WO2003026701A1 - Vectorisation de derives taxoides a travers la barriere hematoencephalique - Google Patents

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WO2003026701A1
WO2003026701A1 PCT/FR2002/003290 FR0203290W WO03026701A1 WO 2003026701 A1 WO2003026701 A1 WO 2003026701A1 FR 0203290 W FR0203290 W FR 0203290W WO 03026701 A1 WO03026701 A1 WO 03026701A1
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linear peptide
peptide
taxoid
compound according
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Jamal Temsamani
Anthony R. Rees
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Synt:Em
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to the use of Taxoid derivatives in the treatment of cancers and more particularly cancers of the central nervous system, very particularly of the brain.
  • the invention is also mainly concerned with the transport of taxoid derivatives across the blood-brain barrier (BBB).
  • BBB blood-brain barrier
  • the subject of the invention is a compound consisting of at least one taxoid derivative linked to at least one vector peptide capable of increasing the solubility of said derivative and advantageously of allowing its transport across the blood-brain barrier.
  • the invention also relates to the preparation of these compounds and to the pharmaceutical compositions comprising them useful for the treatment of cancers, especially brain cancers.
  • Taxol ® and Taxotère ® have a wide spectrum of clinical activity: their contribution is significant, for the moment, in the treatment of ovarian and breast cancers resistant to anthracyclines.
  • One of the preferred targets of this chemotherapy is the microtubules which form a spindle on which the chromosomes migrate at the end of the division of the cell (mitosis).
  • the drugs that work on this spindle are antimitotics that block mitosis and prevent cells from reproducing. Taxol acts on the same target, but unlike vinca alkaloids, it stabilizes this spindle and in another way inhibits cell reproduction.
  • Taxol and its analogs have the disadvantage of being very sparingly soluble in water. It is therefore generally administered to patients in a solvent (Cremophor EL) which is responsible for hypersensitivity phenomena (allergy). As in most chemotherapies, Taxoids, such as Taxol, cause a decrease in white blood cells and platelets. In addition to its toxicity, it has been described in the literature that Taxol does not pass into the brain and is excluded by the blood-brain barrier (Heimans et al; Ann Oncol 1994, 10 .951-953). All this greatly limits the use of this antimitotic agent for the treatment of several cancers and in particular brain tumors.
  • Taxol prodrugs which are metabolized in vivo to release Taxol have been proposed for example in patents and patent applications US 576072, WO
  • linear peptide vectors such as linear peptides derived from natural peptides such as Protegrin and Tachyplesin transport active molecules through the BBB and improve the pharmacological properties of these molecules.
  • the work and results concerning these linear peptides and their use as vectors of active molecules across the blood-brain barrier have been described in French patent applications No. 98/15074 filed on November 30, 1998 and in the French patent application N ° 99/02938 filed on November 26, 1999.
  • the present invention therefore relates to compounds consisting of at least one Taxoid derivative linked to at least one linear peptide capable of increasing the solubility of said derivative and of vectorizing it across the blood-brain barrier.
  • a first group of linear peptides used in the context of the compounds of the invention are those comprising a transduction domain.
  • transduction domain is meant a peptide sequence capable of penetrating inside the cells.
  • transduction domains and in a nonlimiting manner, there may be mentioned:
  • MTSs membrane translocation sequences
  • ER endoplasmic reticulum
  • MTS RE contain 17 to 52 amino acids organized with a positively charged section at the N-terminus, a hydrophobic intersegment and a polar C-terminal region with peptidase recognition sites.
  • sequences SEQ ID NO: 3 Gly-Ala-Leu-Phe-Leu-Gly-Trp-Leu-Gly-Ala-Ala-Gly-Ser-Thr-Met-Gly-Ala-Trp -Ser-Gln-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val, or of sequence SEQ ID NO: 4: Ala-Ala-Val-Ala-Leu-Leu-Pro-Ala- Val-Leu-Leu- Ala-Leu-Leu-Ala-Pro.
  • a second group of linear peptides according to the invention are derived from Proteins and Tachyplines. Proteins and Tachyplesins are natural antibiotic peptides whose structure is of the hairpin type maintained by disulfide bridges. These bridges play an important role in the cytolytic activity observed on human cells.
  • Protinins are used to designate a set of five peptides designated PG-1, PG-2, PG-3, PG-4 and PG-5, the sequences of which are given below, closely related and isolated from pig leukocytes ( VN Kokryakov & col. FEBS lett. 327, 231-236):
  • SEQ ID NO: 5 PG-1: Arg-Gly-Gly-Arg-Leu-Cys- Tyr-Cys-Arg-Arg-Arg-Phe-Cys-Val-Cys-Val-Gly-Arg-NH 2
  • SEQ ID NO: 6 PG-2: Arg-Gly-Gly-Arg-Leu-Cys- Tyr-Cys-Arg-Arg-Arg-Phe-Cys-Ile-Cys-Val-NH 2
  • SEQ ID NO: 7 PG-3: Arg-Gly-Gly-Gly-Leu-Cys- Tyr-Cys-Arg-Arg-Arg-Phe-Cys-Val-Cys-Val-Gly-Arg-NH 2
  • SEQ ID NO: 8 PG-4: Arg-Gly-Gly-Arg-Leu-Cys- Tyr-Cys-Arg-Gly-Trp-Ile-Cys-Phe-Cys-Val-Gly-Arg-NH 2
  • SEQ ID NO: 9 PG-5: Arg-Gly-Gly-Arg-Leu-Cys-
  • Tachyplesins (Tamura, H. et al., 1993, Chem. Pharm. Bul. Tokyo 41, 978-980), designated Tl, T2 and T3 and polyphemusines (Muta, T., 1994, CIBA Found. Sym. 186 , 160-174), designated PI and P2, the sequences of which are given below, are homologous peptides isolated from the hemolymph of two crabs, Tachyplesus tridentatus for the tachyplines Tl, T2 and T3 and Limmulus polyphemus for the polyphemusins PI and P2: SEQ ID NO: 10: PI: Arg-Arg- Trp-Cys-Phe-Arg
  • SEQ ID NO: 11 P2: Arg-Arg-Trp-Cys-Phe-Arg- Val-Cys-Tyr-Lys-Gly-Phe-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH 2 .
