JP2005515402A - 生体膜のアレイおよびその製造方法と用途 - Google Patents

Abstract

本発明は、水系の環境でなく、周囲湿度または調節された湿度の空気に曝露される環境で製造、使用ならびに保存することのできる基材の表面に結合した複数の生体膜マイクロスポットを含むアレイを提供することによって、従来技術アレイの問題点と短所を克服する。好ましくは、生体膜マイクロスポットは膜結合タンパク質を含む。非常に好ましくは、膜結合タンパク質はＧタンパク質共役受容体、イオンチャンネル、受容体セリン／スレオニンキナーゼまたは受容体チロシンキナーゼである。

Description

関連出願とのクロスリファレンス
本出願は米国仮出願第０９／８５４,７８６号（２００１年５月１４日出願）の一部継続出願であってその内容に基づきまたその全体がこの参照により開示に含まれ、また３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２０に基づく優先権の利益をここに主張する。

本発明は、生体膜のアレイ、ならびにその製造方法および用途に関する。

ＤＮＡマイクロアレイは極めて重要な生物分析の道具となっている（たとえば、遺伝子発現を分析するために）；タンパク質マイクロアレイ技術は、しかし、大きく立ち後れている。固定化した状態のタンパク質の折りたたみ構造を保存することと、固定化タンパク質への非特異的結合が多量であることとに伴う問題のため、タンパク質アレイの製作は困難である。薬物の標的の大部分が膜結合タンパク質 （たとえば、Ｇタンパク質共役受容体、イオンチャンネル、など）であるため、膜結合タンパク質に対する高処理量スクリーニングのための道具を開発する勢いがある。膜タンパク質は脂質と結合しているとき折りたたみ構造を維持する；したがって、そのようなタンパク質のアレイを作成するためには、最初に膜の結合を支持する表面を開発することが重要である。固体支持体上に吸着した脂質二重膜は、支持脂質二重膜と呼ばれるが、生体膜の構造的および機能的役割を模倣することができる。（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；および非特許文献６を参照）。これらのハイブリッド表面は脂質黒膜の脆さを克服する一方で天然の生体膜で観察される横方向の流動性の側面を保存するために開発された。

脂質膜に結合する表面は大きく３つの種類に分類することができる：
（ｉ）脂質単層の吸着を支持する疎水性表面（たとえば、末端メチル基を示している自己組織化単層膜）；これらは膜貫通性Ｇタンパク質を組み込むのに用いることができないため、有用性は限られている（非特許文献５）；（ｉｉ）脂質二重膜を結合する親水性表面（たとえば、ガラス表面）；これらもまた、吸着された水の層（〜１ｎｍ）より厚みの少ない膜外領域を有する膜貫通性Ｇタンパク質を組み込むのに用いることができるだけであるため、有用性が限られている（非特許文献３；および非特許文献７）； そして（ｉｉｉ）疎水性と親水性の部分を含み脂質二重膜を結合する両親媒性表面；これらは多様な膜貫通性タンパク質を組み込むための可能性を与える（非特許文献４；非特許文献６；および非特許文献８）。

膜アレイを作成する方法は、複数の薬物候補に対する複数のターゲットの高処理量スクリーニングを可能にする。膜アレイは、酸化チタンは脂質の吸着に耐性があるため、ガラス基材上に酸化チタンの格子を製作することで得られる（非特許文献９；および非特許文献１０）。個々の囲いに入れられた脂質結合領域を空間的に位置指定するためにマイクロピペット技術が用いられている（非特許文献１１）。しかし、これらの方法は扱いにくくまたパターンを付けた表面を製作する必要がある。パターンを付けていない表面上に膜をプリントすることによって膜アレイを作るには、プリントされていない範囲への膜分子の横方向の拡散無しにプリントされた範囲に膜を閉じ込める必要がある。Ｂｏｘｅｒ ｅｔ ａｌ．はホスファチジルコリン（ＰＣ）の「インク」を使ったポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）スタンプを用いてマイクロコンタクトプリント法によりガラス表面上に脂質のパターンを描くことが可能であることを実証している。彼らはプリント領域への脂質の横方向の閉じ込めを、ＰＣ膜の元のプリント範囲の〜１０６％までに自己制限された拡大が原因であるとした（非特許文献１２）。Ｂｏｘｅｒ ｅｔ ａｌが用いた方法は、しかし、一定の制限がある。最初に、Ｂｏｘｅｒと共同研究者は脂質のプリントを水中に浸した表面上に行った（非特許文献１２）。次に、Ｂｏｘｅｒと共同研究者が用いた裸のガラス基材上に吸着された脂質は空気−水界面を通って引き出したとき自発的に脱離した（非特許文献１１）。Ｃｒｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．は、平面である支持体の構造を維持するために水中に浸した状態に留めた、空間的に位置指定された脂質二重層アレイの用途を特許文献１で提示している。そのような系は頑健な、高処理量のマイクロアレイを基礎とする分析には実際的でない可能性がある。
国際公開第０１／２０３３０号パンフレット 米国特許第５,７３１,１５２号明細書 米国特許第５,８０７,５２２号明細書 米国特許第５,６０１,９８０号明細書 国際公開第９６／２６４３２号パンフレット 米国特許第５,６７７,１９６号明細書 Ｓａｃｋｍａｎｎ, Ｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９６, ２７７, ４３−４８ Ｂｉｅｒｉ, Ｃ． ｅｔ ａｌ , Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ, １９９９, １７, １１０５−１１０８ Ｇｒｏｖｅｓ, J． Ｔ． ｅｔ ａｌ．, Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９７, ２７５, ６５１−６５３ Ｌａｎｇ, Ｈ． ｅｔ ａｌ．, Ｌａｎｇｍｕｉｒ １９９４, １０, １９７−２１０ Ｐｌａｎｔ, Ａ． Ｌ． ｅｔ ａｌ, Ｌａｎｇｍｕｉｒ １９９９, １５, ５１２８−５１３５ Ｒａｇｕｓｅ, Ｂ． ｅｔ ａｌ , Ｌａｎｇｍｕｉｒ １９９８, １４, ６４８−６５９ Ｇｒｏｖｅｓ, J． Ｔ． ｅｔ ａｌ．, Ｌａｎｇｍｕｉｒ １９９８, １４, ３３４７−３３５０ Ｖａｎｄｅｒａｈ, Ｄ．J． ｅｔ ａｌ, Mａｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｆａｌｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ, Ｂｏｓｔｏｎ, １９９９ Ｂｏｘｅｒ, Ｓ．Ｇ, ｅｔ ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９７, ２７５, ６５１−６５３ Ｂｏｘｅｒ, Ｓ．Ｇ． ｅｔ ａｌ Ｌａｎｇｍｕｉｒ １９９８, １４, ３３４７−３３５０ Ｃｒｅｍｅｒ, Ｐ． Ｓ． ｅｔ ａｌ, J． Ａｍ． Ｃｈｅｍ, Ｓｏｃ． １９９９, １２１, ８１３０−８１３１ Ｈｏｖｉｓ, J． ｅｔ ａｌ , Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２０００, １６, ８９４−８９７ Ａｎｇｅｒｓ, Ｓ． ｅｔ ａｌ．, Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ, ２０００, ９７, ３６８４−３６８９ Ｓｔａｄｅｌ, ｅｔ ａｌ．,Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍｏｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ, １９９７, １８, ４３０−４３７． Ｎｉｅｌｓｅｎ, Ｓ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．, Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ, ２０００, ９７,１０２７７−１０２８１ Ｆｅｎｇ, Ｙ． ｅｔ ａｌ．, Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９６, ２７２, ８７２−８７６ Ｄｅｎｇ, Ｈ．Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ １９９６, ３８１, ６６１−６６６ Ｍａｃｂｅａｔｈ Ｇ．, Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ, Ｓ． Ｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０００, ２８９, １７６０−１７６１ Ｃｒｅｍｅｒ, Ｐ． Ｓ． Ｂｏｘｅｒ, Ｓ． Ｇ． J． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． Ｂ １９９９, １０３, ２５５４−２５５９ Ｗｉｌｌｉａｍ Ｗ Ｓｈｅｎ, Ｓｔｅｖｅｎ Ｇ．Ｂｏｘｅｒ, Ｗｏｌｆｇａｎｇ Ｋｎｏｌｌ, Ｃｕｒｔｉｓ Ｗ． Ｆｒａｎｋ； Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００１ , ｖｏｌ ２, ｐｐ ７０−７９

本発明は、水系の環境でなく、周囲湿度または調節された湿度の空気に曝露される環境で製造、使用ならびに保存することのできる基材の表面に結合した複数の生体膜マイクロスポットを含むアレイを提供することによって、従来技術アレイの問題点と短所を克服する。好ましくは、生体膜マイクロスポットは膜結合タンパク質を含む。非常に好ましくは、膜結合タンパク質はＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、Ｇタンパク質、イオンチャンネル、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニル酸シクラーゼまたは受容体チロシンキナーゼである。

生体膜マイクロスポットがＧＰＣＲを含む実施形態においては、アレイの用途によって、目的の領域、すなわち細胞外領域または細胞内領域が溶液に面するように、ＧＰＣＲを配向させることができる。たとえば、リガンドのスクリーニングに関連する用途には、細胞外領域を溶液に向けたＧＰＣＲの配向が好ましい。機能的なアレイには、細胞内領域を溶液に向けた配向が好ましい。目的の配向は、下記に詳細に考察する基材表面修飾技術を用いて達成することができる。

別の１つの実施形態では、マイクロスポット内に閉じ込めたＧＰＣＲはＧＰＣＲの１つまたはいくつかの関連したサブファミリーの成員を含む。これらのアレイは「ファミリー特異的アレイ」と呼ばれる。さらに、いくつかのＧＰＣＲは主要素式を含むある種の組織型で高度に発現されているのが見出されている。この情報は、同様な組織分布（組織特異的アレイ）または同様な生理的／薬理的役割（機能特異的アレイ）を有するＧＰＣＲのアレイを作製するのに用いられる。

