JP2005517455A5 - - Google Patents
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Claims (13)
- サンプル中の標的核酸の定量化方法であって、以下のステップ：
(1)既知の標準品と組み合わせてPicoGreen（登録商標）dsDNA定量試薬を使用して、上記サンプル中の核酸の総量を正確に定量化し；
(2)リアルタイムPCRプライマー及びプローブを使用して上記標的核酸を増幅して、一定量の単位複製配列を作製し；
(3)上記単位複製配列に基づいて基準プラスミドを構築し；
(4)蛍光発光プローブを使用して様々な既知量の上記プラスミドを用いたリアルタイムPCR反応の蛍光発光基準曲線を作成し；
(5)上記サンプルのアリコートを用いたリアルタイムPCRを実施して上記標的核酸を増幅し、そして蛍光発光プローブの結合に起因する蛍光発光を得；そして
(6)上記ステップ(5)の蛍光発光の結果を上記ステップ(4)の基準曲線と相関させて、上記サンプル中に存在する総核酸量当たりのコピー数として上記標的核酸を定量化する、
を含む前記定量化方法。 - 定量化され、そして前記ステップ(4)の蛍光発光の基準曲線を作成するのに使用される前記プラスミドを準備するために、前記ステップ(2)の単位複製配列を前記ステップ(3)においてベクター中にクローニングする、請求項1に記載の方法。
- 前記ステップ(5)のリアルタイムPCR反応に、前記ステップ(2)で使用された前記リアルタイム・プライマーを使用する、請求項1又は2に記載の方法。
- 蛍光発光検出用サーモサイクラーを使用して、前記ステップ(2)とステップ(5)の両方を実施する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記蛍光発光基準曲線を、一定量の前記単位複製配列又はコピー数として表されたクローン化単位複製配列に対する前記リアルタイムPCR反応の閾値サイクル(CT)の自然対数を使用して作成する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的核酸がRNAを含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ステップ(2)及び(5)において、前記RNAから構築されたcDNAを前記標的核酸として使用する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記サンプル中のタンパク質レベルを、サンプル中のmRNAのレベルに対して相対的に定量化する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ステップ(2)で使用される前記標的核酸が、前記サンプル以外の起源に由来する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ステップ(4)及び(5)が同じ反応プレート内で実施される、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的核酸量が、サイトカイン量に正比例する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リアルタイムPCR反応に、IFN-γ又はIL4に特異的な所定のアッセイ試薬(PDAR)を使用する、請求項11に記載の方法。
- 前記リアルタイムPCR反応に、IFN-γに対するプライマーとプローブ（配列番号3）、IL2に対するプライマーとプローブ（配列番号6）、IL10に対するプライマーとプローブ（配列番号9）及び/又はTNF-αに対するプライマーとプローブ（配列番号12）を使用する、請求項11に記載の方法。
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