EP1297001A1 - Peptides lineaires amphipathiques et les compositions les contenant - Google Patents

Peptides lineaires amphipathiques et les compositions les contenant

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EP1297001A1
EP1297001A1 EP01951760A EP01951760A EP1297001A1 EP 1297001 A1 EP1297001 A1 EP 1297001A1 EP 01951760 A EP01951760 A EP 01951760A EP 01951760 A EP01951760 A EP 01951760A EP 1297001 A1 EP1297001 A1 EP 1297001A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
seq
cit
peptide
residues
amino acid
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01951760A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Guillaume Drin
Jérôme GOMAR
Jamal Temsamani
Anthony R. Rees
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Synt EM SA
Original Assignee
Synt EM SA
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Filing date
Publication date
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Publication of EP1297001A1 publication Critical patent/EP1297001A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to linear peptides and their use for vectorizing active substances. More particularly, the invention relates to strongly amphipathic linear peptides derived from antibiotic peptides or their analogs.
  • the subject of the invention is also new compounds formed from a linear amphipathic peptide linked to at least one active substance, as well as the preparation of these compounds and the compositions containing them.
  • One of the priorities for work in this area is to find effective means to increase the penetration efficiency of active substances, whether they are conventional molecules, peptides, proteins, or even nucleic acids such as oligonucleotides in living cells.
  • Protinrin and tachyplesin are natural peptides whose structure is of the hairpin type maintained by disulfide bridges. These bridges play a role important in the cytolytic activity observed on human cells.
  • the research carried out by the Applicant on these peptides has enabled it to discover that an irreversible reduction of these disulfide bridges makes it possible to generate linear peptides which have the property of passing quickly through cell membranes.
  • These linear peptides and their use as a vector for active substances are described in the international PCT patent application published under No. WO99 / 07728.
  • the Applicant has now sought to define new amino acid sequences capable of serving as a vector for internalization and addressing of active substances and, for this purpose, several peptides having improved physicochemical properties have been synthesized.
  • the subject of the invention is therefore a linear peptide containing or consisting of a derivative of an antibiotic peptide by:
  • antibiotic peptides is intended to mean peptides of more than 5 to 7 amino acids having cytolytic activity on human or animal cells. These are naturally occurring peptides or synthetic peptides and fragments thereof. The invention particularly contemplates peptides derived from protectin and tachyplesin, an analogue or a fragment thereof.
  • the peptides of the invention lack a disulfide bridge such as those described for example in the international patent application PCT published under No. WO99 / 07728.
  • the absence of disulfide bridges in the peptides of the invention can be obtained by any technique known to a person skilled in the art and in particular by removing or replacing with other amino acids the cysteine residues or by blocking the groups - SH so that they no longer form a disulfide bridge.
  • the amphipathic nature of the peptides of the invention was expressed by the value of the average hydrophobicity per residue ⁇ H> and the moment of helical hydrophobicity ⁇ H> ⁇ .
  • the peptides of the invention have: an average hydrophobicity per residue ⁇ H> of between 0.15 and 0.7;
  • the research carried out in the context of the present invention has in fact concerned three parameters making it possible to orient the design of primary sequences from reference sequences (Eisenberg et al., 1982; The helical hydrophobic moment: a measure of the amphilicity of helix. Nature 299, 371-374).
  • the three parameters chosen were as follows:
  • the average hydrophobicity per residue is a measure of the apolar nature of a peptide.
  • the quantification of the hydrophobicity of a peptide is carried out by summing the contribution of each residue to this hydrophobicity according to the formula:
  • H corresponds to the average hydrophobicity per residue
  • N represents the number of residues
  • H n represents the hydrophobicity index of residue n.
  • the helical hydrophobicity moment ⁇ H> ⁇ makes it possible to quantify the more or less amphiphilic nature of a propeller according to the formula:
  • ⁇ corresponds to the hydrophobicity index of the residue n and ⁇ corresponds to the angle between 2 successive residues (100 ° for an ⁇ helix).
  • Each amino acid is assigned a vector whose direction corresponds to the line connecting the center of the wheel to its position on this wheel.
  • the norm of this vector is equal to the hydrophobicity index of the amino acid.
  • the direction of the vector goes from the center to the amino acid if the amino acid is hydrophobic (positive value in the hydrophobicity scale) and from the amino acid to the center if the amino acid is polar (negative value in the hydrophobicity scale).
  • the moment of hydrophobicity by amino acid of the amphiphilic helix is equal to the norm of the vector resulting from the summation of all these vectors, divided by the number of amino acids of the helix.
  • the resulting vector points in the direction of the most hydrophobic area of the wheel.
  • the moment of hydrophobicity beta ⁇ > ⁇ corresponds to the moment of hydrophobicity of a peptide which would adopt a ⁇ -sheet structure.
  • the moment of beta hydrophobicity is calculated as the parameter ⁇ H> but with in this case, ⁇ , which corresponds to the angle between 2 successive residues, is equal to 180 °.
  • SynB1 - two peptides derived from protectin designated SynB1 and SynB3, a peptide derived from tachyplesin designated SynB4.
  • the invention relates very particularly to a peptide comprising or consisting of a derivative of a peptide whose amino acid sequence is:
  • amino acids are represented by their one-letter code, but they can also be represented by their three-letter code according to the nomenclature below.
  • the mutation of at least one of the residues in position 6, 8, 13, 14, 15, 16 with a hydrophobic amino acid preferably chosen from the group comprising: Ala, Ile, Leu, Val, Phe, Trp,
  • the mutations below increase the parameters ⁇ H> and ⁇ H>, that is to say the average hydrophobicity per residue and the mean helical amphipathicity per residue: the permutation of at least one pair of the residues in position 3 and 5, in position 10 and 12, and in position 16 and 17,
  • a hydrophobic amino acid preferably chosen from the group comprising: Ala, Ile, Leu, Val, Phe, Trp,
  • the A-Synbl peptide is a derivative of SynB1 in which the amino acid pairs in position 3 and 5, in position 10 and 12 and in position 16 and 17 have been permuted.
  • hydrophobic amino acids preferably chosen from the group comprising: Ala, location, Leu, Val, Phe, Trp, optionally, the mutation of at least one other residue, preferably the Phe residue in position 10, by a Tyr or Trp residue giving a spectroscopic signal and allowing the assay of the peptide.
  • Table 5 below reports mutations making it possible to increase the ⁇ H> and ⁇ H> ⁇ parameter of the SynB3 peptide and gives examples of peptides according to the invention derived from SynB3.
  • hydrophobic amino acids preferably chosen from the group comprising: Ala, locus, Leu, Val, Phe and Trp.
  • hydrophobic amino acids preferably chosen from the group comprising: Ala, location, Leu, Val, Phe and Trp.
  • aSynB4 is a peptide obtained by a permutation of the residues in position 12 and 14 and of the residues in position 16 and 17.
  • the invention also relates to a linear peptide containing or consisting of a derivative of an antibiotic peptide by:
  • the substitution of arginines by citrullines or ornithines makes it possible to reduce the possible toxicity of the peptide resulting from the cationic character of arginine. It is thus possible to use a larger amount of peptide vector.