本発明のアレイで用いられる基材はガラス、シリコン、金属または高分子材料を含むことができる。基材はチップ、スライドまたはマイクロプレートとして構成することができる。

ある実施形態では、基材の表面は被覆されている。好ましくは、被覆は生体膜マイクロスポットの基材に対する親和性を促進する材料である。非常に好ましい被覆材料は約１５°から８０°までの範囲の接触角を与える。

被覆材料はシラン、チオール、または高分子（生体または合成）であることができる。好ましくは、材料がチオールである場合は、基材は金被覆表面を有する。好ましくは、チオールは疎水性および親水性部分を有する。非常に好ましくは、チオールはチオアルキル化合物である。

好ましくは、被覆材料がシランである場合は、基材はガラスを含む。好ましくは、シランはたとえば、ヒドロキシル、カルボキシル、リン酸、スルホン酸、イソシアナート、グリシドキシ、チオール、またはアミノ基を含む末端の部分を提示する。非常に好ましいシラン被覆材料はγ−アミノプロピルシランである。被覆は「高分子クッション」と呼ばれる緩く詰まった高分子層を形成しうる。

別の実施形態では、被覆材料は共有結合で結合したリンカー部分を有する誘導体化された１つの単層（またはいくつかの単層）、複数の層またはポリ層である。非常に好ましくは、単層はチオアルキル化合物またはシラン化合物を含む。好ましくは、シラン誘導体化またはチオール誘導体化された表面はさらに、非共有および共有結合形成を通じて膜の固定化を可能にする１またはそれ以上の試薬（たとえば、ポリ（塩化ジアリルジメチルアンモニウム、またはグルタルアルデヒド）といった陽イオン性の高分子で修飾されうる。

好ましくは、チオアルキル化合物はチオアルキル酸、チオアルキルアルコール、チオアルキルアミン、およびハロゲンを含むチオアルキル化合物から成る群から選択される。非常に好ましくは、チオアルキル化合物はチオアルキル酸、たとえば、１６−メルカプトヘキサデカン酸である。

好ましくは、シラン化合物はシリル無水物、シリル酸、シリルアミン、シリルアルコール、シリルチオール、ビニルシランまたはアクリル酸シリルより成る群から選択される。

結合したリンカーは：
（ｉ）誘導体化された単層と反応できる末端官能基；
（ｉｉ）親水性スペーサー領域；および
（ｉｉｉ）疎水性膜接着領域
を含む、部分直鎖または分枝鎖Ｃ_１０〜Ｃ_２５アルキル、アルキニル、アルケニル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアルキニル、ヘテロアルケニル、ヘテロアリール、またはヘテロアラルキル分子を含むことができる。

好ましくは、末端官能基はカルボン酸、ハロゲン、アミン、チオール、アルケン、エポキシド、アクリル酸、無水物、エステル、酸ハロゲン化物、イソシアネート、ヒドラジン、マレイミドおよび水酸基から成る群から選択される。親水性スペーサー領域は好ましくはｎ個のオキシエチレン基を含み、ここでｎ＝２から２５である。膜接着領域は好ましくは直鎖または分枝鎖Ｃ_１０〜Ｃ_２５疎水性尾部を有する。

別の実施形態では、基材の表面はシランで誘導体化されたアルカンチオラートの自己組織化単層膜を提示する金を含む。

さらに別の実施形態では表面は多孔質である。

本発明はまた生体膜のアレイを製造する方法を提供する。１つの好ましい方法は、表面を有する基材を提供し；生体膜溶液を提供し（ここで用いられるように「生体膜溶液」はまた生体膜の懸濁液も含む）；ピンの先端を溶液に浸し；先端を溶液から取り出して先端に付着した溶液を与え；溶液を表面と接触させてそれによって溶液を先端から表面へ移し；そして接触の工程を複数回繰り返して、表面上にアレイのパターンを描く生体膜マイクロスポットを与える工程を含む。典型的には、ピンの先端が基材に接触するとき、基材の表面は周囲湿度または調節された湿度の空気に曝露される。

別の好ましい方法は、表面を有する基材を提供し；生成された膜タンパク質の溶液を提供し；ピンの先端を溶液に浸し；先端を溶液から取り出して先端に付着した溶液を与え；溶液を表面と接触させてそれによって溶液を先端から表面へ移し；接触の工程を複数回繰り返して、表面上にアレイのパターンを描く生体膜マイクロスポットを与え；そして膜タンパク質マイクロスポットを天然に見られるかまたは合成の脂質の溶液とインキュベートして表面上に固定したタンパク質を目的の立体構造へ再折りたたみさせる工程を含む。

本発明の生体膜のアレイを製造するためにさまざまな他の技術もまた用いることができる。たとえば、本発明のアレイはマイクロスタンプ法（特許文献２）、ＰＤＭＳスタンプを用いるマイクロコンタクトプリント法（非特許文献１２）、キャピラリー分注器具（特許文献３）およびマイクロピペット器具（特許文献４）を用いて製造することができる。

好ましい実施形態においては、溶液はタンパク質を含む。好ましくは、溶液は膜結合タンパク質を含む。非常に好ましくは、膜結合タンパク質はＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、Ｇタンパク質、イオンチャンネルまたは受容体チロシンキナーゼである。ある実施形態では、タンパク質は突然変異、たとえば点突然変異を含む。別の実施形態では、溶液は複数のタンパク質を含む。

別の実施形態では、方法はマイクロスポットを、タンパク質を含む溶液と接触させる追加の工程を含む。

本発明はさらにプローブアレイと標的化合物との間の結合事象を検出する方法を提供する。その方法は標的化合物を含む溶液を、基材の表面に結合したプローブ生体膜マイクロスポットのアレイと接触させ、少なくとも１またはそれ以上のプローブマイクロスポットと、標的の１またはそれ以上の構成要素との間の結合事象を検出する。好ましくは、標的化合物の構成要素の少なくとも１つは標識であり、検出工程は標識の存在を検出することを含む。標識の検出は好ましくは結合した標的化合物からの放射能、蛍光、燐光、化学発光、または共鳴光散乱に基づいたイメージングによって行われる。基材は結合していない標的化合物を除去するために検出工程の前に洗浄することができる。

生体膜マイクロスポット中に含まれるＧＰＣＲは機能性である；たとえば、標識された加水分解されないＧＴＰをシグナルプローブとして用いて、プローブＧＰＣＲ結合Ｇタンパク質の、標的化合物に誘導される活性化によって、この機能性はプローブＧＰＣＲと標的化合物との間の結合事象を検出するのに用いることができる。加水分解されないＧＴＰは、たとえば、ＧＴＰγＳを含む。

別の実施形態では、マイクロスポットのアレイを標識同族標的および非標識標的化合物とインキュベートし、そして標識同族標的と非標識標的化合物との間のプローブに対する競合による標識の信号の減少を測定することによって非標識標的化合物とプローブとの間の結合事象が測定される。好ましくは、非標識標的化合物とのインキュベートの前に標識同族標的をアレイとインキュベートする。別の実施形態では、標的化合物は非標識であり、結合事象は界面における物理的性質の変化または質量分析によって測定される。好ましくは、界面における物理的性質の変化は屈折率または電気インピーダンスの変化である。

他の実施形態では、本発明は末端にアミンを有する化合物で被覆された基材の表面に結合した生体膜を含む固定化膜を提供する。基材はガラス、金属またはプラスチックであるかまたはそれらを含むことができる。好ましくは、末端にアミンを有する化合物はシランである。非常に好ましくは、シランはγ−アミノプロピルシランである。あるいは、基材が金表面を含む場合は、末端にアミンを有する化合物分子は１１−メルカプトウンデシルアミンであることができる。好ましくは、固定化膜は膜結合タンパク質を含む。非常に好ましくは、膜結合タンパク質はＧタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、イオンチャンネル、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、または受容体グアニル酸シクラーゼである。

本発明のアレイを含むバイオセンサーおよび診断装置もまた本発明によって検討されている。

この特許のファイルは少なくとも１つのカラーで描かれた図面を含む。カラーの図面を含むこの特許のコピーは請求および必要な料金の支払いにより米国特許庁によって提供される。

図１は本発明のアレイの平面図を示す図である。

図２Ａおよび２ＢはＢＴ−ＴＭＲ ＣＧＰ１２１７７溶液（５ｎＭ）とインキュベートしたβ−アドレナリン受容体（サブタイプ１）のマイクロスポットの１ｘ５アレイの蛍光画像を示す図である。図２Ａでは画像は７日間４℃にて水蒸気で飽和した容器中で保存したアレイに対応する。図２Ｂでは画像は１、６、および１４日間デシケータ中で４℃にて保存したアレイに対応する。

図３Ａおよび３Ｂは本発明のマイクロアレイの蛍光画像を示す図である。図３Ａは緩衝液に繰り返し浸漬し空気−水界面を通して引き上げた、ＧＡＰＳスライド上のＦＩＴＣ−ＤＨＰＥ（２％）で処理したＤＭＰＣ／ＤＰＰＣ（１：４）脂質のマイクロアレイの蛍光画像を示す。（Ｉ）緩衝液に浸漬した脂質アレイの蛍光画像。（ＩＩ） 空気−水界面を通して５回引き上げた後、緩衝液に浸漬したアレイの蛍光画像。（ＩＩＩ） さらに５回空気−水界面を通して引き上げた後、緩衝液に浸漬した同じアレイの蛍光画像 （ＩＶ）乾燥後の空気中のアレイの蛍光画像。（Ｖ）再浸漬後の緩衝液中の同じアレイの蛍光画像。図３Ｂは（Ｉ）−（Ｖ）について上に記載した通り、緩衝液に繰り返し浸漬し空気−水界面を通して引き上げた、ＧＡＰＳスライド上のＦＩＴＣ−ＤＨＰＥ（２％）で処理した卵ＰＣ（１：４）脂質のマイクロアレイの蛍光画像を示す。データはＳｃａｎＡｒｒａｙ ５０００スキャナを用いて集めた。使用した緩衝液は５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５であった。

