JP2005517455A - 核酸定量化 - Google Patents

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Abstract

リアルタイムPCRは、極めて効果的な技術である。しかし、その結果は解釈次第である。それというのもデータ提示の慣例がないからである。リアルタイムPCRがこのように異例である理由は、多くの用途が非標準的な校正遺伝子に依存しており、これらの校正遺伝子自体の値が試験操作中にしばしば変化することにある。われわれは、極めて正確な定量化と基準曲線との組み合わせを用いた、核酸の絶対定量方法をここに明示する。1の実施態様において、リアルタイムPCR生成物をプラスミド内にクローニングし、次いでこれらを、リアルタイムPCRに供される未知のサンプルを校正するのに使用する。結果をcDNAの1μg当たりのコピー数として表し、従って、この結果は試験間及びサンプル間の双方で比較することができる。

Description

本発明は、リアルタイムPCRを用いた核酸定量化に関する。
従来の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)は、幅広く用いられている高感度の技術である。RT-PCRは、比較的稀なmRNA転写の検出にしばしば適用されている。しかし、RT-PCRは、大抵の場合、反応中に試薬が枯渇することに起因して、真には定量的ではなく、またしばしば、実際に存在する総メッセージ・レベルを全体的に過小評価することになる(Santagati他、1997)。その結果、PCR生成物がゲル上で視覚化されると、バンドの強度は初期標的の量に対して正常には比例せず、従って画像分析を不正確にしてしまう。
この制限を克服するための最も正確な方法の1つは、ABI Prism 7700Sequence Detector(Holland他、1991; Livak他、1995)によって例示されているような5'-3'エクソヌクレアーゼ反応を用いることである。「リアルタイムPCR」の場合、標準PCRプライマーに加えて、プローブと呼ばれる第3要素が存在する。このプローブは、順方向プライマーの下流側に位置しており、5'末端に蛍光タグを有し、そして3'末端にはクエンチャーを有する。PCRが進行するのにつれて、Taqポリメラーゼは、その5'-3'エクソヌクレアーゼ活性を利用し、そしてプローブを破壊し、ひいては発色する。この色は、存在する標的DNAの量に対して正比例する。従って色が急速に検出される場合には、多量のDNAが存在し、ゆっくりとした発色の場合には、その逆である。
リアルタイムPCR反応の感度が優れているにもかかわらず、議論の余地がまだ大きく残されている。複数サンプルを比較するために、何らかの校正の形を用いることが必要である。一般的な1方法は、基準遺伝子又は「ハウス・キーピング」遺伝子を使用することである。その論理は、標的遺伝子のレベルが劇的に変化しても、この基準遺伝子又は「ハウス・キーピング」遺伝子は不変であることである(Overbergh他、1999)。これは事実上、外部対照である。これは一般に行われてはいるが、このシステムを使用した時にも顕著な欠点がまだ生じる。これらの欠点は、最も一般的には、基準遺伝子が真には静的でなく、細胞のターンオーバー中に僅かに変化するおそれがあるという事実に関連する。cDNA合成中には、食い違いの別の源が生じる。理想的には、cDNA合成は単一のバッチ内で行い、これにより、標的遺伝子及び基準遺伝子の転写効率の差異によって引き起こされる潜在的な可変性を回避するべきである。このことは、例えばサンプルが異なる時間インターバルで到着するような臨床的な状況においては、明らかに実用的ではない。
別の校正方法は、標的遺伝子を含有するプラスミドの形で内部基準標準を使用することである。このようにして、既知量のプラスミドを使用して、校正曲線を作成し、次いで、この曲線から未知のサンプルを同定することができる(Li及びWang, 2000)。従って、特定遺伝子のコピー数として結果を表すことができる。それというのもコピー数は事実上、プラスミドのモル濃度であるからである。しかしこの方法は、特に、高精度ds-DNA定量と関連して、信頼性の高い標準の作製に依存しているため、今日まで理想的であったことはない。
本発明は、これらの従来技術の問題に対処する、標的核酸分子の新しい定量化方法を提供する。
本発明によれば、サンプル中の標的核酸を定量化する方法であって、以下のステップ：
(1)蛍光発光を使用して上記サンプル中の核酸の総量を、正確に定量化し；
(2)リアルタイムPCRプライマーを使用して上記標的核酸を増幅して、一定量の単位複製配列を作製し；
(3)上記単位複製配列に基づいて基準プラスミドを構築し；
(4)様々な所定量の上記プラスミドを用いたリアルタイムPCR反応の蛍光発光の基準曲線を作製し；
(5)上記サンプルのアリコートを用いたリアルタイムPCRを実施して、上記標的核酸を増幅し、蛍光発光の結果を得；そして
(6)上記ステップ(5)の蛍光発光の結果を上記ステップ(4)の基準曲線と相関させて、上記サンプル中の標的核酸を定量化する、
を含む前記定量化方法が提供される。
標的核酸単位複製配列(リアルタイムPCRプライマーを使用して得られる、増幅されたフラグメント)を、蛍光発光の基準曲線の作成のために使用すると、サンプル中の標的核酸の正確な定量化のための内部対照が提供され、非標的校正遺伝子の使用が必要でなくなる。文献に記載されたリアルタイムPCRデータの大部分は、校正遺伝子を使用することによって相対定量を用いることから導出される。このことは煩雑さを伴い、下記試験の項目においてさらに論じるように、これらのデータの殆どの使用に対して反論が生じるおそれがある。本発明はこのような問題を回避する。
単位複製配列を内部対照として使用することの更なる利点は、標的核酸及び対照の増幅が、同じ効率で生じる可能性が高く、定量化結果がより正確になることである。
ステップ(2)は、リアルタイムPCR反応として、又は通常PCR反応(すなわちプローブを使用しない)として行うことができる。
