FR2830016A1 - Compositions pour la vectorisation de derives taxoides a travers la barriere hematoencephalique et leur utilisation pour le traitement des cancers, plus particulierement des cancers du cerveau - Google Patents
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Abstract
La présente invention a pour objet un composé constitué d'au moins un dérivé taxoïde lié à au moins un peptide vecteur capable d'augmenter la solubilité dudit dérivé et avantageusement de permettre son transport à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE). L'invention concerne aussi la préparation de ces composés et les compositions pharmaceutiques les contenant, utiles pour le traitement de cancers, tout particulièrement des cancers du cerveau.
Description
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COMPOSITIONS POUR LA VECTORISATION DE DÉRIVÉS TAXOIDES A TRAVERS LA BARRIERE HEMATOENCEPHALIQUE ET LEUR UTILISATION POUR LE TRAITEMENT DES CANCERS, PLUS PARTICULIÈREMENT DES CANCERS DU CERVEAU.
La présente invention se rapporte à l'utilisation de dérivés de Taxoïde dans le traitement des cancers et plus particulièrement des cancers du système nerveux central, tout particulièrement du cerveau.
L'invention s'intéresse aussi principalement au transport de dérivés taxoïdes à travers la barrière hématoencéphalique (BHE). Ainsi, l'invention à pour objet un composé constitué d'au moins un dérivé taxoïde lié à au moins un peptide vecteur capable d'augmenter la solubilité dudit dérivé et avantageusement de permettre son transport à travers la barrière hémato-encéphalique. L'invention concerne aussi la préparation de ces composés et les compositions pharmaceutiques les comprenant utiles pour le traitement de cancers, tout particulièrement des cancers du cerveau.
En dépit de progrès indéniables dans la lutte contre certains cancers, force est de reconnaître que globalement les cancers progressent et qu'ils constituent, avec les maladies cardio-vasculaires, une cause majeure de mortalité. Il n'existe actuellement pas de traitement efficace contre certains cancers comme les tumeurs de cerveau. La durée de survie des patients atteints de glioblastome, par exemple, ne dépasse pas un an, même si l'on associe la chimiothérapie et la radiothérapie à la chirurgie. Le traitement des tumeurs cérébrales est limité principalement du fait de la barrière hémato-encéphalique qui isole le système nerveux central du reste de l'organisme. En conséquence, la plupart des anticancéreux doivent être administrés à des doses très importantes pour
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atteindre le système nerveux central mais au prix d'effets secondaires importants.
La découverte de nouveaux médicaments antitumoraux constitue une des priorités de la recherche médicale. Les avancées de la chimiothérapie anti-tumorale ont été obtenues grâce à des médicaments ayant une nouvelle structure chimique et/ou un nouveau mécanisme d'action, comme les anthracyclines découvertes au début des années soixante et le cisplatine une dizaine d'années plus tard.
Après une vingtaine d'années, la situation a fort heureusement à nouveau évolué avec la découverte d'une famille d'agents anti-tumoraux d'origine naturelle : les taxoïdes. Les médicaments disponibles sont le Taxol (paclitaxel), le Taxotèreg (docétaxel). Le Taxol@ et le Taxotère@ ont un large spectre d'activité clinique : leur apport est significatif, pour le moment, dans le traitement des cancers de l'ovaire et des cancers du sein résistants aux anthracyclines. L'une des cibles privilégiées de cette chimiothérapie est constituée par les microtubules qui forment un fuseau sur lequel migrent les chromosomes à la fin de la division de la cellule (mitose). Les médicaments exerçant leur activité sur ce fuseau sont des antimitotiques qui bloquent la mitose et empêchent les cellules de se reproduire. Le Taxol agit sur la même cible, mais à la différence des vinca-alcaloïdes, il stabilise ce fuseau et inhibe d'une autre manière la reproduction cellulaire. Malheureusement, le Taxol et ses analogues présentent l'inconvénient d'être très peu soluble dans l'eau. Il est donc généralement administré chez les patients dans un solvant (Cremophor EL) qui est responsable de phénomènes d'hypersensibilité (allergie). Comme dans la plupart des chimiothérapies, les Taxoïdes, tel que le Taxol, entraînent une diminution des globules blancs et des plaquettes. En plus de sa toxicité, il a été décrit dans la littérature que le Taxol ne passe pas dans le cerveau et
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est exclut par la barrière hémato-encéphalique (Heimans et al ; Ann Oncol 1994,10 : 951-953). Tout ceci limite fortement l'utilisation de cet agent antimitotique pour le traitement de plusieurs cancers et notamment les tumeurs cérébrales.