  • the peptides of the invention comprise at least one more, preferably at least two more and most preferably at least three more arginines.
  • one or more arginines of which are replaced by citrullines (Cit) mention may be made of the derivatives of SynB1, SynB3 and SynB4 in Table 8 below.
  • the peptides of the invention can be prepared by chemical synthesis or by genetic engineering, they can be in retro form and include acids amino acids in form D.
  • the invention also relates to fragments of these peptides consisting of at least five and preferably at least seven successive amino acids of the sequences above.
  • the subject of the invention is also the use of these linear amphipathic peptides or analogues thereof, for vectorization across the membrane of cells in vivo or in vitro of one or more active substances both for therapeutic applications than diagnostic.
  • vectorization is understood to mean, according to the invention, a process capable of crossing the cell membrane (s) and of bringing said active substance to a target located in a cell compartment such as the cytoplasm or the nucleus.
  • the subject of the invention is compounds formed from at least one linear amphipathic peptide of the above described linked directly or indirectly to at least one active substance.
  • These compounds can be represented by the following formula (I):
  • A represents an amphipathic peptide of the invention
  • the invention envisages in particular proteins, such as polypeptides or peptides, antibodies or part of antibodies, nucleic acids and oligonucleotides or ribozymes, or, of course, active chemical molecules for the treatment or the prevention of pathologies - human or animal, such as for example and without limitation anti-tumor, antiviral, etc.
  • the active substance can be a radioactive marker, a colored marker, or any other means or substance capable of revealing a metabolism or a pathology.
  • the coupling between the vector peptide and the active substance, symbolized by the horizontal lines in the formula (I), can be achieved by any acceptable binding means taking into account the chemical nature and the bulk in the compounds of the formula ( I).
  • the bonds can be covalent, hydrophobic or ionic, cleavable or non-cleavable in physiological media or inside the cell.
  • the linkage can comprise one or more intermediate compounds (linker).
  • the coupling can be carried out at any site of the peptide (A), in which functional groups such as -OH, -SH, -COOH, -NH2 are naturally present or have been introduced.
  • the coupling positions for the active substance can be at the N-terminal or C-terminal ends or else at the side chains of the peptide. Likewise, the coupling can be carried out at any site of the active substance (B), into which functional groups such as -OH, -SH, -COOH, -NH2 are naturally present or have been introduced.
  • the invention therefore also relates to pharmaceutical compositions comprising, as active agent, an effective amount of at least one compound of formula (I) in an acceptable vehicle.
  • the peptides were synthesized by the Fmoc-tBu strategy using an AMS 422 (ABIMED, Germany). The peptide sequences are shown in Table I.
  • the labeling of the N-terminal with a NBD fluorescent group was carried out according to the procedure described by [Gazit, E. et al. (1995) Biochemistry 34, 11479-11488].
  • the peptide on resin is first treated with piperidine [20% (v / v) in DMF] to remove the group protecting Fmoc from the N-terminal.
  • NBD-Cl in dry DMF (excess of 5 times) is then added in the presence of DIEA (excess of 2 times) for 6 hr in the shade with stirring to selectively mark the N-terminal group.
  • the resin is then removed with DMF and treated with a deprotective mixture to detach the peptides from the resin and deprotect the side chains.
  • the peptide was then purified by HPLC (reverse phase high performance liquid chromatography) (Water-prep LC 40, Water) with a 0.01% TFA / acetonitrile gradient. The purity of the peptides was measured by UV absorbance criteria at 220 nm and 460 nm and was 95%.
  • the coupling of doxorubicin to a peptide via the succinic link is carried out in 3 stages.
  • doxorubicin hydrochloride (1 eq), dissolved in dimethylformamide (DMF) in the presence of Disopropylethylamine (DIEA, 2 eq), succinic anhydride (1.1 eq, dissolved in DMF) is added. After an incubation of 20 min at room temperature, the doxorubicin hemisuccinate thus formed is then activated by addition of PyBOP (Benzotriazol-1-yl-oxopyrrolidinephosphonium
  • the coupling product is then purified on preparative HPLC (high pressure liquid chromatography), then lyophilized.
  • Each of the stages, as well as the final product, are controlled by analytical HPLC and mass spectrometry.
  • K562 cells are grown in RPMI medium with 10% fetal calf serum. The cells are diluted to 0.3 ⁇ 10 6 cells per ml 24 hours before the experiment. Cell penetration was measured by flow cytometry using a FACScan (Becton Dickinson, USA).
  • the peptides labeled with NBD final concentration 1 ⁇ M are incubated with K562 cells (5 ⁇ 10 5 cells per ml) in Optimem medium at 37 ° C. for varying times (the final volume was 0.5 ml). After incubation, the cells are washed twice and then resuspended in 0.5 ml of cold PBS.
  • the penetration was then analyzed by FACS.
  • the fluorophores are excited at 488 nm and the fluorescence is measured at 525 nm.
  • a histogram of the fluorescence intensity (for 1 ⁇ 10 4 cells) is obtained and the mean distribution was considered to be representative of the amount of peptide associated with the cells.
  • Table 10 shows the penetration of the SM2363 peptide compared to that of two of these analogues which are more amphipathic.
  • the doxorubicin hemisuccinate thus formed is then activated by addition of PyBOP (Benzotriazol-1-yl-oxopyrrolidinephosphonium Hexafluorophosphate, 1.1 eq in DMF) and DIEA (2 eq). This second reaction mixture is incubated for 20 min.
  • PyBOP Benzotriazol-1-yl-oxopyrrolidinephosphonium Hexafluorophosphate, 1.1 eq in DMF
  • DIEA 2 eq
  • the peptide SynB1 / 3Cit (1.2 eq in DMF) is then added to the reaction mixture, and spontaneously couples to the activated doxorubicin hemisuccinate during an additional 20 min incubation.
  • the coupling product is then purified on preparative HPLC (high pressure liquid chromatography), then lyophilized.
  • Each of the stages, as well as the final product, are controlled by analytical HPLC and mass spectrometry.
  • mice 25-30 g, Iffa-Credo; l'Arbresle, France
  • mice 25-30 g, Iffa-Credo; l'Arbresle, France
  • the common carotid artery is linked between the heart and the catheter implantation site (polyethylene catheter, ID: 0.76).
  • the latter previously filled with a heparin solution (100 units / ml) is inserted into the common carotid.
  • mice are perfused with the perfusion buffer (128 mM NaCl, 24 mM NaHC0 3 , 4.2 M KCl, 2.4 mM NaH 2 P0 4 , 1.5 mM CaCl 2 , 0.9 mM MgS0 4 , and 9 mM D-glucose).
  • This buffer is filtered and then bubble by a mixture containing 95% 0 2 /5% C0 2 in order to maintain the pH close to 7.4 and to supply the brain with oxygen during the infusion.
  • mice are perfused with the buffer containing free doxorubicin or doxo-SynBl / 3Cit.
  • doxorubicin is radio-arc carbon 14 (specific activity: 9.4 ⁇ Ci / mg, Amersham, France).
  • the products are infused at a concentration of 0.33 ⁇ Ci / ml or 0.035 g / mouse.
  • the heart is stopped by section of the ventricles, in order to avoid reflux of the perfusate during the infusion.