本発明において、ステップ(2)の単位複製配列を、ベクター(すなわちプラスミド)中にクローニングし、これにより、クローニングされた単位複製配列を生成する。この単位複製配列は、定量化され、ステップ(4)の蛍光発光の基準曲線を作成するのに使用される。標的遺伝子が挿入されているプラスミドを用いて、基準曲線を作成することは知られてはいるものの(例えばLi及びWang, 2000参照)、標的遺伝子全体、又は、少なくとも、リアルタイムPCRによって生成された単位複製配列よりも著しく大きなPCRフラグメントをクローニングすることが普通である(1単位複製配列の長さは典型的には50〜150bpである)。リアルタイムPCRのために使用されたPCRプライマーはクローニングにも用いることができるため、このことは不要であることを我々は示した。従って、リアルタイム実行から得られた生成物は、単に、ベクター及び構築された基準プラスミド中にクローニングすればよい。このような技術のシンプルさは、基準遺伝子の使用及びこれらに付随する煩雑さをもはや不要なものにする。好ましい実施態様では、ステップ(5)のリアルタイムPCRが、ステップ(2)で使用されたリアルタイム・プライマーを使用することができる。このことは、必要な試薬を減らし、そして、対照及び標的の増幅が事実上同一になることを意味する。
ステップ(1)の核酸定量化方法は、少なくとも1 ng/ml DNAの感度限界を有することができる。例えば、この核酸定量化方法は、PicoGreen(RTM)dsDNA定量試薬を使用することができる。高感度核酸定量化方法を用いることは、標的核酸の正確な定量化にとって重要である。核酸定量化方法は(PicoGreenと同様に) 蛍光発光に基づいており、この方法は、ステップ(1)及びステップ(5)の両方が、蛍光発光検出用サーモサイクラー、例えばPerkin Elmer/Applied Biosystems Prism 7700 Sequence Detectorシステムを使用して行われるように、実施することができる。或いは、ステップ(1)は、蛍光計を使用して実施することもできる。ステップ(1)及びステップ(5)に対して同じ機械を使用することにより、当該方法がシンプルになり、より高速の分析が可能になる。例えば、DNA定量化及びPCRの双方を、ABI Prism 7700を使用して実施する場合、余分の装置を設ける必要が軽減される。96ウェル・フォーマットを使用して、例えばABI Prism 7700で、高処理量を維持することができる。
好ましい実施態様において、蛍光発光の基準曲線は、一定量の単位複製配列、又はコピー数として表されたクローニングされた単位複製配列に対する、リアルタイムPCRの閾値サイクル(CT)の自然対数を使用して作成することができる。さらに別の好ましい実施態様において、サンプル中の標的核酸は、上記サンプル中に存在する総核酸の量当たりのコピー数（例えばcDNA 1μg当たりのコピー数)として定量化することができる。このことの利点は、例えば、種々異なるサンプルからのmRNAの分離中に発生し得る損失との関係をなくし、ひいては、ハウスキーピング遺伝子分析を用いた相対定量の必要性を排除することである。さらに、cDNAのコピー数/cDNAの量(例えばμg)として表される結果を用いて、種々異なる試験間及びサンプル間の比較が可能になる。このことは、種々の長さの単位複製配列を検出する試験から得られた結果を比較するときに、特に有利になる。
標的核酸はRNA、例えばmRNAを含んでよい。この場合、cDNAは、ステップ(2)及び(5)において上記標的核酸として使用されるRNAとcDNAとから構築することができる。このシステムは、細胞中の遺伝子発現レベルの定量化を可能にする。
1の実施態様において、サンプル中のタンパク質レベルが定量化される。例えば、cDNAを生成するために使用された細胞サンプルから得られた上澄みを保持し、そしてそのタンパク質レベルを定量化することができる。こうして、mRNA及びタンパク質双方のレベルを同じサンプルから得ることができる。このことは、複数のサンプルを所定の時間にわたって高精度で比較しなければならない臨床試験分析に理想的に好適である。
ステップ(2)において使用される標的核酸は、サンプル以外の起源に由来してよい。
正確な計算のために、ステップ(4)及び(5)は同じ(リアルタイムPCR)反応プレート内で行われる。
この方法は、サイトカイン・レベルを測定するのに特に有用であることが実証された(下記参照)。こうして、本発明は、標的核酸の量がサイトカイン量に対して正比例する場合に使用するための方法をも提供する。リアルタイムPCR反応は、(例えばApplied Biosystemsから得ることができるような)IFN-γ又はIL4に対して特異的な定義済アッセイ試薬(PDAR)を使用することができる。或いは、リアルタイムPCR反応は、下記表1に定義されているようなIFN-γ、IL2、IL10及び/又はTNF-α(配列番号1-12)のためのプライマー及びプローブを使用することができる。
好ましい形態において、この方法はリアルタイムPCRプローブを使用する。しかし、別のシステム、例えば色素だけのシステム(例えば、SYBR-GreeのようなdsDNA特異的色素)は排除される。さらに、蛍光発光ではなく吸光度が検出される核酸定量化方法を用いることが可能であり、このような核酸定量化方法は、蛍光発光の基準曲線でなく吸光度基準曲線の作成を可能にする。
試験
我々は、サンプル中に存在するDNAの総量を高精度で正確に測定することができるプロトコルを含むことにより、cDNAサンプル中のサイトカイン分子のコピー数を定量するための好ましい方法を説明する。この方法は、cDNA 1μg当たりのコピー数として、結果を表すことを可能にする。この技術は、リアルタイム・データに対して示される欠点の多くを克服し、シンプルであり、かつ、臨床検査室において標準的に使用するのに十分に日常的であると考えられる。我々は、具体的にはサイトカイン・レベルを試験したが、この技術は、より全般的なリアルタイムPCR用途に適用可能である。
材料及び方法
脾臓細胞の抽出及び培養(実施例1)