Plusieurs stratégies ont été proposées pour améliorer les propriétés du Taxol.
Des centaines de dérivés de taxol comme ceux décrits dans les brevets et demandes de brevet US 4814470, WO 9302065, WO 9407880, ont été synthétisés, mais les résultats ont été décevants. Ces dérivés présentent le même problème de solubilité que le Taxol ou sont moins actifs que le Taxol.
- Des prodrogues de Taxol qui sont métabolisés in vivo pour libérer le Taxol ont été proposés par exemple dans les brevets et demandes de brevet US 576072, WO 09813059). Mais, dans la plupart des cas, l'activité anticancéreuse est diminuée.
Des vecteurs comme les liposomes (US 5,648, 090) ou le DHA (US 6,080, 877) ont été proposés pour améliorer la solubilité du Taxol. Mais, ces méthodes ne donnent aucune indication sur le passage du Taxol à travers la barrière hémato-encéphalique.
La Demanderesse a mis en évidence que des vecteurs peptidiques linéaires, tels que les peptides linéaires dérivés de peptides naturels comme la Protégrine et la Tachyplésine transportent des molécules actives à travers la BHE et améliorent les propriétés pharmacologiques de ces molécules. Les travaux et résultats concernant ces peptides linéaires et leur utilisation comme vecteurs de molécules actives à travers la barrière hématoencéphalique ont été décrits dans les demandes de brevet français NO 98/15074 déposée le 30 Novembre 1998 et dans la
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demande de brevet français NO 99/02938 déposée le 26 Novembre 1999.
La présente invention a donc pour objet des composés constitués d'au moins un dérivé de Taxoïde lié à au moins un peptide linéaire capable d'augmenter la solubilité dudit dérivé et de le vectoriser à travers la barrière hémato-encéphalique.
Un premier groupe de peptides linéaires mis en oeuvre dans le cadre des composés de l'invention sont ceux comprenant un domaine de transduction. On entend par domaine de transduction, une séquence peptidique capable de pénétrer à l'intérieur des cellules. A titre d'exemples de domaines de transduction, et de manière non-limitative, on peut citer : - Les peptides dérivés de la protéine Tat de HIV1 [Fawell et al, Proc. Natl. Acad. Sci 91 ; 664 (1994) ; Schwarze et al, Science 285 ; 1569 (1999)]. Il s'agit par exemple du fragment 48-60 de la protéine tat de séquence SEQ ID NO : 1 : GRKKRRQRRRPPQ, ou d'un fragment comprenant cette séquence comme le fragment 37-72.
- La pénétratine [Derossi et al, J. Biol. Chem 269,10444 (1994) ; Brevet US 5888762)], de séquence SEQ ID NO : 2 : RQIKIWFQNRRMKWKK
Les séquences signales, ou séquences de translocation membranaires (MTSs) de peptides. Celles-ci sont reconnues par un accepteur de protéines qui participe à l'adressage de la pré-protéine depuis la machinerie de traduction jusque dans la membrane de l'organelle intracellulaire approprié. Les MTSs qui dirigent les protéines dans le même compartiment intracellulaire, comme le reticulum endoplasmique (RE) ou les mitochondries partagent plusieurs caractères structuraux. Les MTS RE contiennent 17 à 52 acides aminés organisées avec une section chargée positivement à l'extrémité N-terminale, un
Les séquences signales, ou séquences de translocation membranaires (MTSs) de peptides. Celles-ci sont reconnues par un accepteur de protéines qui participe à l'adressage de la pré-protéine depuis la machinerie de traduction jusque dans la membrane de l'organelle intracellulaire approprié. Les MTSs qui dirigent les protéines dans le même compartiment intracellulaire, comme le reticulum endoplasmique (RE) ou les mitochondries partagent plusieurs caractères structuraux. Les MTS RE contiennent 17 à 52 acides aminés organisées avec une section chargée positivement à l'extrémité N-terminale, un
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intersegment hydrophobe et une région C-terminale polaire avec des sites de reconnaissance de peptidase. On peut citer comme séquences signales celles de séquences SEQ ID NO : 3 : GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV, ou de séquence SEQ ID NO : 4 : AAVALLPAVLLALLAP.
Un second groupe de peptides linéaires selon l'invention sont dérivés de Protégrines et Tachyplésines.
