこれらの他の混合物を含み、本発明の範囲内に入る。さらなる不斉炭素原子が、置換基中に存在し得る（例えば、アルキル基または他の立体中心）。全てのこのような異性体、およびこれらの混合物は、本発明に包含されることが意図される。同様に、特定の化合物は、全体的な分子の非対称性を示し得、立体中心を有さずに、立体異性体を導く。
例えば、本発明の化合物の特定のエナンチオマーが所望である場合、これは、不斉合成によって、またはキラル添加剤での誘導体化によって調製され得、ここで、得られるジアステレオマー混合物は、分離され、そして添加剤基は切断されて、純粋な所望のエナンチオマーを提供する。あるいは、分子が塩基性官能基（例えば、アミノ）または酸性官能基（例えば、カルボキシル）を含む場合、ジアステレオマー塩が、適切な光学活性酸または塩基を用いて形成され得、引き続いて、このように形成されたジアステレオマーが、当該分野において周知の分別結晶化またはクロマトグラフィー手段によって分解される。
用語「抗体」とは、本明細書中において使用される場合、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびにこれらのフラグメント、ならびに組織因子の領域に選択的に結合し得る免疫学的結合等価物をいう。用語「抗体」とは、均一な分子実体、または複数の異なる分子実態から構成されるポリクローナル血清産物のような混合物をいい、そしてエピトープを特異的に結合する能力を維持する、それらの任意の改変または誘導体化された改変体を、さらに包含し得る。モノクローナル抗体は、標的抗原またはエピトープに選択的に結合し得る。
語句「治療有効量」とは、本明細書中において使用される場合、ポリペプチド（例えば、限定されないが、ｆＶＩＩａ）に、本発明によるテザーおよびリンカーによって結合したクルクミノイドを含み、そして癌または他の病理（脈管形成を含む）に対して何らかの所望の治療効果を提供するために効果的である、化合物、物質、または組成物の量を意味する。
語句「薬学的に受容可能」とは、妥当な医学的判断の範囲内で、過剰の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症なしで、合理的な利益／危険比と釣り合って、人間および動物の組織と接触して使用するために適切な、化合物、物質、組成物、および／または投薬形態をいうように本明細書中において使用される。
語句「薬学的に受容可能なキャリア」とは、本明細書中において使用される場合、目的のクルクミノイド−ＦＦＲｃｋ−ｆＶＩＩａ薬剤を、１つの器官（または身体の一部）から、別の器官（または身体の一部）へと運ぶかまたは輸送することに関与する、薬学的に受容可能な物質、組成物またはビヒクル（例えば、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料（例えば、リポソーム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧ化リポソーム、ナノ粒子（ｎｏｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）など））を意味する。各キャリアは、処方物中の他の成分と適合性であり、そして患者に対して損傷的でないという意味で、「受容可能」でなければならない。薬学的に受容可能なキャリアとして働き得る物質のいくつかの例としては、以下が挙げられる：（１）糖（例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース）；（２）デンプン（例えば、コーンスターチおよびジャガイモデンプン）；（３）セルロースおよびその誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース）；（４）粉末化トラガカント；（５）モルト；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤（例えば、ココアバターおよび坐剤ワックス）；（９）油（例えば、落花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油）；（１０）グリコール（例えば、フロピレングリコール）；（１１）ポリオール（例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール）；（１２）エステル（例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル）；（１３）寒天；（１４）緩衝剤（例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム）；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質を含まない水；（１７）等張性生理食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝液；ならびに（２１）薬学的処方物において使用される他の非毒性適合性物質。
語句「非経口投与」および「非経口投与される」とは、本明細書中において使用される場合、腸内投与および局所投与以外の投与様式を意味し、通常、注射により、例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管（ｔｒａｎｓｔｒａｃｈｅａｌ）、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、髄腔内および胸骨下の注射および注入が挙げられるが、これらに限定されない
語句「全身投与」、「全身投与される」、「末梢投与」および「末梢投与される」とは、本明細書中において使用される場合、化合物、薬物または他の材料の、中枢神経系に直接的以外での投与を意味する。例えば、これは、患者の系に入り、従って、代謝および他の類似のプロセス（例えば、皮下投与）に供される。
（略語）：組織因子、ＴＦ；脈管内皮細胞、ＶＥＣ；脈管内皮細胞増殖因子、ＶＥＧＦ；フェニルアラニン−フェニルアラニン−アルギニル−（クロロ）−メリルケトン、ＦＦＲ−ｃｋ；第ＶＩＩ（ａ）因子、ｆＶＩＩ（ａ）；活性部位−不活性化ｆＶＩＩａ、ｆＶＩＩａ−ｉ；組織因子経路インヒビター、ＴＦＰＩ。
（クルクミノイド−第ＶＩＩａ因子結合体）
本発明の１つの局面は、細胞表面マーカーに選択的に結合し得るタンパク質に共有結合される細胞傷害性化合物、およびこのタンパク質に化合物を結合するための少なくとも１つのリンカーを含む組成物である。本発明の組成物はまた、単独でまたはリンカーとともに、タンパク質に細胞傷害性化合物を結合するように働き得る、テザー分子を含み得る。
従って、本発明は、テザーおよびリンカーによってポリペプチドに共有結合されるクルクミノイドを含む組成物を提供する。このポリペプチドは、標的細胞（例えば、脈管内皮細胞）の細胞表面膜の一体化成分である細胞表面マーカーの領域（好ましくは、細胞外領域）に選択的に結合し得る。本発明の種々の組成物において、クルクミノイドは、テザーに共有結合され得、このテザーは、好ましくは、ジカルボン酸またはカプロイル部分から選択されるが、これらに限定されない。例示的なテザーは、以下の実施例２に記載されるように、無水コハク酸の付加によってクルクミノイドに結合され得るスクシネートである。しかし、任意の適切な治療化合物（クルクミンアナログ、抗癌剤または心血管剤を含むが、これらに限定されない）が、本発明の方法によってリンカーおよびタンパク質に結合体化され、それによって、その薬剤または薬物の必要とされる有効用量を減少し、そして望ましくない副作用を減少すること（結合体化された治療剤を表面に露出されたマーカー（例えば、因子）を有する選択された標的細胞に向けることによる）は、本発明の範囲内であることが考えられる。
本発明の組成物において使用するための適切なポリペプチドは、細胞表面マーカー（例えば、表面結合組織因子の細胞外領域）に選択的に結合し得、そしてそのように結合した場合、標的細胞によって内在化し得る任意のポリペプチドであり得る。適切なポリペプチドとしては、第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子（ｆＶＩＩａ）、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）または組織因子などに特異的に結合し得る抗体が挙げられるが、これらに限定されない。適切なポリペプチドが、図１に示されるアミノ酸配列番号１由来のｆＶＩＩａの成分ポリペプチドであることが本発明の範囲内であることが意図され、ここで、リンカーに結合体化する前に、ポリペプチドが、非切断配列番号１であり得るか、またはアミノ酸位置１５２〜１５３の間で切断されて、その結果、リンカーを受容する成分ポリペプチドは、配列番号１の位置１と１５２との間、１５３〜４０６、またはその誘導体のアミノ酸配列を含み得る。リンカーが非結合アミノ酸配列に結合体化される場合、ポリペプチドは、ｆＶＩＩａジペプチドに切断され得ることが企図される。
本発明における使用のための好ましいポリペプチドは、図１に示されるように、アミノ酸位置１５２と１５３の位置で切断された、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも８０％の類似性を有するｆＶＩＩａまたはその短縮誘導体もしくは改変体である。ｆＶＩＩａが任意の種（ヒトｆＶＩＩを含む）由来であることは、本発明の範囲内であることが意図される。本発明における使用のためのｆＶＩＩａポリペプチドは、当業者に周知の方法（配列番号１の全てまたは一部をコードするクローン化された核酸の改変を含む）によって、またはｆＶＩＩａポリペプチドのタンパク質分解切断などによって、配列改変体を含むように短縮され得る。任意の短縮またはアミノ酸置換は、改変ｆＶＩＩａおよび／または改変ＴＦＰＩが、組織因子に選択的に結合し、標的細胞によって内在化し、そしてクロロメチルケトン基をその上に有するリンカー分子と共有結合を形成し得る能力を保持する。
本発明の組成物はさらに、リンカーを含む。本発明における使用に適切な１つのリンカーは、ポリペプチド（最も好ましくは、ｆＶＩＩａのセリンプロテアーゼドメインの触媒性三連内のアミノ酸の側鎖）に共有結合されたペプチジルメチルケトンリンカーである。ヒト第ＶＩＩ因子タンパク質およびウシ第ＶＩＩ因子タンパク質において、触媒性「三連」を形成するアミノ酸は、Ｓｅｒ３４４、Ａｓｐ２４２、およびＨｉｓ１９３であり、番号付けは、配列番号１の配列内の位置を示す。他の哺乳動物種由来の第ＶＩＩ因子の触媒性部位は、現在利用可能な技術（とりわけ、タンパク質単離およびアミノ酸配列分析を含む）を使用して決定され得る。触媒性部位はまた、配列を他のセリンプロテアーゼの配列（特にキモトリプシン（この活性部位は、Ｓｉｇｌｅｒら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３５：１４３−１６４（１９６８）（これは、本明細書中において参考として援用される）によって決定されている））と整列し、それから、類似の活性部位残基をこのアライメントから決定することによって決定され得る。このドメインへのペプチジルリンカーの結合は、セリンプロテアーゼ活性を不活性化し、それによって組成物の能力（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を減少させ、動物に投与された場合、血液凝固を誘導する。本発明の１つの好ましい実施形態において、少なくとも１つのリンカーは、配列番号１のＨｉｓ１９８位に共有結合される。
本発明における使用に適切なペプチジルリンカーは、ポリペプチドに結合される前に、以下の実施例３に記載されるように、ポリペプチドの適切なアミノ酸側鎖と反応し得るカルボキシ末端クロロメチルケトン基を有する。好ましくは、必ずしもではないが、クロロメチルケトン基をその上に有するカルボキシ末端アミノ酸は、アルギニンである。任意のペプチジル鎖配列または長さが本発明の組成物で使用され得るが、適切なペプチドは、トリペプチドである。好ましいペプチジルリンカーとしては、チロシン−グリシン−アルギニン−クロロメチルケトン（ＹＧＲ−ｃｋ）；フェニルアラニン−フェニルアラニン−アルギニン−クロロメチルケトン（ＦＦＲ−ｃｋ）、グルタミン−グリシン−アルギニン−クロロメチルケトン（ＱＧＲ−ｃｋ）、グルタミン−グリシン−アルギニン−クロロメチルケトン（ＥＧＲ−ｃｋ）などが挙げられるが、これらに限定されない。最も好ましいリンカーは、ＦＦＲ−ｃｋである。クルクミノイドＥＦ２４−テザー−ＦＦＲｃｋのｆＶＩＩａへの結合の化学量論は、以下の実施例４に与えられる。