C57/b16マウス(英国ロンドン在、St. George's Hospital Medical School)から、脾臓を切除した。40μmナイロン・セル・ストレーナー(英国オックスフォード在、Falcon, Oxford)を通し、そして10% ウシ胎仔血清(英国テディントン在、FCS; PAA Laboratories)、L-グルタミン(スコットランド、ペイズリー在、Life Technologies)、ペニシリン(1000 U/ml)及びストレプトマイシン(1000μg/ml)(Life Technologies)が補足された培地(英国ドーセット在、Sigma Chemical Co.)で洗浄することにより、脾臓細胞を分離した。
Histopaque 1083 (Sigma)上で遠心分離することにより、末梢血細胞リンパ球(pbl)を取り出した。その界面から得た細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄した後、Concanavlin A (ConA)(2.5μg/ml; Sigma)、ConA プラス 組換えインターフェロン-γ(0.01μg/ml,英国アビンドン在R&D Systems)、又はConA プラス 組換えインターロイキン-4(0.02μg/ml,英国アビンドン在R&D Systems)の存在において、2.5×106/mlの濃度で培養した。培地及び細胞を単独で含有する対照培養を同時に準備した。37℃の5% CO2雰囲気のインキュベータ内で48時間にわたって、培養をインキュベートし、その後PBS中で洗浄し、そしてRNAの抽出を始めた。
ヒト末梢血リンパ球の抽出及び培養(実施例2)
健康なドナーからの10mlヒト血液を、10mlリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈し、そして、Histopaque 1077 (Sigma)上で遠心分離することにより、末梢血細胞リンパ球(PBL)を取り出した。その界面から得た細胞をPBSで洗浄した後、(A)Concanavlin A (ConA)(2.5μg/ml; Sigma)、(B)ホルボール12-ミリステート13-アセテート(PMA) (0.05μg/ml; Sigma) + イオノマイシン(0.5mg/ml; Sigma)、(C)リポ多糖類(LPS) (1μg/ml; Sigma)又は(D)培地及び細胞だけの対照培養の存在において、2.5×106/mlの濃度で培養した。37℃の5% CO2雰囲気のインキュベータ内で培養をインキュベートした。24時間のインキュベーション後、これらの培養を1.5mlエッペンドルフ管に移し、細胞を8000rpmで1分間にわたってペレット化した。上澄みを新鮮なエッペンドルフに移し、血球計算ビード・アレイ(CBA)による分析の前に、-80℃で保存した。細胞ペレットはRNA抽出源及びcDNA合成源であった。
RNA抽出及びcDNA合成
Absolutely RNA RT PCR ミニプレップ・キット(オランダ国アムステルダム在Stratagene)を使用して、製造元の指針に従って、1×107個の細胞(マウス脾臓PBL;実施例1)又は2.5×106個の細胞(ヒト血液PBL;実施例2)から成る細胞ペレットから、RNAを抽出した。キットにおけるDNアーゼ処理ステップの存在により、ゲノムDNAの汚染が排除された。31-32μlの容積でRNAを溶出し、そして直ちにcDNA合成において鋳型として使用した。10mM dNTP(Gibco BRL)、1μg Oligo(dT)(12-18)プライマー(オランダ国フローニンゲン在Invitrogen)、80単位の組換えリボヌクレアーゼ阻害薬(Invitrogen)、31μl RNA、10μl 第1ストランド緩衝液(5x)(英国リトル・チャルフォント在、Amersham Pharmacia)及び500単位のMMLV逆転写酵素(Amersham Pharmacia)を含有する50μlの総容積で、0.2ml PCRチューブ内で逆転写を実施した。これを1時間にわたって37℃でインキュベートし、続いて4℃(実施例1)又は-20℃(実施例2)でcDNAを保存した。
総DNAのPicoGreen定量化
PicoGreen dsDNA定量キット(英国ケンブリッジ在Molecular Probes)からの試薬を使用して、定量化を実施した。λDNA標準(Molecular Probes)を1×Tris-EDTA(TE)中で500ng/mlに希釈し、96ウェル型光反応プレート(英国ウォリントン在、Applied Biosystems)内に3部にアリコートした。TEを添加して、最終容積50μl及び最終濃度500ng/ml、375ng/ml、250ng/mg、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml及び0ng/mlを構成した。cDNAを1×TE中に希釈し、100分の1及び200分の1の希釈率のものを3部、反応プレートに添加した。PicoGreen二本鎖DNA定量試薬(Molecular Probes)を200分の1に希釈し、50μlをそれぞれのウェルに添加し、こうしてDNAの希釈率を倍にした。光学接着カバーをウェルに被さるように固定し、次いでプレートをアルミニウム・ホイルでラッピングすることにより、PicoGreen試薬の光分解を防止した。1又は2秒間のバーストを3回行うために、プレートに渦流を与え、その後、プレートを下方に振り、液体をウェルの底部に移動させた。PicoGreen 環境下でABI Prism 7700 Sequence Detector上でPCR後読み出しプロトコルを使用して、プレートを読み取る。これらの環境は、製造元の指示書の通り、励起480nmでの励起、及び520nmでの測定を伴うPicoGreen標準に対応する吸光スペクトルを形成することにより生成した。線形標準曲線を描き、標準DNA濃度に対するλDNAの3部から成る値に関して得られた平均蛍光発光値をプロットした(実施例1-図1；実施例2-図6)。試験DNAの濃度を、希釈率に合わせて調節した後、一次方程式から算出した。
特異的cDNAの絶対定量化