  • Proteins, tachyplines and polyphemusins contain a high proportion of basic residues (lysines and arginines) and have four cysteines which form two parallel disulfide bridges. These three families of peptides also exhibit homologies with certain defensins and in particular with human defensin NP-1 (Kokryakov, V. N. et al., 1993, Febs Let. 327, 231-236).
  • the subject of the invention is therefore a compound consisting of at least one Taxoid derivative linked to at least one linear peptide chosen from the group comprising:
  • linear peptide comprising a transduction domain.
  • the invention envisages very particularly as linear peptides comprising a transduction peptide chosen, without limitation, from: the transduction domains derived from the Tat protein of HIV1, - the transduction domains derived from the third helix of Antennapedia,
  • the invention particularly contemplates as linear peptides derived from Proteins, a peptide which corresponds to the following formula (I):
  • Tachyplines a peptide that meets the following formula (II):
  • BXXXBXXXBXXXXBBXB (II), in which: - groups B, identical or different, represent an amino acid residue whose side chain carries a basic group, and groups X, identical or different, represent a residue of aliphatic amino acid or aromatic or said peptides of formulas (I) or (II), in retro form, consisting of amino acids of configuration D and / or L, or a fragment thereof consisting of a sequence of at least 5 and preferably at least 7 successive amino acids of the peptides of formulas (I) or (II).
  • the invention also contemplates, as linear peptides derived from Proteins, a peptide which corresponds to the following formula (I):
  • the groups B which are identical or different, are chosen from arginine, lysine, diaminoacetic acid, diaminobutyric acid, diaminopropionic acid, ornithine, - the X groups, identical or different, are chosen from glycine, alanine, valine, norleucine, isoleucine, leucine, cysteine,
  • Taxoid derivatives used in the compounds of the invention include the following:
  • Taxol Taxol, Taxotère, or any other derivative of Taxol which is substituted in one or more positions like the positions
  • the bond between the Taxoid derivative and the linear peptide in the compounds of the invention is chosen from a covalent bond, a hydrophobic bond, an ionic bond, a cleavable bond or a non-cleavable bond in physiological media or within cells.
  • This link can be direct or indirect via a linker (linker) and carried out by means of a functional group naturally present or introduced either on the peptide, or on the Taxoid derivative, or on both.
  • This link arm if present, must be acceptable taking into account the chemical nature and the bulk of both the peptide and the Taxoid derivative.
  • linkers containing alkyl, aryl, aralkyl or peptide groups esters, aldehydes or acids of alkyl, aryl or aralkyl, anhydride, sulfhydrile or carboxyl groups such as derivatives of l maleymil benzoic acid, maleymil propionic acid and succynimidyl derivatives, groups derived from bromide or cianogen chloride, carbonyldiimidazole, succinimide esters or sulphonic halides.
  • Taxoid derivative (s) can be linked by covalent bonds at the level of the N-terminal or C-terminal ends or else at the level of the side chains of the peptide.
  • a preferred type of bond between the Taxoid derivative (s) and the linear peptide (s) involves at least one disulfide bridge. Indeed, this type of bond is characterized by its stability in the plasma after injection of the compound, then once the compounds of the invention have crossed the blood-brain barrier, said disulfide bridge is reduced by releasing the Taxoid derivative.
  • the binding can be carried out at any site of the peptide as indicated above.
  • a subject of the present invention is also a method of treating cancers, particularly brain cancers, consisting in administering to a subject suffering from such cancer an effective amount of a compound previously described.
  • the invention therefore relates to a pharmaceutical composition for the treatment of cancers and particularly brain cancers comprising, as active agent, at least one compound described above.
  • said pharmaceutical composition is in a form suitable for administration by the parenteral, oral, rectal, nasal, transdermal, pulmonary, central or systemic route.
  • linear peptides used in the context of the compounds of the invention are remarkable in that they are capable of solubilizing the Taxoid derivatives in water and thus allowing new formulation of these derivatives capable of increase their effectiveness and reduce side effects.
  • a subject of the invention is therefore very particularly a pharmaceutical composition for the treatment of cancers and more particularly of brain cancers comprising at least one Taxoid derivative, characterized in that said taxoid derivative is in the form of a compound soluble in water in which the taxoid derivative is linked to at least one linear peptide as defined above.
  • the subject of the invention is also the use of a linear peptide as defined above for solubilizing a Taxoid derivative.
  • Another subject of the invention is the use of a linear peptide defined above for the preparation of a medicament intended for the treatment and / or prevention of cancers, said peptide being linked to at least one Taxoid derivative so as to render the latter soluble in water.
  • the invention also relates to the use of a linear peptide defined above for the preparation of a medicament intended for the treatment and / or prevention of brain cancers, said peptide being linked to at least one Taxoid derivative to vectorize it. here through the BBB.
  • the invention finally relates to the use of a linear peptide for the preparation of a medicament as defined above to be administered to a subject in combination with another anticancer compound such as, without limitation, carmustine, doxorubicin , methotrexate, etc.
  • another anticancer compound such as, without limitation, carmustine, doxorubicin , methotrexate, etc.
  • FIG. 1 schematically shows the chemical synthesis of a vectorized compound of Taxol.
  • FIG. 2 illustrates the passage through the blood-brain barrier of compound 1 (Taxol), compound 2 (Taxol vectorized).
  • Taxol 100 mg are dissolved in 1 mL of Dimethylformamide (DMF).