図４Ａ〜４ＥはＧＰＣＲアレイの蛍光画像を示す図であり、ここで各アレイは３列を含み各カラムは５連のマイクロスポットから成る。マイクロスポットの各列は異なるＧＰＣＲに対応する。左から右へ、これらの受容体はβ−アドレナリン受容体サブタイプ１（β１）、ニューロテンシン受容体サブタイプ１（ＮＴＲ１）、およびドーパミン受容体サブタイプ１（Ｄ１）である。図４Ａは結合緩衝液だけとインキュベートしたアレイの蛍光画像である；この画像は陰性対照となる。図４ＢはＢｏｄｉｐｙ−ＴＭＲ−ニューロテンシン（ＢＴ−ＮＴ）（２ｎＭ）溶液とインキュベートした次のアレイの蛍光画像を示す。図４ＣはＢＴ−ＮＴ（２ｎＭ）およびＣＧＰ１２１７７（１μＭ）の溶液とインキュベートしたアレイの蛍光画像を示す。図４ＤはＢＴ−ＮＴ（２ｎＭ）およびＳＣＨ２３３９０（１μＭ）の溶液とインキュベートしたアレイの蛍光画像を示す。図４ＥはＢＴ−ＮＴ（２ｎＭ）およびニューロテンシン（１ＵＭ）の溶液とインキュベートしたアレイの蛍光画像を示す。ＣＧＰ１２１７７およびＳＣＨ２３３９０はＮＴＲ１受容体と結合しないことが知られているリガンドである；ニューロテンシンはＮＴＲ１の同族リガンドである。

図５Ａおよび５Ｂは本発明のアレイの蛍光画像を示す図である。図５Ａは、図中に示す通り、異なる濃度のＢＴ−ニューロテンシンを含む溶液中でインキュベートしたＮＴＲ１のマイクロスポットの１ｘ５アレイの蛍光画像を示す。図５Ｂは、図中に示す通り、異なる濃度のｃｙ５−標識アンタゴニストＤを含む溶液中でインキュベートしたガラニン受容体のマイクロスポットの１ｘ５アレイの蛍光画像を示す。結合緩衝液は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＢＳＡ、ｐＨ７．４であった。

図６は結合緩衝液中に固定濃度（１ｎＭ）のＢＴ−ニューロテンシンおよび異なる濃度の非標識ニューロテンシンを含む溶液中でインキュベートしたＮＴＲ１受容体アレイの蛍光画像を示す図である。

図７はＢＴ−ニューロテンシンの存在下においてニューロテンシンの濃度の関数としてＮＴＲ１受容体アレイの蛍光強度のプロットを示す図である；統計データは図６に示した例からである。

図８Ａおよび８Ｂは、β−受容体アンタゴニストである１０μＭプロプラノロールの非存在下（図８Ａ）および存在下（図８Ｂ）で、Ｂｏｄｉｐｙ−ＴＭＲ ＣＧＰ１２１７７（ＢＴ−ＣＧＰ）の、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）表面上のヒトβ１受容体アレイとの結合の用量依存性結合を示す図である。両方の例で、β１受容体アレイの蛍光強度はＢＴ−ＣＧＰ濃度が上昇するにつれて上昇する。しかし、プロプラノロールの存在下でのβ１アレイの蛍光強度はプロプラノロールの非存在下での対応するアレイよりはるかに低い。これらの結果は、ＢＴ−ＣＧＰのβ１受容体アレイとの結合が特異的であることを示唆する。非特異的結合によるＷＧＡ表面上の蛍光バックグラウンドは、ＣＭＴ−ＧＡＰＳ表面上のバックグラウンドよりはるかに低い。

図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃは単一のサブファミリーに関して受容体に対する目的の化合物の選択性を差別化するのに用いるＧＰＣＲテーマアレイを説明する図である。β１、β２およびα２_Ａの複数のアレイが、ＡＰＴＥＳ修飾された金表面上に製作された。各アレイ内には５連の３列があり、左から右の列へβ１、β２およびα２_Ａにそれぞれ対応した。５ｎＭ ＢＴ−ＣＧＰだけとインキュベートしたアレイを陽性対照として用いた（図９Ａ）。他の２つのアレイは５ｎＭ ＢＴ−ＣＧＰと共に、異なる濃度のＩＣＩ１１８５１：１０ｎＭ ＩＣＩ１１８５５１（図９Ｂ）および５００ｎＭ ＩＣＩ１１８５５１（図９Ｃ）の存在下でインキュベートした。ＩＣＩ１１８５５１のＫｉはβ１について１２０ｎＭ、β２について１．２ｎＭ、そしてα２_Ａについて１０μＭより大であることが知られている。

図１０Ａおよび１０Ｂは金表面上のアルカンチオールの自己組織化単層膜（ＳＡＭ）のシラン修飾の化学的説明を示す図である。ＳＡＭは１工程（図式１−図１０Ａ）または２工程（図式２−図１０Ｂ）の手順を経て３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）と反応させる。あるいは、ＡＰＴＥＳといったアミノシランは、静電気的にアルカンチオールＳＡＭ上に吸着させることができる。

図１１Ａ、１１Ｂおよび１１ＣはＧＰＣＲアレイの蛍光画像を説明する図である。β−アドレナリン受容体サブタイプ１（β１）のアレイがＡＰＴＥＳ修飾された金表面上にプリントされ、ＢＴ−ＣＧＰ１２１７７を含む溶液とインキュベートされた。ＣＭＴ−ＧＡＰＳスライド上にプリントされたアレイと比較して、金表面上のアレイは〜４×低いバックグラウンド蛍光を有した。

図１２はＡＰＴＥＳ修飾された金表面上にプリントされたβ１アドレナリン受容体のアレイへの標識リガンドの結合の特異的阻害を示す図である。アレイは５ｎＭ ＢＴ−ＣＧＰおよび２０μＭ非標識阻害剤を含む溶液とインキュベートした。非標識阻害剤はＣＧＰ１２１７７、プロプラノロール、またはベタキソロールであった。結果は２回の実験の平均である。

図１３Ａおよび１３ＢはＡＰＴＥＳ修飾された金表面上にプリントされたガラニン受容体およびβ１受容体のアレイへのガラニン結合のＳＰＲ画像検出を説明する図である。（Ａ）ガラニンのガラニン受容体への特異的結合と、β１受容体へは結合しないことを示すＳＰＲ差分画像。（Ｂ）アレイ中の第１列へのガラニンの結合を示すプロットプロファイル。

図１４Ａ、１４Ｂおよび１４ＣはダイノルフィンＡの存在下および非存在下でのミューおよびデルタ２受容体のアレイ（ＡＰＴＥＳ修飾された金表面上にプリント）の蛍光画像とヒストグラム分析を示す図である。各アレイはそれぞれ、ミュー（左列）とデルタ２受容体（右列）の３連の２列を有する。結合緩衝液は１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｎＭ ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＧＴＰγＳ、０．１％ ＢＳＡ、３μＭ ＧＤＰ、５０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌを含み、ｐＨ７．４であった。インキュベート時間は９０分間であった。

図１５Ａ、１５Ｂおよび１５ＣはＧＰＣＲの配向固定化のためのガラスまたは金属表面の化学修飾を説明する図である。（１５Ａ）ガラス表面はＥＤＴＡ−シランで誘導体化することができ、ＥＤＴＡ−シランはニッケルイオンを含む溶液で処理してニッケルキレート表面を形成することができる。（１５Ｂ）金表面上の１１−メルカプトウンデカノールの自己組織化単層膜（ＳＡＭ）に、または１１−メルカプトウンデカン酸（ＭＵＡ）のＳＡＭに、ＮＨＳ／ＥＤＣ媒介活性化によってＥＤＴＡ−シランを結合することができる。（１５Ｃ）ＥＤＴＡ−シランの代わりに、ＭＵＡのＳＡＭ（ＮＨＳ／ＥＤＣを用いて）への結合にｅ−アミノニトリロトリ酢酸基を用いることができる。

図１６Ａは異なる濃度のテトラメチルローダミン−上皮成長因子（ＴＭＲ−ＥＧＦ）とインキュベート後の、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の７つの別々のアレイの蛍光画像を示す図である。図１６Ｂは５００ｎＭ ＥＧＦの存在下で異なる濃度のＴＭＲ−ＥＧＦとインキュベート後の、ＥＧＦＲの７つの別々のアレイの蛍光画像を示す図である。ＥＧＦＲアレイは金スライド上の１１−メルカプトウンデシルアミンのＳＡＭ上に管状ピンプリンターを用いて製作した。結合緩衝液は５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、１３８ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、０．２％ＢＳＡを含んだ。インキュベート時間は６０分間であった。ＥＧＦの存在下および非存在下での、ＴＭＲ−ＥＧＦ濃度の関数としてのＥＧＦＲアレイの蛍光強度を図１６Ｃに示す。特異的結合に由来するＥＧＦＲアレイの蛍光強度を図１６Ｄに示す。

生体膜アレイ、ならびにその調製および用途が提供される。本発明のアレイでは、複数の生体膜プローブスポットが固体支持体の表面に安定して結合している。本発明のアレイは、たとえばＧタンパク質共役受容体といった膜結合タンパク質のリガンドの同定に特に有用である。さらに、本発明のアレイは複数の薬物候補に対する複数の膜結合標的の高処理量スクリーニングに極めて大きい可能性をもたらし、それによって薬物発見の過程を非常に加速する。主題の発明をさらに記載するにあたり、アレイ自体を最初に考察し、続いてその調製のための方法を記載する。次に、主題のアレイを使用することのできる代表的な実施形態の概観を提供する。