  • the right hemisphere is then perfused at a speed of 10 ml / min for 60 seconds after which the mouse is decapitated.
  • FIG. 1 shows that the vectorization of doxorubicin by the vector SynBl / 3Cit increases its passage in the brain by 20 times after an infusion of 60 seconds in buffer.

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Abstract

La présente invention a pour objet des peptides contenant ou constitués par un dérivé d'un peptide antibiotique par (i) modification des résidus cystéines de façon à ce que ledit peptide soit dépourvu de pont disulfure, (ii) substitution de 1 à 18 et de préférence de 1 à 6 acides aminés, et/ou permutation d'au moins une paire d'acides aminés, lesdites substitutions et/ou permutations étant telles que ledit peptide présente un caractère amphipathique. L'invention concerne aussi un composé formé d'au moins un desdits peptides lié directement ou indirectement à au moins une substance active.

Description

PEPTIDES LINEAIRES AMPHIPATHIQUES ET LES COMPOSITIONS LES CONTENANT.
La présente invention concerne des peptides linéaires et leur utilisation pour vectoriser des substances actives. Plus particulièrement, l'invention se rapporte à des peptides linéaires fortement amphipathiqu.es dérivés de peptides antibiotiques ou de leurs analogues. L'invention a aussi pour objet de nouveaux composés formés d'un peptide linéaire amphipathique lié à au moins une substance active, ainsi que la préparation de ces composés et les compositions les contenant .
Le problème de 1 ' entrée dans les cellules vivantes de différentes substances dotées de propriétés pharmacologiques revêt un grand intérêt tant pour la recherche que pour des utilisations thérapeutiques ou diagnostiques .
Une des priorités des travaux dans ce domaine est de trouver des moyens efficaces pour augmenter l'efficacité de pénétration des substances actives, qu'il s'agisse de molécules conventionnelles, que de peptides, protéines, ou encore acides nucléiques comme les oligonucléotides dans les cellules vivantes .
Plusieurs stratégies sont proposées pour permettre ou augmenter le passage de ces substances à travers la membrane des cellules. Parmi celles-ci, la Demanderesse a développé un système de transport de substances actives à travers la membrane '' des cellules mettant en œuvre des peptides vecteurs . Cette stratégie de vectorisation offre de nombreux avantages, car le peptide vecteur peut être synthétisé par voie chimique, et la plupart des substances actives citées ci-dessus peuvent être couplées au vecteur de façon simple et efficace.
Les protégrine et tachyplésine sont des peptides naturels dont la structure est de type épingle à cheveux maintenue par des ponts disulfures . Ces ponts jouent un rôle important dans l'activité cytolytique observée sur cellules humaines . Les travaux de recherche réalisés par la Demanderesse sur ces peptides lui ont permis de découvrir qu'une réduction irréversible de ces ponts disulfures permet de générer des peptides linéaires qui ont la propriété de passer rapidement au travers des membranes cellulaires . Ces peptides linéaires et leur utilisation comme vecteur pour des substances actives sont décrits dans la demande de brevet internationale PCT publiée sous le No. WO99/07728.
La Demanderesse a maintenant cherché à définir de nouvelles séquences d'acides aminés capables de servir de vecteur d' internalisation et d'adressage de substances actives et, dans ce but, plusieurs peptides présentant des propriétés physico-chimiques améliorées ont été synthétisés .
L'invention a donc pour objet un peptide linéaire contenant ou constitué par un dérivé d'un peptide antibiotique par :
- modification des résidus cystéines de façon à ce que ledit peptide soit dépourvu de pont disulfure,
- substitution de 1 à 18 et de préférence de 1 à 6 acides aminés, et/ou permutation d'au moins une paire d'acides aminés, lesdites substitutions et/ou permutations étant telles que ledit peptide présente un caractère amphipathique.
On entend par peptides antibiotiques, des peptides de plus de 5 à 7 acides aminés présentant une activité cytolytique sur des cellules humaines ou animales. Il s'agit de peptides d'origine naturelle ou de peptides de synthèse et de fragments de ceux-ci. L'invention envisage tout particulièrement des peptides dérivés de protégrine et de tachyplésine, un analogue ou un fragment de ceux-ci.
Les peptides de 1 ' invention sont dépourvus de pont disulfure comme ceux décrits par exemple dans la demande de brevet internationale PCT publiée sous le No. WO99/07728. L'absence de ponts disulfures dans les peptides de 1 ' invention peut être obtenue par toute- technique connue de l'homme du métier et notamment en supprimant ou en remplaçant par d'autres acides aminés les résidus de cystéines ou en bloquant les groupes -SH de façon à ce qu'ils ne forment plus de pont disulfure.
Le caractère amphipathique des peptides de l'invention a été exprimé par la valeur de l'hydrophobicité moyenne par résidu <H> et le moment d'hydrophobicite hélicoïdal <μH>α. Avantageusement, les peptides de 1 ' invention présentent : une hydrophobicité moyenne par résidu <H> comprise entre 0,15 et 0,7 ;
- un moment d'hydrophobicite hélicoïdal <μH>α supérieur à 0,15 ; un moment d'hydrophobicite bêta <μïï>β supérieur à 0.
Les travaux de recherche effectués dans le cadre de la présente invention ont en effet concerné trois paramètres permettant d'orienter la conception de séquences primaires à partir de séquences de référence (Eisenberg et al., 1982 ; The helical hydrophobic moment : a mesure of the amphilicity of hélix. Nature 299, 371-374) . Les trois paramètres choisis ont été les suivants :
- l'hydrophobicité moyenne par résidu,
- le moment d'hydrophobicite hélicoïdale,
- le moment d'hydrophobicite bêta.
L'hydrophobicité moyenne par résidu est une mesure du caractère apolaire d'un peptide. La quantification de l'hydrophobicité d'un peptide s'effectue par sommation de la contribution de chaque résidu à cette hydrophobicité suivant la formule :
1 N
< H >
M π=l dans laquelle, H correspond à l'hydrophobicité moyenne par résidu, N représente le nombre de résidu, Hn représente l'indice d'hydrophobicite du résidu n. L'échelle d'hydrophobicite utilisée est celle de Fauchete et Pliska (1983, Eur. J. Med. Chem 18.369-375). La sommation s'effectue sur tous les résidus de l'hélice (de n = 1 à N) .
Le moment d'hydrophobicite hélicoïdale <μH>α permet de quantifier le caractère plus ou moins amphiphile d'une l'hélice suivant la formule :
dans laquelle Η correspond à 1 ' indice d'hydrophobicite du résidu n et δ correspond à l'angle entre 2 résidus successifs (100° pour une hélice α) .
A chaque acide aminé, il est assigné un vecteur dont la direction correspond à la droite reliant le centre de la roue à sa position sur cette roue. La norme de ce vecteur est égale à l'indice d'hydrophobicite de l'acide aminé. Le sens du vecteur va du centre vers l'acide aminé si l'acide aminé est hydrophobe (valeur positive dans l'échelle d'hydrophobicite) et de l'acide aminé vers le centre si l'acide aminé est polaire (valeur négative dans l'échelle d'hydrophobicite) .