クロロメチルケトン基をレシピエントのポリペプチドに共有結合させる際、クロロ部分は、置換されることが当業者によって理解される。従って、例えば、用語「ＦＦＲ−ｃｋ−ＶＩＩａ」とは、ｆＶＩＩａに結合し、それに結合したクロロ原子を有さない、ＦＦＲ−メチルケトントリペプチジルリンカーをいう。
いかなる１つの理論によって束縛されることは望まないが、複合体（フェニルアラニル−フェニルアラニル−アルギニル−ｃｋ−ＶＩＩａ（ＦＦＲ−ｃｋ−ＶＩＩＡ）および癌細胞の形質膜上に発現する組織因子（ＴＦ）から形成される）は、リガンド−レセプター媒介エンドサイトーシスによって、ＦＦＲ−ｃｋ−ＶＩＩａ濃度依存性様式で内在化され得る。リガンド−レセプター複合体は、初期および後期にエンドソームにエンドサイトーシスされ、リソソームベシクルに送達され、そしてリソソーム酵素によって分解される。
本出願の組成物においてリンカーペプチドとしての使用のために選択されるペプチドはまた、標的細胞酵素の細胞内加水分解活性による切断に適切である。そのように切断される場合、エンドサイトーシス内在化の後、リンカーに結合されたクルクミノイドは、ポリペプチド（例えば、ｆＶＩＩａ）から放出され得る。次いで、放出されたクルクミノイドは、標的細胞の生理学的機能を調節し得る。
９０個より多くの新規なクルクミンアナログ（全ての化合物について特許が係属している）は、ＰＣＴ出願番号ＷＯ ０１，４０１８８（その全体が、本明細書中において参考として援用される）に記載されるように合成されている。これらの化合物のいくつかは、癌細胞ＶＥＧＦ産生を抑制するが、クルクミンが細胞傷害性である濃度で、癌細胞または内皮細胞のいずれに対しても細胞傷害性でない。
本発明の組成物における使用のために特に適切なクルクミノイドは、３，５−ビス−（２−フルオロベンジリデン）−ピペリジン−４−オン（ＥＦ２４は、式：
Figure 2005529080
 を有する）またはその塩である。
任意のクルクミノイド（例えば、その全体が、本明細書中において参考として援用されるＰＣＴ出願番号０１／４０１８８に開示されるクルクミノイド）は、例えば、以下の実施例２に記載されるような反応によってカルボキシルテザーまたはポリカプロイルテザーに結合し得る場合、本発明の組成物で使用され得ることが企図される。クルクミノイドを合成するための方法はまた、ＰＣＴ出願番号０１／４０１８８に完全に開示される。
従って、本発明の組成物の１つの実施形態は、タンパク質（このタンパク質が標的細胞の表面マーカーに選択的に結合する）、このタンパク質に共有結合される少なくとも１つのリンカー、および加水分解可能結合によってリンカーに結合される細胞傷害性化合物を含む。
本発明の組成物の１つの実施形態において、タンパク質は、標的細胞の表面上の組織因子に選択的に結合する。
本発明の組成物の別の実施形態において、タンパク質は、第ＶＩＩａ因子の成分ポリペプチドである。
本発明の組成物のなお別の実施形態において、タンパク質は、第ＶＩＩａ因子の成分ポリペプチドであり、そしてこのポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸位置１５３と４０６との間のアミノ酸配列あるいはその短縮改変体または改変された改変体を含む。
本発明の組成物の１つの実施形態において、タンパク質は、抗体および組織因子経路インヒビターから選択される。
本発明の組成物の種々の実施形態において、タンパク質は、標的細胞によって内在化され得る。
本発明の組成物の他の実施形態において、少なくとも１つのリンカーは、ペプチジルリンカーである。
本発明の組成物の種々の実施形態において、少なくとも１つのペプチジルリンカーが、ペプチジルメチルケトンリンカーである。
本発明の組成物の実施形態において、組成物はさらに、テザーを含み得る。
本発明の組成物の１つの実施形態において、リンカーは、テザーである。
本発明の組成物の種々の実施形態において、加水分解可能な結合は、カルバメート、アミド、エステル、カルボネートおよびスルホネートからなる群より選択される。
本発明の組成物の実施形態において、少なくともリンカーは、フェニルアラニン−フェニルアラニン−アルギニンメチルケトン、チロシン−グリシン−アルギニンメチルケトン、グルタミン−グリシン−アルギニン メチルケトン、グルタミン−グリシン−アルギニン メチルケトンおよびフェニルアラニン−プロリン−アルギニンメチルケトンからなる群より選択されるアルギニルメチルケトンである。
本発明の組成物の他の実施形態において、リンカーは、チロシン−グリシン−アルギニンメチルケトンおよびフェニルアラニン−フェニルアラニン−アルギニンメチルケトンから選択される。
本発明の組成物の１つの実施形態において、リンカーは、フェニルアラニン−フェニルアラニン−アルギニンメチルケトンである。
本発明の組成物の別の実施形態において、リンカーは、チロシン−グリシン−アルギニンメチルケトンである。
本発明の組成物のなお他の実施形態において、リンカーは、第ＶＩＩａ因子のセリンプロテアーゼ活性部位内のアミノ酸側鎖に共有結合され、それによって、セリンプロテアーゼ活性部位を不活性化する。
本発明の組成物の種々実施形態において、細胞傷害性化合物は、式：
Figure 2005529080
 を有するクルクミノイドであり得、
ここで、Ｘ４は、（ＣＨ２）ｍ、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２またはＮＲ１２（ここで、Ｒ１２は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アシル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニルまたはジアルキルアミノカルボニルである）であり；ｍは、１〜７であり；各Ｘ５は、独立して、ＮまたはＣ−Ｒ１１であり；そして各Ｒ３〜Ｒ１１は、独立して、Ｈ、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、ＣＦ３、アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アルカリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボキサミド、ニトロ、シアノ、アジド、アルキルカルボニル、アシル、またはトリアルキルアンモニウムであり；そして破線は、任意の二重結合を示し；但し、Ｘ４が、（ＣＨ２）ｍであり、ｍが、２〜６であり、そして各Ｘ５が、Ｃ−Ｒ１１である場合、Ｒ３〜Ｒ１１は、アルコキシではなく、そしてＸ４が、ＮＲ１２であり、そして各Ｘ５が、Ｎである場合、Ｒ３〜Ｒ１０は、アルコキシ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アルカリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボン酸、またはアルキルカルボニルではなく、そして立体異性体構造が、エナンチオマーおよびジアステレオ異性体、ならびに幾何（シス−トランス）異性体を含む。
本発明の組成物のいくつかの実施形態において、Ｘ４は、−ＮＨおよび−ＮＲ１２からなる群より選択され、そしてＲ３〜Ｒ１０は、ヒドロキシおよび−ＮＨＲ１２から選択され得る。
本発明の組成物の１つの実施形態において、細胞傷害性化合物は、式：
Figure 2005529080
 を有するクルクミノイドである。
本発明の組成物のなお他の実施形態において、テザーは、ジカルボン酸、ジスルホン酸、ω−アミノカルボン酸、ω−アミノスルホン酸、ω−アミノカルボキシスルホン酸、またはその誘導体からなる群より選択され、ここで、このテザーは、２〜６個の炭素を含み、そしてここで、このテザーは、加水分解可能な結合を形成し得る。
本発明の組成物の１つの実施形態において、テザーは、ジカルボン酸を含み、そして別の実施形態において、テザーは、スクシネートである。
本発明は、さらに、クルクミノイド−ポリペプチド結合体を作製する方法を提供し、この方法は、以下の工程：（ａ）共有結合したテザーを有するクルクミノイドを含む生成物を合成する工程であって、ここで、このクルクミノイドが、式：
Figure 2005529080
 を有し、ここで、Ｘ４は、（ＣＨ２）ｍ、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２またはＮＲ１２（ここで、Ｒ１２は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アシル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニルまたはジアルキルアミノカルボニルである）であり、ｍは、１〜７であり、各Ｘ５は、独立して、ＮまたはＣ−Ｒ１１であり、そして各Ｒ３〜Ｒ１１は、独立して、Ｈ、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、ＣＦ３、アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アルカリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボキサミド、ニトロ、シアノ、アジド、アルキルカルボニル、アシル、またはトリアルキルアンモニウムであり；そして破線は、任意の二重結合を示し；但し、Ｘ４が、（ＣＨ２）ｍであり、ｍが、２〜６であり、そして各Ｘ５が、Ｃ−Ｒ１１である場合、Ｒ３〜Ｒ１１は、アルコキシではなく、そしてＸ４が、ＮＲ１２であり、そして各Ｘ５が、Ｎである場合、Ｒ３〜Ｒ１０は、アルコキシ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アルカリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボン酸、またはアルキルカルボニルではなく、そして立体異性体構造が、エナンチオマーおよびジアステレオ異性体、ならびに幾何（シス−トランス）異性体を含む、工程、（ｂ）ペプチジルクロロメチルケトンリンカーを提供する工程、（ｃ）工程（ａ）の生成物とリンカーとを共有結合する工程、および（ｄ）工程（ｃ）の組成物を標的細胞の表面上の組織因子に選択的に結合し得るポリペプチドに共有結合する工程、を包含する。
本発明の方法の１つの実施形態において、この方法は、細胞傷害性化合物を含む生成物を合成する工程、工程（ａ）の生成物およびリンカーを共有結合させる工程、ならびに工程（ｂ）の組成物の少なくとも１分子を標的細胞の表面マーカーに選択的に結合し得るタンパク質に共有結合させる工程を包含する。
本発明のこの局面の１つの実施形態において、工程（ａ）は、クルクミノイドを、ジカルボン酸、ジスルホン酸、ω−アミノカルボン酸、ω−アミノスルホン酸、ω−アミノカルボキシスルホン酸、またはそれらの誘導体からなる群から選択されるテザー（ｔｅｔｈｅｒ）と反応させる工程を包含し、このテザーは、２〜６個の炭素を含み、そして、このテザーは加水分解可能な結合を形成し得る。
本発明の方法の種々の実施形態において、Ｘ４は、−ＮＨおよび−ＮＲ１２からなる群から選択され、そしてＲ３〜Ｒ１０は、ヒドロキシルおよび−ＮＨＲ１２から選択され得る。
本発明の方法の１つの実施形態において、上記細胞傷害性化合物は、以下の式：
Figure 2005529080
 を有する。
本発明の方法の別の実施形態において、工程（ａ）は、細胞傷害性化合物を無水ジカルボン酸と反応させる工程を包含する。本発明の組成物のなお別の実施形態において、無水ジカルボン酸は無水コハク酸である。そして、
本発明の方法の１つの実施形態において、工程（ａ）の生成物は、以下の式：
Figure 2005529080
 を有し、そして、なお別の実施形態において、工程（ｂ）は、ペプチジルリンカーを提供する工程を包含する。種々の実施形態において、工程（ｂ）は、以下の式：