本発明は、下に記載する本発明の特定の実施形態に制限されないと解釈されるべきであり、それは当該の特定の実施形態の変化を作ることができなお付記する請求項の範囲に入るためである。また使用した用語は特定の実施形態を記載する目的であり、制限することを意図しないと解されるべきである。代わりに、本発明の範囲は付記する請求項によって規定される。

この明細書および付属の請求項においては、文脈上明らかに他の意味を示さない限り、単数形「ａ」「ａｎ」「ｔｈｅ」は複数形の言及を含む。他の意味に定義されない限り、使用したすべての技術用語および科学用語はこの発明の属する分野で通常の技能を有する者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。

本発明のアレイ
図１で説明するように、本発明のアレイ（１０）は表面（１４）を覆う複数の生体膜プローブマイクロスポット（１６）を有する表面（１４）を有する基材（１２）を含む。アレイ上の個々のプローブマイクロスポットは既知または未知の組成の生体膜を含み、また好ましい実施形態では、膜結合タンパク質を含む。マイクロスポットは複数の異なるタンパク質を含みうる。たとえば、ヘテロダイマーの組に関与する２種類の異なるタンパク質を１つのマイクロスポットに含むことができる。アレイ上のプローブマイクロスポットは任意の都合の良い形状であることができるが、典型的には円形、楕円形、卵形、輪形、またはある種の他の類似の曲線状の形であり、ここでその形は、ある実施形態では、アレイを製造するために使用した特定の方法の結果でありうる。基材の表面上のマイクロスポットすべて、すなわちプローブスポットおよびたとえば、校正スポット、対照スポット、などといった非プローブスポットの両方の密度は、少なくとも約１／ｃｍ^２であり通常は少なくとも約１０／ｃｍ^２であるが約１０００／ｃｍ^２を超えず、多くの実施形態では約５００／ｃｍ^２を超えず、ここで一部の好ましい実施形態では、その密度は約４００／ｃｍ^２を超えず、通常は約３００／ｃｍ^２を超えず、そしてより普通には約６０／ｃｍ^２を超えない。マイクロスポットはアレイの表面をわたってまたは覆って、たとえば格子を形成するように行と列に、また円形に、など、任意の便利なパターンに配列させることができ、ここで一般的にスポットのパターンは固体支持体の表面をわたる格子状に存在する。

本発明のアレイでは、マイクロスポットは基材の表面と安定に結合している。「安定に結合している」とは、結合および／または洗浄条件下で、マイクロスポットが基材との相対的な位置を維持し、たとえば、空気−水界面を通して引き上げたときマイクロスポットが位置的に留まりまた生物学的機能を維持することを意味する。したがって、スポットを構成する生体膜は基材表面と非共有的にまたは共有的に安定して結合することができる。非共有結合の実施形態は非特異的吸着、静電気的相互作用（たとえば、イオン、イオン対相互作用）、疎水性相互作用、水素結合相互作用、表面水和力などに基づく結合、および固定化した結合パートナーと膜結合タンパク質との特異的相互作用に基づく特異的結合を含む。特異的結合から誘発される固定化は、たとえば、抗体−抗原相互作用、一般的なリガンド−受容体結合、レクチン−糖部分相互作用、などを含む。共有結合の実施形態は、スポット生体膜と基材の表面に存在する官能基、たとえば−ＮＨ_２、との間に形成された共有結合を含み、ここで官能基は天然に存在するかまたは、導入された被覆材料の一部として存在する。別の実施形態では、ＧＰＣＲまたは膜タンパク質のヒスチジンタグ突然変異がＮｉ−提示表面とキレート結合を通じて結合することができる。

典型的には、生体膜マイクロスポットが膜結合タンパク質を含む場合、タンパク質の１つの型だけがアレイの個々のマイクロスポットに含まれる。しかし、一部の場合には１つ以上の型のタンパク質がマイクロスポットに含まれる。たとえば、一部のＧＰＣＲは生物学的機能のためにヘテロダイマーを形成する。（非特許文献１３）さらに、機能するＧＰＣＲ活性のために、生体膜マイクロスポットは必要なコエフェクターおよび／またはアダプターを含むことができる。さらに、多数の細胞表面分子を含む細胞溶解した細胞由来の生体膜を直接用いて生体膜アレイを製作することができる。

アレイの好ましい実施形態では、マイクロスポットに含まれるタンパク質は同じアレイの別のマイクロスポットに含まれるタンパク質とは異なる。そのような実施形態では、複数の異なるタンパク質がアレイの別々のマイクロスポット上に存在する。典型的にはアレイは少なくとも約２種類の異なるタンパク質を含む。好ましくは、アレイは少なくとも約１０種類の異なるタンパク質を含む。非常に好ましくは、アレイは少なくとも約５０種類の異なるタンパク質を含む。さらに非常に好ましくは、アレイは少なくとも約１００種類の異なるタンパク質を含む。別の好ましいアレイは約１０^３種類より多くの異なるタンパク質または約１０^４種類より多くの異なるタンパク質を含む。アレイはさらに選択的に１０^５種類より多くの異なるタンパク質を含みうる。

アレイの実施形態においては、アレイのマイクロスポットのそれぞれが別のタンパク質を含む。たとえば、約１００個のマイクロスポットをふくむアレイは約１００個の異なるタンパク質を含みうる。同様に、約１０,０００個のマイクロスポットのアレイは約１０,０００個の異なるタンパク質を含みうる。別の実施形態では、しかし、各々の異なるタンパク質はアレイ上の１個以上の別々のマイクロスポットに含まれる。たとえば、各々の異なるタンパク質は選択的に２〜６個の異なるマイクロスポットに存在する。本発明のアレイは、したがって、約３０００個のマイクロスポットを含むことができ、しかし、各々の異なるタンパク質は３個の異なるマイクロスポットに存在するため、約１０００種類だけの異なるタンパク質を含む。

別の実施形態では、アレイは細胞膜調製物を用いて製作される。そのような細胞膜調製物は、目的の膜タンパク質に加えて多数の異なる細胞表面タンパク質を含む。この実施形態の一例では、正常組織および疾患組織から得た細胞膜調製物を本発明のアレイを形成するのに用いることができ、得られたアレイを用いて組織の薬理的および生理的特徴を比較することができる。

代わりの別の実施形態では、アレイのマイクロスポットのそれぞれは目的の同一タンパク質を、しかし異なる量で、および／または異なる埋め込み環境で含む。たとえば、同一の受容体を、細胞溶解した細胞膜調製物から、または異なる組成のリポソームまたはミセルで再構成した精製した受容体から得ることができる。結果として得られるアレイを用いて受容体の安定性および機能性に対する環境の影響を検討することができる。さらに別の実施形態では、アレイのマイクロスポットのそれぞれは同一タンパク質でしかし異なる点突然変異を有するものを含む。結果として得られるアレイを用いて受容体の構造と機能の関係を体系的に検討することができる。

さらに別の実施形態では、アレイは、使用時に異なる分析対象（標的）で処理される、実質的に同一のマイクロスポット（たとえば、同一のタンパク質を含むマイクロスポット）または一連の実質的に同一のマイクロスポットを含む。たとえば、本発明のアレイは、それぞれのマイクロスポットが異なる膜結合タンパク質を含む２０個のマイクロスポットの「ミニアレイ」を含み、そのミニアレイがより大きなアレイの一部として２０回繰り返されることができる。

本発明の別の実施形態では、あるマイクロスポットのタンパク質は別のマイクロスポットのタンパク質と異なるが、それらのタンパク質は関連している。好ましい実施形態では、２種類の異なるタンパク質は同一のタンパク質ファミリーの成員である。本発明のアレイ上の異なるタンパク質は機能的に関連しているかまたは単に機能的に関連している疑いがある。本発明の別の実施形態では、しかし、固定化されたタンパク質の機能は未知でありうる。この場合、アレイの別々のマイクロスポットの異なるタンパク質は構造または配列に類似性を共有するかまたは単に構造または配列に類似性を共有する疑いがある。あるいは、そのタンパク質は１つのタンパク質ファミリーの異なる成員の断片である可能性がある。本発明のさらなる実施形態では、タンパク質は薬理的および生理的分布または役割に類似性を共有する。

基材
本主題アレイの基材はプローブスポットのパターンが存在する少なくとも１つの表面を含み、ここでその表面は平滑または本質的に平面、またはたとえば窪みまたは隆起といった不規則性を有することができる。スポットのパターンが存在する表面は、表面の性質を望ましい方法で修飾し以下により詳細に記載する１またはそれ以上の異なる層の化合物で修飾されうる。表面はまた多孔質でありうる。

基材はセラミック性物質、ガラス、金属、結晶性材料、プラスチック、高分子または共重合体、それらの任意の組み合わせ、またはある材料の上の他の材料の被覆を含みうる。そのような基材はたとえば、金または銀のような（半）貴金属；ソーダ石灰ガラス、パイレックス（登録商標）ガラス、バイコールガラス、石英ガラスといったガラス材料；金属酸化物または非金属酸化物；シリコン、リン酸一アンモニウム、および他のそうした結晶性材料；遷移金属；ポリ（塩化ビニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（酢酸ビニル−無水マレイン酸）、ポリ（ジメチルシロキサン）モノメタクリル酸、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンイミンといった樹状高分子を含むプラスチックまたは高分子；ポリ（ビニル酢酸−無水マレイン酸共重合体）、ポリ（スチレン−無水マレイン酸共重合体）、ポリ（エチレン−アクリル酸共重合体）といった共重合体；またはこれらなどの誘導体を含みうるがこれらに限定されない。