Le moment d'hydrophobicite par acide aminé de l'hélice amphiphile est égal à la norme du vecteur résultant de la sommation de tous ces vecteurs, divisés par le nombre d'acides aminés de l'hélice. La sommation s'effectue sur tous les résidus de l'hélice (de n = 1 à N) . Le vecteur résultant pointe dans la direction de la zone la plus hydrophobe de la roue.
Le moment d'hydrophobicite bêta <μΗ>β correspond au moment d'hydrophobicite d'un peptide qui adopterait une structure en feuillet β. Le moment d'hydrophobicite bêta est calculé comme le paramètre <μH> mais avec dans ce cas, δ, qui correspond à l'angle entre 2 résidus successifs, est égal à 180°.
L'étude des trois paramètres ci-dessus a été appliquée à trois peptides de référence :
- deux peptides dérivés de protégrine désignés SynBl et SynB3, un peptide dérivé de tachyplésine désigné SynB4.
Les substitutions d'acides aminés réalisées sur les peptides SynBl, SynB3 et SynB4 rapportés ci-après ont permis d'identifier les modifications de séquences conduisant à des peptides fortement amphipathiques .
L'invention se rapporte tout particulièrement à un peptide comprenant ou constitué par un dérivé d'un peptide dont la séquence en acides aminés est :
1 5 10 15 18 - R G G R L S Y S R R R F S T S T G R
1 5 10 - R R L S Y S R R R F
1 5 10 15 17 - AW S F R V S Y R G I S Y R R S R
- ou un fragment de celles-ci constitué d'au moins cinq et de préférence d'au moins sept acides aminés successifs, par substitution de 1 à 18 et de préférence de 1 à 6 acides aminés, et/ou permutation d'au moins une paire d'acides aminés, lesdites substitutions et/ou permutations étant telles que ledit peptide présente un caractère amphipathique .
Dans les séquences peptidiques rapportées ci- après, les acides aminés sont représentés par leur code à une lettre, mais ils peuvent être aussi représentés par leur code à trois lettres selon la nomenclature ci-dessous .
A Ala alanine
C Cys cystéine D Asp acide aspartique
E Glu acide glutamique
F Phe phénylalanine
G Gly glycine
H His histidine
I Ile isoleucine
K Lys lysine
L Leu leucine
M Met méthionine
N Asn asparagine
P Pro proline
Q Gin glutamine
R ' Arg arginine
S Ser serine
T Thr thréonine
V Val valine
W Trp tryptophane
Y Tyr tyrosine
D Mutation du peptide SynBl .
1.1) Augmentation de l'hydrophobicité <H> de
SynBl.
Les mutations suivantes augmentent le paramètre <H>, c'est-à-dire l'hydrophobicité moyenne par résidus :
- la mutation d'au moins un des résidus en position 6, 8, 13, 14, 15, 16 par un acide aminé hydrophobe, de préférence choisi parmi le groupe comprenant : Ala, Ile, Leu, Val, Phe, Trp,
- éventuellement la mutation d'au moins un autre résidu, de préférence le résidu Phe en position 12, par un résidu Tyr ou Trp donnant un signal spectroscopique et permettant le dosage du peptide.
Le tableau 1 ci-dessous rapporte des mutations permettant d'augmenter l'hydrophobicité de SynBl et donne des exemples de peptides selon 1 ' invention dérivés de SynBl . Tableau 1
<H> <μH>
SynBl R G G R L S Y S R R R F S T S T G R -0,069 0,18
A A W A A A A
I I I I I I
L L L L L L
V V V V V V
F F F F F F
W W W W W W
SM3979 R G G R L A Y L R R R W A V L V G R 0,295 0,27
SM3980 R G G R L V Y V R R R W V V V V G R 0,343 0,25
PG-4L R G G R L L Y L R R R W L V L V G R 0,45 0,27
PG-4A R G G R L A Y A R R R F A V A V G R 0,115 0,2
PG-AFLl R G G R L V Y L R R R F A F L I G R 0,384 0,23
1.2) Augmentation de l'amphipathicite de SynBl.
Les mutations ci-dessous augmentent les paramètres <H> et <μH> , c'est-à-dire l'hydrophobicité moyenne par résidu et l'amphipathicite hélicoïdale moyenne par résidu : la permutation d'au moins une paire des résidus en position 3 et 5, en position 10 et 12, et en position 16 et 17,
- la mutation d'au moins un des résidus en position 6, 13, 14 et 16 par un acide aminé hydrophobe, de préférence choisi parmi le groupe comprenant : Ala, Ile, Leu, Val, Phe, Trp,
- éventuellement la mutation d'au moins un autre résidu, de préférence le résidu Phe en position 12, par un résidu Tyr ou Trp donnant un signal spectroscopique et permettant le dosage du peptide, éventuellement la mutation du résidu en position 3 par un acide aminé hydrophobe, de préférence choisi parmi le groupe comprenant : Ile, Leu, Val, Phe, Trp. Le tableau 2 ci-dessous rapporte les mutations permettant d'augmenter l'amphipathicite de SynBl et donne des exemples de peptides selon l'invention dérivés de SynBl.
Tableau 2
<H> <μH>
SynBl R G G R L S Y S R R R F S T S T G R -0,069 0,18
A-Synbl R G L R G S Y S R F R R S T S T G R -0,069 0,37
V A W A A A
I V V V V
F I I I I
W L L L L F F F F W W W W
A-PG-3L R G L R G L Y L R F R R L V S V G R 0,327 0,43
A-PG-IL R G L R G L Y F R F R R I L S V G R 0,364 0,45
A-PG-4LF R G I R G L Y L R W R R L L S F G R 0,417 0,47
A-PG-3-LF R G F R G L Y L R W R R L V S V G R 0,359 0,46
Dans le tableau 2 ci-dessus, le peptide A-Synbl est un dérivé de SynBl dans lequel les paires d'acides aminés en position 3 et 5, en position 10 et 12 et en position 16 et 17 ont été permutées.
2) Mutation du peptide SynB3.
2.1) Augmentation de l'hydrophobicité <H> de SynB3.
Les mutations suivantes augmentent le paramètre <H>, c'est-à-dire l'hydrophobicité moyenne par résidus :
- la mutation simultanée des résidus en position
4 et 6 ou la mutation simultanée des résidus en position 4,
5 et 6 par des acides aminés hydrophobes, de préférence choisi parmi le groupe comprenant : Ala, lieu, Leu, Val, Phe, Trp, éventuellement, la mutation d'un moins un autre résidu, de préférence le résidu Phe en position 10, par un résidu Tyr ou Trp donnant un signal spectroscopique et permettant le dosage du peptide.
Le tableau 3 ci-dessous rapporte des mutations permettant d'augmenter l'hydrophobicité de SynB3 et donne des exemples de peptides selon 1 ' invention dérivés de SynB3.
Tableau 3
2.2) Augmentation de 1 ' amphipathicité hélicoïdale par résidu <μH> de SynB3.