Figure 2005529080
 を有する組成物をイソプロピルクロロホルメートおよびエセテリアルジアゾメタンと反応させて、これによって以下の式：
Figure 2005529080
 を有する化合物を生じる工程、以下の式：
Figure 2005529080
 を有する化合物をＮ−Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−ＯＨ、イソプロピルクロロホルメートおよび塩基と反応させて；これによって以下の式：
Figure 2005529080
 を有する化合物、すなわち脱保護化合物ａｇを生じ、これによって以下の式：
Figure 2005529080
 を有する化合物を生じる工程を包含する。
本発明の方法の１つの実施形態において、工程（ｂ）の組成物は以下の式：
Figure 2005529080
 を有する。
本発明の方法の１つの実施形態において、タンパク質は、第ＶＩＩａ因子の構成ポリペプチドである。
本発明の方法の別の実施形態において、工程（ｂ）の組成物の少なくとも１分子が、第ＶＩＩａ因子のセリンプロテアーゼ活性部位のアミノ酸に共有結合され、それによってこの活性部位を不活性化する。
本発明の方法のなお別の実施形態において、このアミノ酸は配列番号１のＨｉｓ１９３である。
（薬学的組成物）
本発明の別の局面は、治療有効量の、組織に結合したクルクミノイド（上記のような因子特異的ポリペプチド）を含有し、ヒトまたは動物の病理学的状態（例えば、癌または新生血管ベースの疾患）を処置するための治療剤として使用するための、１つ以上の薬学的に受容可能なキャリア（添加剤）および／または希釈剤と一緒に処方される、薬学的に受容可能な組成物を提供する。
癌細胞に対して有効な細胞傷害性剤としての、本発明における使用に適したクルクミノイドの効力は、ＰＣＴ出願番号ＷＯ ０１／４０１８８（その全体が本明細書中に援用される）に完全に記載されている。
本発明の新規のクルクミン−ＦＦＲｃｋ−ｆＶＩＩａ構築物の細胞傷害性効果を、ヒト前立腺癌細胞（以下の実施例５）、乳癌（実施例６）および黒色腫細胞（実施例７）、臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（実施例８）ならびにＳＶ４０ラージＴ抗原のトランスフェクションにより不死化したマウス血管内皮細胞（ＭＳ−１細胞）で試験した。ヌードマウスでの場合、マウスの全寿命の間、ＭＳ−１細胞は直径数ｍｍの小さな腫瘍のままであり、そして転移しないため、この細胞は良性であるとみなされる。以下の実施例９に示すように、ホルボールエステルに曝露することによって、高レベルの組織因子を発現するように誘導された正常なＨＵＶＥＣ細胞は、ＥＦ２４−ＦＦＲ−ｃｋ−ｆＶＩＩａ結合体の細胞傷害性効果に感受性である。
以下に詳述するように、本発明の薬学的組成物は、固形形態または液体形態で投与するために特に処方され得、これらとしては、経口投与あるいは例えば、皮下注射、筋肉内注射または静脈内注射（例えば、滅菌の溶液または懸濁液）による非経口投与に適合されたものが挙げられる。
従って、本発明の１つの局面は、タンパク質を含む薬学的組成物であり、ここで、このタンパク質は、標的細胞の表面マーカーに選択的に結合し、そしてここで、このタンパク質は少なくとも１つのリンカーに共有結合し、各リンカーは、それに結合した細胞傷害性化合物を有し、そしてここで前記細胞傷害性化合物は、加水分解可能な結合によってこのリンカーおよび薬学的に受容可能なキャリアに共有結合している。
本発明のこの局面の種々の実施形態において、この薬学的組成物は、細胞傷害性化合物に加水分解可能な結合によって共有結合されたテザーをさらに含む。
また、この局面の種々の実施形態において、この加水分解可能な結合は、カルバメート、アミド、エステル、カーボネートおよびスルホネートからなる群から選択される。
本発明の薬学的組成物のなお他の実施形態において、このテザーは、ジカルボン酸、ジスルホン酸、ω−アミノカルボン酸、ω−アミノスルホン酸、ω−アミノカルボキシスルホン酸またはそれらの誘導体からなる群から選択され、ここで、テザーは２〜６個の炭素を含み、そして、このテザーは加水分解可能な結合を形成し得る。
本発明のこの局面の種々の実施形態において、少なくとも１つのリンカーは、フェニルアラニン−フェニルアラニン−アルギニンメチルケトン、チロシン−グリシン−アルギニンメチルケトン、グルタミン−グリシン−アルギニンメチルケトン、グルタミン酸−グリシン−アルギニンメチルケトンおよびフェニルアラニン−プロリン−アルギニンメチルケトンからなる群から選択される、アルギニルメチルケトンである。
また、本発明の種々の局面において、細胞傷害性化合物は、以下の式：
Figure 2005529080
 を有するクルクミノイドである。
本発明の薬学的組成物の１つの実施形態において、薬学的組成物は、薬学的有効投薬量で処方される。
本発明の薬学的組成物の１つの実施形態において、タンパク質は第ＶＩＩａ因子の構成ポリペプチドである。
本発明の薬学的組成物のなお別の実施形態において、薬学的組成物は静脈内注入のために処方される。
（薬学的投与）
本明細書中に言及される薬学的組成物を用いて処置される任意の患者に対するレジメンは、当業者によって決定されるべきである。治療において投与される１日用量は、医師によって決定され得、使用される特定の化合物、投与経路、ならびに患者の体重および状態に依存する。
本発明の薬学的組成物は、単一用量で投与され得るが、与えられる用量および患者の状態に依存して、連続的な投薬間の間隔で複数用量にても与えられ得る。
本発明の薬学的組成物は、静脈内に投与され得るか、または、好ましくは静脈内注射によって投与される、連続注入もしくは拍動性注入によって投与され得る。
皮膚障害の処置のために、本発明の脈管新生インヒビターは、好ましくは全身投与される。しかし、特定の障害の処置のために、クルクミノイド−テザーリンカー−ｆＶＩＩａは、皮膚の疾患もしくは病理学的状態に局所的（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）に適用され得るか、または、癌、前悪性状態ならびに脈管新生が生じている他の疾患および状態を処置するために、他の組織に局部的（ｌｏｃａｌｌｙ）に適用され得る。
局所的または局部的なこれらの薬剤の投与はまた、このような疾患および状態の発症または進行を防ぐために用いられる。例えば、クルクミノイド処方物は、生検が前癌状態を示す場合、膀胱に、またはＰａｐ標本が異常または疑わしい場合、頚部に、局所的にかまたは滴下によって投与され得る。
脈管新生阻害処方物は、障害の症状を緩和するのに必要とされるように投与される。薬剤の有効量を決定するために、アッセイがインビトロおよびインビボのいずれかで行われ得る。代表的なアッセイは、以下に提供される実施例に記載される。他の方法は当業者に公知であり、そして本明細書中に記載される疾患または他の障害の処置および予防のための、これらおよび他の薬剤の有効量を決定するのに用いられ得る。
本発明に従って使用され得る薬学的組成物を調製するための従来技術は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９８５に記載されている。
簡単には、本発明に従う使用に適する薬学的調製物は、薬学的組成物を、好ましくは精製された形態で、適切なアジュバントおよび適切なキャリアまたは賦形剤と混合することによって作製される。適切な生理的に受容可能なキャリアまたは賦形剤としては、滅菌水および生理食塩水が挙げられる。この点に関して、精製した第ＶＩＩａ因子を安定させるのに適切なアジュバントとしては、カルシウム、タンパク質（例えば、アルブミン）もしくは他の不活性なペプチド（例えば、グリシルグリシン）、またはアミノ酸（例えば、グリシンまたはヒスチジン）が挙げられる。他の生理的に受容可能なアジュバントは、非還元糖、シクロデキストリン（デンプン由来の環状炭化水素）、ポリアルコール（例えば、ソルビトール、マンニトールまたはグリセロ−ル）、ポリサッカリド（例えば、低分子量デキストリン）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）および抗酸化剤（例えば、亜硫酸水素塩およびアスコルビン酸）である。アジュバントは、一般に０．００１〜４％ｗ／ｖの濃度（これに限定はされない）で存在する。薬学的調製物はまた、プロテアーゼインヒビター（例えば、アプロチニン）および保存料を含有し得る。
これらの調製物は、例えば、細菌保持性フィルターを通す濾過によって、組成物中に滅菌剤を組み込むことによって、組成物を放射線照射することによって、滅菌され得る。これらはまた、使用前もしくは使用直前に、滅菌水または、注射に適したいくつかの他の滅菌培地に溶解され得る、滅菌固形組成物の形状で、製造され得る。
本発明の特定の実施形態は、クルクミノイドまたは塩基性官能基（例えば、アミノまたはアルキルアミノ）を含み得るその誘導体を包含し得、従って、薬学的に受容可能な酸と薬学的に受容可能な塩を形成し得る。この局面において、用語「薬学的に受容可能な塩」とは、クルクミノイドの比較的非毒性の、無機および有機酸の付加塩をいう。これらの塩は、本発明の化合物の最終的な単離および精製の間にか、または、適切な有機もしくは無機酸で形成されるその遊離塩基中で、精製した本発明の化合物を別々に反応させ、こうして形成された塩を単離することによって、インサイチュで調製され得る。代表的な塩としては、臭化水素酸、塩酸、硫酸、重硫酸、リン酸塩、硝酸、酢酸、吉草酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ラウリル酸、安息香酸、乳酸、リン酸、トシル酸、クエン酸、マレイン酸、フマル酸、スクシニル酸、酒石酸、ナフチル酸、メシル酸、グルコヘプトン酸、ラクトビオネートおよびラウリル硫酸の塩などが挙げられる（例えば、Ｂｅｒｇｅら（１９７７）「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照のこと）。
他の場合において、本発明の化合物は、１つ以上の酸性官能基を含み得、従って、薬学的に受容可能な塩基と薬学的に受容可能な塩を形成し得る。この塩は同様に、本発明のクルクミノイド含有組成物の最終的な単離および精製の間にインサイチュで調製され得るか、あるいは適切な塩基（例えば、薬学的に受容可能な金属カチオンの水酸化物、炭酸塩または重炭酸塩）、アンモニア、または薬学的に受容可能な有機の第１級、第２級もしくは第３級のアミンとカルボン酸基もしくはスルホン酸基を含有する誘導体を別々に反応させることによって調製され得る。代表的なアルカリまたはアルカリ土類塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩およびアルミニウム塩などが挙げられる。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンとしては、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが挙げられる（例えば、Ｂｅｒｇｅら、前出を参照のこと）。
湿潤剤、乳化剤および光沢剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム）、ならびに着色料、放出剤、コーティング剤、甘味料、矯味剤および芳香剤、保存料および抗酸化剤がまた、組成物中に存在し得る。
本発明の処方物は、非経口投与に適したものを含み得ることが意図される。これらの処方物は、簡便に単位投薬形態で提示され得、そして、製薬学の分野で周知の任意の方法によって調製され得る。キャリア物質と組み合されて単一投薬形態を生じ得る活性成分の量は、処置される宿主、投与の特定の様式に依存して変化する。キャリア物質と組み合されて単一投薬形態を生じ得る活性成分の量は、一般に、治療効果を生じる、そのクルクミノイド誘導体の量である。一般に、この量は、１００％中、約０．１％〜約９９．５％の活性成分、好ましくは約５％〜約７０％の活性成分、最も好ましくは、約１０％〜約３０％の活性成分の範囲である。
