CN102363814B - 一种绝对荧光定量pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种绝对荧光定量PCR检测方法，是将双链的线性质粒稀释成不同浓度作为标准品，将单链的cDNA待测样品先扩增一次得到双链的cDNA待测样品，以双链的cDNA待测样品和双链的线性质粒标准品同时进行荧光定量PCR反应，得出每个拷贝数所对应的Ct值，以标准品拷贝数的对数值为横坐标，测得的每个拷贝数所对应的Ct值为纵坐标得到标准曲线，将待测样品的Ct值带入标准曲线中，得到待测样品的起始拷贝数。本发明的绝对荧光定量PCR检测方法能够更真实的测定目的片段的绝对拷贝数，使测得的结果更加准确。
Description
技术领域
本发明涉及定量PCR技术，特别是涉及一种绝对荧光定量PCR检测方法。
背景技术
实时荧光定量PCR技术（Real-time Quantification PCR）是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。荧光定量PCR技术包括相对荧光定量PCR和绝对荧光定量PCR。绝对荧光定量PCR（absolute quantification PCR，AQ-PCR）技术是利用已知起始拷贝数的标准样品作出标准曲线，通过测定未知样品的Ct值，从标准曲线上计算出该样品的起始浓度，可以实现对测定样本基因mRNA分子拷贝数的绝对定量。而相对荧光定量PCR技术只是测定样本中的靶序列相对于参照样本量的变化，而不能测出初始模板起始拷贝数的绝对量。绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数量，相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，因此不需要得出它们在每个样本中的绝对拷贝数。
相比而言，绝对定量的优点在于：(1)可以得到基因mRNA表达的绝对数，这对于一些生物检验检测十分重要；(2)不同实验结果可以相互进行对比。其缺点是绝对标准品的制备比较困难，技术水平要求较高。目前，我国研究基因表达大多采用相对荧光定量PCR技术，而在国外应用绝对荧光定量PCR测定基因表达技术方法已经比较成熟。
制备标准曲线的是绝对荧光定量PCR测定基因的关键步骤。常用的质粒制备标准曲线方法是先将测定基因的目的片段克隆到质粒中，测定质粒浓度，计算其拷贝数，稀释成不同浓度的标准品，依据这一系列标准品的Ct值得出标准曲线。测定样品时，标准品与未知样品同时进行PCR循环，根据未知样品的Ct值，结合标准曲线来求得未知样品cDNA的起始拷贝数。这种用质粒来制备标准曲线的方法可能存在一定的弊端。首先，质粒是环状的，环状的质粒有可能影响到荧光定量PCR体系的优化；其次，质粒为双链DNA，未知样品cDNA为单链DNA，用来构建标准曲线的目的基因片段是连接在环状质粒上的，当进行绝对荧光定量PCR反应时，环状和线性空间结构的差异将会影响到PCR的扩增效率。一些分子实验已经表明环状质粒和线性质粒有很大的区别。质粒的双链DNA、未知样品cDNA的单链DNA同时进行PCR反应，在质粒第一个循环扩增时，上下游引物均可以结合质粒模板DNA，而测定样品单链cDNA第一个循环扩增时，只有上游引物中可以结合测定样品cDNA，扩增出基因的正义链片段，第二个循环扩增时，cDNA才开始双链的扩增，而此时质粒已经扩增为四条核苷酸链，所以，质粒和样品cDNA在进行绝对荧光定量PCR所扩增的模板数是不同步的，会导致通过标准曲线测得的未知样品起始拷贝数数值比实际偏小。这个问题对于相对定量是没有影响的，因为相对荧光定量PCR的目的是比较几种样品的相对性，基因表达量的相对比值是不变的。而绝对荧光定量PCR的方法是测出未知样品的起始拷贝数，结果偏小了就不能反映出实验的真实性，准确性。