  • DMF Dimethylformamide
  • succinic anhydride Succ20, 1 eq
  • DMAP 1,4-dimethylaminopyridine
  • DIEA Diisopropylethylamine
  • Test used cytotoxicity test.
  • Cells 9L glioblastoma
  • MCF-7 and MDA-MB-435 breast cancer
  • SK-N-SH nerveroblastoma
  • ATCC ATCC's tumor cancer
  • the cells are seeded at approximately 10 4 cells per well, 24 h before the addition of the products. They are then at 60-80% confluence on the day of the experiment.
  • the cells are kept in culture at 37 ° C. in an atmosphere at 95% humidity and 5% CO 2 in an OptiMem® medium.
  • the cells are incubated either with free Taxol or with vectorized Taxol at increasing concentrations for 48 hours to 72 hours.
  • the MTT (4, 5-dimethylthiazole-2-yl) - 2, 5-diphenyltetrazolium bromide
  • the culture plates are then incubated for 4 hours in 1 oven.
  • the resulting crystalline formazan deposit is then dissolved by adding 200 ⁇ l of DMF / SDS.
  • the optical density (OD) is measured at 550 nm (reference 630 nm) using a microplate reader.
  • the graphic representation of the OD percentages of the wells treated as a function of the concentration of products makes it possible to determine the IC 50 . This corresponds to the concentration of the product inhibiting 50% of growth.
  • mice (20-25 g, Iffa-Credo; l'Arbresle, France) are anesthetized.
  • the right external carotid artery is linked to the level of bifurcation with the internal carotid artery and the common carotid artery is linked between the heart and the catheter implantation site (polyethylene catheter, ID: 0.76).
  • This, previously filled with a heparin solution (100 units / ml) is inserted into the common carotid.
  • mice are perfused with the perfusion buffer (128 mM NaCl, 24 mM NaHC0 3 , 4.2 mM KCl, 2.4 mM NaH 2 P0 4 , 1.5 mM CaCl 2 , 0.9 mM MgS0 4 , and 9 mM D-glucose ).
  • This buffer is filtered and then bubble by a mixture containing 95% 0 2 /5% C0 2 in order to maintain the pH close to 7.4 and to supply the brain with oxygen during the infusion.
  • mice are perfused with the buffer containing free Taxol or vectorized Taxol.
  • Taxol is radiolabelled with carbon 14 (specific activity: 55 mCi / mmol, Sigma, France).
  • the heart is stopped by section of the ventricles, in order to avoid reflux of the perfusate during the infusion.
  • the right hemisphere is then perfused at a speed of 10 ml / min for 60 seconds after which the mouse is decapitated. The amount of radioactivity in the right hemisphere is then measured and the brain penetration (Kin) is calculated.
  • Taxol is very insoluble in water or in biological buffers.
  • its solubility was more than 10 g / l. This indicates that vectorization significantly improves the solubility of Taxol.
  • the sensitivity of cells 9L, MCF-7, MDA-MB- 435 and SK-N-SH to free taxol and vectorized taxol was measured by the MTT test under the experimental conditions defined above for which the relationship between the density optical and the number of viable cells is linear.
  • the cells are incubated with increasing concentrations of product and after 24 hours of incubation, the survival of the cells is measured by the MTT test.
  • Table 2 represents the concentrations of products causing 50% of growth inhibition (IC 50 ) determined for the free and vectorized Taxol.

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Abstract

La présente invention a pour objet un composé constitué d'au moins un dérivé taxoïde lié à au moins un peptide vecteur capable d'augmenter la solubilité dudit dérivé et avantageusement de permettre son transport à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE). L'invention concerne aussi la préparation de ces composés et les compositions pharmaceutiques les contenant, utiles pour le traitement de cancers, tout particulièrement des cancers du cerveau.

Description

VECTORISATION DE DERIVES TAXOIDES A TRAVERS LA BARRIERE HEMATOENCEPHALIQUE
La présente invention se rapporte à l'utilisation de dérivés de Taxoïde dans le traitement des cancers et plus particulièrement des cancers du système nerveux central, tout particulièrement du cerveau. L'invention s'intéresse aussi principalement au transport de dérivés taxoïdes à travers la barrière hématoencéphalique (BHE) . Ainsi, l'invention à pour objet un composé constitué d'au moins un dérivé taxoïde lié à au moins un peptide vecteur capable d'augmenter la solubilité dudit dérivé et avantageusement de permettre son transport à travers la barrière hémato-encéphalique. L'invention concerne aussi la préparation de ces composés et les compositions pharmaceutiques les comprenant utiles pour le traitement de cancers, tout particulièrement des cancers du cerveau.
En dépit de progrès indéniables dans la lutte contre certains cancers, force est de reconnaître que globalement les cancers progressent et qu'ils constituent, avec les maladies cardio-vasculaires, une cause majeure de mortalité. Il n'existe actuellement pas de traitement efficace contre certains cancers comme les tumeurs de cerveau. La durée de survie des patients atteints de glioblastome, par exemple, ne dépasse pas un an, même si l'on associe la chimiothérapie et la radiothérapie à la chirurgie. Le traitement des tumeurs cérébrales est limité principalement du fait de la barrière hémato-encéphalique qui isole le système nerveux central du reste de l'organisme. En conséquence, la plupart des anticancéreux doivent être administrés à des doses très importantes pour atteindre le système nerveux central mais au prix d'effets secondaires importants.