Les mutations suivantes permettent d'augmenter le paramètre <H> et <μH>α du peptide SynB3 , c'est-à-dire l'hydrophobicité moyenne par résidu et l'amphipathicite hélicoïdale moyenne par résidu de ce peptide :
- la permutation des résidus en position 5 et 7 et la mutation simultanée, sur la séquence résultant de la permutation, des résidus en' position 4 et 6 ou des résidus en position 4, 6 et 7 par des acides aminés hydrophobes de préférence choisi parmi le groupe comprenant : Ala, lieu, Leu, Val, Phe et Trp, éventuellement, la mutation d'un moins un autre résidu, de préférence le résidu Phe en position 10, par un résidu Tyr ou Trp donnant un signal spectroscopique et permettant le dosage du peptide. Le tableau 4 ci-dessous rapporte des mutations permettant d'augmenter l'hydrophobicité moyenne par résidu et l'amphipathicite hélicoïdale moyenne par résidu de SynB3 et donne des exemples de peptides selon 1 ' invention dérivés de SynB3.
Tableau 4
2.3) Augmentation de l'amphipathicite bêta <μH>β de SynB3.
Les mutations suivantes permettent d'augmenter le paramètre <H> et <μH>β du peptide SynB3 , c'est-à-dire l'hydrophobicité moyenne par résidus et l'amphipathicite bêta moyenne par résidu <μH>β de ce peptide :
- la permutation des résidus en position 2 et 3 et la permutation des résidus en position 5 et 8, et sur la séquence résultant de la permutation, la mutation simultanée des résidus en position 4 et 6 ou la mutation simultanée des résidus en position 4, 6 et 8 par des acides aminés hydrophobes de préférence choisis parmi le groupe comprenant : Ala, lieu, Leu, Val, Phe et Trp, éventuellement, la mutation d'au moins un autre résidu, de préférence le résidu Phe en position 10, par un résidu Tyr ou Trp donnant un signal spectroscopique et permettant le dosage du peptide. Le tableau 5 ci-dessous rapporte des mutations permettant d'augmenter le paramètre <H> et <μH>β du peptide SynB3 et donne des exemples de peptides selon l'invention dérivés de SynB3.
Tableau 5
3) Mutation du peptide SynB4.
3.1) Augmentation de l'hydrophobicité <H> de SynB3.
Les mutations suivantes augmentent le paramètre <H>, c'est-à-dire l'hydrophobicité moyenne par résidus :
- la mutation simultanée des résidus en position 3, 7, 12, 16 par des acides aminés hydrophobes de préférence choisis parmi le groupe comprenant : Ala, lieu, Leu, Val, Phe et Trp.
Le tableau 6 ci-dessous rapporte des mutations permettant d'augmenter l'hydrophobicité <H> de SynB4 et donne des exemples de peptides selon l'invention dérivés de SynB4. Tableau 6
3.2) Augmentation de l'amphipathicite de SynB4.
Les mutations ci-dessous augmentent les paramètres <H> et <μH>α, c'est-à-dire l'hydrophobicité moyenne par résidu et l'amphipathicite hélicoïdale moyenne par résidu :
- une permutation des résidus en position 12 et 14, des résidus en position 16 et 17 et une mutation simultanée des résidus en position 3, 7, 14 et 17 par des acides aminés hydrophobes de préférence choisis parmi le groupe comprenant : Ala, lieu, Leu, Val, Phe et Trp.
Le tableau 7 ci-dessous rapporte des mutations permettant d'augmenter les paramètres <H> et <μH> , c'est-à- dire l'hydrophobicité moyenne par résidus et l'amphipathicite hélicoïdale moyenne par résidu, de SynB4 et donne des exemples de peptides selon 1 ' invention dérivés de SynB4. Tableau 7
Dans le tableau 7, aSynB4 est un peptide obtenu par une permutation des résidus en position 12 et 14 et des résidus en position 16 et 17.
L'invention concerne aussi un peptide linéaire contenant ou constitué par un dérivé d'un peptide antibiotique par :
- modification des résidus cystéines de façon à ce que ledit peptide soit dépourvu de pont disulfure,
- substitution d'une ou plusieurs arginines par la citrulline ou l'ornithine.
En effet, la substitution des arginines par des citrullines ou des ornithines permet de diminuer la toxicité éventuelle du peptide résultant du caractère cationique de l'arginine. Il est ainsi possible d'utiliser une plus grande quantité de vecteur peptidique. Toutefois, avantageusement selon la taille et le nombre d'arginine dans le peptide antibiotique d'origine, les peptides de l'invention comprennent au mois encore une, de préférence au moins encore deux et tout préférentiellement au moins encore trois arginines . A titre d'exemple de peptides selon l'invention dont une ou plusieurs arginines sont remplacées par des citrullines (Cit) , on peut citer les dérivés de SynBl, SynB3 et SynB4 du tableau 8 ci-dessous.
Tableau 8
SynBl R G G R L S Y S R R R F S T S T G R
SynBl/2Cit R G G R L S Y S Cit Cit R F S T S T G R
SynBl/3Cit R G G R L S Y S Cit Cit Cit F S T S T G R
SM3979 R G G R L A Y L R R R W A V L V G R
SM3979/2Cit R G G R L A Y L Cit Cit RW AV L VG R
SM3979/3Cit R G G R L A Y L Cit Cit Cit W A V L V G R
SM3980 R G G R L VY V R R R W V V V V G R
SM3980/2Cit R G G R L V Y V Cit Cit RWVVVV G R
SM3980/3Cit R G G R L V Y V Cit Cit Cit W V V V V G R
SyriB3 R R L S Y S R R R F
SynB3/2Cit R R L S Y S Cit Cit R F
SynB3/3CitA R R L S Y S Cit Cit Cit F
SynB3/3CitB R Cit L S Y S Cit Cit R F
SM4289 R R L W R L Y R R F
SM4289/2Cit R R L W R L Y Cit Cit F
SM4289/3Cit R Cit L W R L Y Cit Cit F
SM4290 R R L W R L L R R F
SM4290/2Cit R R L W R L L Cit Cit F
SM4290/3Cit R Cit L W R L L Cit Cit F
SynB4 A W S F R V S Y R G I S Y R R S R
SynB4/2Cit A W S F R V S Y R G I S Y Cit Cit S R
SynB4/3Cit A W S F Cit V S Y R G I S Y Cit Cit S R
SynB4-FALF A W F F RVA Y R G I L Y R R F R
SynB4-FALF/2Cit A W F F RVAY R G I L Y Cit Cit F R
SynB4-FALF/3Cit A W F F Cit V A Y R G I L Y Cit Cit F R
Les peptides de 1 ' invention peuvent être préparés par synthèse chimique ou par génie génétique, ils peuvent être sous forme rétro et comprendre des acides aminés sous forme D. L'invention concerne aussi des fragments de ces peptides constitués d'au moins cinq et de préférence d'au moins sept acides aminés successifs des séquences ci-dessu .
L'invention a aussi pour objet l'utilisation de ces peptides linéaires amphipathiques ou d'analogues de ceux-ci, pour la vectorisation à travers la membrane des cellules in vivo ou in vitro d'une ou plusieurs substances actives tant pour des applications thérapeutiques que de diagnostic. Par vectorisation, on entend selon l'invention, un processus capable de traverser la ou les membranes cellulaires et d'amener ladite substance active jusqu'à une cible située dans un compartiment cellulaire tel que le cytoplasme ou le noyau.