IFN-γ、IL2、IL4及びIL10(Applied Biosystems)に対して特異的な定義済アッセイ試薬(PDAR)でプライミングされたPCRから得られたリアルタイムPCR反応生成物をクローニングすることにより、インターフェロン-γ(IFN-γ)、インターロイキン-2(IL2)、インターロイキン-4(IL4)、インターロイキン-10(IL10)に対して、特異的対照を構築した。PDARは、特異的cDNA標的のためのプライマー及びプローブ(Applied Biosystemsからは入手不能の配列)を含有する試薬であり、ABI Prism 7700と共に使用するために最適化されており、通常、イントロン-エクソン境界に跨がるように構築されている。pBAD TOPO TAクローニング・キット(Invitrogen)を使用して、生成物をpBAD-TOPOベクター中にクローニングした。単独のコロニーを含有する25 ml LBブイヨン培養を一晩成長させ、37℃で振盪し、続いて、QIAfilterプラスミド・ミディプレップ・キット(英国クローレイ在Quiagen)を使用して精製した。プラスミドDNAを150μl TE緩衝液中に可溶化した。DNA配列決定(LARK技術)が、クローニングされた生成物の配列を確認した。pBR322ベクター中にクローニングされた腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)に対応するcDNAは、American Type Culture Collection (ATCC番号39894)から入手可能であった。続いて、プライマー発現ソフトウェア(Applied Biosystems)を使用して、クローニングされた生成物に対して特異的なオリゴヌクレオチドを構築し、そしてこれを後続のRT-PCR反応において使用した(表1参照)。
表1：リアルタイムPCRのためのオリゴヌクレオチド・プライマー(実施例2)
cDNA標的 オリゴヌクレオチド(5'から3')
IFN-γ For:ATG TAT TGC TTT GCG TTG GAC A [配列番号1]
Rev:TCA ATA GCA ACA AAA AGA AAC GAG [配列番号2]
Pro:6Fam-TCA AGT CAG TTA CCG AAT AAT TAG TCA GCT TTT C-Tamra[配列番号3]
IL2 For:TCA CCA GGA TGC TCA CAT TTA AGT [配列番号4]
Rev:GAG GTT TGA GTT CTT CTT CTA GAC ACT GA [配列番号5]
Pro:6Fam-ATG CCC AAG AAG GCC ACA GAA CTG AA- Tamra[配列番号6]
IL10 For:CAA GGA CTC CTT TAA CAA CAA GTT [配列番号7]
Rev:GAG ATG CCT TCA GCA GAG TG [配列番号8]
Pro:6Fam-CAG CTG ATC CTT CAT TT - MGB[配列番号9]
TNF-α For:CTG CCC CAA TCC CTT TAT T [配列番号10]
Rev:CCC AAT TCT CTT TTT GAG CC [配列番号11]
Pro:6Fam-CCC CTC CTT CAG ACA CCC TCA ACC TCT T -Tamra[配列番号12]
GADPH For:TCG ACA GTC AGC CGC ATC T [配列番号13]
Rev:CCG TTG ACT CCG ACC TTC A [配列番号14]
For、Rev及びProはそれぞれ順方向、逆方向及びプローブを示す。全てのプライマー及びFam-Tamraプローブは、MWG-Biotechから購入した。IL10Fam-MGBプローブはApplied Biosystems から購入した。
精製済プラスミド・クローンを、PicoGreen定量化方法(上記参照)を用いて定量した。この定量化方法には、プラスミドDNAが1000分の1及び2000分の1の希釈率で測定されるように小さな変更が加えられている。
プラスミド及び既知の挿入体の分子量により、コピー数を下記のように計算することが可能である：
重量(ダルトン(g/モル))=(ds生成物のbpサイズ)(330ダルトン×2nt/bp)
故に：(g/モル)/アボガドロ数=g/分子=コピー数
(上記式中：bp=塩基対、ds=二本鎖、nt=ヌクレオチド)
プラスミドDNAのコピー数及び濃度を知ることによって、後続のPCR実行に加えられる分子の正確な数を計算し、ひいては特異的cDNA定量化のための標準を提供することができる。
96ウェル型光学プレートの3部から成るウェルにおいて、リアルタイムPCRを実施した。これらのウェルはそれぞれ、1×PCRマスター混合物(Applied Biosystems)、1×PDAR試薬(Applied Biosystems；実施例1)、又は、順方向プライマー、逆方向プライマー及び標識付けプローブをそれぞれ0.3pmol/μl(実施例2)、及び2μlの鋳型DNA (cDNA、5分の1に希釈されたcDNA、又は104分の1〜5×109分の1の範囲のプラスミドDNA希釈液)を最終容積25μlで含有した。このリアルタイムPCRの実行は、ABI 7700 Prism(Applied Biosystems)を用いて40サイクルで行った。デフォルト7700サイクル条件は下記の通りであった：50℃で2分間、次いで95℃で10分間、続いて、95℃で15分間及び60℃で1分間を40サイクル。分子の自然対数に対して閾値サイクル(CT)の自然対数をプロットすることにより、標準曲線を描いた(実施例1;図2)。PCR反応によって発生したシグナルの規模の統計的に有意な増大が最初に検出されるサイクルとして、CTを定義した。リアルタイム配列検出ソフトウェア(Applied Biosystems)に対応するデフォルト設定条件下で、CTを計算した。グラフから引き出された方程式を使用して、標準と同じ反応プレートにおいて試験された総cDNA 1μg当たりに存在する特異的サイトカインcDNAの正確な数を計算した。
相対定量化