绝对荧光定量PCR制备标准曲线另一种方法是在质粒载体上用T7或SP6RNA聚合酶的启动子来亚克隆复制子，转录成cRNA，用核酸微量测定仪测定cRNA的浓度，并按照公式：N(molecules/μl)=C(cRNAμg/μl)×182.5×1013/K(fragment size/bp)测出cRNA的拷贝数。以10倍浓度梯度稀释cRNA样品，开始实时定量RT-PCR测出每个浓度标准品的Ct值，以Ct值为纵坐标，cRNA模板数的对数为横坐标绘制标准曲线。未知样品进行RT-PCR后，根据其Ct值重合在标准曲线上的位置可计算出样品的准确浓度。这种方法保证了建立标准曲线所使用的cRNA模板与未知样品cDNA都是单链，可以同步进行PCR反应，Gilbert等人采用此方法测定了肉鸡小肠中营养转运因子基因的表达变化。但用这种方法制备标准曲线比较繁琐，进行体外转录技术水平要求很高。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的缺陷，提供一种绝对荧光定量PCR检测方法，以消除用质粒制备绝对定量PCR标准曲线存在的标准品双链环状质粒分子与待测样品单链线性cDNA分子结构之间的差异，确保绝对荧光定量PCR测定方法的准确性。
为解决上述问题，本发明提供的绝对荧光定量PCR检测方法如下：
(1)提取样品总RNA；
(2)将(1)提取的总RNA进行反转录和基因片段扩增，得到单链的cDNA待测样品；
(3)将(2)的cDNA待测样品进行纯化，利用纯化的cDNA制备带有EcoRⅠ酶切位点的重组质粒；
(4)EcoRⅠ酶切(3)获得的质粒，得到双链的线性质粒；
(5)计算(4)质粒的拷贝数，以此作为标准品；
(6)将标准品稀释成不同梯度浓度，作为模板进行荧光定量PCR反应，反应完成后，得出每个拷贝数所对应的Ct值，以标准品拷贝数的对数值为横坐标，测得的每个拷贝数所对应的Ct值为纵坐标，得到标准曲线；
(7)按照(6)中的PCR反应体系，将cDNA待测样品在荧光定量PCR仪中先扩增一次，得到双链的cDNA待测样品；
(8)将双链的cDNA待测样品按照(6)的荧光定量PCR反应方法进行扩增，反应完成后，得出其所对应的Ct值；
(9)将待测样品的Ct值带入步骤(6)的标准曲线中，得到待测样品的起始拷贝数。
其中，上述检测方法中，双链的cDNA待测样品与双链的线性质粒标准品是同时进行荧光定量PCR反应的。
本发明的的绝对荧光定量PCR检测方法主要进行了两个改进：1)用酶切的方法使环状质粒线性化，用线性质粒制备标准曲线；2)将未知样品cDNA先扩增出一条正义链，再与作为标准曲线的质粒标准品同时开始荧光定量PCR循环。经过上述改进，本发明的绝对荧光定量PCR检测方法能够更真实的测定目的片段的绝对拷贝数，使测得的结果更加准确。
本发明的的绝对荧光定量PCR检测方法标准曲线制备简单，具有较高的准确性和灵敏性，适用于绝对荧光定量PCR定量分析，易于推广应用。
具体实施方式
实施例1。
以在鸡胃肠道发育和分化中起重要作用的GATA5（GATA binding protein 5）基因表达为例，以绝对荧光定量PCR检测方法测定目的片段的起始绝对拷贝数。
1)、以常规方法提取出样品的总RNA。
2)、Primer3（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）在线设计合成GATA5基因PCR克隆引物，上游引物5ˊ-3ˊ:AACCCCAGAAGAGGCTGTCT，下游引物：5ˊ-3ˊ: TGGGAGAAAAGGGGTAGTCC，扩增产物长度432bp。反转录在25μL体系中进行，根据反转录试剂盒进行操作，产物置-20℃保存。进行cDNA PCR反应，反应体系为cDNA模板4μL，10×PCR缓冲液8μL，dNTPs 6.4μL（2.5mmol/L），0.8μL克隆上游引物（5μmol/L）和0.8μL克隆下游引物（5μmol/L），rTaq酶1.6μL，ddH2O 58.4μL，总体积80μL。PCR反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性1分钟，65℃退火30秒，72℃延伸1分钟，完成35个循环后，72℃延伸8分钟，反应结束后，将扩增产物在TAE电泳缓冲液中以1%的琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶分析仪观察，照相。
3)、将纯化的PCR产物连接PMD-18-T载体，置于4℃冰箱中过夜，加入200μL感受态大肠杆菌DH5α，再加入不含氨苄的LB培养基，复苏1小时，在含氨苄的固体LB培养基中过夜培养后，挑取单菌落白斑，加入50mL含氨苄的 LB液体培养基，37℃、200r/min振荡培养12个小时。按照质粒提取试剂盒(Mini KitⅠ)的操作说明提取质粒。