Les Protégrines et Tachyplésines sont des peptides antibiotiques naturels dont la structure est de type épingle à cheveux maintenue par des ponts disulfures. Ces ponts jouent un rôle important dans l'activité cytolytique observée sur cellules humaines.
On désigne sous le nom de protégrines un ensemble de cinq peptides désignés PG-1, PG-2, PG-3, PG-4 et PG-5 dont les séquences sont données ci-dessous, étroitement apparentés et isolés de leucocytes de porc (V. N. Kokryakov & col. FEBS lett. 327,231-236) :
SEQ ID NO : 5 : PG-1 : RGGRLCYCRRRFCVCVGR-NH2
SEQ ID NO : 6 : PG-2 : RGGRLCYCRRRFCICV..-NH2
SEQ ID NO : 7 : PG-3 : RGGGLCYCRRRFCVCVGR-NH2
SEQ ID NO : 8 : PG-4 : RGGRLCYCRGWICFCVGR-NH2
SEQ ID NO : 9 : PG-5 : RGGRLCYCRPRFCVCVGR-NH2
Les tachyplésines (Tamura, H. et al., 1993, Chem. Pharm. Bul. Tokyo 41,978-980), désignées Tl, T2 et T3 et les polyphémusines (Muta, T., 1994, CIBA Found. Sym.
SEQ ID NO : 5 : PG-1 : RGGRLCYCRRRFCVCVGR-NH2
SEQ ID NO : 6 : PG-2 : RGGRLCYCRRRFCICV..-NH2
SEQ ID NO : 7 : PG-3 : RGGGLCYCRRRFCVCVGR-NH2
SEQ ID NO : 8 : PG-4 : RGGRLCYCRGWICFCVGR-NH2
SEQ ID NO : 9 : PG-5 : RGGRLCYCRPRFCVCVGR-NH2
Les tachyplésines (Tamura, H. et al., 1993, Chem. Pharm. Bul. Tokyo 41,978-980), désignées Tl, T2 et T3 et les polyphémusines (Muta, T., 1994, CIBA Found. Sym.
186,160-174), désignées Pi et P2, dont les séquences sont données ci-dessous, sont des peptides homologues isolés de l'hémolymphe de deux crabes, Tachyplesus tridentatus pour les tachyplésines Tl, T2 et T3 et Limmulus polyphemus pour les polyphémusines PI et P2 :
SEQ ID NO : 10 : PI : RRWCFRVCYRGFCYRKCR-NH2
SEQ ID NO : 11 : P2 : RRWCFRVCYKGFCYRKCR-NH2 Protégrines, tachyplésines et polyphémusines contiennent une forte proportion de résidus basiques (lysines et arginines) et possèdent quatre cystéines qui forment deux ponts disulfures paralléles. Ces trois
SEQ ID NO : 10 : PI : RRWCFRVCYRGFCYRKCR-NH2
SEQ ID NO : 11 : P2 : RRWCFRVCYKGFCYRKCR-NH2 Protégrines, tachyplésines et polyphémusines contiennent une forte proportion de résidus basiques (lysines et arginines) et possèdent quatre cystéines qui forment deux ponts disulfures paralléles. Ces trois
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familles de peptides présentent également des homologies avec certaines défensines et en particulier avec la défensine humaine NP-1 (Kokryakov, V. N. et al., 1993, Febs Let. 327,231-236).
L'invention a donc pour objet un composé constitué d'au moins un dérivé de Taxoïde lié à au moins un peptide linéaire choisi dans le groupe comprenant : - un peptide linéaire dérivé de protégrines ou de tachyplésines, - un peptide linéaire comprenant un domaine de transduction.