Ainsi, l'invention a pour objet des composés formés d'au moins un peptide linéaire amphipathiqùe de décrit précédemment lié directement ou indirectement à au moins une substance active. Ces composés peuvent être représentés par la formule (I) suivante :
A B (I) dans laquelle :
A représente un peptide amphipathiqùe de 1 ' invention,
- B représente une substance active, et le trait horizontal représente la liaison entre la substance active et le peptide linéaire amphiphatique .
A titre de substance active, l'invention envisage notamment des protéines, comme des polypeptides ou peptides, des anticorps ou partie d'anticorps, des acides nucléiques et oligonucléotides ou des ribozymes, ou encore, bien entendu, des molécules chimiques actives pour le traitement ou la prévention de pathologies - humaines ou animales, comme par exemple et de manière non limitative des antitumoraux, des antiviraux, etc.. Dans le domaine du diagnostic, la substance active peut être un marqueur radioactif, un marqueur coloré, ou tout autre moyen ou substance capable de révéler un métabolisme ou une pathologie.
Le couplage entre le peptide vecteur et la substance active, symbolisé par les traits horizontaux dans la formule (I) , peut être réalisé par tout moyen de liaison acceptable compte tenu de la nature chimique et de l'encombrement dans les composés de la formule (I) . Les liaisons peuvent être covalentes, hydrophobes ou ioniques, clivables ou non-clivables dans les milieux physiologiques ou à l'intérieur de la cellules. La liaison peut comprendre un ou plusieurs composés intermédiaires (linker) .
Le couplage peut être effectué en n'importe quel site du peptide (A) , dans lequel des groupements fonctionnels tels que -OH, -SH, -COOH, -NH2 sont naturellement présents ou ont été introduits .
Les positions de couplage pour la substance active peuvent être au niveau des extrémités N-terminale ou C-terminale ou bien au niveau des chaînes latérales du peptide. De même, le couplage peut être effectué en n'importe quel site de la substance active (B) , dans laquelle des groupements fonctionnels tels que -OH, -SH, -COOH, -NH2 sont naturellement présents ou ont été introduits .
L'invention concerne donc aussi des compositions pharmaceutiques comprenant à titre d'agent actif une quantité efficace d'au moins un composé de formule (I) dans un véhicule acceptable .
D'autres avantages et caractéristiques de 1 ' invention apparaîtront des exemples qui suivent concernant la préparation de peptides linéaires amphipathiques, leur couplage à une substance active et la pénétration de ce conjugué dans les cellules. 1) Synthèse des peptides marqués au groupe fluorescent NBD.
Les peptides ont été synthétisés par la stratégie Fmoc-tBu en utilisant un AMS 422 (ABIMED, Allemagne) . Les séquences des peptides sont indiquées dans le tableau I . Le marquage du N-terminal par un groupe fluorescent NBD a été effectué selon la procédure décrite par [Gazit, E. et al. (1995) Biochemistry 34, 11479-11488].
Le peptide sur résine est d'abord traité avec pipéridine [20% (v/v) dans du DMF] pour enlever le groupe protégeant Fmoc du N-terminal. Du NBD-Cl dans du DMF sec (excès de 5 fois) est ensuite rajouté en présence du DIEA (excès de 2 fois) pendant 6 hr à l'ombre avec agitation pour sélectivement marquer le groupe N-terminal. La résine est ensuite enlevée avec du DMF et traitée avec un mélange déprotégeant pour décrocher les peptides de la résine et déprotéger les chaînes latérales . Le peptide a été ensuite purifié par HPLC (reverse phase high performance liquid chromâtography) (Water-prep LC 40, Water) avec un gradient TFA 0,01%/ acétonitrile. La pureté des peptides a été mesurée par des critères d'absorbance UV à 220 nm et 460 nm et était de 95%.
2) Préparation des peptides couplés à la doxorubicine .
Le couplage de la doxorubicine sur un peptide par 1 ' intermédiaire du maillon succinique est effectué en 3 étapes .
Au chlorhydrate de doxorubicine (1 eq) , solubilisé dans diméthylformamide (DMF) en présence de Disopropyléthylamine (DIEA, 2 eq) est ajouté l'anhydride succinique (1,1 eq, dissous dans DMF). Après une incubation de 20 min à température ambiante, 1 'hémisuccinate de doxorubicine ainsi formé est ensuite activé par addition de PyBOP (Benzotriazol-1-yl-oxopyrrolidinephosphonium
Hexafluorophosphate 1,1 eq dans DMF) et DIEA (2 eq) . Ce second mélange réactionnel est incubé 20 min. Le peptide (1,2 eq dans DMF) est ensuite ajouté au mélange réactionnel, et se couple spontanément sur l 'hémisuccinate de doxorubicine activé au cours d'une incubation supplémentaire de 20 min.
Le produit de couplage est ensuite purifié sur HPLC (Chromatographie liquide haute pression) préparative, puis lyophilisé.
Chacune des étapes, ainsi que le produit final sont contrôlés par HPLC analytique et spectrometrie de masse.
Les peptides testés sont donnés dans le tableau 9 ci-dessous.
Tableau 9
3) Pénétration Cellulaire.
La pénétration cellulaire des peptides a été étudiée par cytométrie de flux. Les cellules K562 sont cultivées dans du milieu RPMI avec 10% de sérum de veau fœtal. Les cellules sont diluées à 0,3 x 106 cellules par ml 24 heures avant l'expérience. La pénétration cellulaire a été mesurée par cytométrie de flux en utilisant un FACScan (Becton Dickinson, USA) . Les peptides marqués au NBD (concentration finale 1 μM) sont incubés avec les cellules K562 (5 x 105 cellules par ml) dans un milieu Optimem à 37°C pendant des temps variables (le volume final était de 0,5 ml). Après l'incubation, les cellules sont lavées deux fois et ensuite resuspendues dans 0,5 ml de PBS froid. La pénétration a été ensuite analysée par FACS . Les fluorophores sont excités à 488 nm et la fluorescence est mesurée à 525 nm. Un histogramme de l'intensité de fluorescence (pour 1 x 104 cellules) est obtenu et la moyenne de distribution était considérée comme représentative de la quantité de peptide associé aux cellules .
4) Résultats.
Les résultats d' internalisation sont rapportés dans les tableaux ci-dessous.
Le tableau 10 montre la pénétration du peptide SM2363 par rapport à celle de deux de ces analogues qui sont plus amphipathiques .
Tableau 10
Les résultats du tableau 10 montrent que les analogues amphipathiques (SM3979 et SM3980) pénètrent avec beaucoup plus d'efficacité, et ceci quel que soit le temps considéré. Ainsi au temps 60 min, la pénétration du SM3979 et du SM3980 est respectivement 9 et 5 fois supérieure à celle du SynBl .
Le même design a été réalisé chez des peptides plus courts . Le peptide SynB3 a été pris comme référence et son amphipathie a été augmentée. La comparaison de pénétration du peptide SynB3 avec ces analogues est représentée dans les tableaux 11 et 12 ci-dessous .
Tableau 11
Tableau 12
Les résultats des tableaux 11 et 12 montrent aussi que les analogues amphipathiques pénètrent avec beaucoup plus d'efficacité, et ceci quel que soit le temps considéré.