La découverte de nouveaux médicaments anti- tumoraux constitue une des priorités de la recherche médicale. Les avancées de la chimiothérapie anti-tumorale ont été obtenues grâce à des médicaments ayant une nouvelle structure chimique et/ou un nouveau mécanisme d'action, comme les anthracyclines découvertes au début des années soixante et le cisplatine une dizaine d'années plus tard. Après une vingtaine d'années, la situation a fort heureusement à nouveau évolué avec la découverte d'une famille d'agents anti-tumoraux d'origine naturelle : les taxoïdes. Les médicaments disponibles sont le Taxol®
(paclitaxel) , le Taxotère® (docétaxel) . Le Taxol® et le Taxotère® ont un large spectre d'activité clinique : leur apport est significatif, pour le moment, dans le traitement des cancers de l'ovaire et des cancers du sein résistants aux anthracyclines. L'une des cibles privilégiées de cette chimiothérapie est constituée par les microtubules qui forment un fuseau sur lequel migrent les chromosomes à la fin de la division de la cellule (mitose) . Les médicaments exerçant leur activité sur ce fuseau sont des antimitotiques qui bloquent la mitose et empêchent les cellules de se reproduire. Le Taxol agit sur la même cible, mais à la différence des vinca-alcaloïdes, il stabilise ce fuseau et inhibe d'une autre manière la reproduction cellulaire. Malheureusement, le Taxol et ses analogues présentent l'inconvénient d'être très peu soluble dans l'eau. Il est donc généralement administré chez les patients dans un solvant (Cremophor EL) qui est responsable de phénomènes d'hypersensibilité (allergie) . Comme dans la plupart des chimiothérapies, les Taxoïdes, tel que le Taxol, entraînent une diminution des globules blancs et des plaquettes. En plus de sa toxicité, il a été décrit dans la littérature que le Taxol ne passe pas dans le cerveau et est exclut par la barrière hémato-encéphalique (Heimans et al ; Ann Oncol 1994, 10 .951-953). Tout ceci limite fortement l'utilisation de cet agent antimitotique pour le traitement de plusieurs cancers et notamment les tumeurs cérébrales .
Plusieurs stratégies ont été proposées pour améliorer les propriétés du Taxol.
Des centaines de dérivés de taxol comme ceux décrits dans les brevets et demandes de brevet US 4814470, WO 9302065, WO 9407880, ont été synthétisés, mais les résultats ont été décevants. Ces dérivés présentent le même problème de solubilité que le Taxol ou sont moins actifs que le Taxol .
- Des prodrogues de Taxol qui sont métabolisés in vivo pour libérer le Taxol ont été proposés par exemple dans les brevets et demandes de brevet US 576072, WO
09813059) . Mais, dans la plupart des cas, l'activité anticancéreuse est diminuée.
Des vecteurs comme les liposomes (US 5,648,090) ou le DHA (US 6,080,877) ont été proposés pour améliorer la solubilité du Taxol. Mais, ces méthodes ne donnent aucune indication sur le passage du Taxol à travers la barrière hémato-encéphalique.
La Demanderesse a mis en évidence que des vecteurs peptidiques linéaires, tels que les peptides linéaires dérivés de peptides naturels comme la Protégrine et la Tachyplésine transportent des molécules actives à travers la BHE et améliorent les propriétés pharmacologiques de ces molécules. Les travaux et résultats concernant ces peptides linéaires et leur utilisation comme vecteurs de molécules actives à travers la barrière hématoencéphalique ont été décrits dans les demandes de brevet français N° 98/15074 déposée le 30 Novembre 1998 et dans la demande de brevet français N° 99/02938 déposée le 26 Novembre 1999.
La présente invention a donc pour objet des composés constitués d'au moins un dérivé de Taxoïde lié à au moins un peptide linéaire capable d'augmenter la solubilité dudit dérivé et de le vectoriser à travers la barrière hémato-encéphalique .
Un premier groupe de peptides linéaires mis en œuvre dans le cadre des composés de l'invention sont ceux comprenant un domaine de transduction . On entend par domaine de transduction, une séquence peptidique capable de pénétrer à l'intérieur des cellules. A titre d'exemples de domaines de transduction, et de manière non-limitative, on peut citer :
- Les peptides dérivés de la protéine Tat de HIV1 [Fawell et al, Proc . Natl . Acad. Sci 91 ; 664 (1994) ; Schwarze et al, Science 285 ; 1569 (1999)]. Il s'agit par exemple du fragment 48-60 de la protéine tat de séquence SEQ ID NO:l : Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Pro- Pro-Gln, ou d'un fragment comprenant cette séquence comme le fragment 37-72.
- La pénétrâtine [Derossi et al, J. Biol . Chem 269, 10444 (1994) ; Brevet US 5888762)], de séquence SEQ ID NO: 2 : Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys- Trp-Lys-Lys .
Les séquences signal, ou séquences de translocation membranaire (MTSs) de peptides. Celles-ci sont reconnues par un accepteur de protéines qui participe à l'adressage de la pré-protéine depuis la machinerie de traduction jusque dans la membrane de l'organelle intracellulaire approprié. Les MTSs qui dirigent les protéines dans le même compartiment intracellulaire, comme le reticulum endoplasmique (RE) ou les mitochondries partagent plusieurs caractères structuraux. Les MTS RE contiennent 17 à 52 acides aminés organisés avec une section chargée positivement à l'extrémité N-terminale, un intersegment hydrophobe et une région C-terminale polaire avec des sites de reconnaissance de peptidase. On peut citer comme séquences signal celles de séquences SEQ ID NO: 3 : Gly-Ala-Leu-Phe-Leu-Gly-Trp-Leu-Gly-Ala-Ala-Gly-Ser- Thr-Met-Gly-Ala-Trp-Ser-Gln-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val, ou de séquence SEQ ID NO: 4 : Ala-Ala-Val-Ala-Leu-Leu-Pro-Ala- Val-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-Ala-Pro. Un second groupe de peptides linéaires selon l'invention sont dérivés de Protégrines et Tachyplésines . Les Protégrines et Tachyplésines sont des peptides antibiotiques naturels dont la structure est de type épingle à cheveux maintenue par des ponts disulfures. Ces ponts jouent un rôle important dans l'activité cytolytique observée sur cellules humaines.