L'invention envisage tout particulièrement comme peptides linéaires comprenant un peptide transduction choisi, de manière non-limitative, parmi : les domaines de transduction dérivés de la protéine Tat de HIV1 les domaines de transduction dérivés de la troisième hélice d'Antennapedia - les domaines de transduction d'une séquence signal
L'invention envisage tout particulièrement comme peptides linéaires dérivés de Protégrines, un peptide qui répond à la formule (I) suivante :
BX (X ou B) BXXXXBBBXXXXXXB (I) et par peptide linéaire dérivé de Tachyplésines, un peptide qui répond à la formule (II) suivante :
BXXXBXXXBXXXXBBXB (II), dans lesquelles : - les groupes B, identiques ou différents, représentent un résidu d'acide aminé dont la chaîne latérale porte un groupement basique, et - les groupes x, identiques ou différents, représentent un résidu d'acide aminé aliphatique ou aromatique
L'invention envisage tout particulièrement comme peptides linéaires dérivés de Protégrines, un peptide qui répond à la formule (I) suivante :
BX (X ou B) BXXXXBBBXXXXXXB (I) et par peptide linéaire dérivé de Tachyplésines, un peptide qui répond à la formule (II) suivante :
BXXXBXXXBXXXXBBXB (II), dans lesquelles : - les groupes B, identiques ou différents, représentent un résidu d'acide aminé dont la chaîne latérale porte un groupement basique, et - les groupes x, identiques ou différents, représentent un résidu d'acide aminé aliphatique ou aromatique
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ou lesdits peptides de formules (I) ou (II), sous forme rétro, constitués d'acides aminés de configuration D et/ou L, ou un fragment de ceux-ci constitué d'une séquence d'au moins 5 et de préférence d'au moins 7 acides aminés successifs des peptides de formules (I) ou (II).
On peut citer comme exemple, les significations de B et X suivantes :
B est choisi parmi l'arginine, la lysine, l'acide diaminoacétique, l'acide diaminobutyrique, l'acide diaminopropionique, l'ornithine.
B est choisi parmi l'arginine, la lysine, l'acide diaminoacétique, l'acide diaminobutyrique, l'acide diaminopropionique, l'ornithine.
X est choisi parmi glycine, l'alanine, la valine, la norleucine, l'isoleucine, la leucine, la
Acm cystéine, la cystéine, la penicillamine, la méthionine, le serine, la thréonine, l'asparagine, la glutamine, la phényalanine, l'histidine, le tryptophane, la tyrosine, la proline, l'Abu, l'acide amino-1-cyclohexane carboxylique, l'Aib, la 2-aminotétraline carboxylique, la 4bromophényalanine, tert-Leucine, la 4-chlorophénylalanine, la bêta-cyclohexyalanine, la 3,4-dichlorophényalanine, la 4-fluorophényalanine, l'homoleucine, la bêta-homoleucine, l'homophényalanine, la 4-méthylphényalanine, la 1naphtyalanine, la 2-naphtyalanine, la 4-nitrophényalanine, la 3-nitrotyrosine, la norvaline, la phénylglycine, la 3pyridyalanine, la [2-thiényl] alanine.
Acm cystéine, la cystéine, la penicillamine, la méthionine, le serine, la thréonine, l'asparagine, la glutamine, la phényalanine, l'histidine, le tryptophane, la tyrosine, la proline, l'Abu, l'acide amino-1-cyclohexane carboxylique, l'Aib, la 2-aminotétraline carboxylique, la 4bromophényalanine, tert-Leucine, la 4-chlorophénylalanine, la bêta-cyclohexyalanine, la 3,4-dichlorophényalanine, la 4-fluorophényalanine, l'homoleucine, la bêta-homoleucine, l'homophényalanine, la 4-méthylphényalanine, la 1naphtyalanine, la 2-naphtyalanine, la 4-nitrophényalanine, la 3-nitrotyrosine, la norvaline, la phénylglycine, la 3pyridyalanine, la [2-thiényl] alanine.
A titre d'exemples, de dérivés de Taxoïde mis en oeuvre dans les composés de l'invention, on peut citer le Taxol, le Taxotère, ou tout autre dérivé du Taxol qui est substitué en une ou plusieurs positions comme les positions C7, C9, C10, C19, R, etc.
La liaison entre le dérivé Taxoïde et le peptide linéaire dans les composés de l'invention est choisie parmi une liaison covalente, une liaison hydrophobe, une liaison ionique, une liaison clivable ou
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une liaison non clivable dans les milieux physiologiques ou à l'intérieur des cellules.
Cette liaison peut être directe ou indirecte par l'intermédiaire d'un bras de liaison (linker) et effectuée au moyen d'un groupe fonctionnel naturellement présent ou introduit soit sur le peptide, soit sur le dérivé Taxoïde, soit sur les deux. Ce bras de liaison s'il est présent doit être acceptable compte tenu de la nature chimique et de l'encombrement tant du peptide que du dérivé Taxoïde. On peut citer à titre d'exemple de tels linkers contenant des groupements alkyle, aryle, aralkyle ou peptidique, des esters, aldéhydes ou acides d'alkyle, aryle ou aralkyle, des groupements anhydrides, sulfhydriles, ou carboxyles tels que les dérivés de l'acide maleymil benzoïque, de l'acide maleymil propionique et des dérivés succynimidyle, des groupes dérivés du bromure ou chlorure de cianogène, carbonyldiimidazole, des esters de succinimide ou des halogenures sulphoniques.