IFN-γ、IL2、IL10、TNF-α、リボソームcDNA及びグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)に関して、5分の1(サイトカイン及びGAPDHの場合)及び100分の1(リボソームの場合)に希釈されたcDNA上で、RT-PCRを実施した。96ウェル型光反応プレートにおいて、3部から成るウェル内でRT-PCRを実施した(ウェルはそれぞれ1×SYBR Green PCR Master 混合物(Applied Biosystems)、0.3pmol/μlの順方向プライマー及び逆方向プライマー(又は、リボソームRT-PCRの場合には1×調合リボソーム・プライマー(Applied Biosystems))、及び2μl鋳型cDNAを、最終容積25μlで含有した)。サイクル条件は、cDNAの絶対定量化に関して上述したのと同じであった。GAPDHプライマーを、Primer Express (Applied Biosystems)ソフトウェアを使用して構築した(表1)。リボソームcDNA用調合プライマーをApplied Biosystemsから入手した。蛍光発光値を使用して、リボソームRNA及びGAPDH RNAに対して相対的なサイトカインRNA発現レベルを計算した。
IFN-γ環状プラスミドDNAの線形化
線形化DNAとは異なる効率で環状DNAが増幅されるか否かを見極めるために、連続希釈された環状IFN-γプラスミド標準と並行して、連続希釈及び増幅を行う前に、IFN-γプラスミド標準を切断した。「REACT 2」緩衝液(Life Technoligies)の存在において、1時間にわたって37℃で、10単位のEcoRV(Life Technoligies)を用いて、0.1μgのプラスミドDNAを切断した。IFN-γ挿入体を備えたpBAD TOPOベクターは、位置3513に1つのEcoRV制限部位を有している。
血球計算ビードアレイ分析
培地内に放出されたサイトカイン・タンパク質のレベルを、TH1/TH2血球計算ビードアレイ(CBA)キット(英国オックスフォード在、BD Biosciences)を使用して、製造元の指示書に従って測定した。凍結されたPBL培養後の上澄みを急速解凍し、3分間にわたって2000×gでスピンダウンし、これにより細胞の残骸を除去した。上澄みを薄めずに使用するか、又はアッセイ希釈剤(CBAキットの成分)中で10分の1に希釈した。抗サイトカイン・ビードの混合物を、この希釈されていない上澄みサンプル及び希釈された上澄みサンプルに添加し、付属のPE検出試薬と共にインキュベートした。ビード及び検出試薬を、さらに、4種の全てのサイトカインの連続希釈標準と混合させた。サンプル及び標準とを、3時間にわたって室温で暗所内にインキュベートした。MASプレート・ローダー(BD Biosciences)を備えたFACSCalibur上で、サンプルを分析し、CBA分析ソフトウェア(BD Biosciences)を使用して、データを分析した。
結果
実施例1:マウスに由来するPBL
好ましい方法を例示するために、原理の裏付けとして、第1実施例の試験を実施した。脾臓細胞をマウス(C57/b16)から分離し、次いで、ConA単独、ConA及びインターフェロン-γ、又はConA及びIL4を用いて一晩刺激した。外生的なサイトカインが添加されると、オートクライン形式で、刺激された細胞によって、これらの分子のde novo合成が生じる(Di Marzio他、1994; Koch他、1992)。その結果、これらのサンプルは、TH1/TH2 T細胞の一例として処理することができ、ひいては、この技術の考えられ得る用途の有用な証明となる。
総DNAのPicoGreen定量化
細胞培養からのRNA抽出物を逆転写し、上述のPicoGreen定量化法を用いて、cDNAを定量(すなわち定量化)した。表2は、cDNAサンプルに関して得られた蛍光発光データを示す。図1から導出された方程式：y = 0.0249x - 0.5022を用いて、最終濃度を計算した。
Figure 2005517455
入手可能なサンプルが限定されているので、対照サンプルに関して、種々異なる希釈倍率を用いた。M=培地；Abs =吸光度；Diln cor. = 補正された希釈率；Eqn calc. = 方程式計算；Ave. = (方程式計算の)平均；(i)=希釈率200分の1；(ii)希釈率400分の1。
この方法は高度に再現可能であり、2つの別々の機会に定量を実施し、平均をとり、そしてエラーバーを描いた(図3)。総DNA定量化を実施して正確な計算を保証する度に、標準曲線を形成した。しかし、形成された方程式は、それぞれの機会において比較的不変のままであった。この方法の感度は、最小DNAがその方程式において使用されるのを可能にし、ひいては貴重なサンプルを保存するのを可能にする。
インターフェロン-γ及びインターロイキン-4に対して特異的なcDNAの絶対定量
インターフェロン-γ及びIL4のプラスミド内に存在する総DNAを定量化し、これらのコピー数を計算し、これらの希釈液においてリアルタイムPCRを実施した。サンプルから得られたcDNAを同じプレート上で分析した。図2は、かつて、IL4プラスミドに関して得られた標準曲線及び方程式を示す。表3は、生のCT値と、これに続いて行われた、PicoGreen 法から得られた総cDNA濃度を用いたコピー数計算を示す。ゲノムDNAを検出するこの手順のリスクは、DNアーゼ処理ステップを用いることによって排除される。
Figure 2005517455
図4及び図5はこの方法の再現可能性を示す。2つの別々の機会に定量を実施し、平均をとり、そしてIL4及びIFN-γの両方の定量実行に関してエラーバーを描いた。総絶対cDNA定量化を実施して正確な計算を保証する度に、標準曲線を形成するべきである。しかし、形成された方程式は、それぞれの機会において比較的不変のままであった。PCRに基づく方法において、その感度は、最小cDNAが鋳型として使用されるのを可能にし、従って、多数のサイトカインのスクリーニングが実現可能である。実際、この方法を精緻化して、同じサンプル中の複合的ないくつかの標的に適用し、ひいては同じ試験管内でTH1/TH2比を試験することも可能である。
実施例2:ヒトに由来するPBL
第2の試験において、健康な男性有志からPBLを分離し、次いでConA, PMA + イオノマイシン又はLPSで一晩刺激することにより、種々異なる条件下でサイトカイン発現量を高めた。
総DNAのPicoGreen定量化