On désigne sous le nom de protégrines un ensemble de cinq peptides désignés PG-1, PG-2, PG-3, PG-4 et PG-5 dont les séquences sont données ci-dessous, étroitement apparentés et isolés de leucocytes de porc (V.N. Kokryakov & col. FEBS lett. 327, 231-236) :
SEQ ID NO: 5 : PG-1 : Arg-Gly-Gly-Arg-Leu-Cys- Tyr-Cys-Arg-Arg-Arg-Phe-Cys-Val-Cys-Val-Gly-Arg-NH2
SEQ ID NO: 6 : PG-2 : Arg-Gly-Gly-Arg-Leu-Cys- Tyr-Cys-Arg-Arg-Arg-Phe-Cys-Ile-Cys-Val-NH2
SEQ ID NO: 7 : PG-3 : Arg-Gly-Gly-Gly-Leu-Cys- Tyr-Cys-Arg-Arg-Arg-Phe-Cys-Val-Cys-Val-Gly-Arg-NH2
SEQ ID NO: 8 : PG-4 : Arg-Gly-Gly-Arg-Leu-Cys- Tyr-Cys-Arg-Gly-Trp-Ile-Cys-Phe-Cys-Val-Gly-Arg-NH2 SEQ ID NO: 9 : PG-5 : Arg-Gly-Gly-Arg-Leu-Cys-
Tyr-Cys-Arg-Pro-Arg-Phe-Cys-Val-Cys-Val-Gly-Arg-NH2
Les tachyplésines (Tamura, H. et al., 1993, Chem. Pharm. Bul . Tokyo 41, 978-980), désignées Tl, T2 et T3 et les polyphémusines (Muta, T., 1994, CIBA Found. Sym. 186, 160-174), désignées PI et P2 , dont les séquences sont données ci -dessous, sont des peptides homologues isolés de 1' hémolymphe de deux crabes, Tachyplesus tridentatus pour les tachyplésines Tl , T2 et T3 et Limmulus polyphemus pour les polyphémusines PI et P2 : SEQ ID NO: 10 : PI : Arg-Arg-Trp-Cys-Phe-Arg-
Val-Cys-Tyr-Arg-Gly-Phe-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2
SEQ ID NO: 11 : P2 : Arg-Arg-Trp-Cys-Phe-Arg- Val-Cys-Tyr-Lys-Gly-Phe-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2.
Protégrines, tachyplésines et polyphémusines contiennent une forte proportion de résidus basiques (lysines et arginines) et possèdent quatre cystéines qui forment deux ponts disulfures parallèles. Ces trois familles de peptides présentent également des homologies avec certaines defensines et en particulier avec la défensine humaine NP-1 (Kokryakov, V. N. et al., 1993, Febs Let. 327, 231-236) .
L'invention a donc pour objet un composé constitué d'au moins un dérivé de Taxoïde lié à au moins un peptide linéaire choisi dans le groupe comprenant :
- un peptide linéaire dérivé de protégrines ou de tachyplésines,
- un peptide linéaire comprenant un domaine de transduction. L' invention envisage tout particulièrement comme peptides linéaires comprenant un peptide transduction choisi, de manière non-limitative, parmi : les domaines de transduction dérivés de la protéine Tat de HIV1, - les domaines de transduction dérivés de la troisième hélice d'Antennapedia,
- les domaines de transduction d'une séquence signal . L' invention envisage tout particulièrement comme peptides linéaires dérivés de Protégrines, un peptide qui répond à la formule (I) suivante :
BX(X OU B)BXXXXBBBXXXXXXB (I) et par peptide linéaire dérivé de
Tachyplésines, un peptide qui répond à la formule (II) suivante :
BXXXBXXXBXXXXBBXB (II), dans lesquelles : - les groupes B, identiques ou différents, représentent un résidu d'acide aminé dont la chaîne latérale porte un groupement basique, et les groupes X, identiques ou différents, représentent un résidu d'acide aminé aliphatique ou aromatique ou lesdits peptides de formules (I) ou (II), sous forme rétro, constitués d'acides aminés de configuration D et/ou L, ou un fragment de ceux-ci constitué d'une séquence d'au moins 5 et de préférence d'au moins 7 acides aminés successifs des peptides de formules (I) ou (II) .
L'invention envisage également comme peptides linéaires dérivés de Protégrines, un peptide qui répond à la formule (I) suivante :
BX(X ou B)BXXXXBBBXXXXXXB (I) et par peptide linéaire dérivé de Tachyplésines, un peptide qui répond à la formule (II) suivante : BXXXBXXXBXXXXBBXB (II), dans lesquelles :
- les groupes B, identiques ou différents, sont choisis parmi l'arginine, la lysine, l'acide diaminoacét ique , l'acide diaminobutyrique , l'acide diaminopropionique, l'ornithine, - les groupes X, identiques ou différents, sont choisis parmi la glycine, l'alanine, la valine, la norleucine, 1 ' isoleucine, la leucine, la cystéine, la
Acm cystéine , la penicillamine, la méthionine, le serine, la thréonine, 1 ' asparagine, la glutamine, la phényalanine, l'histidine, le tryptophane, la tyrosine, la proline, l'acide amino-butyrique , l'acide amino-1-cyclohexane carboxyl ique , l'acide amino- isobutyrique , la 2- aminotétraline carboxylique , la 4-bromophényalanine , la tert-Leucine , la 4 - chlorophénylalanine , la bêta- cyclohexyalanine, la 3 , 4 -dichlorophényalanine , la 4- f luorophényalanine, 1 ' homoleucine, la bêta-homoleucine , 1 ' homophényalanine , la 4 -méthylphénylalanine , la 1- naphtyalanine, la 2-naphtyalanine, la 4-nitrophényalanine, la 3-nitrotyrosine, la norvaline, la phénylglycine, la 3- pyridyalanine, la [2-thiényl] alanine, ou lesdits peptides de formules (I) ou (II) , sous forme rétro, constitués d'acides aminés de configuration D et/ou L, ou un fragment de ceux-ci constitué d'une séquence d'au moins 5 et de préférence d'au moins 7 acides aminés successifs des peptides de formules (I) ou (II) .