これらの処方物または組成物を調製する方法は、本発明の化合物をキャリアおよび必要に応じて１種以上の補助成分と会合させる工程を包含する。概して、これらの処方物は、本発明のクルクミノイド−リンカー−ｆＶＩＩａ結合体を、液体キャリアもしくは微細に分割された固体キャリア、またはその両方と均一かつ本質的に会合させ、必要な場合生成物を成形することによって調製される。
非経口投与に適した本発明の薬学的組成物は、１つ以上の薬学的に受容可能な滅菌等張性水溶液または非水系の溶液、分散物、懸濁物もしくはエマルジョン、あるいは使用直前に滅菌注射用溶液または分散物に再構成され得る滅菌粉末（これは、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、処方物を意図されたレシピエントの血液と等張にする溶質または懸濁物もしくは増粘剤を含み得る）を包含し得る。
本発明の薬学的組成物に使用され得る適切な水性キャリアおよび非水系のキャリアの例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロ−ル、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物、植物油（例えば、オリーブ油）ならびに注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられる。例えば、コーティング物質（例えば、レシチン）を用いることによって、分散剤の場合は、必要な粒子サイズを維持することによって、そして界面活性剤を用いることによって、適切な流動性が維持され得る。
これらの組成物はまた、アジュバント（例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤）を含み得る。微生物の活動の防止は、種々の抗菌剤および他の抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸など）を含めることによって確実にされ得る。等張剤（例えば、糖、塩化ナトリウムなど）を組成物に含めることもまた、所望され得る。さらに、注射可能な薬学的形態の長期吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノステアリン酸アンモニウムおよびゼラチン）を含めることによって、もたらされ得る。
いくつかの場合において、薬物の効果を延長するために、皮下注射または筋肉内注射からの薬物吸収を遅らせることが所望される。これは、ＰＥＧへの結合、水溶性の乏しい結晶性物質または非晶質物質の液体懸濁液の使用によって達成され得る。次いで、薬物の吸収速度は、溶解速度に依存し、次に、ＰＥＧの大きさ、形態および量、結晶の大きさおよび結晶性形態に依存し得る。あるいは、非経口投与される薬物形態の遅延吸収は、油状ビヒクルに薬物を、溶解または懸濁することによって達成される。
注射可能貯蔵形態は、生体分解性ポリマー（例えば、ポリラクチド−ポリグリコリド）中に、対象のペプチドまたはペプチド模倣物のマイクロカプセル化マトリクスを形成することによって作製される。ポリマーに対する薬物の割合、および使用される特定のポリマーの性質に依存して、薬物放出の速度が制御され得る。他の生体分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられ得る。貯蔵注射可能形態はまた、身体組織に適合するリポソームまたはマイクロエマルジョンに、薬物を封入することによって調製される。
薬学的組成物は、予防的処置および／または治療的処置のための、非経口投与、局所投与または局在投与に向いている。最も好ましくは、薬学的組成物は、本発明の組成物が、選択された標的細胞（例えば、癌細胞または脈管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ）内皮細胞）に迅速に移送され得るように、非経口（すなわち、静脈内）投与される。従って、本発明は、受容可能なキャリア、好ましくは水性キャリアに溶解された、改変ｆＶＩＩ分子の溶液を含む、非経口投与のための組成物を提供する。種々の水性キャリアは、例えば、水、緩衝化水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなどが使用され得る。この改変ｆＶＩＩａ分子はまた、損傷部位に送達または損傷部位を標的化する、リポソーム調製物に処方され得る。リポソーム調製物は、概して、例えば、米国特許第４，８３７，０２８号、同第４，５０１，７２８号、および同第４，９７５，２８２号（これらは、参考として本明細書中に援用される）に記載されている。これらの組成物は、簡便で周知の安定化技術によって安定化され得る。得られた水溶液は、無菌状態下で使用のためにパッケージされ得るかまたは濾過され得、そして凍結乾燥され得、この凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌水溶液と合わされる。これらの組成物は、生理学的状態に近づけるために要求されるような、薬学的に受容可能な以下の補助物質を含み得る：ｐＨ調節剤および緩衝化剤、等張剤など（例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなど）。これらの処方物中の改変第ＶＩＩ因子の濃度は、広範（すなわち、約０．５重量％未満、通常、約１重量％もしくは少なくとも約１重量％未満〜１５重量％もしくは２０重量％程度）に変動し得、そしてこれは、選択される特定の投与様式に従って、流体容積、粘度などによって主に選択される。
従って、静脈内注入のための例示的な所望の薬学的組成物は、滅菌リンゲル溶液（２５０ｍｌ）中に、０．０５〜５ ｍｇ／ｋｇ体重（ラットにおいて）、または０．０５〜１０ｍｇ／ｋｇヒト成人、および改変第ＶＩＩ因子（１０ｍｇ）を含むように作製され得る。非経口投与可能な化合物を調製するための実際の方法は、当業者に公知または明らかであり、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，第１６版，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８２）（これは、参考として本明細書中に援用される）に、より詳細に記載される。
本発明のさらに別の局面は、標的細胞の生理学的機能を調節する方法であり、上記方法は、細胞傷害性化合物−タンパク質結合体を含む組成物と、その表面に表面マーカーを有する標的細胞とを接触させる工程であって、ここで、上記組成物は、表面マーカーに選択的に結合し、そして内在化され、それによって上記タンパク質から細胞傷害性化合物を放出する工程；および上記標的細胞の生理学的機能を調節する工程を包含する。
本方法の１実施形態において、表面マーカーは、組織因子である。
本方法の多様な実施形態において、生理学的機能は細胞の増殖であって、ここで増殖は低減される。
本発明の本方法の実施形態において、上記標的細胞は、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、腫瘍細胞、単球、マクロファージおよび微粒子から選択され得る。１実施形態において、上記標的細胞は、血管内皮細胞である。さらに別の実施形態において、上記標的細胞は、血管平滑筋細胞である。
本発明の本方法のさらに他の実施形態において、上記血管内皮細胞は、単離された血管内皮細胞、毛細血管内皮細胞、静脈内皮細胞、動脈内皮細胞および腫瘍の脈管新生内皮細胞からなる群より選択され得る。
本発明のこの局面の他の実施形態において、上記組成物は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む。
本方法のなお別の実施形態において、上記標的細胞は、培養細胞である。
本発明の本方法の多様な実施形態はさらに、以下の工程をさらに包含する：
標的細胞を有する動物またはヒトに組成物を送達させる工程であって、ここで、上記組成物は、局所静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、髄腔内、胸骨内の注射および注入からなる群より選択される経路によって動物またはヒトに送達される、工程。
本発明のさらに別の局面は、細胞傷害性化合物を標的細胞に選択的に送達する方法であり、上記方法は、以下の工程を包含する：
請求項１に記載の組成物と、その表面に表面マーカーを有する標的細胞とを接触させる工程；および標的細胞上の上記表面マーカーに上記組成物を結合させて、上記組成物を上記標的細胞に内在化し、それによって上記標的細胞の内部に細胞傷害性化合物を送達させる工程。
本発明のこの局面において、上記治療用調製物はさらに、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。
本発明の本方法の１実施形態において、上記細胞傷害性化合物は、以下の式：
Figure 2005529080
 を有するクルクミノイドであり、ここで、上記タンパク質は、第ＶＩＩａ因子の成分ポリペプチドである。
本発明のなおさらに別の局面は、動物またはヒトにおける病理学的状態を調節する方法であり、上記方法は、以下の工程を包含する：
本発明に従う有効用量の細胞傷害性化合物−タンパク質結合体を含む組成物を、病理学的状態を有する動物またはヒトの被験体に投与する工程であって、それにより表面−結合マーカーを発現し得る標的細胞の増殖を低減させ、そして患者被験体の上記病理学的状態を調節する、工程。
本発明の本方法の１実施形態において、上記標的細胞の表面マーカーは、組織因子である。
本発明の本方法の多様な実施形態において、上記病理学的状態は、癌、凝固能亢進症（ｈｙｐｅｒｃｏａｇｕｌａｐａｔｈｙ）、再狭窄、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチおよび皮膚障害性炎症（ｓｋｉｎ ｄｉｓｏｒｄｅｒ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）からなる群より選択される。
また、本発明のこの局面の多様な実施形態において、上記病理学的状態は、白血病、乳癌、肺癌、肝臓癌、黒色腫および前立腺癌からなる群より選択される癌である。
本発明の本方法の１実施形態において、上記標的細胞は、血管内皮細胞である。
本発明の本方法のさらに別の実施形態において、上記標的細胞は、血管平滑筋細胞である。
本発明の本方法のさらに別の実施形態において、上記標的細胞は、癌細胞である。
本発明の本方法の別の実施形態において、上記組成物は、抗脈管新生剤（ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）であり、ここで、標的細胞の増殖低減は、脈管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を低減させる。別の実施形態において、脈管新生の低減は、腫瘍の縮小を引き起こす。
（再狭窄）
冠状動脈疾患の処置における最近の進歩は、具合の悪いプラーク物質を除去または移動させるための機械的介入の使用を含み、冠状動脈を通して十分な血流を再び確立する。機械的介入の多様な形態（バルーン血管形成、縮少アテローム切除術（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ａｔｈｅｒｅｃｔｏｍｙ）、血管ステントの配置、レーザー治療、またはロータブレーター（ｒｏｔｏｂｌａｔｏｒ）を含む）の使用にもかかわらず、これらの技術の有効性は、処置後６ヶ月以内の再狭窄が約４０％に限定されたままである。
再狭窄は、生物学的プロセスの複雑な相互作用により生じると考えられ、これらの生物学的プロセスとしては、血小板沈着および血栓形成、化学走化性因子およびマイトジェン因子の放出、ならびに拡張型動脈セグメントの内膜への血管平滑筋細胞の移動および増殖が挙げられる。機械的損傷部位における血小板蓄積の阻害は、ヒト被験体の再狭窄の割合を限定し得る。ヒト冠状動脈の機械的損傷部位における血小板蓄積の阻害は、究極の治癒応答が生じるのに有益である。血小板蓄積は急性血管損傷部位において生じるものの、これらの部位における血栓形成は、血小板の活性化およびその後の血小板蓄積に起因し得る。