Comme groupes fonctionnels, on peut citer : -OH,-SH,-COOH, ou-NH2. Ainsi, le ou les dérivés Taxoïdes peuvent être liés par des liaisons covalentes au niveau des extrémités N-terminale ou C-terminale ou bien au niveau des chaînes latérales du peptide.
Un type de liaison préféré entre le ou les dérivés Taxoïdes et le ou les peptides linéaires implique au moins un pont disulfure. En effet, ce type de liaison se caractérise par sa stabilité dans le plasma après injection du composé, puis une fois que les composés de l'invention ont traversé la barrière hémato-encéphalique, ledit pont disulfure est réduit en libérant le dérivé Taxoïde. La liaison peut être effectuée en n'importe quel site du peptide comme indiqué précédemment.
La présente invention a aussi pour objet une méthode de traitement des cancers, particulièrement des
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cancers du cerveau consistant à administrer à un sujet soufrant d'un tel cancer une quantité efficace d'un composé décrit précédemment. L'invention concerne donc une composition pharmaceutique pour le traitement des cancers et particulièrement des cancers du cerveau comprenant à titre d'agent actif au moins un composé décrit précédemment.
De préférence, ladite composition pharmaceutique se présente sous une forme appropriée pour une administration par voie parentérale, par voie orale, par voie rectale, par voie nasale, par voie transdermique, par voie pulmonaire, par voie centrale.
Comme indiqué précédemment, les peptides linéaires mis en oeuvre dans le cadre des composés de l'invention sont remarquables en ce qu'ils sont capables de solubiliser les dérivés Taxoïdes dans l'eau et ainsi de permettre de nouvelle formulation de ces dérivés susceptible d'augmenter leur efficacité et de réduire les effets secondaires.
L'invention a donc tout spécialement pour objet des compositions pharmaceutiques pour le traitement des cancers et plus particulièrement des cancers du cerveau comprenant au moins un dérivé de Taxoïde, caractérisée en ce que ledit dérivé taxoïde se présente sous la forme d'un composé soluble dans l'eau dans lequel le dérivé taxoïde est lié à au moins un peptide linéaire comme défini précédemment.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'un peptide linéaire comme défini précédemment pour solubiliser un dérivé Taxoïde.
L'invention a encore pour objet l'utilisation d'un peptide linéaire défini précédemment pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des cancers, ledit peptide étant lié à au
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moins un dérivé Taxoïde de façon à rendre celui-ci soluble dans l'eau.
L'invention concerne encore l'utilisation d'un peptide linéaire défini précédemment pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des cancers du cerveau, ledit peptide étant lié à au moins un dérivé Taxoïde pour vectoriser celui-ci à travers la BHE.
L'invention concerne enfin l'utilisation d'un peptide linéaire pour la préparation d'un médicament comme défini précédemment pour être administré à un sujet en combinaison avec un autre composé anticancéreux tels que, de manière non-limitative, la carmustine, la doxorubicine, le méthotréxate, etc.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent concernant la préparation d'un composé constitué du taxol et d'un peptide linéaire et son activité. Il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels : - la figure 1 représente schématiquement la synthèse chimique d'un composé vectorisé du Taxol.
- la figure 2 illustre le passage à travers la barrière hémato-encéphalique du composé 1 (Taxol), le composé 2 (Taxol vectorisé).
1-Synthèse Chimique du Taxol vectorisé.
1) Synthèse du peptide vecteur
Le peptide SynB3 de séquence SEQ ID NO : 12 : RRLSYSRRRF, est assemblé sur phase solide selon une stratégie Foc/tu, clivé et déprotégé par l'acide trifluoroacétique, puis purifié par chromatographie haute pression préparative en phase inverse et lyophilisé. Sa pureté ( > 95%) et son identité sont confirmées par HPLC analytique et par spectrométrie de masse.
Le peptide SynB3 de séquence SEQ ID NO : 12 : RRLSYSRRRF, est assemblé sur phase solide selon une stratégie Foc/tu, clivé et déprotégé par l'acide trifluoroacétique, puis purifié par chromatographie haute pression préparative en phase inverse et lyophilisé. Sa pureté ( > 95%) et son identité sont confirmées par HPLC analytique et par spectrométrie de masse.