A titre d'exemples, de dérivés de Taxoïde mis en œuvre dans les composés de l'invention, on peut citer le
Taxol, le Taxotère, ou tout autre dérivé du Taxol qui est substitué en une ou plusieurs positions comme les positions
C7, C9, C10, C19, R, etc.
La liaison entre le dérivé Taxoïde et le peptide linéaire dans les composés de l'invention est choisie parmi une liaison covalente, une liaison hydrophobe, une liaison ionique, une liaison clivable ou une liaison non clivable dans les milieux physiologiques ou à l'intérieur des cellules. Cette liaison peut être directe ou indirecte par l'intermédiaire d'un bras de liaison (linker) et effectuée au moyen d'un groupe fonctionnel naturellement présent ou introduit soit sur le peptide, soit sur le dérivé Taxoïde, soit sur les deux. Ce bras de liaison, s'il est présent, doit être acceptable compte tenu de la nature chimique et de l'encombrement tant du peptide que du dérivé Taxoïde. On peut citer à titre d'exemple de tels linkers contenant des groupements alkyle, aryle, aralkyle ou peptidique, des esters, aldéhydes ou acides d' alkyle, aryle ou aralkyle, des groupements anhydrides, sulfhydriles, ou carboxyles tels que les dérivés de l'acide maleymil benzoïque, de l'acide maleymil propionique et des dérivés succynimidyle, des groupes dérivés du bromure ou chlorure de cianogène, carbonyldiimidazole , des esters de succinimide ou des halogenures sulphoniques .
Comme groupes fonctionnels, on peut citer : -OH, -SH, -COOH, ou -NH2. Ainsi, le ou les dérivés Taxoïdes peuvent être liés par des liaisons covalentes au niveau des extrémités N-terminale ou C-terminale ou bien au niveau des chaînes latérales du peptide.
Un type de liaison préféré entre le ou les dérivés Taxoïdes et le ou les peptides linéaires implique au moins un pont disulfure. En effet, ce type de liaison se caractérise par sa stabilité dans le plasma après injection du composé, puis une fois que les composés de l'invention ont traversé la barrière hémato-encéphalique, ledit pont disulfure est réduit en libérant le dérivé Taxoïde. La liaison peut être effectuée en n'importe quel site du peptide comme indiqué précédemment.
La présente invention a aussi pour objet une méthode de traitement des cancers, particulièrement des cancers du cerveau consistant à administrer à un sujet soufrant d'un tel cancer une quantité efficace d'un composé décrit précédemment. L'invention concerne donc une composition pharmaceutique pour le traitement des cancers et particulièrement des cancers du cerveau comprenant à titre d'agent actif au moins un composé décrit précédemment .
De préférence, ladite composition pharmaceutique se présente sous une forme appropriée pour une administration par voie parentérale, par voie orale, par voie rectale, par voie nasale, par voie transdermique, par voie pulmonaire, par voie centrale ou par voie systémique .
Comme indiqué précédemment, les peptides linéaires mis en œuvre dans le cadre des composés de l'invention sont remarquables en ce qu'ils sont capables de solubiliser les dérivés Taxoïdes dans l'eau et ainsi de permettre de nouvelle formulation de ces dérivés susceptible d'augmenter leur efficacité et de réduire les effets secondaires.
L'invention a donc tout spécialement pour objet des compositions pharmaceutiques pour le traitement des cancers et plus particulièrement des cancers du cerveau comprenant au moins un dérivé de Taxoïde, caractérisée en ce que ledit dérivé taxoïde se présente sous la forme d'un composé soluble dans l'eau dans lequel le dérivé taxoïde est lié à au moins un peptide linéaire comme défini précédemment.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'un peptide linéaire comme défini précédemment pour solubiliser un dérivé Taxoïde. L'invention a encore pour objet l'utilisation d'un peptide linéaire défini précédemment pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des cancers, ledit peptide étant lié à au moins un dérivé Taxoïde de façon à rendre celui-ci soluble dans l'eau. L'invention concerne encore l'utilisation d'un peptide linéaire défini précédemment pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des cancers du cerveau, ledit peptide étant lié à au moins un dérivé Taxoïde pour vectoriser celui-ci à travers la BHE .
L'invention concerne enfin l'utilisation d'un peptide linéaire pour la préparation d'un médicament comme défini précédemment pour être administré a un sujet en combinaison avec un autre composé anticancéreux tels que, de manière non-limitative, la carmustine, la doxorubicine, le méthotréxate, etc.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent concernant la préparation d'un composé constitué du taxol et d'un peptide linéaire et son activité. Il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels :
- la figure 1 représente schématiquement la synthèse chimique d'un composé vectorisé du Taxol.
- la figure 2 illustre le passage à travers la barrière hémato-encéphalique du composé 1 (Taxol), le composé 2 (Taxol vectorisé) .
I - Synthèse Chimique du Taxol vectorisé.
1) Synthèse du peptide vecteur.
Le peptide SynB3 de séquence SEQ ID NO: 12 : Arg-Arg-Leu-Ser-Tyr-Ser-Arg-Arg-Arg-Phe, est assemblé sur phase solide selon une stratégie Foc/tu, clivé et déprotégé par l'acide trif luoroacét ique , puis purifié par chromatographie haute pression préparative en phase inverse et lyophilisé. Sa pureté (>95%) et son identité sont confirmées par HPLC analytique et par spectrométrie de masse. 2) Couplage du Taxol sur SynB3.