本発明の改変ｆＶＩＩａは、細胞表面組織因子に結合し得るが、酵素活性を有さない。しかし、これは、野生型ｆＶＩＩａの競合的アンタゴニストとして働き、それによりトロンビンの生成を生じる外因的凝縮経路における続く工程を阻害する。
本発明の改変ｆＶＩＩａ分子（組織因子の結合を維持する）は、トロンビンの生成およびその後のフィブリンの蓄積をブロックすることによって、血管損傷部位における血小板堆積を阻害する。
本発明のクルクミノイド（ｃｕｒｃｕｍｉｎｏｉｄ）−リンカー−ｆＶＩＩａ結合体は、トロンビンの生成をブロックし、そして急性血管損傷の部位における血小板堆積を制限し、従って、血管再狭窄を阻害するのに有用である。本発明の組成物は、内皮細胞または平滑筋細胞を増殖させ、それによってクルクミノイド（例えば、ＥＦ２４があるが、これに限定されない）を標的細胞の細胞質に送達することによる内在化によって、再狭窄をさらに阻害し得る。このクルクミノイドは、次いで、図３に示されるように、標的細胞を直接殺傷し、ここで、ＥＦ２４を含む種々の候補クルクミノイドが、Ｒａｓ遺伝子で不死化された内皮細胞に添加され、それにより再狭窄を低減するかまたは排除している。
従って、本発明の組成物および方法は、広範な種々の用途を有する。例えば、これらは、介入、代表的には、機械的介入の後の再狭窄を予防または阻害して、バルーン血管形成、修復型じゅく腫切除術、血管ステントの交換、レーザー治療、ロトブレーション（ｒｏｔｏｂｌａｔｉｏｎ）などと共に、および／またはこれらの後の、冠血管疾患または末梢血管の処置において望まれないプラーク物質を除去するかまたは移動させるかのいずれかの際に有用である。これらの化合物は、代表的に、介入の実施前約２４時間以内に、その後７日間以上にわたって投与される。投与は、本明細書でさらに記載されるような種々の経路により得る。好ましい経路は、組織因子保有細胞への迅速かつ特異的な送達のために、再狭窄部または組織損傷の部位におそらく近い血管への直接送達である。本発明の化合物はまた、吻合、外科的動脈血管内膜切除術（代表的には、冠動脈内膜切除術）、バイパス移植片などの部位における、（例えば、合成動脈移植片または改変された動脈移植片を被覆することによる）血管移植片の配置のために、全身的または局所的に投与され得る。改変されたｆＶＩＩａはまた、内膜過形成、加速性アテローム性動脈硬化症および臓器移植に関連する（例えば、骨髄移植後の）静脈閉塞性疾患の阻害における用途を見出す。
本発明のクルクミノイド−リンカー−ｆＶＩＩａ結合体は特に、急性血管損傷に起因する内膜過形成または再狭窄の処置において有用である。急性血管損傷は、生涯にわたって生じる慢性血管損傷（例えば、アテローム性動脈硬化症）とは対照的に、急激（すなわち、数日〜数ヶ月）に生じる損傷である。急性血管損傷は、しばしば、血管形成術、動脈血管内膜切除術、じゅく腫切除術、血管移植片配置などの技術が用いられる、外科手順（例えば、血管再構築）から生じる。過形成はまた、例えば、移植片配置または臓器移植に応答して、後発性の応答として生じ得る。結合体化ｆＶＩＩａは、ヘパリンより選択性であるため、一般的に、損傷部位で露出された組織因子にのみ結合し、そして改変されたｆＶＩＩａは他の凝固タンパク質を破壊しないため、このｆＶＩＩａは、深部の静脈血栓症の予防のために予防的に使用される場合、ヘパリンよりも有効であり、かつ出血性合併症を生じる可能性がより小さい。深部の静脈血栓症を予防するための改変ｆＶＩＩａの用量は、７０ｋｇの患者について、約５０μｇ〜５００ｍｇ／日、より代表的には１ｍｇ〜２００μｇ／日、より好ましくは１０〜約１７５μｇ／日の範囲であり、投与は、手術の少なくとも約６時間前に開始され、少なくとも患者が歩行可能になるまで続けられる。再狭窄の処置における本発明のクルクミノイド−ｆＶＩＩａ結合体の用量は、各患者ごとに異なるが、一般に、上で示唆された用量範囲内である。
本発明の好ましい実施形態は、特定の用語、デバイスおよび方法を使用して記載されてきたが、このような記載は、例示目的のみのためである。使用される単語は、制限ではなく説明の単語である。変更および改変は、添付の特許請求の範囲に記載される本発明の精神または範囲から逸脱することなく、当業者によって実施され得ることが理解される。さらに、種々の実施形態の局面が、全体または一部の両方で交換可能であることが理解されるべきである。
本発明は、以下の実施例によってさらに例示され、これらの実施例は、例示のために示され、限定であると解釈されるべきではない。本願全体にわたって引用される全ての参考文献、公開された特許および特許の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
（実施例１：第ＶＩＩ因子（ｆＶＩＩａ））
本発明における使用に適切な精製されたヒト第ＶＩＩａ因子は、好ましくは、ＤＮＡ組換え技術（例えば、Ｈａｇｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：２４１２−２４１６，（１９８６）または欧州特許第２００．４２１号に記載されるような技術）によって作製される。組換え技術によって生成される第ＩＶＶａ因子は、本来の第ＶＩＩａ因子、またはより改変されているかまたはそれほど改変されていない第ＩＶＶａ因子であり得るが、ただし、このような第ＶＩＩａ因子は、本来の第ＶＩＩａ因子と実質的に同じ、血液凝固に対する生物学的活性を有する。このような改変された第ＶＩＩａ因子は、アミノ酸コドンを変更することによってか、または公知の方法によって（例えば、部位特異的変異誘発によって）天然のｆＶＩＩをコードする核酸中のアミノ酸コドンのいくつかを除去することによってのいずれかにより、第ＶＩＩ因子をコードする核酸配列を改変することによって、生成され得る。
第ＶＩＩａ因子はまた、ＢｒｏｚｅおよびＭａｊｅｒｕｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（４）：１２４２−１２４７，（１９８０）、ならびにＨｅｄｎｅｒおよびＫｉｓｉｅｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７１：１８３６−１８４１，（１９８３）により記載される方法によって生成され得る。これらの方法は、検出可能な量の他の血液凝固因子を含まない第ＶＩＩａ因子を生成する。なおさらに精製された第ＶＩＩａ因子調製物は、最終精製工程としてさらなるゲル濾過を含めることによって、得られ得る。次いで、第ＶＩＩａ因子は、公知の手段によって（例えば、いくつかの異なる血漿タンパク質（例えば、第ＸＩＩａ因子、第ＩＸａ因子または第Ｘａ因子）によって）、活性化ｆＶＩＩａに変換される。あるいは、Ｂｊｏｅｒｎら（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ，２６９ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９８６，ｐｐ．５６４−５６５）により記載されるように、第ＶＩＩ因子は、イオン交換クロマトグラフィーカラム（例えば、Ｍｏｎｏ ＱＲＴＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）など）を通すことによって、活性化され得る。
（実施例２：クルクミンアナログの合成およびスクシネートテザーを使用するＥＦ２４とＦＦＲｃｋとのカップリング）
本発明において有用な一連のモノカルボニルクルクミンアナログの説明および合成的調製物は、ＰＣＴ出願番号０１／４０１８８（本明細書中に、その全体が参考として援用される）に記載されている。
ｆＶＩＩａタンパク質と薬剤分子の結合体である、ＥＦ２４−ＦＦＲｃｋ−ｆＶＩＩａの合成は、３工程で進行した。最初に、ＥＦＲトリペプチドへの結合を許容する適切なＥＦ２４の誘導体を生成した。ＥＦ２４を合成するために、ピペリドン水和物．ＨＣｌ（２．２ｇ、１４ｍｍｏｌ）を、氷ＣＨ３ＣＯＯＨ（６０ｍｌ）に懸濁した。この懸濁液を、溶液が透明になるまで、ＨＣｌガスで飽和し、そして固体の２−フルオロベンズアルデヒド（５．０ｇ、４０ｍｍｏｌ）で処理した。この反応混合物を、周囲温度で４８時間撹拌した。沈殿した固体を、濾過によって回収し、冷却した無水エタノールで洗浄し、そして減圧下で乾燥して、山吹色の結晶性固体を得た（ＥＦ２４、４．２７ｇ、収率８０％）。
試験したいくつかの化合物のうち、コハク酸誘導体ａａ（収率８６％）が、適切であった。なぜなら、これは、細胞傷害性アッセイにおいて、ＥＦ２４の活性の５０％を維持したからである。ＥＦ２４のスクシニル誘導体ａａを合成するために、無水ＣＨ２Ｃｌ２（６ｍｌ）中のＥＦ２４（０．１６ｇ、０．５ｍｍｏｌ）の溶液に、無水コハク酸（０．０５７ｇ、０．５ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（１０１ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を、室温で３時間撹拌し、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（２×１０ｍｌ）およびブラインで２回洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、そしてエバポレーションによって溶媒を除去した。得られた固体を、溶出液としてベンゼン／アセトン／酢酸（２７：１０：０．５）を使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、黄色の固体ａａを得た（８５２ｍｇ、ｍｐ １４５℃、収率８６％）。
Figure 2005529080
 ２番目に、ＦＦＲ−ｃｋペプチドリンカーを、以下に示すように構築した。この工程について、市販のＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｍｔｒ）−ＯＨ（ａｂ １２２ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（２ｍｌ）に溶解し、そしてＮ−メチルモルホリン（２５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の存在下で、クロロギ酸イソプロピル（トルエン中１．０Ｍ、０．２５ｍｌ、０．２５ｍｍｏｌ）と、−２０℃で４時間反応させた。この混合物を濾過し、そして濾液を、４ｍｌのエーテルを含むジアゾメタンに添加した。この反応溶液を、０℃で１時間か撹拌した後、溶媒をエバポレートして、粗生成物を白色の針状物として得た。これを、溶出液として酢酸エチルを使用するクロマトグラフィーによって精製して、白色の固体ａｃを得た（７５ｍｇ、収率５９％）。
Figure 2005529080
 Ｎ−Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−ＯＨ ａｆ（１９７ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を、Ｎ−メチルモルホリン（４０ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）およびクロロギ酸イソプロピル（トルエン中１．０Ｍ、０．４ｍｌ、０．４ｍｍｏｌ）と、−２０℃で１０分間反応させた。Ｎ−メチルモルホリン（４０ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を含む冷ＴＨＦ（５．７２ｍｌ）を、この混合物に添加し、これを直ちに、ＤＭＦ（０．９２ｍｌ）に溶解したＡｒｇ（Ｍｔｒ）ＣＨ２Ｃｌ．ＨＣｌ ａｄ（２００ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）に添加した。−２０℃で１時間撹拌し、そして室温で２時間撹拌した後、ＴＨＦ（５．６ｍｌ）を添加し、そしてこの混合物を濾過した。濾液をエバポレートし、そして固体残渣を、溶出液としてＥｔＯＡｃ／ヘキサン（４：１）を使用するカラムによって精製した。白色の固体ａｇ（２４５ｍｇ、収率７５％）を得た。化合物ａｇ（０．０５ｍｍｏｌ、４２．５ｍｇ）を、ＥｔＯＡｃ（０．１６ｍｌ）に溶解し、そしてＨＣｌのメタノール溶液（０．８５ｍｍｏｌ）と、室温で３．５時間反応させ、ＮａＨＣＯ３（ａｑ）で洗浄し、ＣＨ２Ｃｌ２（２×１０ｍｌ）で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、そして濾過した。溶媒をエバポレートして、白色固体のＦＦＲ−ｃｋ ａｈ（４０ｍｇ）を得た。