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2) Couplage du Taxol sur SynB3
100 mg de Taxol (Paclitaxel, 1 eq) sont dissous dans 1 mL de Dimethylformamide (DMF). Ajout de 12 mg d'anhydride succinique (Succ20,1 eq) dans 120 uL DMF.
100 mg de Taxol (Paclitaxel, 1 eq) sont dissous dans 1 mL de Dimethylformamide (DMF). Ajout de 12 mg d'anhydride succinique (Succ20,1 eq) dans 120 uL DMF.
Ajout de 1.47 mg de Dimethylaminopyridine (DMAP, 0.1 eq) dans 14 uL de DMF. Ajout de 40 uL de Diisopropylethylamine (DIEA, 2 eq). Incubation 1 heure. Contrôle de la formation d'hémisuccinate de Paclitaxel par spectrométrie de masse.
Addition de 200 mg (1,2 eq) du peptide vecteur SynB3 dissous dans 2 mL DMF. Ajout de 75 mg de PyBOP (1,2 eq) puis de DIEA (41 uL, 2 eq). Incubation 20 min. Contrôle de la formation du produit de couplage par spectrométrie de masse et HPLC analytique.
Précipitation du produit de couplage par l'éther, centrifugation et reprise du brut dans 2 mL H20/Acetonitrile 50/50-TFA 0,1%. Purification sur HPLC préparative phase reverse, suivie d'une lyophilisation.
II-Composés testés
Les composés testés sont dans le tableau 1 cidessous.
Les composés testés sont dans le tableau 1 cidessous.
Tableau 1
<tb>
<tb> Composé
<tb> Composé <SEP> 1 <SEP> Taxol
<tb> Composé <SEP> 2 <SEP> Taxol-RRLSYSRRRF
<tb>
<tb> Composé
<tb> Composé <SEP> 1 <SEP> Taxol
<tb> Composé <SEP> 2 <SEP> Taxol-RRLSYSRRRF
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1) Essai utilisé : test de cytotoxicité
Les cellules 9L ont été obtenues commercialement auprès de l'ATCC. Les cellules sont ensemencées à environ 104 cellules par puits, 24 h avant l'addition des produits. Elles sont alors à 60-80% de confluence le jour de l'expérience. Les cellules sont maintenues en culture à 370C dans une atmosphère à 95% d'humidité et 5% de CO2 dans un milieu OptiMem@.
Les cellules 9L ont été obtenues commercialement auprès de l'ATCC. Les cellules sont ensemencées à environ 104 cellules par puits, 24 h avant l'addition des produits. Elles sont alors à 60-80% de confluence le jour de l'expérience. Les cellules sont maintenues en culture à 370C dans une atmosphère à 95% d'humidité et 5% de CO2 dans un milieu OptiMem@.
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Les cellules sont incubées soit avec le Taxol libre soit avec le Taxol vectorisé à des concentrations croissantes pendant 48 heures. A la fin du temps de culture, le MTT (3- (4, 5-diméthylthiazole-2-yl)-2, 5diphényltétrazolium bromure) est rajouté dans les puits et les plaques de culture sont ensuite incubées pendant 4 heures dans l'étuve. Le dépôt cristallin de formazan résultant est alors dissout par addition de 200 gl de DMF/SDS. La densité optique (DO) est mesurée à 550 nm (référence 630 nm) en utilisant un lecteur de microplaques.
La représentation graphique des pourcentages de DO des puits traités en fonction de la concentration de produits permet de déterminer la ICso. Celle-ci correspond à la concentration du produit inhibant 50% de la croissance.
2) Perfusion Cérébrale in situ
Des souris (20-25 g, Iffa-Credo ; l'Arbresle, France) sont anesthésiés. Après exposition de la carotide commune, l'artère carotide externe droite est liée au niveau de la bifurcation avec la carotide interne et la carotide commune est liée entre le coeur et le site d'implantation du cathéter (cathéter polyéthylène, ID : 0.76). Celui-ci, préalablement rempli par une solution d'héparine (100 unités/ml) est inséré dans la carotide commune. Les souris sont perfusées avec le tampon de perfusion (128 mM NaCl, 24 mM NaHC03, 4,2 mM KCl, 2,4 mM NaH2P04, 1.5 mM Cal2, 0. 9 mM MgSO, et 9 mM D-glucose). Ce tampon est filtré puis bullé par un mélange contenant 95% O2/5% CO2 afin de maintenir le pH proche de 7,4 et d'alimenter le cerveau en oxygène au cours de la perfusion.