4)、PMD18-T Vector含有EcoRⅠ酶切位点，用EcoRⅠ酶切质粒，使环状质粒变为线性质粒。反应体系为20μL:16μL的质粒，2μL的10×Buffer EcoRⅠ，2μL的EcoRⅠ。37℃酶切消化4.5小时后，提高温度到65℃反应20min，使得EcoRⅠ酶失活。
5)、用微量核酸测定仪测定酶切前和酶切后质粒的浓度和纯度，即环状质粒和线性质粒的浓度和纯度。根据公式：质粒拷贝数（copies/μL）=6.02×1023(copies/moL)×质粒浓度（g/μL）/质粒分子量（g/moL），得出质粒拷贝数。
6)、在所克隆出的目的基因片段432bp中，用Primer Premier 5设计并合成荧光定量PCR引物。上游引物5ˊ-3ˊ：CCCCTTCTTCCATTACGA，下游引物：5ˊ-3ˊ:GTGCTGGGCTCTGACTTT，扩增产物长度58bp。将环状质粒和线性质粒用ddH2O进行10倍系列稀释，稀释成1×1010-1×103copies/μL的8个梯度，分别选出拷贝数是108、106、104三个梯度作为模板进行荧光定量PCR反应，每个模板重复做3次，一共做18个样，采用25μL PCR反应体系：模板1μL，荧光定量PCR上、下游引物（5μmol/L）各0.3μL，qRT-PCR SuperMix 12.5μL，ddH2O 10.9μL。PCR反应程序：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，57℃退火15秒，72℃延伸10秒，经过45个循环，接下来生成溶解曲线，55℃30秒，每30秒升温0.5℃，共进行81个循环，到达95℃。反应完成后，得出每个拷贝数所对应的Ct值。
7)、按照6)中的PCR反应体系，将线性质粒的8个梯度作为模板进行荧光定量PCR反应，根据荧光值的变化规律，系统将自动生成标准曲线和溶解曲线。
8)、按照6)中的PCR反应体系，随机选取3个单链线性cDNA待测样品，将cDNA待测样品在荧光定量PCR仪中先扩增一次，得到双链的cDNA待测样品；然后加好线性质粒标准曲线的标准品，放到荧光定量PCR仪中，与之前的3个cDNA样品同时进行扩增。作为对照，把未经扩增的3个cDNA与标准质粒一起放到荧光定量PCR仪中，每个待测样品重复做3次，进行PCR扩增。PCR反应结束后，系统将自动生成结果。
结果分析。
1、环状质粒与线性质粒中目的片段扩增曲线的比较。
由表1可见，环状质粒和线性质粒分别为104、106拷贝数时，两者之间所得的Ct值差异显著（P<0.05），环状和线性质粒为108拷贝数时，两者之间所得的Ct值差异极显著（P<0.01），环状质粒所得的Ct值显著大于线性质粒所得的Ct值。虽然是在同样的拷贝数，但是线性质粒在进行荧光定量PCR反应时到达阈值的时间比环状质粒短，其中质粒起始拷贝数越大，所表现出的差异性越明显，实验结果表明，环状和线性质粒为108拷贝数时比在104拷贝数时Ct值差异更为显著，说明环状和线性质粒在进行荧光定量PCR时有很大的区别。
2、cDNA样品先扩增一次与未先扩增的起始拷贝数的比较。
随机选取3个cDNA样品，先扩增一次后，与质粒一起进行PCR扩增，和未先扩增一次的 cDNA样品与质粒同时进行PCR扩增，起始拷贝数试验比较结果见表2。
结果表明，先扩增一次cDNA样品，测定得出的起始拷贝数大于未先扩增一次的cDNA样品。同样的3个样品，是否先扩增产生的测定值之间的差异经t-检验分析得出其P值分别为0.01、0.03、0.03，3个样品的差异均是显著的（P<0.05）。
实施例2。
以PepT1基因表达为例，PepT1是质子依赖性寡肽转运载体家族的成员，是低亲和力/高容量的肽载体，主要在消化道中表达。
1)、以常规方法提取出样品的总RNA。