Figure 2005529080
 ＣＨ２Ｃｌ２（０．６ｍｌ）中の、ａｈ（２４ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）およびａａ（１２ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）の混合物に、ＤＣＣ（６．１８ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を添加した。室温で一晩撹拌した後、溶媒を濾過し、そしてエバポレートして、溶出液として酢酸エチルを使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。ａｉ（１７ｍｇ、収率４９％）を得た。化合物ａｉ（３４ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を、チオアニソール（０．０５ｍｌ）を含む９５％ＴＦＡ水溶液（０．９５ｍｌ）に溶解した。得られた暗色溶液を、室温で４８時間撹拌し、次いで減圧下で濃縮した。得られた固体を、エーテルで粉砕し、再結晶し、そして減圧下で乾燥して、化合物ａｊ（ＥＦ２４−ＦＦＲ−ｃｋ）（１２ｍｇ、収率４５％）を得た。
（実施例３：ＥＦ２４−ＦＦＲｃｋ（ａｊ）とｆＶＩＩａのカップリング）
方法１：組換えｆＶＩＩａ（２５０μｇ）を、０．５ｍｌの蒸留水に再懸濁し、そして１リットルの１ｍＭ ＴｒｉｓＨＣＩ（ｐＨ８．０）中で４℃にて一晩透析した。０．２５ｍｌのＤＭＳＯ中の上記の実施例２に記載されるように合成した４０倍モル過剰のＥＦ２４−ＦＦＲｃｋ ａｊを、４００μＭの最終濃度まで添加した。この混合物を、アルミニウムホイルで覆い（ＥＦ２４は、感光性である）、そして室温にて暗室中で一晩インキュベートした。この反応混物を、４℃にて２０分間、１６，０００ｒｐｍでＳｏｒｖａｌｌ遠心分離器で、遠心分離し、未結合のＥＦ２４−ＦＦＲｃｋを沈殿し、そしてＥＦ２４−ＦＦＲｃｋ−ｆＶＩＩａから分離した。この上清を、１０％のウシ胎仔血清、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有する１００ｍｌの滅菌細胞培養培地中で４℃にて一晩さらに透析した。培養培地で平衡化したＥＦ２４−ＦＦＲｃｋ−ｆＶＩＩａを、９６ウェルプレートのウェル中の細胞に添加した。
方法２：（１）因子ＶＩＩａ（ｆＶＩＩａ）を、１．０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に対して４℃にて一晩透析する。（２）ＥＦ２４−ＦＦＲｃｋを、１００％ ＤＭＳＯに溶解する。（３）１ｍｌあたりｆＶｌｌａおよび０．２５ｍｌあたりＥＦ２４−ＦＦＲｃｋを、モル比１：１３．２で混合し、そして２時間室温にてゆっくりと撹拌する。（４）０．２５ｍｌあたりさらなるＥＦ２４−ＦＦＲｃｋ（モル比で１：１３．２）を、反応混合物に添加し、最終モル比を１：４０にし、そしてカップリング反応を一晩室温にて続ける。（５）このカップリング産物ＥＦ２４−ＦＥＲ−ｃｋ−ｆＶｌＩａを、カラムクロマトグラフィーによって未結合のＥＦ２４−ＦＦＲｃｋから分離し、そして０．５ｍｌの画分を回収する。（６）タンパク質ピーク（ｆＶＩＩａ）を、ＯＤ２８０およびＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質定量（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で画分を読み取ることによって測定する。（７）活性画分をプールする。
（実施例４：ｆＶＩＩａにカップリングしたＥＦ２４−ＦＦＲｃｋ（ａｌ）の質量スペクトル試験）
ｆｖＩＩａの質量は、５２３９２．６＋Ｈダルトンであり、そしてＥＦ２４−ＦＦＲｃｋ−ｆＶＩＩａの質量は、５４３２２．２＋Ｈダルトンである。後者の質量は、前者より１９２９．６ダルトン大きい。ＥＦ２４−ＦＦＲｃｋ（８９４）−ＨＣＩ（３７）のＭＷ＝８５７。１９２９．６を８５７で割ると２．３である。図２に示されるように、ＥＦ２４−ＦＦＲｃｋの少なくとも２分子は、ｆＶＩＩａに共有結合された。
（実施例５：ＥＦ２４−ＦＦＲｃｋ−ｆＶＩＩａは、ｆＶＩＩａを介してＴＦにのみ結合し、そしてヒト前立腺癌細胞株を殺傷する）
ＤＵ１４５およびＰＣ３の前立腺癌細胞株によって発現された組織因子（ＴＦ）レベルおよび血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）レベルを、以下の表１によって示されるように、ＥＬＩＳＡによって測定した。高いＴＦレベルおよびＶＥＧＦレベルを、ＤＵ１４５細胞で見出した。
（表１：ＤＵ１４５およびＰＣ３の前立腺癌細胞株での組織因子（ＴＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のＥＬＩＳＡ。ＤＵ１４５細胞中で高いＴＦレベルおよびＶＥＧＦレベル。値は、平均±Ｓ．Ｄ．を示す）
Figure 2005529080
 ＤＵ１４５細胞を、９６ウェルプレート中２×１０４細胞／１００μｌ／ウェルでプレーティングし、そして一晩培養した。この細胞を、４８時間培養した。培養を、最終濃度１０％まで４０％ＴＣＡを添加することによって終了した。細胞を、４℃にて１時間、ＴＣＡ中に固定し、水道水で５回洗浄し、そして空気乾燥した。１％酢酸中０．４％（ｗ／ｖ）のスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）溶液（１００μｌ）を、各ウェルに添加し、そしてこれらの細胞を、１０分間室温にてインキュベートした。染色後、未結合の染料を、１％酢酸で５回洗浄することによって除去し、そして空気乾燥した。次いで、結合染料を、２００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｚｍａベースを用いて可溶化し、そして吸光度を４９０ｎｍの波長で自動化プレートリーダーで読み取った。アッセイを、三連または四連で行った。アスタリスク（＊）は、スチューデントｔ検定（両側確率：ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）によってｐ＜０．０００１を示す。ＥＦ２４−ＦＦＲｃｋ−ｆＶＩＩａの濃度を、タンパク質濃度に基づいて見積った。
ＥＦ２４−ＦＦＲｃｋ単独では、細胞表面に結合し得ないので、表２に示されるように、いずれの細胞も殺傷しない。
（表２：ＥＦ２４−ＦＦＲｃｋ−ｆＶＩＩａは、ＤＵ１４５、組織因子を発現するヒト前立腺癌細胞株を殺傷する。ＳＲＢ生存試験。値は、平均Ｓ．Ｄ．である）
Figure 2005529080
 （実施例６：ＥＦ２４−ＦＦＲｃｋ−ｆＶＩＩａは、ヒト胸部癌および黒色腫細胞を殺傷する）
（表３：ＥＦ２４−ＦＦＲｃｋ−ｆＶＩＩａは、ヒト胸部癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）および黒色腫（ＲＰＭＩ−７９５１）を殺傷する。ＮＲ生存試験。値は、平均±Ｓ．Ｅ．を示す）
Figure 2005529080
 スチューデントｔ検定（両側確率）（９５％確信レベル）
スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイの代わりに、ニュートラルレッド（ＮＲ）染料生存アッセイを使用した。ＮＲ生存アッセイにおいて、ＮＲ染料は、生存細胞によってのみ取り込まれるが、ＳＲＢ生存アッセイにおいては、生存細胞は、プレート上にトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）によって固定化され（従って、細胞が殺傷される）、そして固定化された細胞は、ＳＲＢ染料によって染色される。
培養の最終で、培地を除去し、５０μｇのＮＲ／ｍｌを含有する２００μｌの新しい温かい培地を、９６ウェルプレート中の各ウェルに添加した。細胞を、３７℃にて３０分間インキュベートし、次いで２００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。細胞によって取り込まれたＮＲを、３５％のエタノールを含有する２００μｌの０．５Ｎ ＨＣｌを添加することによって溶解した。各ウェル中の染料の量を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーによって５７０ｎｍで読み取った。
（実施例７：ＥＦ２４−ＦＦＲｃｋ−ｆＶＩＩａは、正常なヒトメラノサイトおよび正常なヒト胸部管腔細胞に対する効果を有さない）
（表４：ＥＦ２４−ＦＦＲｃｋ−ｆＶＩＩａは、正常なヒトメラノサイトおよびＭＣＦ１０（正常なヒト胸部管腔細胞株）（これは、組織因子を発現しない）に対する効果を有さない：ＮＲ（ニューラルレッド染料）生存試験。値は、平均±Ｓ．Ｄ．である）
Figure 2005529080
 アッセイを、上記のＤＵ１４５と基本的に同様に行った。
（実施例８：ＥＦ２４−ＦＦＲｃｋ−ｆＶＩＩａは、正常なＨＵＶＥＣを殺傷しない）
（表５：ＥＦ２４−ＦＦＲｃｋ−ｆＶＩＩａは、組織因子を発現しない正常なＨＵＶＥＣを殺傷しない：ＳＲＢ生存試験（ＮＣＩ方法）。平均±Ｓ．Ｄ．）
Figure 2005529080
Figure 2005529080
＊スチューデントｔ検定（両側確率）（９５％確信レベル）
ａ細胞を、ＳＲＢ染料の添加前に洗浄せず、従ってＥＦ２４−ＦＦＲｃｋ−ｆＶＩＩａ吸着染料を沈殿し、それによって間違って高い．Ｄ．４９０ｎｍ値を得た。
ＥＦ２４−ＦＦＲｃｋ−ｆＶＩＩａは、表面結合組織因子を発現しない正常なＨＵＶＥＣを殺傷しない。
（実施例９：ＥＦ２４−ＦＦＲｃｋ−ｆＶＩＩａは、１００ｎＭ ＴＰＡによってＴＦの発現を誘導したＨＵＶＥＣを殺傷する）
（表６：ＥＦ２４−ＦＦＲｃｋ−ｆＶＩＩａは、ＥＦ２４−ＦＦＲｃｋ−ｆＶＩＩａを添加する２４時間前に、１００ｎＭ ＴＰＡ（ホルボールエステル）によってＴＦの発現を誘導したＨＵＶＥＣを殺傷する：ＳＲＢ生存試験（ＮＣＩ方法）。平均±Ｓ．Ｄ．）
Figure 2005529080
 ＊スチューデントｔ検定（両側確率）（９５％確信レベル）
（実施例１０：新規のクルクミンアナログ（Ａ２７９Ｌ．Ａ２７９ＵおよびＥＦ−１５）は、血管内皮細胞に対して細胞傷害性でない）
ＨＵＶＥＣ、ＭＳ−１細胞およびＳＶＲ細胞を、コンフルエンスになるまで培養し、そして因子を２４時間インキュベートした。細胞生存を、ニュートラルレッドアッセイによって測定した。合成クルクミンアナログのうちで、Ａ２７９Ｌ、Ａ２７９ＵおよびＥＦ−１５は、２０μＭで細胞傷害性でなかった。ＭＳ−Ｉ細胞は、ＳＶ４０大Ｔ抗原のトランスフェクションによって不死化されたマウス血管内皮細胞であるが、非悪性である。しかし、ＭＳ−１細胞を、ｒａｓ変異遺伝子を用いてトランスフェクトした場合、細胞は形質転換され、悪性の血管肉腫細胞（ＳＶＲ細胞）になった。
（表７：新規のクルクミンアナログ（Ａ２７９Ｌ．Ａ２７９ＵおよびＥＦ−１５）は、血管内皮細胞に対して細胞傷害性でない）
Figure 2005529080
Figure 2005529080
（実施例１１：種々の濃度のＦＦＲ−ｃｋ−ｆＶＩＩａと共に細胞を２４時間インキュベートした後のＴＦ／ＦＦＲ−ｃｋ−ＶＩＩａ複合体の内在化）
３つのヒト癌細胞株（高いＴＦおよびＶＥＧＦ手順）において、ＦＦＲ−ｃｋ−ＶＩＩａのみが、用量依存様式において、原形質膜小胞中の小胞へのＴＦの内在化（細胞膜のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００不溶性領域）を引き起こした。ＦＦＲ−ｃｋ−ＶＩＩａは、細胞表面に残っているＴＦを全て阻害し、第Ｘ因子を触媒し、第Ｘａ因子を生成した。しかし、ＶＥＧＦ生成および細胞生存には影響しなかった。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において、約１０μＭのＦＦＲ−ｃｋ−ＶＩＩａが、５０％のＴＦ−ＦＦＲ−ｃｋ−ＶＩＩａ複合体を内在化するために必要とされる。なぜなら、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト胸部癌細胞は、他の細胞株よりＴＦをより高いレベルで発現するからである。