100 mg de Taxol (Paclitaxel, 1 eq) sont dissous dans 1 mL de Dimethylformamide (DMF) . Ajout de 12 mg d'anhydride succinique (Succ20, 1 eq) dans 120 μL DMF. Ajout de 1.47 mg de Dimethylaminopyridine (DMAP, 0.1 eq) dans 14 μL de DMF. Ajout de 40 μL de Diisopropylethylamine (DIEA, 2 eq) . Incubation 1 heure. Contrôle de la formation d' hémisuccinate de Paclitaxel par spectrométrie de masse. Addition de 200 mg (1,2 eq) du peptide vecteur SynB3 dissous dans 2 mL DMF. Ajout de 75 mg de PyBOP (1,2 eq) puis de DIEA (41 μL, 2 eq) . Incubation 20 min. Contrôle de la formation du produit de couplage par spectrométrie de masse et HPLC analytique.
Précipitation du produit de couplage par l'éther, centrifugation et reprise du brut dans 2 mL H20/Acetonitrile 50/50-TFA 0,1%. Purification sur HPLC préparative phase reverse, suivie d'une lyophilisation.
II - Composés testés.
Les composés testés sont dans le tableau 1 ci- dessous .
Tableau 1
Figure imgf000013_0001
1) Essai utilisé : test de cytotoxicité .
Les cellules 9L (glioblastome) , MCF-7 et MDA- MB-435 (cancer du sein) , SK-N-SH (neuroblastome) ont été obtenues commercialement auprès de l'ATCC. Les cellules sont ensemencées à environ 104 cellules par puits, 24 h avant l'addition des produits. Elles sont alors à 60-80% de confluence le jour de l'expérience. Les cellules sont maintenues en culture à 37°C dans une atmosphère à 95% d'humidité et 5% de C02 dans un milieu OptiMem®. Les cellules sont incubées soit avec le Taxol libre soit avec le Taxol vectorisé à des concentrations croissantes pendant 48 heures à 72 heures. A la fin du temps de culture, le MTT (3- (4 , 5-diméthylthiazole-2-yl) - 2 , 5-diphényltétrazolium bromure) est rajouté dans les puits et les plaques de culture sont ensuite incubées pendant 4 heures dans l'étuve. Le dépôt cristallin de formazan résultant est alors dissout par addition de 200 μl de DMF/SDS. La densité optique (DO) est mesurée à 550 nm (référence 630 nm) en utilisant un lecteur de microplaques.
La représentation graphique des pourcentages de DO des puits traités en fonction de la concentration de produits permet de déterminer la IC50. Celle-ci correspond à la concentration du produit inhibant 50% de la croissance.
2) Perfusion Cérébrale in si tu .
Des souris (20-25 g, Iffa-Credo ; l'Arbresle, France) sont anesthésiés. Après exposition de la carotide commune, l'artère carotide externe droite est liée au niveau de la bifurcation avec la carotide interne et la carotide commune est liée entre le cœur et le site d'implantation du cathéter (cathéter polyéthylène , ID :0.76). Celui-ci, préalablement rempli par une solution d'héparine (100 unités/ml) est inséré dans la carotide commune. Les souris sont perfusées avec le tampon de perfusion (128 mM NaCl, 24 mM NaHC03, 4,2 mM KCl, 2,4 mM NaH2P04, 1.5 mM CaCl2, 0.9 mM MgS04, et 9 mM D-glucose) . Ce tampon est filtré puis bulle par un mélange contenant 95% 02/ 5% C02 afin de maintenir le pH proche de 7,4 et d'alimenter le cerveau en oxygène au cours de la perfusion.
Les souris sont perfusées avec le tampon contenant le Taxol libre ou le Taxol vectorisé. Dans chaque produit le Taxol est radiomarqué au carbone 14 (activité spécifique : 55 mCi/mmole, Sigma, France) . Juste avant le début de la perfusion, le cœur est arrêté par section des ventricules, ceci afin d'éviter au cours de la perfusion un reflux du perfusât . L'hémisphère droit est alors perfusé à une vitesse de 10 ml/min pendant 60 secondes après quoi la souris est décapitée. La quantité de radioactivité dans l'hémisphère droit est alors mesurée et la pénétration cérébrale (Kin) est calculée.
III - Résultats. 1) Solubilité.
Comme indiqué précédemment, le Taxol est très insoluble dans l'eau ou dans les tampons biologiques. Quand le Taxol est vectorisé avec le peptide vecteur SynB3 , sa solubilité était de plus de 10 g/1. Ceci indique que la vectorisation permet d'améliorer de façon significative la solubilité du Taxol.
2) Cytotoxicité .
La sensibilité des cellules 9L, MCF-7, MDA-MB- 435 et SK-N-SH au taxol libre et au taxol vectorisé a été mesurée par le test MTT dans les conditions expérimentales définies ci-dessus pour lesquelles la relation entre la densité optique et le nombre de cellules viables est linéaire . Les cellules sont incubées avec des concentrations croissantes de produit et après 24 heures d'incubation, la survie des cellules est mesurée par le test MTT.
Le tableau 2 représente les concentrations en produits entraînant 50% d'inhibition de croissance (IC50) déterminées pour le Taxol libre et vectorisé.
Figure imgf000016_0001
Nos résultats montrent que l'IC50 pour le Taxol libre est de 3,5 uM alors que celle du Taxol vectorisé est de 0.6 uM. Ceci indique que le Taxol vectorisé est environ 5 fois plus actif que le Taxol libre dans la lignée cellulaire 9L. Dans les autres lignées cellulaires, l'IC50 est le même pour les deux produits.
3) Pénétration dans le cerveau.