2)、Primer3（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）在线设计合成PepT1基因PCR克隆引物，上游引物5ˊ-3ˊ:ACTGTCAATCCAATCCTG，下游引物：5ˊ-3ˊ:GACAGTCACGTTCTGAAGA，扩增产物长度282bp。以cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为cDNA模板4μL，10×PCR缓冲液8μL，dNTPs 6.4μL（2.5mmol/L），8μL克隆上游引物（5μmol/L）和8μL克隆下游引物（5μmol/L），rTaq酶1.6μL，ddH2O44μL，总体积80μL。反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性1分钟，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟，完成35个循环后，72℃延伸8分钟，反应结束后，将扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳观察。
3)、将纯化的PCR产物连接PMD-18-T载体，置于4℃冰箱中过夜，加入200μL感受态大肠杆菌DH5α，再加入不含氨苄的LB培养基，复苏1小时，在含氨苄的固体LB培养基中过夜培养后，挑取单菌落白斑，加入50mL含氨苄的 LB液体培养基，37℃、200r/min振荡培养12个小时。按照质粒提取试剂盒(Mini KitⅠ)的操作说明提取质粒。
4)、用EcoRⅠ酶切质粒，使环状质粒变为线性质粒。反应体系为20μL:16μL的质粒，2μL的10×Buffer EcoRⅠ，2μL的EcoRⅠ。37℃酶切消化4.5小时后，提高温度到65℃反应20min，使得EcoRⅠ酶失活。
5)、用微量核酸测定仪测定酶切后质粒的浓度和纯度，即线性质粒的浓度和纯度。根据公式：质粒拷贝数（copies/μL）=6.02×1023(copies/moL)×质粒浓度（g/μL）/质粒分子量（g/moL），得出质粒拷贝数。
6)、在所克隆出的目的基因片段282bp中，设计并合成荧光定量PCR引物。上游引物CCCCTGAGGAGGATCACTGTT，下游引物：CAAAAGAGCAGCAGCAACGA，扩增产物长度66bp，将线性质粒用ddH2O进行10倍系列稀释，稀释成1×1010-1×105copies/μL的6个梯度，采用25μL PCR反应体系：模板1μL，荧光定量PCR上、下游引物（5μmol/L）各0.5μL，SYBR Premix Ex TaqⅡ12.5μL，ddH2O 10.5μL。PCR反应程序为：95℃3分钟；95℃10秒→60℃30秒→72℃30秒，40个循环；72℃5分钟；生成溶解曲线步骤：55℃30秒，每30秒升温0.5℃，81个循环。根据荧光值的变化规律，系统将自动生成标准曲线和溶解曲线。
7)、按照6)中的PCR反应体系，将cDNA待测样品在荧光定量PCR仪中先扩增一次，得到双链的cDNA待测样品。
8)、按照6)的荧光定量PCR反应方法，将7)制备的双链cDNA待测样品与线性质粒标准曲线标准品同时进行绝对荧光定量PCR扩增，PCR反应结束后，系统将自动生成结果，得出cDNA样品的起始拷贝数。
通过本实施例对PepT1基因表达的试验，进一步验证了本发明的绝对荧光定量PCR检测方法具有较高的准确性和灵敏性，适用于绝对荧光定量PCR的定量分析。
Claims (2)
1.一种绝对荧光定量PCR检测方法，其方法如下：
(1)提取样品总RNA；
(2)将(1)提取的总RNA进行反转录和基因片段扩增，得到单链的cDNA待测样品；
(3)将(2)的cDNA待测样品进行纯化，利用纯化的cDNA制备带有EcoRⅠ酶切位点的重组质粒；
(4)EcoRⅠ酶切(3)获得的质粒，得到双链的线性质粒；
(5)计算(4) 得到的双链线性质粒的拷贝数，以此作为标准品；
(6)将标准品稀释成不同梯度浓度，作为模板进行荧光定量PCR反应，反应完成后，得出每个拷贝数所对应的Ct值，以标准品拷贝数的对数值为横坐标，测得的每个拷贝数所对应的Ct值为纵坐标，得到标准曲线；
(7)按照(6)中的PCR反应体系，将cDNA待测样品在荧光定量PCR仪中先扩增一次，得到双链的cDNA待测样品；
(8)将双链的cDNA待测样品按照(6)的荧光定量PCR反应方法进行扩增，反应完成后，得出其所对应的Ct值；
(9)将双链cDNA待测样品的Ct值带入步骤(6)的标准曲线中，得到双链cDNA待测样品的起始拷贝数。
2.根据权利要求1所述的绝对荧光定量PCR检测方法，其特征是将双链的cDNA待测样品与双链的线性质粒标准品同时进行荧光定量PCR反应。
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