（表８：癌細胞に対するＦＦＲｃｋ−ｆＶＩＩａの効果）
Figure 2005529080
Figure 2005529080
ＴＦの値は、三連の測定の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。
＊コントロール値からの統計学的に有意な差（ｐ＜０．０５）。
（実施例１２：細胞内のクルクミンまたはそのアナログとＦＦＲ−ｃｋ−ＶＩＩａ（またはＹＧＲ−ｃｋ−ＶＩＩａ）との間の化学結合の解離）
１．ＨＰＬＣクロマトグラフィーによる物理的分析：適切な濃度で、結合した化合物（例えば、ＥＦ２４−ＦＦＲ−ｃｋ−ＶＩＩａ）を、コンフルエントな単層の癌細胞に添加し、そして約２〜６時間インキュベートする。上清を、ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイのために−２０℃で貯蔵する。ＴＦから表面結合アナログ−ＦＦＲ−ｃｋ−ＶＩＩａを解離するために、細胞を、ラバーポリスマンで回収し、そして２００μｌの氷冷リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）／ＨＣｌ（ｐＨ３．０）中に１分間０℃にて再懸濁する。この細胞を、微量遠心分離器で５秒間回転し、そして上清を除去する。細胞生存率は、酸に対する曝露によって影響しない。細胞ペレットに０．５ｍｌの氷冷１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を添加し、そして１０〜２０秒間超音波処理し、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で一晩可溶化する。次いで、細胞を、遠心分離によってペレット化する。抽出物の上清中のタンパク質を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ方法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって測定する。等量の全タンパク質を含む各サンプル由来の可溶化抽出物のアリコートを、孔サイズ１，０００〜２，０００の膜フィルターに通し、より大きなタンパク質とアナログを分離する。アナログを含む濾過抽出物を、ＨＰＬＣによってクロマトグラフィーで分離する。別のアリコートを、ＥＬＩＳＡによってＴＦを定量するために使用する。ＦＦＲ−ｃｋ−ＶＩＩａピーク、ＴＦピーク、ＦＦＲ−ｃｋ−ＶＩＩａ−ＴＦピークまたはアナログ−ＦＦＲ−ｃｋ−ＶＩＩａ−ＴＦピークから分離したアナログの単一ピークの存在を、解離の証拠と解釈する。
ネガティブコントロールとしてのＦＦＲ−ｃｋ−ＶＩＩａおよびポジティブコントロールとしてのアナログ単独を単層に添加し、６時間培養し、そして可溶化した画分を同様に分析する。ＨＰＬＣを、ポンプ、ＵＶ／ｖｉｓ．検出器およびレコーダーを備えたＢｅｃｋｍａｎ液体クロマトグラフを使用して行う。Ｗａｔｅｒｓ Ｎｏｖａ−Ｐａｋ Ｃ１８カラム（１５０×３．９ｍｍ、５μｍ粒子サイズ）を使用する。移動相は、４０％テトラヒドロフランおよび１％のクエン酸を含有する６０％水（濃ＫＯＨ溶液（ｖ／ｖ）でｐＨ３．０に調節する）からなる。システムを、１ｍｌ／分の流速で定組成的に（ｉｓｏｃｒａｔｉｃａｌｌｙ）走らせる。サンプルの検出を、４２０ｎｍで行い、そして注入容量は、２０μｌである。０．２〜２０μＭの範囲にわたる較正曲線を、クルクミンアナログの定量化のために確立する。このＨＰＬＣ検出方法は、５ｎｇ／ｍｌの検出限界を提供する。
（実施例１３：ＴＦ産生およびＶＥＧＦ産生ならびにニュートラルレッド（ＮＲ）生存アッセイによる機能的分析）
ＴＦレベルおよびＶＥＧＦレベルを、上記のような実験によって得られたサンプルにおいてＥＬＩＳＡによって定量し、そしてサンプルのタンパク質濃度に基づいて調整した。さらに、癌細胞を、二連で４８ウェルプレート中でコンフルエンシーまで増殖させた。各ウェルを、アナログ−ＦＦＲ−ｃｋ−ＶＩＩａ、アナログ単独、ＦＦＲ−ｃｋ−ＶＩＩａ単独またはＤＭＳＯ（溶媒コントロール）と共に４日間インキュベートした。上清を、ＥＬＩＳＡによってＶＥＧＦレベルを認定するために回収した。１つのプレートを使用して、ＮＲアッセイによって細胞生存を測定した。他のプレートを使用して、ＥＬＩＳＡによって（細胞中の）ＴＦレベルを決定下。各ウェル中のＶＥＧＦレベルおよびＴＦレベルを、ニュートラルレッドアッセイの値によって調節した。
（実施例１４：クルクミノイドＥＦ２４は、腫瘍細胞に対してクルクミンよりも効果的である）
クルクミン、ＥＦ２４およびシスプラチンを、ＮＣＩスクリーニングシステム中の腫瘍細胞に対して試験した。ＥＦ２４は、図４に示されるように、シスプラチンまたはクルクミンのいずれよりも有意に効果的であった。クルクミノイドはまた、図５に示されるように、形質転換された胸部癌細胞に添加し、そして平均増殖阻害濃度を決定した。
図１は、第ＶＩＩ因子（ｆＶＩＩａ）のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。ボールド体の文字は、１本鎖ｆＶＩＩを２本鎖ｆＶＩＩａに変換するための切断点、およびペプチジルリンカーの共有結合したアルギニル−クロロメチルケトンを受容するＨｉｓ１９３を示す。 図２は、ＥＦ２４−テザー−リンカーの共有結合によって改変された場合の、ｆＶＩＩａの質量シフトを示す。 図３は、不死化した内皮細胞の培養液に添加した場合の、種々のクルクミノイドの平均成長阻害濃度を示す。 図４は、培養した腫瘍細胞のパネルに対して試験した場合の、種々のクルクミノイドの平均成長阻害濃度を示す。 図５は、培養した乳癌細胞に添加した場合の、種々のクルクミノイドの平均成長阻害濃度を示す。
【配列表】
Figure 2005529080
Figure 2005529080

Claims (70)

  1. 組成物であって、以下：
    （ａ）タンパク質であって、標的細胞の表面マーカーに選択的に結合する、タンパク質；
    （ｂ）該タンパク質に共有結合された、少なくとも１つのリンカー；および
    （ｃ）加水分解可能な結合によって、該リンカーに結合された、細胞傷害性化合物、
    を含む、組成物。
  2. 前記タンパク質が、前記標的細胞の表面上の組織因子に選択的に結合する、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記タンパク質が、第ＶＩＩａ因子の構成ポリペプチドである、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記タンパク質が、第ＶＩＩａ因子の構成ポリペプチドであって、かつ、該ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸位１５３と４０６との間のアミノ酸配列、またはその短縮もしくは改変された変異体を含む、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記タンパク質が、抗体および組織因子経路インヒビターから選択される、請求項１に記載の組成物。
  6. 前記タンパク質が、前記標的細胞によって内在化され得る、請求項１に記載の組成物。
  7. 前記少なくとも１つのリンカーが、ペプチジルリンカーである、請求項１に記載の組成物。
  8. 前記少なくとも１つのペプチジルリンカーが、ペプチジルメチルケトンリンカーである、請求項７に記載の組成物。
  9. 前記組成物が、テザーをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  10. 前記少なくとも１つのリンカーが、テザーである、請求項１に記載の組成物。
  11. 前記加水分解可能な結合が、カルバメート、アミド、エステル、カーボネートおよびスルホネートからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
  12. 前記少なくとも１つのリンカーが、フェニルアラニン−フェニルアラニン−アルギニンメチルケトン、チロシン−グリシン−アルギニンメチルケトン、グルタミン−グリシン−アルギニンメチルケトン、グルタミン酸−グリシン−アルギニンメチルケトンおよびフェニルアラニン−プロリン−アルギニンメチルケトンからなる群から選択される、アルギニルメチルケトンである、請求項１に記載の組成物。
  13. 前記少なくとも１つのリンカーが、チロシン−グリシン−アルギニンメチルケトンおよびフェニルアラニン−フェニルアラニン−アルギニンメチルケトンから選択される、請求項１に記載の組成物。
  14. 前記少なくとも１つのリンカーが、フェニルアラニン−フェニルアラニン−アルギニンメチルケトンである、請求項１に記載の組成物。
  15. 前記少なくとも１つのリンカーが、チロシン−グリシン−アルギニンメチルケトンである、請求項１に記載の組成物。
  16. 少なくとも１つのリンカーが、第ＶＩＩａ因子のセリンプロテアーゼ活性部位のアミノ酸鎖に共有結合され、それによって該セリンプロテアーゼ活性部位を不活性化する、請求項３に記載の組成物。
  17. 請求項１に記載の組成物であって、前記細胞傷害性化合物が、式：
    Figure 2005529080
     を有するクルクミノイドであり；
    ここで；
    Ｘ４は、（ＣＨ２）ｍ、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２またはＮＲ１２であり、ここで、Ｒ１２は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アシル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニルまたはジアルキルアミノカルボニルであり；
    ｍは、１−７であり；
    各Ｘ５は、独立してＮまたはＣ−Ｒ１１であり；
    そして、各Ｒ３−Ｒ１１は、独立して、Ｈ、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、ＣＦ３、アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アルカリール、ヘテロアリール、置換へテロアリール、複素環、置換複素環、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボキサミド、ニトロ、シアノ、アジド、アルキルカルボニル、アシル、またはトリアルキルアンモニウムであり；そして破線は、任意の二重結合を示し；但し、Ｘ４が、（ＣＨ２）ｍであり、ｍが、２−６であり、そして各Ｘ５が、Ｃ−Ｒ１１である場合、Ｒ３−Ｒ１１は、アルコキシではなく、そして、Ｘ４が、ＮＲ１２であり、そして各Ｘ５が、Ｎである場合、Ｒ３−Ｒ１０は、アルコキシ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アルカリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、置換へテロアリール、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボン酸、またはアルキルカルボニルではなく、ここで、立体異性体構造が、エナンチオマーおよびジアステレオ異性体、および幾何学的（シス−トランス）異性体を含む、組成物。
  18. Ｘ４が、−ＮＨおよび−ＮＲ１２からなる群より選択される、請求項１３に記載の組成物。
  19. Ｒ３−Ｒ１０が、ヒドロキシルおよび−ＮＨＲ１２から選択される、請求項１３に記載の組成物。
  20. 前記細胞傷害性化合物が、式：
    Figure 2005529080
     を有するクルクミノイドである、請求項１に記載の組成物。
  21. 前記テザーが、ジカルボン酸、ジスルホン酸、ω−アミノカルボン酸、ω−アミノスルホン酸、ω−アミノカルボキシスルホン酸またはそれらの誘導体からなる群から選択され、ここで、該テザーは２〜６個の炭素を含み、そして、該テザーは加水分解可能な結合を形成し得る、請求項１に記載の組成物。