アレイの使用目的に応じて、基材は単純なものから複雑なものまでの範囲のさまざまな構造を取りうる。したがって、基材はたとえば長方形または円板構造といったスライドまたはプレート全面の構造を有しうる。標準的なマイクロプレート構造を用いることができる。多くの実施形態では、基材は長方形の断面状の形を有し、長さ約１０ｍｍから２００ｍｍまで、通常は約４０から１５０ｍｍまで、そしてより普通には約７５から１２５ｍｍまで、そして幅約１０ｍｍから２００ｍｍまで、通常は約２０ｍｍから１２０ｍｍまで、そしてより普通には約２５から８０ｍｍまで、そして厚み約０．０１ｍｍから５．０ｍｍまで、通常は約０．１ｍｍから２ｍｍまで、そしてより普通には約０．２から１ｍｍまでである。

被覆材料
本発明のアレイは選択的にさらにプローブマイクロスポットを含む被覆材料を基材の全体または一部の上に含みうる。好ましくは被覆材料は生体膜マイクロスポットの基材に対する親和性を向上させる。非常に好ましくは、被覆材料は約１５°から８０°までの範囲の接触角を与える。

１つの実施形態では、被覆材料はシラン、チオール、ジスルフィド、または高分子である。好ましくは、材料がチオールである場合、基材は金被覆表面を有する。好ましくは、チオールは疎水性および親水性部分を含む。非常に好ましくは、チオールはチオアルキル化合物である。

好ましくは、被覆材料がシランである場合、基材はガラスを含む。好ましくは、シランはたとえば、ヒドロキシル、カルボキシル、リン酸、グリシドキシ、スルホン酸、イソシアナート、チオール、またはアミノ基を含む末端の部分を提示する。被覆は「高分子クッション」と呼ばれる緩く詰まった高分子層を形成しうる。非常に好ましいシラン被覆材料はγ−アミノプロピルシランである。γ−アミノプロピルシラン被覆スライド（ＣＭＴ−ＧＡＰＳ（商標）スライドガラス）はＣｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．から市販されている。

別の実施形態では、被覆材料は共有結合で結合したリンカー部分を有する誘導体化された単層または複数の層である。たとえば長鎖炭化水素部分を含む単層被覆は、基材への化学的または物理化学的結合を生じるたとえばチオール（たとえば、チオアルキル）、ジスルフィドまたはシラン基を有しうるがこれらに限定されない。単層の基材への結合は、非共有相互作用によって、または共有反応によっても達成しうる。

好ましくは、チオールはチオアルキル化合物であり、チオアルキル酸、チオアルキルアルコール、チオアルキルアミンおよびハロゲンを含むチオアルキル化合物から成る群から選択される。非常に好ましくは、チオアルキル化合物はチオアルキル酸、たとえば、１６−メルカプトヘキサデカン酸である。そのような化合物は容易に合成されうるかおよび／または市販品を購入しうる。

基材への結合後、単層は少なくとも１の反応性官能基を有する。単層被覆上の反応性官能基の実施形態は、カルボキシル、イソシアネート、ハロゲン、アミンまたは水酸基でありうるがこれらに限定されない。１つの実施形態では、単層被覆上のこれらの反応性官能基は、単層被覆上の対応する活性化官能基への標準的化学技術によって活性化されうる（たとえば、カルボキシル基の無水物または酸ハロゲン化物への変換、など）。基材上の単層被覆の活性化された官能基は、リンカー化合物の末端アミノ基との共有結合のための、無水物、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルまたは他の一般的な活性化エステルまたは酸ハロゲン化物でありうるがこれらに限定されない。別の実施形態では、単層被覆上の活性化された官能基は、リンカー化合物の末端の水酸基との結合のための無水物誘導体リンカー化合物の酸化糖残基との結合のためのヒドラジン誘導体；またはリンカー化合物のチオール基との共有結合のためのマレイミド誘導体、でありうるがこれらに限定されない。誘導体化された単層被覆を製するためには、単層被覆上の少なくとも１つの末端カルボキシル基が最初に無水物基へ活性化され、次いでリンカー化合物と反応させられる。

あるいは、単層被覆上の反応性官能基を、単層被覆上の反応性アミノ基との共有結合のための、たとえば、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、酸ハロゲン化物、酸無水物、およびイソシアナートであるがこれらに限定されない、活性化された官能基を有するリンカー化合物と反応させることができる。

リンカー化合物は１個の末端官能基、スペーサー領域および膜接着領域を有する。活性化された単層被覆上の活性化された官能基と反応するための末端の官能基はたとえば、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシル、またはチオール基であるがこれらに限定されない。好ましくは、末端の官能基はカルボン酸、ハロゲン、アミン、チオール、アルケン、アクリル酸、無水物、エステル、酸ハロゲン化物、イソシアネート、ヒドラジン、マレイミドおよび水酸基から成る群から選択される。

スペーサー領域は、オリゴ／ポリエーテル、オリゴ／ポリペプチド、オリゴ／ポリアミド、オリゴ／ポリアミン、オリゴ／ポリエステル、オリゴ／ポリサッカライド、ポリオール、複数荷電種またはその任意の他の組み合わせから構成されうるがこれらに限定されない。実施形態は、エチレングリコール、ペプチド、グリセロール、エタノールアミン、セリン、イノシトール、などのオリゴマーを含みうるがこれらに限定されず、またリンカー部分の膜接着領域へ膜が自由に吸着するようになっている。スペーサー領域は本質的に親水性でありうる。好ましい実施形態では、スペーサーはｎ個のオキシエチレン基を有し、ここでｎは２と２５の間である。最も好ましい実施形態では、スペーサーは１０個のオキシエチレン基を有する。好ましい実施形態では膜接着領域すなわちリンカー化合物の「疎水性尾部」は直鎖または分枝鎖アルキル、アルキニル、アルケニル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアルキニル、ヘテロアルケニル、ヘテロアリール、またはヘテロアラルキルを有し疎水性または両親媒性である。好ましい実施形態では、膜接着領域はＣ_１０〜Ｃ_２５直鎖または分枝鎖アルキルまたはヘテロアルキル疎水性尾部を含む。最も好ましい実施形態では、疎水性尾部はＣ_１０〜Ｃ_２０直鎖または分枝鎖アルキル断片を含む。

別の実施形態では、リンカー化合物は一方の端に末端官能基を、スペーサー、リンカー／膜接着領域、および他方の端に親水基を有する。リンカー化合物の一方の端の親水基は単一の基または複数の親水基の直鎖または分枝鎖でありうる。たとえば、単一の水酸基またはエチレングリコール単位の鎖でありうるがこれに限定されない。

さらなる実施形態では、「誘導体化された単層」はシランで修飾されたアルカンチオールの自己組織化単層膜（ＳＡＭ）である。アルカンチオールは好ましくはたとえば、１１−メルカプトウンデカノール（ＭＵＤ）、１１−メルカプトウンデカン酸（ＭＵＡ）、１１−メルカプトウンデシルアミン（ＭＵＡＭ）、１６−メルカプトヘキサデカノール、および１６−メルカプトヘキサデカン酸を含む。シランは好ましくは３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、および３−イソシアナートプロピルトリエトキシシランを含む、上記に特定したさまざまな末端の官能基を有するシランを含む。この実施形態では、基材は好ましくは金表面を有する。実施例４で説明する通り、金表面を有する基材を使用する結果、ガラス基材上にプリントされたアレイと比較して高いシグナル対バックグラウンド比が得られる。さらに、金は表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）、マトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）および電気化学的方法を含む非標識検出技術のための好ましい基材である。

生体膜
本発明に基づいて、本発明で言う「生体膜」はたとえば、小胞、リポソ−ム、脂質単層膜、脂質二重膜、受容体を組み込んだ膜、細胞膜の全体または一部、または再折りたたみタンパク質を含むリポソ−ム、または再折りたたみタンパク質を含む界面活性剤ミセル、などを含むがこれらに限定されない、合成または天然に存在する膜を含む。本発明での使用に適した膜はたとえば、リン脂質、スフィンゴミエリン、コレステロールまたはその誘導体を含むがこれらに限定されない、両親媒性分子である。好ましい実施形態では、膜は膜タンパク質を含む。そのような膜タンパク質は、たとえば、膜貫通タンパク質、膜周辺タンパク質および受容体（たとえば、Ｇタンパク質−結合受容体、イオンチャンネル受容体、チロシンキナーゼ結合受容体、受容体チロシンキナーゼ、サイトカイン受容体、および固有の酵素活性を有する受容体）を含む。別の実施形態では、膜はイオノフォア（たとえば、バリノマイシン、ノナクチン、メチルモネンシン、クラウンエーテル、クリプタンドまたはその誘導体でありうるがこれらに限定されない）、イオンチャンネル（たとえばタンパク質イオノフォアなどであるがこれに限定されない）、またはたとえば、抗体、酵素、レクチン、色素、キレート剤などであるがこれらに限定されない合成または天然に存在する分析対象、などであるがこれらに限定されないものを組み込んだ脂質二重膜でありうる。

さらに、ＧＰＣＲアレイについては、ある実施形態では、固定化された受容体は１またはそれ以上のたとえばＧタンパク質およびＧタンパク質共役受容体キナーゼ（ＧＲＫｓ）のようなそのコエフェクターと結合していることが好ましい。好ましい実施形態では、目的の受容体およびそのコエフェクターを同時に過剰発現している細胞株からの細胞膜調製物が用いられている。別の実施形態では、リポソ−ムまたはミセルで再構成された受容体が用いられ、リポソ−ムまたはミセルでは受容体が１またはそれ以上の好ましいコエフェクターと望ましい比で結合している。受容体とそのコエフェクターとの結合は、受容体をアレイにする前または後に行うことができる。コエフェクターは精製した天然タンパク質、天然の配列を有する組み換えタンパク質、またはたとえば突然変異やキメラといったサブユニットの独自の組み合わせを有する組み換えタンパク質のいずれでもよい。