5) Utilisation des peptides de 1 ' invention comme vecteurs pour le transfert d'une molécule active à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE) .
Dans de nombreuses maladies du système nerveux central, les molécules administrées ne passent pas la barrière hémato-encéphalique et ne peuvent donc pas atteindre leur cible dans le cerveau. a) Conditions Expérimentales .
i) Préparation du SynBl /3Cit-Doxorubicine.
Le couplage de la doxorubicine sur le peptide SynBl/3Cit par l'intermédiaire du maillon succinique est effectué en 3 étapes :
Au chlorhydrate de doxorubicine (1 eq) , solubilisé dans dimethylformaminde (DMF) en présence de Disopropyléthylamine (DIEA, 2 eq) est ajouté l'anhydride succinique (1,1 eq, dissous dans DMF).
Après une incubation de 20 min à température ambiante, 1 'hémisuccinate de doxorubicine ainsi formé est ensuite activé par addition de PyBOP (Benzotriazol-1-yl- oxopyrrolidinephosphonium Hexafluorophosphate, 1,1 eq dans DMF) et DIEA (2 eq) . Ce second mélange réactionnel est incubé 20 min.
Le peptide SynBl/3Cit (1.2 eq dans DMF) est ensuite ajouté au mélange réactionnel, et se couple spontanément sur 1 'hémisuccinate de doxorubicine activé au cours d'une incubation supplémentaire de 20 min.
Le produit de couplage est ensuite purifié sur HPLC (Chromatographie liquide haute pression) préparative, puis lyophilise.
Chacune des étapes, ainsi que le produit final sont contrôlés par HPLC analytique et spectrometrie de masse.
ii) Produits testés .
iii) Perfusion Cérébrale in si tu.
C'est une méthode rapide et sensible pour évaluer la pénétration de divers composés dans le système nerveux central. Des souris jeunes (25-30 g, Iffa-Credo ; l'Arbresle, France) sont anesthésiées . Après exposition de la carotide commune, l'artère carotide externe droite est liée au niveau de la bifurcation avec la carotide interne et la carotide commune est liée entre le cœur et le site d'implantation du cathéter (cathéter polyéthylène, ID :0.76). Celui-ci préalablement rempli par une solution d'héparine (100 unités/ml) est inséré dans la carotide commune . Les souris sont perfusées avec le tampon de perfusion (128 mM NaCl, 24 mM NaHC03, 4,2 M KCl, 2,4 mM NaH2P04, 1,5 mM CaCl2, 0,9 mM MgS04, et 9 mM D-glucose) . Ce tampon est filtré puis bulle par un mélange contenant 95% 02/ 5% C02 afin de maintenir le pH proche de 7,4 et d'alimenter le cerveau en oxygène au cours de la perfusion.
Les souris sont perfusées avec le tampon contenant la doxorubicine libre ou la doxo-SynBl/3Cit . Dans chaque produit, la doxorubicine est radio arquée au carbone 14 (activité spécifique : 9,4 μCi/mg, Amersham, France). Les produits sont perfuses à la concentration de 0,33 μCi/ml ou 0,035 g/souris.
Juste avant le début de la perfusion, le cœur est arrêté par section des ventricules, ceci afin d'éviter au cours de la perfusion un reflux du perfusat. L'hémisphère droit est alors perfusé à une vitesse de 10 ml/min pendant 60 secondes après quoi la souris est décapitée.
b) Résultats de la perfusion cérébrale in situ.
Dans cette étude, nous avons comparé la pénétration dans la BHE de la doxorubicine seule avec la doxorubicine vectorisée avec SynBl/3Cit. Après 60 secondes de perfusion dans le tampon, la pénétration des produits est estimée par la constante d'influx ou Kin en μl/sec/g. La figure 1 montre que la vectorisation de la doxorubicine par le vecteur SynBl/3Cit augmente son passage dans le cerveau de 20 fois après une perfusion de 60 secondes dans du tampon.

Claims

REVENDICATIONS
1) Peptide contenant ou constitué par un dérivé d'un peptide antibiotique par :
- modification des résidus cystéines de façon à ce que ledit peptide soit dépourvu de pont disulfure,
- substitution de 1 à 18 et de préférence de 1 à 6 acides aminés, et/ou permutation d'au moins une paire d'acides aminés, lesdites substitutions et/ou permutations étant telles que ledit peptide présente un caractère amphipathiqùe .
2) Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente une hydrophobicité moyenne par résidu <H> comprise entre 0,15 et 0,7.
3 ) Peptide selon 1 ' une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il présente un moment d'hydrophobicite hélicoïdal <μH>α supérieur à 0,15.
4) Peptide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il présente un moment d'hydrophobicite bêta <μH>β supérieur à 0.
5) Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il est dérivé de protégrine ou de tachyplésine, d'un analogue ou d'un fragment de ceux-ci .
6) Peptide comprenant ou constitué par un dérivé d'un peptide dont la séquence en acides aminés est choisi parmi :
1 5 10 15 18
- SEQ ID O:l r R G G R L S Y S R R R F S T S T G R
1 5 10
- SEQ ID NO:2 : R R L S Y S R R R F
1 5 10 15 17 - SEQ ID NO:3 -. AW S F R V S Y R G I S Y R R S R ou un fragment de celles-ci constitué d'au moins cinq et de préférence d'au moins sept acides aminés successifs, par substitution de 1 à 18 et de préférence de 1 à 6 acides aminés, et/ou permutation d'au moins une paire d'acides aminés, lesdites substitutions et/ou permutations étant telles que ledit peptide présente un caractère amphipathiqùe .
7) Peptide selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il dérive d'un peptide dont la séquence en acides aminés est SEQ ID NO:l par mutation d'au moins un des résidus en position 6, 8, 13, 14, 15, 16 par un acide aminé hydrophobe, de préférence choisi parmi le groupe comprenant : Ala, Ile, Leu, Val, Phe, Trp, et éventuellement mutation d'au moins un autre résidu, de préférence le résidu Phe en position 12, par un résidu tyr ou Trp.
8) Peptide selon la revendication 7, caractérisé par l'un des séquences en acides aminés suivantes :
- SEQ ID NO:4 : R G G R L AY L R R R W AV L V G R,
- SEQ ID NO:5 : R G G R L VY V R R R W VVVV G R,
- SEQ ID NO:6 r R G G R L L Y L R R R W L V L V G R,
- SEQ ID 0:7 : R G G R L AY A R R R F AV AV G R,
- SEQ ID NO:8 : R G G R L VY L R R R F A F L I G R.
9) Peptide selon l'une des revendication 6 à 8, caractérisé en ce qu'il dérive d'un peptide dont la séquence en acides aminés est SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 ou SEQ ID NO : 8 par permutation d'au moins une paire des résidus en position 3 et 5, en position 10 et 12, et en position 16 et 17.