細胞培養からのRNA抽出物を逆転写し、上述のPicoGreen定量化法を用いて、cDNAを定量(すなわち定量化)した。標準曲線を描き、この曲線からcDNAの絶対レベルを計算することができた(図6)。図6において、λDNA標準(Molecular Probes)を光学反応プレートのウェル内で希釈し、これにより、濃度範囲を250ng/ml〜15.625ng/mlにした。プロットされたそれぞれの点が、測定された標準濃度毎の3部から成る蛍光発光値の平均である。この方法は高度に再現可能であり、全てのサンプルに対して、別々の2回の機会において実施した。cDNA量の平均値を図7に示す(この図において、ConA、PMA + イオノマイシン、LPS、又は培地単独で刺激されたヒトPBLに由来する2つの異なる希釈率のcDNAを、2回の別々の機会において3つの部分で測定し、希釈率に合わせた調節後に、その量を計算した。それぞれの平均を標準偏差でプロットし、エラーバーを描いた)。総DNA定量化を実施して正確な計算を保証する度に、標準曲線を形成した。しかし、形成された方程式は通常、それぞれの機会において比較的不変のままであった。
リボソーム及びGAPDHのcDNAの比較
ハウスキーピング遺伝子レベルを変える組織培養条件の効果を試験するために、同じ反応プレート上のリボソーム及びGAPDHのcDNAに対して特異的なプライマーを使用して、3部から成るcDNAサンプル上でRT-PCRを実施した。CT値を使用して、結果を未刺激の(媒質)対照CTで割算することにより、ConA、PMA + イオノマイシン又はLPSで刺激したときのリボソームRNA及びGAODH RNAの相対発現量を計算した(図8参照。この図において、ConA、PMA + イオノマイシン、LPS又は培地単独で刺激されたヒトPBLに由来するcDNAを、リボソームcRNA及びGAODH cRNAに対するプライマーで増幅した。平均CT値を計算し、そして培地単独のサンプルに関して得られた平均値で割算した)。明らかに、GAPDH発現は培養条件によって有意な影響を受けた。リボソームレベルにおいて観察された変化は小さいが、検出可能であった。
CBA分析と、絶対cDNA定量化、及びリボソームRNAレベルに対する相対定量化との比較
クローニングされたIFN-γ、IL2、IL10及びTNF-αプラスミド内に存在する総DNAを定量化し、リアルタイムPCRを3部から成るサンプルにおいて実施し、これらのコピー数を計算した。上述のPicoGreen法によって定量化されたサンプルに由来するcDNAを、同じプレート上で3部から成るサンプルにおいて分析し、そしてこれらのサイトカインのコピー数を続いて計算した(図9B参照。図9において、ヒトPBLをConA、PMA + イオノマイシン、LPS又は培地単独によって、24時間にわたって刺激した。CBA分析のために、培養の上澄みを使用した。PBLに由来するcDNAを、IFN-γ、TNF-α、IL10及びIL2に対して特異的なオリゴヌクレオチドを使用して増幅し、そして、クローニングされたサイトカインcDNAフラグメントを標準として使用して、絶対定量化方法で定量化するか、又は、リボソームcDNAに対して相対定量化した)。この値を、CBA分析によって測定された培養上澄みから得られたサイトカイン・タンパク質レベル(図9A)、及び、リボソームcDNAに対して相対的なサイトカインcDNAのレベル(図9C)と比較した。CBA及び絶対定量化グラフに対応するY軸上の尺度を低くした。なぜならば、PMA + イオノマイシン刺激サンプル中のIFN-γ及びIL2サイトカインの値は際立って高く、従って、その他のサンプル中のサイトカインの発現量の差異を識別することができなかったからである。CBA及び絶対cDNAの計算された発現レベルを表4に示す。興味深いことに、相対定量化は、単独のサイトカインが試験される場合には、かなり確固たるものであるが、しかし、同じサンプル中で異なる分子を比較する場合には不良である。絶対定量化しか、互いに比較されたサイトカイン中の変化を、タンパク質レベルによる現れとして示すことはできなかった。
Figure 2005517455
絶対定量化プロトコルの感度
PCRに基づく方法において、その感度は、最小cDNAが鋳型として使用されるのを可能にし、従って、多数のサイトカインのスクリーニングが同時に実現可能である。実際、この方法を精緻化して、同じサンプル中の複合的ないくつかの標的に適用し、ひいては同じ試験管内でTH1/TH2比を試験することが可能である。図10は、IFN-γcDNAを細胞1000個当量の少ない細胞から検出することができることを示している(図10において、コピー数を計算するために、最小で細胞1000個当量のレベルまで連続希釈されたcDNAが、連続希釈されたIFN-γプラスミド標準と同時に増幅された。全ての反応は3部から成るサンプルにおいて行われた。R2=0.9966)。さらに、図11は、この方法が、標的の最小8つの分子(すなわち、プラスミドの希釈率は、5×109分の1)に対して感受性を有することを実証している。一次方程式は、環状プラスミドと線形化プラスミドとの間で、比較的不変のままである。こうして、図11はまた、線形化プラスミドDNA(図11B)の代わりに、環状プラスミドDNA(図11A)を使用することによって、PCR反応の効率が変わることはないことを示している。従って、プラスミドは、PCRの前に制限酵素で切断することなしに、より安定的な環状形で保存することができる。
論議
リアルタイムPCRは、極めて効果的な技術である。しかし、その結果は解釈次第である。それというのもデータ提示の慣例がないからである。リアルタイムPCRがこのように異例である理由は、多くの用途が非標準的な校正遺伝子に依存しており、これらの校正遺伝子自体の値が試験操作中にしばしば変化することにある。