Dans cette étude, nous avons comparé la pénétration dans la BHE du Taxol libre avec celle du Taxol vectorisé. Les deux produits ont été perfuses dans le cerveau de la souris. Après 60 secondes de perfusion dans le tampon, la pénétration des produits est estimée par la constante d'influx ou Kin en ul/sec/g. La figure 2 montre que la vectorisation du Taxol par le vecteur SynB3 augmente son passage dans le cerveau d'environ 12 fois après une perfusion de 60 secondes dans du tampon.

Claims

REVENDICATIONS
1) Un composé constitué d'au moins un dérivé de Taxoïde lié à au moins un peptide linéaire choisi dans le groupe comprenant :
- un peptide linéaire dérivé de protégrines ou de tachyplésines,
- un peptide linéaire comprenant un domaine de transduction .
2) Un composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le peptide linéaire est un dérivé de de protégrines ou de tachyplésines choisi parmi ceux de formules (I) ou (II) suivantes : BX(X ou B)BXXXXBBBXXXXXXB (I)
BXXXBXXXBXXXXBBXB (II) , dans lesquelles : les groupes B, identiques ou différents, représentent un résidu d'acide aminé dont la chaîne latérale porte un groupement basique, et les groupes X, identiques ou différents, représentent un résidu d'acide aminé aliphatique ou aromatique, ou lesdits peptides de formules (I) ou (II), sous forme rétro, constitués d'acides aminés de configuration D et/ou L, ou un fragment de ceux-ci constitué d'une séquence d'au moins 5 et de préférence d'au moins 7 acides aminés successifs des peptides de formules (I) ou (II) .
3) Un composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le peptide linéaire est un dérivé de de protégrines ou de tachyplésines choisi parmi ceux de formules (I) ou (II) suivantes : BX(X ou B)BXXXXBBBXXXXXXB (I) BXXXBXXXBXXXXBBXB (II) , dans lesquelles :
- les groupes B, identiques ou différents, sont choisis parmi l'arginine, la lysine, l'acide diaminoacét ique , l'acide diaminobutyrique , l'acide diaminopropionique, l'ornithine,
- les groupes X, identiques ou différents, sont choisis parmi la glycine, l'alanine, la valine, la norleucine, 1 ' isoleucine, la leucine, la cystéine, la cystéine Acm , la penicillamine, la méthionme, le serine, la thréonine, 1 ' asparagine, la glutamine, la phényalanine, l'histidine, le tryptophane, la tyrosine, la proline, l'acide amino-butyrique , l'acide amino- 1 - cyclohexane carboxylique, l'acide amino- isobutyrique , la 2- aminotétraline carboxylique, la 4-bromophényalanine, la tert -Leucine , la 4 - chlorophénylalanine , la bêta- cyclohexyalanine, la 3 , 4 -dichlorophényalanine , la 4- f luorophényalanine, 1 ' homoleucine, la bêta-homoleucine, 1 ' homophényalanine , la 4 -méthylphénylalanine , la 1- naphtyalanine, la 2-naphtyalanine, la 4-nitrophényalanine, la 3-nitrotyrosine, la norvaline, la phénylglycine, la 3- pyridyalanine, la [2-thiényl] alanine, ou lesdits peptides de formules (I) ou (II) , sous forme rétro, constitués d'acides aminés de configuration D et/ou L, ou un fragment de ceux-ci constitué d'une séquence d'au moins 5 et de préférence d'au moins 7 acides aminés successifs des peptides de formules (I) ou (II) .
4) Un composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le peptide linéaire comprend un domaine de transduction choisi dans le groupe comprenant: les domaines de transduction dérivés de la protéine Tat de HIV1, les domaines de transduction dérivés de la troisième hélice d' Antennapedia, les domaines de transduction d'une séquence signal . 5) Un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le dérivé de Taxoïde est choisi parmi le Taxol, le Taxotère, ou tout autre dérivé du Taxol qui est substitué en une ou plusieurs positions comme les positions C7, C9, CIO, C19, R.
6) Un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la liaison entre le dérivé Taxoïde et le peptide linéaire est choisie parmi une liaison covalente, une liaison hydrophobe, une liaison ionique, une liaison clivable ou une liaison non clivable dans les milieux physiologiques ou à l'intérieur des cellules.
7) Un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la liaison entre le dérivé Taxoïde et le peptide linéaire est une liaison directe ou indirecte par l'intermédiaire d'un bras de liaison.
8) Un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la liaison entre le dérivé Taxoïde et le peptide linéaire est réalisée au moyen d'un groupe fonctionnel naturellement présent ou introduit soit sur le peptide, soit sur le dérivé Taxoïde, soit sur les deux.
9) Un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le ou les dérivés Taxoïdes sont liés par des liaisons covalentes au niveau des extrémités N-terminale ou C-terminale ou bien au niveau des chaînes latérales du ou des peptides.
10) Une composition pharmaceutique pour le traitement des cancers et particulièrement des cancers du cerveau comprenant à titre d'agent actif à moins un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.
11) Une composition pharmaceutique pour le traitement des cancers et particulièrement des cancers du cerveau comprenant au moins un dérivé de Taxoïde, caractérisée en ce que ledit dérivé Taxoïde se présente sous la forme d'un composé soluble dans l'eau dans lequel le dérivé taxoïde est lié à au moins un peptide linéaire comme défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 9.
12) Utilisation d'un peptide linéaire comme défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 9 pour solubiliser un dérivé Taxoïde.
13) Utilisation d'un peptide linéaire comme défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 9 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des cancers, ledit peptide étant lié à au moins un dérivé Taxoïde de façon à rendre celui- ci soluble dans l'eau.
14) Utilisation d'un peptide linéaire comme défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 9 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des cancers, ledit peptide étant lié à au moins un dérivé Taxoïde pour vectoriser celui-ci à travers la BHE . 15) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 13 ou 14 caractérisé en ce que le médicament est administré à un sujet en combinaison avec un composé anticancéreux tels que la carmustine, la doxorubicine, le méthotréxate .
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