  22. 前記テザーが、ジカルボン酸を含む、請求項１に記載の組成物。
  23. 前記テザーが、スクシネートである、請求項１に記載の組成物。
  24. タンパク質を含む薬学的組成物であって、該タンパク質が、標的細胞の表面マーカーに選択的に結合し、そしてここで、該タンパク質は少なくとも１つのリンカーに共有結合し、各リンカーは、それに結合した細胞傷害性化合物を有し、そしてここで該細胞傷害性化合物は、加水分解可能な結合によって該リンカーおよび薬学的に受容可能なキャリアに共有結合している、薬学的組成物。
  25. 加水分解可能な結合によって該細胞傷害性化合物に共有結合したテザーをさらに含む、請求項２４に記載の薬学的組成物。
  26. 前記加水分解可能な結合が、カルバメート、アミド、エステル、カーボネートおよびスルホネートからなる群から選択される、請求項２４に記載の薬学的組成物。
  27. 前記テザーが、ジカルボン酸、ジスルホン酸、ω−アミノカルボン酸、ω−アミノスルホン酸、ω−アミノカルボキシスルホン酸またはそれらの誘導体からなる群から選択され、ここで、該テザーは２〜６個の炭素を含み、そして、該テザーは加水分解可能な結合を形成し得る、請求項２５に記載の薬学的組成物。
  28. 前記少なくとも１つのリンカーが、フェニルアラニン−フェニルアラニン−アルギニンメチルケトン、チロシン−グリシン−アルギニンメチルケトン、グルタミン−グリシン−アルギニンメチルケトン、グルタミン酸−グリシン−アルギニンメチルケトンおよびフェニルアラニン−プロリン−アルギニンメチルケトンからなる群から選択される、アルギニルメチルケトンである、請求項２４に記載の薬学的組成物。
  29. 前記細胞傷害性化合物は、式：
    Figure 2005529080
     を有するクルクミノイドである、請求項２４に記載の薬学的組成物。
  30. 薬学的有効投薬量で処方される、請求項２４に記載の薬学的組成物。
  31. 前記タンパク質が、第ＶＩＩａ因子の構成ポリペプチドである、請求項２４に記載の薬学的組成物。
  32. 前記薬学的組成物が、静脈内注入のために処方される、請求項２４に記載の薬学的組成物。
  33. 細胞傷害性化合物−タンパク質結合体を生成する方法であって、以下の工程：
    （ａ）細胞傷害性化合物を含む生成物を合成する工程；
    （ｂ）工程（ａ）の生成物とリンカーとを共有結合させる工程；および
    （ｃ）工程（ｂ）の組成物の少なくとも１分子を標的細胞の表面マーカーに選択的に結合し得るタンパク質に共有結合させる工程、
    を包含する、方法。
  34. 請求項３３に記載の方法であって、前記細胞傷害性化合物が、式：
    Figure 2005529080
     を有するクルクミノイドであり、
    ここで：
    Ｘ４は、（ＣＨ２）ｍ、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２またはＮＲ１２であり、ここで、Ｒ１２は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アシル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニルまたはジアルキルアミノカルボニルであり；
    ｍは、１−７であり；
    各Ｘ５は、独立してＮまたはＣ−Ｒ１１であり；
    そして、各Ｒ３−Ｒ１１は、独立して、Ｈ、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、ＣＦ３、アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アルカリール、ヘテロアリール、置換へテロアリール、複素環、置換複素環、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボキサミド、ニトロ、シアノ、アジド、アルキルカルボニル、アシル、またはトリアルキルアンモニウムであり；そして破線は、任意の二重結合を示し；但し、Ｘ４が、（ＣＨ２）ｍであり、ｍが、２−６であり、そして各Ｘ５が、Ｃ−Ｒ１１である場合、Ｒ３−Ｒ１１は、アルコキシではなく、そして、Ｘ４が、ＮＲ１２であり、そして各Ｘ５が、Ｎである場合、Ｒ３−Ｒ１０は、アルコキシ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アルカリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、置換へテロアリール、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボン酸、またはアルキルカルボニルではなく、ここで、立体異性体構造が、エナンチオマーおよびジアステレオ異性体、および幾何学的（シス−トランス）異性体を含む、方法。
  35. 請求項３３に記載の方法であって、工程（ａ）が、ジカルボン酸、ジスルホン酸、ω−アミノカルボン酸、ω−アミノスルホン酸、ω−アミノカルボキシスルホン酸またはそれらの誘導体からなる群から選択されるテザーと、前記クルクミノイドとを反応させる工程を包含し、ここで、該テザーは２〜６個の炭素を含み、そして、該テザーは加水分解可能な結合を形成し得る、方法。
  36. Ｘ４が、−ＮＨおよび−ＮＲ１２からなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
  37. Ｒ３−Ｒ１０が、ヒドロキシルおよび−ＮＨＲ１２から選択される、請求項３４に記載の方法。
  38. 前記細胞傷害性化合物が、式：
    Figure 2005529080
     を有する、請求項３３に記載の方法。
  39. 工程（ａ）が、前記細胞傷害性化合物と無水ジカルボン酸とを反応させる工程を包含する、請求項３３に記載の方法。
  40. 前記無水ジカルボン酸が、無水コハク酸である、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記工程（ａ）の生成物は、式：
    Figure 2005529080
     を有する、請求項３９に記載の方法。
  42. 前記工程（ｂ）は、ペプチジルリンカーを提供する工程を包含する、請求項３３に記載の方法。
  43. 請求項４２に記載の方法であって、前記工程（ｂ）は、以下の工程：
    （ｉ）式：
    Figure 2005529080
     を有する組成物と、イソプロピルクロロホルメートおよびエセテリアルジアゾメタンとを反応させて、これによって、式：
    Figure 2005529080
     を有する化合物を生成する工程；
    （ｉｉ）式：
    Figure 2005529080
     を有する化合物と、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−ＯＨ、イソプロピルクロロホルメートおよび塩基とを反応させて、これによって、式：
    Figure 2005529080
     を有する化合物を生成する工程；
    （ｉｉｉ）化合物ａｇを脱保護して、これによって、式：
    Figure 2005529080
     を有する化合物を生成する工程、
    を包含する、方法。
  44. 前記工程（ｂ）の組成物が、式：
    Figure 2005529080
     を有する、請求項３３に記載の方法。
  45. 前記タンパク質が、第ＶＩＩａ因子の構成ポリペプチドである、請求項３３に記載の方法。
  46. 前記工程（ｂ）の組成物の少なくとも１分子が、第ＶＩＩａ因子のセリンプロテアーゼ活性部位のアミノ酸に共有結合され、それによって該活性部位を不活性化する、請求項３３に記載の方法。
  47. 前記アミノ酸が、配列番号１のＨｉｓ１９３である、請求項３６に記載の方法。
  48. 標的細胞の生理学的機能を調節する方法であって、該方法は、請求項１に記載の組成物と、その表面に表面マーカーを有する標的細胞とを接触させ、それによって、該組成物は、該表面マーカーに選択的に結合し、そして内在化され、それによって前記タンパク質から該細胞傷害性化合物を放出する工程；および、該表的細胞の生理学的機能を調節する工程を包含する、方法。
  49. 前記表面マーカーは、組織因子である、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記生理学的機能が、前記細胞の増殖であって、ここで増殖は低減される、請求項４８に記載の方法。
  51. 前記標的細胞が、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、腫瘍細胞、単球、マクロファージおよび微粒子から選択される、請求項４８に記載の方法。
  52. 前記標的細胞が、血管内皮細胞である、請求項４８に記載の方法。
  53. 前記標的細胞が、血管平滑筋細胞である、請求項４８に記載の方法。
  54. 前記血管内皮細胞が、単離された血管内皮細胞、毛細血管内皮細胞、静脈内皮細胞、動脈内皮細胞および腫瘍の脈管新生内皮細胞からなる群より選択される、請求項４８に記載の方法。
  55. 前記組成物が、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
  56. 前記標的細胞が、培養細胞である、請求項４８に記載の方法。
  57. 前記標的細胞を有する動物またはヒトに前記組成物を送達する工程をさらに包含する、請求項４８に記載の方法。
  58. 前記組成物が、局所静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、髄腔内、胸骨内の注射および注入からなる群より選択される経路によって動物またはヒトに送達される、請求項４８に記載の方法。
  59. 細胞傷害性化合物を標的細胞に選択的に送達する方法であって、該方法は、以下の工程：
    （ａ）請求項１に記載の組成物と、その表面に表面マーカーを有する標的細胞とを接触させる工程；および
    （ｂ）該標的細胞上の該表面マーカーに該組成物を結合させて、これにより、該組成物を該標的細胞に内在化し、それによって、該標的細胞の内部に該細胞傷害性化合物を送達する工程、
    を包含する、方法。
  60. 前記治療用調製物は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記細胞傷害性化合物は、式：
    Figure 2005529080
     を有するクルクミノイドであり、ここで、前記タンパク質は、第ＶＩＩａ因子の構成ポリペプチドである、請求項５９に記載の方法。
  62. 動物またはヒトにおける病理学的状態を調節する方法であって、該方法は、有効用量の請求項１に記載の組成物を、病理学的状態を有する動物被験体またはヒト被験体に投与して、それにより表面−結合マーカーを発現し得る標的細胞の増殖を低減させ、それにより、患者被験体の該病理学的状態を調節する工程を包含する、方法。
  63. 前記標的細胞の表面マーカーは、組織因子である、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記病理学的状態が、癌、凝固能亢進症、再狭窄、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチおよび皮膚障害性炎症からなる群より選択される、請求項６２に記載の方法。
  65. 前記病理学的状態が、白血病、乳癌、肺癌、肝臓癌、黒色腫および前立腺癌からなる群より選択される癌である、請求項６２に記載の方法。
  66. 前記標的細胞が、血管内皮細胞である、請求項６２に記載の方法。
  67. 前記標的細胞が、血管平滑筋細胞である、請求項６２に記載の方法。
  68. 前記標的細胞が、癌細胞である、請求項６２に記載の方法。
  69. 前記組成物は、抗脈管新生剤であり、ここで、標的細胞の増殖低減は、脈管新生を低減させる、請求項６２に記載の方法。
  70. 脈管新生の低減が、腫瘍の縮小を引き起こす、請求項６９に記載の方法。
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