われわれは本明細書において、極めて正確な二本鎖DNA定量とプラスミド基準曲線との組み合わせを用いた、cDNA種の好ましい絶対定量方法を明示する。好ましい実施態様において、PicoGreen標準及び基準標準を使用することにより、蛍光発光を用いてサンプル中に存在するcDNAの量を測定する。リアルタイムPCR生成物をプラスミド内にクローニングし、次いでこれらを未知のサンプルを校正するのに使用する。このクローニングは好ましくは、リアルタイムPCRに必要な同じプライマーを使用して達成され、ひいては第2設計段を伴うことはない。このようにして、結果をcDNAの1μg当たりのコピー数として表し、従って、この結果は試験間及びサンプル間の双方で比較することができる。我々は、モデル・マウス系から実施例1の結果を提供する。実施例1においては、インターフェロン-γ及びインターロイキン-4の絶対レベルが測定される。実施例2においては、我々は、ヒト系からの結果を提供する。実施例2において、インターフェロン-γ、TNF-α、インターロイキン-2及びインターロイキン-10の絶対レベルが測定される。しかし、我々は、この技術が、リアルタイムPCR用途の大部分に幅広く適用可能であると信じる。
この好ましい実施態様において、コピー数に関してmRNA種を正確に定量することができることは、臨床分析における大きな前進となる。このことは、in vivoで発生する事象の正確なスナップショットが直接的に評価されることを可能にするはずであり、その結果、この能力は多様の用途を有する。本明細書に示したデータは、リアルタイムPCRを直接的に使用して、mRNA分子の絶対数を測定することが確かに可能であることを示している。cDNA 1μg当たりのコピー数として結果を表すことにより、我々は、従来の技術の主要な問題の1つを克服した。それというのも、今や、mRNA合成効率とは無関係に、サンプルを直接的に比較することが可能だからである。癌患者の臨床試験における我々の経験により、疾患が進行するにつれて、T細胞数が著しく低下することが判っている。従って、mRNAレベルとは無関係に結果を表すことができることは大きな前進である。我々は、純粋に合成系からデータを示し、これにより原理の証拠を明示するが、しかし、この技術は多様な状況に幅広く適用可能である。
この方法の重要な特徴は、高感度で再現可能なds-DNA定量方法を利用することであった。残念ながら、多くの研究所は、ds-鋳型が正確に測定されることを保証するのに十分に厳密な方法を使用しておらず、従って、それらの結果が比較研究に研究される見込みはない。PicoGreenの使用はそれ自体は独自のものではないが(Singer他、1997)、コピー数計算を校正するためにPicoGreenの使用をリアルタイムPCRと結び付けたのはこれが初めてである。
文献に記載されたリアルタイムPCRデータの殆どは、校正遺伝子を使用することにより、相対定量化を利用することから導き出される。校正に使用される1つの一般的な遺伝子は、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)(Overbergh他、1999)であり、GAPDHは解糖経路内に見出される。残念ながら、これに対して試験遺伝子のレベルを標準化することが一般的になってきてはいるものの、GAPDHの発現はインターロイキン-2によって調節されることが判った(Sabath他、1990)。その結果、いかなる炎症性状態においても、GAPDHレベルは変化し、ひいては相対定量を無効にしてしまう。このことは、図9において明らかに実証される。その他の校正遺伝子も使用されており、最近のもののうちの1つはリボソームRNAである(Pleau他、2001)。これはその他のものより優れてはいるが、依然としてその有効性には反論の余地がある(Schmittgen 及びZakrajsek, 2000)。最近のデータが示唆するところによれば、結果が有効にあるためには、基準遺伝子が未知のものと同様の濃度でなければならないので、相対定量は一層信頼性が低くなるおそれがある(Ke他、2000)。結果は全く未知であるので、当然のことながら、臨床用途には相対定量は明らかに受け入れられない。
クローニングされた標的の使用は、リアルタイム用途において知られており、標準曲線を使用することにより、絶対コピー数が評価されることを可能にする(Li及びWang,2000)。しかし我々の好ましい方法は、クローニングのためのプライマーと同じプライマーをリアルタイムPCRのために使用することにより、各mRNAに対して特異的なプラスミドを比較的シンプルに形成するように構築されている。DNA定量後、プラスミドは、cDNAコピー数の絶対定量のために利用可能である。さらに、我々は、結果が線形プラスミド及び環状プラスミドの双方に関して同じであり、ひいては基準プラスミドの保存を容易にすることを示す。この技術がシンプルであることにより、基準遺伝子の使用、及び基準遺伝子に付随する煩雑さが不要になる。
我々の具体的な関心は、ワクチン接種前後の癌患者サンプルからのサイトカイン転写物を測定するために、この技術を用いることにある。サイトカインの測定は主要な研究分野であり、数人の執筆者がリアルタイムPCRを用いて、転写物を測定した(Stordeur他、2002; Overbergh他、1999; Kruse他、1997)。幾つかの異なる方法が使用されるので、結果として、このテーマは標準化を必要とする。我々は、cDNA 1μg当たりのコピー数を用いることにより、研究所間で結果を比較することが可能になると提案する。さらに、この特定用途は、この技術の別の利点を実証する。それというのも、mRNA定量及びタンパク質定量の双方のために同じ細胞を使用することが可能であるからである。
日常的には、われわれはマイトジェン又はカルシウム・イオノフォアで、一晩細胞を刺激し、mRNA抽出のために細胞を採取し、そして上澄みを保持する。この培地は次いで種々の技術、例えばELISA又は血球計算ビード・アレイ(CBA; BD Biosciences)によって、タンパク質含有量に関して試験することができる。われわれはこのことが大きな前進を意味すると考える。それというのも、mRNAレベルがタンパク質と絶対的に相関することはない(Hein他、2001)ことは良く知られてはいるものの、メッセージ・レベルにおいて検出された変化が細胞のタンパク質出力と相関することを証明する能力が、リアルタイム・データに機能有効性を与えるからである。総レベルは僅かに変化する(表4)ものの、両方の系における明瞭な傾向が明らかである(図9)。リアルタイムPCR及びCBAの双方は、プレートに基づくアッセイであり、ひいては処理量が高い。このことにより、リアルタイムPCR及びCBAの双方は、臨床試験モニタリングに用いるのに理想的になる。