Des souris (20-25 g, Iffa-Credo ; l'Arbresle, France) sont anesthésiés. Après exposition de la carotide commune, l'artère carotide externe droite est liée au niveau de la bifurcation avec la carotide interne et la carotide commune est liée entre le coeur et le site d'implantation du cathéter (cathéter polyéthylène, ID : 0.76). Celui-ci, préalablement rempli par une solution d'héparine (100 unités/ml) est inséré dans la carotide commune. Les souris sont perfusées avec le tampon de perfusion (128 mM NaCl, 24 mM NaHC03, 4,2 mM KCl, 2,4 mM NaH2P04, 1.5 mM Cal2, 0. 9 mM MgSO, et 9 mM D-glucose). Ce tampon est filtré puis bullé par un mélange contenant 95% O2/5% CO2 afin de maintenir le pH proche de 7,4 et d'alimenter le cerveau en oxygène au cours de la perfusion.
Les souris sont perfusées avec le tampon contenant le Taxol libre ou le Taxol vectorisé. Dans chaque produit le Taxol est radiomarqué au carbon 14 (activité spécifique : 55 mCi/mmole, Sigma, France). Juste avant le début de la perfusion, le coeur est arrêté par
<Desc/Clms Page number 13>
section des ventricules, ceci afin d'éviter au cours de la perfusion un reflux du perfusat. L'hémisphère droit est alors perfusé à une vitesse de 10 ml/min pendant 60 secondes après quoi la souris est décapitée. La quantité de radioactivité dans l'hémisphère droit est alors mesurée et la pénétration cérébrale (Kin) est calculée.
III-Résultats.
1) Solubilité.
Comme indiqué précédemment, le Taxol est très insoluble dans l'eau ou dans les tampons biologiques. Quand le Taxol est vectorisé avec le peptide vecteur SynB3, sa solubilité était de plus de 10 g/l. Ceci indique que la vectorisation permet d'améliorer de façon significative la solubilité du Taxol.
2) cytotoxicité.
La sensibilité des cellules 9L au taxol libre et au taxol vectorisé a été mesurée par le test MTT dans les conditions expérimentales définies ci dessus pour lesquelles la relation entre la densité optique et le nombre de cellules viables est linéaire.
Les cellules sont incubées avec des concentrations croissantes de produit et après 24 heures d'incubation, la survie des cellules est mesurée par le test MTT.
Le tableau I représente les concentrations en produits entraînant 50% d'inhibition de croissance (IC) déterminées pour le Taxol libre et vectorisé dans les cellules 9L.
Tableau 1
<tb>
<tb> IC50 <SEP> (cellules <SEP> 9L)
<tb> Taxol <SEP> libre <SEP> 3.5 <SEP> uM
<tb> Taxol-SynB3 <SEP> 0. <SEP> 6 <SEP> uM
<tb>
<tb> IC50 <SEP> (cellules <SEP> 9L)
<tb> Taxol <SEP> libre <SEP> 3.5 <SEP> uM
<tb> Taxol-SynB3 <SEP> 0. <SEP> 6 <SEP> uM
<tb>
<Desc/Clms Page number 14>
Ces résultats montrent que l'IC50 pour le Taxol libre est de 3,5 uM alors que celle du Taxol vectorisé est de 0.6 uM. Ceci indique que le Taxol vectorisé est environ 5 fois plus actif que le Taxol libre.
3) Pénétration dans le cerveau.
Dans cette étude, nous avons comparé la pénétration dans la BHE du Taxol libre avec celle du Taxol vectorisé. Les deux produits ont été perfusés dans le cerveau de la souris. Après 60 secondes de perfusion dans le tampon, la pénétration des produits est estimée par la constante d'influx ou Kin en ul/sec/g. La figure 2 montre que la vectorisation du Taxol par le vecteur SynB3 augmente son passage dans le cerveau d'environ 12 fois après une perfusion de 60 secondes dans du tampon.
Claims (15)
1) Un composé constitué d'au moins un dérivé de Taxoïde lié à au moins un peptide linéaire choisi dans le groupe comprenant : - un peptide linéaire dérivé de protégrines ou de tachyplésines, - un peptide linéaire comprenant un domaine de transduction.