タンパク質
アレイに組み込まれたタンパク質は当該分野の通常の技能を有する者に知られているさまざまな方法のうち任意のものにより製造することができる。本発明のアレイへの組み込みの準備として、タンパク質は天然の起源から得ることができ、あるいは選択的に組み換えＤＮＡ法を用いて過剰発現させることができる。タンパク質は、たとえば、ＧＰＣＲ（たとえば、アドレナリン受容体、アンギオテンシン受容体、コレシストキニン受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、ニューロテンシン受容体、ガラニン受容体、ドーパミン受容体、オピオイド受容体、セロトニン受容体、ソマトスタチン受容体、など）、Ｇタンパク質、イオンチャンネル（ニコチン性アセチルコリン受容体、ナトリウムおよびカリウムチャンネル、など）、受容体チロシンキナーゼ（たとえば、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体）、および他の膜結合タンパク質を含む。そのようなタンパク質の突然変異または修飾もまた用いることができる。たとえば、１つまたは複数の点突然変異を有する一部のＧＰＣＲは生物学的機能を保持し、疾患に関わっている可能性がある。（非特許文献１４を参照。）
さらに、タンパク質はまた（あるいは独立に）Ｎ末端に結合した作用剤（またはペプチド）を持つように修飾することができる。そのような方法で修飾されたＧＰＣＲは構造的に活性化されている（非特許文献１５）。

さらに、ＧＰＣＲアレイについては、ある実施形態では、受容体が配向して固定されているのが好ましい。たとえば、リガンドスクリーニングのためのＧＰＣＲアレイの性能を改善するために、ＧＰＣＲはリガンド結合部位（細胞外領域）を溶液に向けて、また細胞内領域を基材に面して配向されている。これはいくつかの方法によって達成することができる。たとえば、基材の表面は、ニッケルをキレートしたニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）基またはエチレンジアミントリ酢酸（ＥＤＴＡ）基を含むように修飾される。この表面を、Ｃ末端にヒスチジンタグを有する組み換えＧＰＣＲを固定化するのに用いることができる。

図１５Ａ、１５Ｂおよび１５ＣはＧＰＣＲの配向固定化のためのガラスまたは金属表面の化学修飾を図解する。ＮＴＡ基またはＥＤＴＡ基を提示する表面は、ガラスまたは金属酸化物表面に対するシラン化学によって、または金被覆表面に対するチオール化学を経由して便利に得ることができる。これらの表面化学のための化合物は市販されている（たとえば、Ｎ−[（３−トリメトキシシリル）プロピル）プロピル]エチレンジアミントリ酢酸；Ｈｕｅｌｓ、Ｉｎｃ．）。

ＧＰＣＲをその細胞外領域を溶液に曝露して固定化するための代替の手法では、抗−Ｇタンパク質抗体を用いることができる。この手法は、Ｇタンパク質をヒスチジンタグ付きで発現する必要が無いという利点を有する。

あるいは、機能的分析のためのＧＰＣＲアレイの性能を改善するためには、ＧＰＣＲはその細胞内側を溶液に面して、また細胞外領域を基材に面して配向される。これは、たとえば基材表面を小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）といったレクチンで修飾することを含む、いくつかの方法によって達成することができる。これらの表面は、受容体のＮ−末端のグリコシル化部分、または細胞膜に存在する他の細胞表面部分を通じてＧＰＣＲを固定化するのに用いることができる。

ＧＰＣＲテーマアレイ：選択性スクリーニング
薬物候補化合物の、同じ器官、組織または単一の細胞さえの中の他のＧＰＣＲに対する標的ＧＰＣＲへの選択性は、医薬開発の間に考慮および観察すべき極めて重要な因子である。現在、ほとんどすべてのＨＴＳ技術は一度に１つの標的スクリーニングに関係している。ＧＰＣＲアレイはさまざまな受容体への複数の目的化合物の選択性を評価するのに用いることができる。本発明の１つの実施形態では、アレイはＧＰＣＲテーマアレイを作り、そこで表面上に配列した受容体はＧＰＣＲの単一またはいくつかの関連したサブファミリーの成員を含む（実施例３を参照）。

一部のＧＰＣＲおよびその突然変異はある種の腫瘍の進行に関係している。たとえば、ロドプシンのある種の突然変異は網膜色素変性症と関係している一方、バソプレッシンＶ２のある種の突然変異はＸ連鎖腎性尿崩症と関係している（非特許文献１４）。さらに、ある種のＧＰＣＲは好ましくは特定の型の組織に分布している。たとえば、ムスカリン性アセチルコリン受容体、ドーパミン２受容体、ヒスタミン２受容体、セロトニン４受容体およびプロスタグランジン受容体を含む一部の受容体は目立って胃腸系に分布する一方、セロトニン１Ａ／１Ｄおよび２Ａ／２Ｃ受容体、ニューロテンシン１および２受容体、オピオイド受容体（ミュー、デルタ、カッパ、ＯＲＬ−１）、およびドーパミン２／３受容体を含む一部の受容体は目立って中枢神経系に分布する（非特許文献１４）。同様に、一部の受容体は既知の生理的および薬理的機能と結びついている。たとえば、ケモカインに対するある種のＧＰＣＲはＨＴＶ感染のコファクターとして作用する（非特許文献１６；非特許文献１７）。さらに、セロトニン１Ａ、アデノシンＡ１／２Ａおよびアンギオテンシン受容体を含む一部の受容体は、不安および高血圧において重要な役割を果たす一方、オピオイド受容体、カルシトニン遺伝子関連ペプチド受容体およびニューロペプチドＦＦ受容体を含む一部の受容体は、と閏管理に関係している。これらの性質は、特異的な組織分布、または生理学および薬理学において特異的な役割のどちらかを有するＧＰＣＲのテーマアレイを製作するのに用いることができる。

アレイの作製
本発明のアレイはマイクロパターン技術を用いて作製する。そのような技術は当該分野でよく知られている。作製の好ましい方法においては、プローブの先端（「ピン」ともいう）を生体膜の溶液に浸す。先端を溶液から取り出し、先端に付着した溶液を得る。溶液を基材の表面に接触させ、それによって溶液を先端から表面へ移す。

本発明で用いる「ピン」はどのような形、大きさ、寸法でもよい。たとえば、ピンプリント過程は輪状ピン、四角ピン、または尖端ピン、などを使用することができる。別の実施形態では、直接接触プリント法は単一ピンプリントまたは複数ピンプリント、すなわち、１つの原料プレートを使用する単一ピンプリント法または任意の方式で並べた複数のピンの配列アレイを使用する複数ピンプリント法を用いることができる。

プリント器具はプリントヘッド、プレート、基材取り扱い部、ＸＹまたはＸＹＺ位置調整ステージ、環境制御部、機器制御ソフトウェア、試料追跡ソフトウェア、などを含みうる。そのような器具はたとえば、Ｃａｒｔｅｓｉａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ, Ｉｎｃ．の販売する管状ピンプリンターを含む。

行列からの各プローブが対応する原料ウェル、たとえばマイクロタイタープレートからのウェル、に適合するように配列されたプローブの行列を有するプリント用プローブアレイが、高密度アレイを形成するために好ましくは用いられる。

本発明の生体膜のアレイを製造するためにさまざまな他の技術もまた用いることができる。たとえば、本発明のアレイはマイクロスタンプ（特許文献２）、ＰＤＭＳスタンプを用いたマイクロコンタクトプリント（非特許文献１２）、キャピラリー分注器具（特許文献３）およびマイクロピペッティング器具（特許文献４）を用いて製造することができる。生体膜のアレイを用いた放射能分析のためには、アレイを製作するためにはピペットを基礎とした液体移送技術が好ましく、何故ならそのような技術は数百ミクロンから数ｍｍまでの範囲の、より大きなサイズのスポットを作ることができるからである。

アレイの用途
本発明はまた生体膜アレイを使用する方法も提供する。本発明のアレイは特に医薬開発、医療診断学、プロテオミクスおよびバイオセンサーにおける使用に適している。アレイに送達される試料は典型的には液体である。

幅広い検出方法が本発明の方法に適用可能である。目的通りに、検出は定量的、半定量的、あるいは定性的でありうる。本発明のアレイは可視または赤外範囲の吸収、化学発光、および蛍光（蛍光寿命、蛍光偏光、蛍光相関分光（ＦＣＳ）、および蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を含む）といった光学検出法と適合させることができ、さらに、導光板（特許文献５および特許文献６）、表面プラズモン共鳴、表面電荷センサー、表面力センサー、およびＭＡＬＤＩ−ＭＳといったものに基づく他の検出様式も本発明の多くの実施形態に適合する。

これらのアレイに用いる分析法は、直接的、非競合的分析法または間接的、競合的分析法であることができる。非競合的方法では、プローブ上の結合部位に対する親和性を直接測定する。この方法では、プローブ上の結合部位への親和性は直接測定される。この方法では、マイクロスポット中のタンパク質は分析対象（「標的」）に直接曝露される。分析対象は標識されているかまたは非標識であることができる。分析対象が標識されている場合は、検出方法は蛍光、発光、放射能、などを含みうる。分析対象が非標識である場合は、結合の検出はプローブ表面の何らかの物理的性質の変化に基づくことになる。この物理的性質は、屈折率、または電気インピーダンスであることができる。非標識標的の結合の検出はまた質量分析によって実施できる。競合法では、結合部位の占有は間接的に測定される。この方法では、アレイのタンパク質はプローブアレイに対する標識同族リガンドと、非標識標的とを含む溶液に曝露される。標識同族リガンドと非標識標的とはプローブタンパク質マイクロスポット上の結合部位を奪い合う。プローブマイクロスポットに対する標的の、同族リガンドと相対的な親和性は、標識リガンドの結合量の減少によって測定される。標的の結合の検出はまた、サンドイッチアッセイを用いて実施することもでき、そこでは最初の結合後、たとえば結合した標的に対して親和性を有する標識抗体といった分子を含む第二の溶液と共にアレイをインキュベートし、標的の結合は標識抗体のプローブ−標的複合体への結合の量に基づいて測定される。標的の結合の検出は置換分析によって実施することができ、そこでは標識リガンドを最初に結合させた後、アレイを目的の化合物を含む第二の溶液とインキュベートする。結合能力と標的の結合量とは、プローブアレイ中の結合前の標識リガンドの数の減少に基づいて測定される。