10) Peptide selon l'une des revendication 6 à 9, caractérisé en ce qu'il dérive d'un peptide dont la séquence en acides aminés est SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 7 ou SEQ ID NO: 8 par : - permutation d'au moins une paire des résidus en position 3 et 5, en position 10 et 12, et en position 16 et 17,
- mutation d'au moins un des résidus en position 6, 13, 14 et 16 par un acide aminé hydrophobe, de préférence choisi parmi le groupe comprenant : Ala, Ile, Leu, Val, Phe, Trp, et éventuellement mutation d'au moins un autre résidu, de préférence le résidu Phe en position 12, par un résidu Tyr ou Trp donnant un signal spectroscopique et permettant le dosage du peptide,
- éventuellement mutation du résidu en position 3 par un acide aminé hydrophobe, de préférence choisi parmi le groupe comprenant : Ile, Leu, Val, Phe, Trp.
11) Peptide selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisé par l'une des séquences en acides aminés suivantes : - SEQ ID NO:9 : R G L R G S Y S R F R R S T S T G R,
- SEQ ID NO: 10 R G L R G L Y L R F R R L V S V G R,
- SEQ ID NO: 11 R G L R G L Y F R F R R I L S VG R,
- SEQ ID NO: 12 R G I R G L Y L R W R R L L S F G R,
- SEQ ID NO: 13 R G F R G L Y L R W R R L V S V G R.
12) Peptide selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il dérive d'un peptide dont la séquence en acides aminés est SEQ ID NO: 2 par mutation simultanée des résidus en position 4 et 6 ou la mutation simultanée des résidus en position 4, 5 et 6 par des acides aminés hydrophobes, de préférence choisis parmi le groupe comprenant : Ala, lieu, Leu, Val, Phe, Trp, et éventuellement, la mutation d'un moins un autre résidu, de préférence le résidu Phe en position 10, par un résidu Tyr ou Trp donnant un signal spectroscopique et permettant le dosage du peptide.
13 ) Peptide selon la revendication 12 , caractérisé par l'un des séquences en acides aminés suivantes : - SEQ ID NO:14 : R R L W Y L R R R F
- SEQ ID NO:15 : R R L W L L R R R F
14) Peptide selon l'une quelconque des revendication 6, 12 ou 13, caractérisé en ce qu'il dérive d'un peptide dont la séquence en acides aminés est SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 par permutation des résidus en position 5 et 7 et la mutation simultanée, sur la séquence résultant de la permutation, des résidus en position 4 et 6 ou des résidus en position 4, 6 et 7 par des acides aminés hydrophobes de préférence choisis parmi le groupe comprenant : Ala, lieu, Leu, Val, Phe et Trp, et éventuellement, mutation d'un moins un autre résidu, de préférence le résidu Phe en position 10, par un résidu Tyr ou Trp donnant un signal spectroscopique et permettant le dosage du peptide.
15) Peptide selon la revendication 14, caractérisé par l'un des séquences en acides aminés suivantes :
- SEQ ID NO:16 : R R L W R L Y R R F
- SEQ ID NO:17 : R R L W R L L R R F
16) Peptide selon l'une quelconque des revendication 6, 12, 13, 14 ou 15, caractérisé en ce qu'il dérive d'un peptide dont la séquence en acides aminés est SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 17 par permutation des résidus en position 2 et 3 et la permutation des résidus en position 5 et 8, et sur la séquence résultant de la permutation, la mutation simultanée des résidus en position 4 et 6 ou la mutation simultanée des résidus en position 4, 6 et 8 par des acides aminés hydrophobes de préférence choisis parmi le groupe comprenant : Ala, lieu, Leu, Val, Phe et Trp, et éventuellement, mutation d'un moins un autre résidu, de préférence le résidu Phe en position 10, par un résidu Tyr ou Trp donnant un signal spectroscopique et permettant le dosage du peptide. 17) Peptide selon la revendication 16, caractérisé par l'un des séquences en acides aminés suivantes :
- SEQ ID O:18 : R L R W R L R Y R F
- SEQ ID NO:19 : R L R W R L R L R F
18) Peptide selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il dérive d'un peptide dont la séquence en acides aminés est SEQ ID NO: 3 par mutation simultanée des résidus en position 3, 7, 12, 16 par des acides aminés hydrophobes de préférence choisis parmi le groupe comprenant : Ala, lieu, Leu, Val, Phe et Trp.
19) Peptide selon la revendication 18, caractérisé par 1 ' une des séquences en acides aminés suivantes :
- SEQ ID NO: 20 AWAF RVAY R G I AY R RA R
- SEQ ID NO: 21 A W L F R VA Y R G I L Y R R A R
- SEQ ID NO: 22 AW F F RV A Y R G I L Y R R F R
20) Peptide selon l'une quelconque des revendication 6 ou 19, caractérisé en ce qu'il dérive d'un peptide dont la séquence en acides aminés est SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 22 par permutation des résidus en position 12 et 14, des résidus en position 16 et 17 et une mutation simultanée des résidus en position 3, 7 , 14 et 17 par des acides aminés hydrophobes de préférence choisis parmi le groupe comprenant : Ala, lieu, Leu, Val, Phe et Trp.
21) Peptide selon la revendication 20, caractérisé par l'une des séquences en acides aminés suivantes :
- SEQ ID NO: 23 AW A F RV L Y R G I R Y L R R A
- SEQ ID NO: 24 AW I F RVV Y R G I R Y F R R A
- SEQ ID NO: 25 AW F F RV I Y R G I R Y I R R L 22) Peptides selon l'une quelconques des revendications 1 à 21, caractérisé en ce que la substitution d'une ou plusieurs arginines par la citrulline ou 1 ' ornithine .
23) Peptide selon la revendication 22, caractérisé par l1 ''uunnee des séquences en acides aminés suivantes :
- SEQ ID NO: 26 : R G G R L S Y S Cit Cit R F S T S T G R
- SEQ ID NO: 27 : R G G R L S Y S Cit Cit Cit F S T S T G R
- SEQ ID NO: 28 : R G G R L A Y L Cit Cit R W A V L V G R
- SEQ ID NO: 29 : R G G R L A Y L Cit Cit Cit W A V L V G R
- SEQ ID NO: 30 : R G G R L V Y V Cit Cit R W V V V V G R
- SEQ ID NO: 31 : R G G R L V Y V Cit Cit Cit W V V V V G R
- SEQ ID NO: 32 : R R L S Y S Cit Cit R F
- SEQ ID NO: 33 : R R L S Y S Cit Cit Cit F
- SEQ ID NO: 34 : R Cit L S Y S Cit Cit R F
- SEQ ID NO: 35 : R R L W R L Y Cit Cit F
- SEQ ID NO: 36 : R Cit L W R L Y Cit Cit F
- SEQ ID NO: 37 : R R L W R L L Cit Cit F
- SEQ ID NO: 38 : R Cit L W R L L Cit Cit F
- SEQ ID NO: 39 : A W S F R V S Y R G I S Y Cit Cit S R
- SEQ ID NO: 40 : A W S F Cit V S Y R G I S Y Cit Cit S R
- SEQ ID NO: 41 : A W F F R V A Y R G I L Y Cit Cit F R
- SEQ ID NO: 42 : A W F F Cit V A Y R G I L Y Cit Cit F R
24) Un composé formé d'au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 23 lié directement ou indirectement à au moins une substance active.
25) Un composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent actif une quantité efficace d'au moins un composé selon la revendication 24 dans un véhicule acceptable .
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