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本発明の特定の実施態様を、添付の図面を参照しながら以下にさらに詳しく説明する。
総DNA定量に関して得られた標準曲線の例を示す図である。一次方程式：y = 0.0249x - 0.5022、R2 = 0.9983。 特異的DNA定量に関して得られた標準曲線の例を示す図である。一次方程式：y = -0.0723x - 3.8854、R2 = 0.9974。 48時間にわたって刺激されたマウス脾臓細胞の総cDNA定量を示す図である。 48時間にわたって培養されたマウス脾臓細胞のIFN-γmRNA定量化(2回の実施の平均)を示す図である。 48時間にわたって培養されたマウス脾臓細胞のIL-4 mRNA定量化(2回の実施の平均)を示す図である。 総DNA定量化に関して得られた標準曲線の更なる例を示す図である。一次方程式：y = 0.0327x - 1.8695、R2 = 0.9988。 24時間にわたって刺激されたヒトPBLの総cDNA定量化(2回の実施の平均)を示す図である。 リボソーム及びGAPDHのリアルタイムPCRにおける、培地対照cDNAと比較した平均CT値の比を示す図である。図中、
Figure 2005517455
である。
血球計算ビード・アレイ(A)、絶対cDNA定量化(B)及びリボソームcDNAに対する相対定量化(C)を用いて測定されたサイトカイン・レベルを示す。図中、
Figure 2005517455
である。
連続希釈されたcDNAのIFN-γコピー数定量化を示す図である。 104分の1から5×109分の1の範囲で希釈された連続希釈IFN-γプラスミド標準(環状(A)及び線形化(B))のRT-PCRを示す図である。Aの場合、一次方程式：y = -0.0612x + 3.7789、R2 = 0.9956。Bの場合、一次方程式： y = -0.062x + 3.6938、R2 = 0.9919。

Claims (16)

  1. サンプル中の標的核酸の定量化方法であって、以下のステップ：
    (1)蛍光発光を使用して、上記サンプル中の核酸の総量を正確に定量化し；
    (2)リアルタイムPCRプライマーを使用して上記標的核酸を増幅して、一定量の単位複製配列を作製し；
    (3)上記単位複製配列に基づいて基準プラスミドを構築し；
    (4)様々な所定量の上記プラスミドを用いたリアルタイムPCR反応の蛍光発光の基準曲線を作成し；
    (5)上記サンプルのアリコートを用いたリアルタイムPCRを実施し、上記標的核酸を増幅して蛍光発光の結果を得；そして
    (6)上記ステップ(5)の蛍光発光の結果を上記ステップ(4)の基準曲線と相関させて、上記サンプル中の標的核酸を定量化する、
    を含む前記定量化方法。
  2. 定量化され、そして前記ステップ(4)の蛍光発光の基準曲線を作成するのに使用される前記プラスミドを準備するために、前記ステップ(2)の単位複製配列を前記ステップ(3)においてベクター中にクローニングする、請求項1に記載の方法。
  3. 前記ステップ(5)のリアルタイムPCR反応に、前記ステップ(2)で使用された前記リアルタイム・プライマーを使用する、請求項1又は2に記載の方法。
  4. 前記ステップ(1)の核酸定量化方法が、少なくとも1 ng/ml DNAの感度限界を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
  5. 前記核酸定量化方法が、PicoGreen(RTM)dsDNA定量試薬を使用する、請求項4に記載の方法。
  6. 蛍光発光検出用サーモサイクラー、例えばPerkin Elmer/Applied Biosystems Prism 7700 Sequence Detectorシステムを使用して、前記ステップ(2)とステップ(5)の両方を実施する、請求項5に記載の方法。
  7. 前記蛍光発光の基準曲線を、一定量の前記単位複製配列又はコピー数として表されたクローン化単位複製配列に対する前記リアルタイムPCR反応の閾値サイクル(CT)の自然対数を使用して作成する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
  8. 前記サンプル中の標的核酸を、当該サンプル中に存在する総核酸量当たりのコピー数（例えば、cDNA 1μg当たりのコピー数)として定量化する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
  9. 前記標的核酸がRNAを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
  10. 前記ステップ(2)及び(5)において、前記RNAから構築されたcDNAを前記標的核酸として使用する、請求項9に記載の方法。
  11. 前記サンプル中のタンパク質レベルを定量化する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
  12. 前記ステップ(2)で使用される前記標的核酸が、前記サンプル以外の起源に由来する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
  13. 前記ステップ(4)及び(5)が同じ反応プレート内で実施される、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
  14. 前記標的核酸量が、サイトカイン量に正比例する、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
  15. 前記リアルタイムPCR反応に、(例えば、Applied Biosystemsから入手可能な)IFN-γ又はIL4に特異的な所定のアッセイ試薬(PDAR)を使用する、請求項14に記載の方法。
  16. 前記リアルタイムPCR反応に、表1に規定するIFN-γ、IL2、IL10及び/又はTNF-αのためのプライマー及びプローブを使用する、請求項14に記載の方法。
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