本発明の別の側面は、標的試料の特定の成分と結合する能力について複数のタンパク質をスクリーニングするための方法を提供する。この方法は、スクリーニングするタンパク質を含む本発明のアレイへ試料を送達することと、各マイクロスポットに保持されたその特定の成分の存在または量を、直接または間接に、検出することとを含む。好ましい実施形態では、本方法はさらに検出工程の前にアレイを洗浄してアレイから試料の結合していないかまたは非特異的に結合した成分を除去する中間工程を含む。別の実施形態では、本方法はさらに少なくとも１個のマイクロスポットに保持された特定の成分をさらに特徴づけする追加の工程を含む。

本発明の別の実施形態では、下記の工程を含むタンパク質−タンパク質結合相互作用を分析する方法を提供する：最初に、本発明のアレイへの結合について分析する少なくとも１種類のタンパク質を含む試料を送達する；それから、各マイクロスポットに保持された、試料からのタンパク質の存在または量を、直接に、または間接に、検出する。

本発明の別の実施形態は、アレイ上のタンパク質の１またはそれ以上と反応することのできる試料中の、複数の分析対象の存在について平行して分析を行う方法を提供する。この方法は、試料をアレイへ送達し、そして各マイクロスポットでの分析対象とタンパク質との相互作用を検出することを含む。

本発明のさらに別の実施形態では、アレイ上のタンパク質の１またはそれ以上と結合することのできる試料中の、複数の分析対象の存在について平行して分析を行う方法は、液体試料をアレイへ送達し、各マイクロスポットに保持された分析対象の存在または量を、直接に、または間接に、検出することを含む。好ましい実施形態においては、本方法はさらに、アレイを洗浄してアレイから試料の結合していないかまたは非特異的に結合した成分を除去する工程を含む。

アレイは、分析されている複数の分析対象が生物における疾患状態または秒検体の存在を示す場合、診断方法として用いることができる。そのような実施形態では、アレイへ送達される試料はその時、典型的には生物の体液または細胞抽出液に由来する。

薬物候補を直接、アレイ上の複数のタンパク質と結合するか、でなければ相互作用する能力についてスクリーニングする場合、アレイは医薬スクリーニングに用いることができる。あるいは、複数の薬物候補を、アレイ上の複数のタンパク質と結合するか、でなければ相互作用する能力について平行してスクリーニングすることができる。薬物スクリーニング過程は選択的に、少なくとも１つの分析対象、または試料の成分と、アレイ上の１またはそれ以上のタンパク質との結合といった相互作用について、薬物候補の存在下または非存在下の両方で分析することを含む。これは薬物候補を、最初に分析されていた１または複数の相互作用の阻害剤として作用する能力について調べる効果がある。

一般に、アレイのタンパク質に結合するＧタンパク質を含む溶液の送達について選択的に、その前に、または後に、あるいは同時に、ブロック溶液の送達を行うことができる。ブロック溶液はアレイ上の非特異的結合部位に付着するタンパク質または他の部分を含む。たとえば、ウシ血清アルブミン、粉乳、ポリグルタミン酸、ＤＮＡ分子またはレクチンをブロック試薬として用いることができる。

ＧＰＣＲマイクロアレイの機能性分析
本発明のアレイは、ＧＰＣＲの活性化およびコエフェクターを同定するためのマイクロアレイに基づく不均一性分析に用いることができる。この用途のためには、分析では、標識された加水分解されないＧＴＰ（たとえば、放射性[^３５Ｓ]ＧＴＰγＳまたはその蛍光類縁物質（たとえば、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＧＴＰγＳ））を用いてＧＴＰγＳのｉ）過剰発現したＧＰＣＲおよびＧタンパク質を含む細胞膜調製物；またはｉｉ）目的の受容体およびそのコエフェクターを含む再構成された小胞／ミセル、のアレイへのリガンド刺激結合を観察する。この手法はＧＰＣＲに対する作用剤の高処理量でのスクリーニングを可能にするだけでなく、ＧＰＣＲのコエフェクター（たとえば、結合Ｇαタンパク質）の同定も可能にする。

作用剤の結合時に、ＧＰＣＲは以前は覆われていたＧタンパク質結合部位を露わにする立体構造変化を経験し、それによってヘテロ三量体Ｇタンパク質との相互作用を促進する。この相互作用はグアニンヌクレオチド交換を触媒し、結果としてＧタンパク質のサブユニットへのＧＴＰ結合を生じる。ＧＴＰ結合はＧβγサブユニットからのＧα−ＧＴＰ複合体の解離に繋がる。Ｇαサブユニットの固有のＧＴＰアーゼ活性の結果として、結合したＧＴＰはＧＤＰへ加水分解され、それによって系をヘテロ三量体休止状態へ戻す。

ＧＴＰγＳはＧＴＰの加水分解されない類縁物質である。放射性および蛍光ＧＴＰγＳの両方の結合は、均一な、溶液に基づく分析において、作用剤結合ＧＰＣＲによるＧタンパク質活性化を測定するのに広く用いられてきている。

組織および細胞型でみられるＧタンパク質のさまざまな群がある（Ｍｏｒｒｉｓ,Ｃ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．）。Ｇαタンパク質は、生物学的機能とアミノ酸相同性に基づいて４つのファミリーに分類することができる（Ｇ_ｓ、Ｇ_ｊ、Ｇ_ｑおよびＧ_{１２／１３}）。さらに、少なくとも５つのＧβと７つのＧγタンパク質が文献で報告されている。ヘテロ三量体Ｇタンパク質はしたがって、３つのサブユニットの組み合わせの複雑さを考慮すると、極めて多様である。ＧＰＣＲは少なくとも１つのＧαタンパク質と結合することが知られている（Ｍｏｒｒｉｓ,Ｃ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．）。さらに、ほとんどすべての細胞株がすべてでなく一部のＧαタンパク質を優先的に発現する。このことは、ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質経路へのリガンドの作用を分析し正規化することの複雑性を増大させる。たとえば、ＧＰＣＲコエフェクターが目的のＧＰＣＲを過剰発現している任意の細胞株で存在しない場合、リガンドスクリーニング分析の結果は無効である。

Ｇαサブユニットのリガンド誘導活性化の非存在下では、ＧＴＰγＳおよびその類縁物質は、Ｇαタンパク質の成員と、異なる親和性で結合する。たとえば、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＧＴＰγＳは不活性化された形のＧタンパク質Ｇ_０、Ｇ_ｓ、Ｇ_ｉ１、およびＧ_ｉ２とそれぞれ６、７０、１５０および３００ｎＭのＫｄで再構成小胞系で結合する（ＭｃＥｗｅｎ, Ｄ．Ｐ．, ｅｔ ａｌ．）。このことは、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＧＴＰγＳを用いる蛍光強度（または[^３５Ｓ]ＧＴＰγＳを用いる場合は放射能カウント）に異なる基底ラインを生じさせる。しかし、作用剤誘導Ｇα活性化はＧＴＰγＳの結合を大きく促進する。

本発明は以下を与える：（１）（平面アレイ、またはマイクロプレートアレイ中の）固定化ＧＰＣＲへの結合に関する作用剤または阻害剤として化合物をスクリーニングするための標識ＧＴＰ類縁物質の使用法；（２）目的の受容体を含む特定の生体膜を用いてコエフェクターの存在下または非存在下でのＧＰＣＲアレイの製作；および（３）基底線と、ＧＰＣＲのリガンド誘導活性化と引き続き起こるＧαサブユニット活性化時のシグナルのパーセント増加とを観察することによって、ＧＰＣＲの結合Ｇαタンパク質を同定するための、蛍光ＧＴＰγＳと組み合わせたＧＰＣＲマイクロアレイの使用法。ＧＰＣＲをＧ_１６タンパク質（共通Ｇタンパク質アダプター／コエフェクター）と同時発現している細胞からの膜調製物、またはＧＰＣＲおよびＧ_１６タンパク質と共に再構成した脂質小胞を、本発明の分析に使用することができる。さらに、たとえばファージ提示技術によって生成したリガンドの組み合わせライブラリもまた、本発明の分析に使用することができる。

β−アレスチンまたはその突然変異に関連する別の分析もまた、作用剤によって活性化されたアレイ中の受容体を同定するのに用いることができる。生細胞におけるＧＰＣＲの脱感作に関わる２段階機構が存在することが報告されている（Ｇｕｒｅｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．, １９９７；Ｂａｒａｋ, ｅｔ ａｌ．, １９９７；Ｋｏｖｏｏｒ, ｅｔ ａｌ．, １９９９）。作用剤の結合時に、受容体は活性化され、次いでＧタンパク質共役受容体キナーゼ（ＧＲＫ）によってリン酸化される。アレスチンは活性化されリン酸化された受容体と結合し、それによって受容体のＧタンパク質との相互作用をブロックする。アレスチンのＧＰＣＲへの結合にはＧＰＣＲの活性化とリン酸化の両方が必要である。しかし、ある種のアレスチン突然変異、たとえばβ−アレスチン突然変異（Ａｒｇ１６９ＧｌｕおよびＡｓｐ３８２Ｔｅｒ）は構造活性化されており、またある種の作用剤活性化受容体とリン酸化に無関係に結合することができる（Ｋｏｖｏｏｒ, ｅｔ ａｌ．, １９９９）。したがって、たとえば天然ペプチドといったリガンドの受容体に対する生物学的機能を、アレスチンまたはその突然変異の結合をＧタンパク質共役受容体キナーゼ（ＧＲＫ）の存在下または非存在下で観察することによって測定することができる。アレスチンおよびその突然変異は、同位体、蛍光色素、またはビオチンで標識することができる。非標識アレスチンおよびその突然変異もまた、たとえば表面プラズモン共鳴といった無標識検出法によって使用し検討することができる。受容体共役Ｇタンパク質を標的とするＧＴＰγＳ結合分析と比較して、アレスチン結合分析はより簡単で直接であると考えられる。