2) Un composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le peptide linéaire est un dérivé de de protégrines ou de tachyplésines choisi parmi ceux de formules (I) ou (II) suivantes :
BX (X ou B) BXXXXBBBXXXXXXB (I)
BXXXBXXXBXXXXBBXB (II), dans lesquelles : - les groupes B, identiques ou différents, représentent un résidu d'acide aminé dont la chaîne latérale porte un groupement basique, et les groupes X, identiques ou différents, représentent un résidu d'acide aminé aliphatique ou aromatique ou lesdits peptides de formules (I) ou (II), sous forme rétro, constitués d'acides aminés de configuration D et/ou L, ou un fragment de ceux-ci constitué d'une séquence d'au moins 5 et de préférence d'au moins 7 acides aminés successifs des peptides de formules (I) ou (II).
3) Un composé selon la revendication 2, caractérisé en ce que dans les formules (I) et (II), B et X ont les significations suivantes :
<Desc/Clms Page number 16>
B est choisi parmi l'arginine, la lysine, l'acide diaminoacétique, l'acide diaminobutyrique, l'acide diaminopropionique, l'ornithine.
Acm cystéine, la cystéine c, la penicillamine, la méthionine, le serine, la thréonine, l'asparagine, la glutamine, la phényalanine, l'histidine, le tryptophane, la tyrosine, la proline, l'Abu, l'acide amino-1-cyclohexane carboxylique, l'Aib, la 2-aminotétraline carboxylique, la 4bromophényalanine, tert-Leucine, la 4-chlorophénylalanine, la bêta-cyclohexyalanine, la 3,4-dichlorophényalanine, la 4-fluorophényalanine, l'homoleucine, la bêta-homoleucine, l'homophényalanine, la 4-méthylphényalanine, la 1naphtyalanine, la 2-naphtyalanine, la 4-nitrophényalanine, la 3-nitrotyrosine, la norvaline, la phénylglycine, la 3pyridyalanine, la [2-thiényl] alanine.
X est choisi parmi glycine, l'alanine, la valine, la norleucine, l'isoleucine, la leucine, la
4) Un composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le peptide linéaire comprend un domaine de transduction choisi dans le groupe comprenant : les domaines de transduction dérivés de la protéine Tat de HIV1,
les domaines de transduction dérivés de la troisième hélice d'Antennapedia, les domaines de transduction d'une séquence signal.
5) Un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le dérivé de Taxoïde est choisi parmi le Taxol, le Taxotère, ou tout autre dérivé du Taxol qui est substitué en une ou plusieurs positions comme les positions C7, C9, C10, C19, R.
<Desc/Clms Page number 17>
6) Un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la liaison entre le dérivé Taxoïde et le peptide linéaire est choisie parmi une liaison covalente, une liaison hydrophobe, une liaison ionique, une liaison clivable ou une liaison non clivable dans les milieux physiologiques ou à l'intérieur des cellules.
7) Un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la liaison entre le dérivé Taxoïde et le peptide linéaire est une liaison directe ou indirecte par l'intermédiaire d'un bras de liaison.
8) Un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la liaison entre le dérivé Taxoïde et le peptide linéaire est réalisée au moyen d'un groupe fonctionnel naturellement présent ou introduit soit sur le peptide, soit sur le dérivé Taxoïde, soit sur les deux.
9) Un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le ou les dérivés Taxoïdes sont liés par des liaisons covalentes au niveau des extrémités N-terminale ou C-terminale ou bien au niveau des chaînes latérales du ou des peptides.
10) Une composition pharmaceutique pour le traitement des cancers et particulièrement des cancers du cerveau comprenant à titre d'agent actif à moins un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.
11) Une composition pharmaceutique pour le traitement des cancers et particulièrement des cancers du cerveau comprenant au moins un dérivé de Taxoïde,
<Desc/Clms Page number 18>
9.
caractérisée en ce que ledit dérivé Taxoïde se présente sous la forme d'un composé soluble dans l'eau dans lequel le dérivé taxoïde est lié à au moins un peptide linéaire comme défini dans l'une quelconque des revendications 1 à
12) Utilisation d'un peptide linéaire comme défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 9 pour solubiliser un dérivé Taxoïde.
13) Utilisation d'un peptide linéaire comme défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 9 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des cancers, ledit peptide étant lié à au moins un dérivé Taxoïde de façon à rendre celui- ci soluble dans l'eau.
14) Utilisation d'un peptide linéaire comme défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 9 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des cancers, ledit peptide étant lié à au moins un dérivé Taxoïde pour vectoriser celui-ci à travers la BHE.
15) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 13 ou 14 caractérisé en ce que le médicament est administré à un sujet en combinaison avec un composé anticancéreux tels que la carmustine, la doxorubicine, le méthotréxate.
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