ＧＰＣＲ−リガンドスクリーニングのためのマイクロプレートに基づく不均一分析
本発明の生体膜アレイはマイクロプレートを用いて製作することができる。受容体がその生物学的機能を保持するように受容体をマイクロプレート表面上に固定化するため、マイクロプレートの少なくとも底面は修飾されている。ある実施形態ではウェル全体の表面を修飾するのが望ましい。修飾に応じて、マイクロプレートの底はガラス、高分子、または金を基礎としたものとすることができる。いくつかの異なる表面化学を修飾に用いることができ、たとえば下記が含まれる：
（１）シラン化表面。たとえば、ガラス底を有するマイクロプレートは３−アミノプロピルトリエトキシシランといったアミン末端を有するシランの気相蒸着法または溶液相析出法を用いて修飾することができる。金で被覆したマイクロプレートはアルカンチオラートのＳＡＭのシラン化を用いて修飾することができる。ポリスチレン底を有するマイクロプレートは、これらの表面をガンマ線で活性化後に気相蒸着法または溶液相析出法を用いて、またはこれらの表面へのシランの架橋を用いてシラン化することができる。

（２）小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）被覆表面。本被覆は通常２工程で実施される。第一工程はイソシアナートプロピルシランを用いたマイクロプレートのシラン化、または金マイクロプレート上のアルカンチオラートＳＡＭの形成および活性化を含む。第二工程はＷＧＡの非共有または共有結合を含む。ＷＧＡ被覆表面は受容体のＮ−末端のグリコシル化部分を通じたＧＰＣＲの固定化に用いることができる。

（３）抗体被覆表面。抗−ＧＰＣＲ抗体または抗−Ｇタンパク質抗体もまたマイクロプレートの底に結合させ、ＧＰＣＲ固定化に用いることができる。

本発明のマイクロプレートアレイを製作するためには、ＧＰＣＲを含む少量の生体膜を、たとえばＣａｒｔｅｎｓｉａｎ ｓｙｎＱｕａｄディスペンサーを用いて、マイクロプレートに供給する。本発明のＧＰＣＲマイクロプレートは、競合結合分析および機能分析を含む上述した不均一分析で用いることができる。

以下で、本発明を記載する限定されない実施例によって本発明を説明する。

実施例１
材料
ヒトβ−アドレナリン受容体サブタイプ１（β１）およびドーパミン受容体サブタイプ１（Ｄ１）の膜調製物はＢｉｏｓｉｇｎａｌ Ｐａｃｋａｒｄ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ, Ｃａｎａｄａ）より購入した。これらの受容体結合膜は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４および１０％グリセロールを含む緩衝溶液中に懸濁されて販売されていた。ヒトクローン化ニューロテンシン受容体サブタイプ１（ＮＴ１Ｒ）およびＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ−ニューロテンシン（ＢＴ−ＮＴ）はＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ （Ｂｏｓｔｏｎ, ＭＡ）から購入し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および１０％スクロースを含む緩衝溶液中の膜結合懸濁液として受領した。ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ−ＣＧＰ１２１７７（ＢＴ−ＣＧＰ）およびＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＳＣＨ２３３９０（ＢＦ−ＳＣＨ）はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ, ＯＲ）から購入した。ＣＧＰ１２１７７およびＳＣＨ２３３９０はＴｏｃｒｉｓ Ｃｏｏｋｓｏｎ, Ｉｎｃ （Ｂａｌｌｗｉｎ, ＭＯ）から購入した。ニューロテンシンはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ, ＭＯ）から購入した。Ｃｏｒｎｉｎｇ ＣＭＴ−ＧＡＰＳスライドは受領時の状態で使用した。蛍光標識リガンドおよびニューロテンシンはＤＭＳＯに溶解し−２０℃にて保存した。使用前に、リガンド溶液は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ７．４および０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）から成る結合緩衝液を用いて希釈した。

１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−２−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、Ｌ−α−ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、Ｌ−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、および卵ホスファチジルコリン（卵ＰＣ）、はＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ, ＡＬ）から購入した。ＦＩＴＣ−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＦＩＴＣ−ＤＨＰＥ）およびテキサスレッド−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＴＲ−ＤＨＰＥ）はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．から購入した。

ＧＰＣＲおよび脂質プリント
管状ピン（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ）を装備した自動ピンプリンター（Ｍｏｄｅｌ ＰＳ ５０００, Ｃａｒｔｅｓｉａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて、ＧＰＣＲまたは脂質の複数アレイを各スライド（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＣＭＴ−ＧＡＰＳスライド）にプリントした。各３Ｘ３または５Ｘ５要素のアレイは隣接するアレイから少なくとも６ｍｍ離した。ＧＰＣＲを含む膜調製物は、メーカーから受領したままでさらに精製または希釈を行わずにプリントに使用した。プリント後アレイを湿潤室内で室温にて１時間インキュベートし、その後リガンド結合実験に使用した。より長期の保存には、アレイはデシケータ内で４℃にて保存した。

リガンド結合
任意のスライド状の各アレイはリガンドを含む緩衝溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ７．４、０．１％ＢＳＡ）１０μＬと共に１時間インキュベートした。インキュベート後、真空ポンプに接続したピペットチップを用いて溶液を注意深く除去した。スライドを水で簡単に洗浄し窒素気流下で乾燥した。スライドをＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ａスキャナ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ, Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ, ＣＡ）でイメージングした。

蛍光褪色後の蛍光の回復（ＦＲＡＰ）
２％（ｍｏｌ％）テキサスレッドＤＨＰＥと混合した１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−２−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）の小さな１枚膜リポソーム（ＳＵＶ）を、緩衝液中の脂質（１ｍｇ／ｍＬ）懸濁液を超音波処理して生成した；これらの小胞を次いで基材と共にインキュベートした。注意深く徹底的に洗浄後、支持された脂質膜がこれらの表面上に形成された。ＦＲＡＰ実験は裸のガラスおよびＧＡＰＳスライド上のこれらの支持された脂質膜上で、ＣＣＤ検出器（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を装備したＯｌｙｍｐｕｓ ＡＸ７０エピ蛍光顕微鏡を用いて実施した。

結果および考察
ＧＰＣＲアレイの製作と保存
ＧＰＣＲのアレイを管状ピンプリンターを用いて従来の自動ピンプリンターによって、実験の項に記載した通り製作した。Ｂｏｘｅｒと共同研究者は膜を固体支持体上へ水中で移すことの重要性を記載している；我々は、しかし、ピン上を濡らす脂質溶液が水中で一部がピンから解離しプリント中にクロスコンタミネーションの原因となることを危惧した。さらに、市販プリンターのスライドラックは水中でのプリント用には設定されていない。既製のプリント装置を膜タンパク質アレイの製作に用いることができることは、生物分析用途にこれらのアレイが幅広く製作および開発されることに向けた重要な一歩である。

プリントされたＧＰＣＲタンパク質の安定性を調べるため、アドレナリンβ１受容体のアレイを標的としてプリントした。我々は最初にこれらのアレイの保存を高湿度下でさまざまな温度（室温から−８０℃）にて調べた。これらの高湿度条件は、膜タンパク質複合体の構造を維持するために水系環境の重要性を示唆した多数の文献があったために選択された。（非特許文献１８；非特許文献１９）。アレイの機能的安定性は蛍光標識同族リガンドおよび阻害剤を用いた結合分析で、実験の項で記載した手順を用いて評価した。一週間の保存後にはリガンドのアレイへの結合は観察されなかった（図２Ａ）。したがって、我々はこれらのアレイの安定性を乾燥下で試験することにした。我々は乾燥がプロテアーゼによって起こりうる分解を減少させると考えた。新しい条件下で、プリントしたＧＰＣＲアレイを有するスライドを室温にて２時間風乾し、窒素中でスライドホルダーに入れ、デシケータ内で４℃にて暗所で保存した。我々の観察は、２ヶ月の期間にわたって、アドレナリンβ１受容体はリガンド結合親和性を保持したことを示した（図２Ｂ）これらの安定性試験は、ＧＰＣＲアレイの製造にとって意義深い、実現可能性の画期的な出来事である。

ＧＡＰＳ基材上の膜アレイの機械的安定性
我々は膜タンパク質アレイのための頑健な結合分析の開発に関心があった。Ｂｏｘｅｒおよび共同研究者は、裸のガラス基材上に吸着された脂質は、空気−水界面を通って引き出したとき自発的に脱離したことを報告している（非特許文献１９）バイオアッセイでは手順でしばしばスライドを溶液から引き出す必要があり（たとえば、連続的浸漬による洗浄の間）、我々は、この挙動がバイオアッセイのための膜タンパク質アレイの使用を制限すると考えた。我々はしたがって、機械的に安定な支持された膜の吸着を支持する表面を調べた；安定性についての我々の判定基準は、空気−水界面を通って引き出したとき、支持された膜が吸着されたまま残ることであった。試験した数種類の表面のうち、ＣＭＴ−ＧＡＰＳ表面が最も安定して支持された脂質を与えた。図３Ａは空気−水界面を通って引き出し、水に浸漬し、乾燥し、再び水中に浸漬した、緩衝液に浸漬したフルオレセイン−ＤＨＰＥを添加したＤＰＰＣ／ＤＭＰＣから成る支持された膜のアレイの蛍光画像を示す。我々はこれらの連続した浸漬と引き出しを通じて、これらの脂質マイクロスポットの蛍光強度に何ら低下を認めなかった；これらの結果は、結合した脂質は安定であることを示す。図３Ｂは卵ＰＣから成る脂質についてのデータを示す；連続した浸漬と引き出しに供された場合、これらの脂質のアレイもまた安定である。室温で、ＤＭＰＣ／ＤＰＰＣ脂質はゲル相にあり、一方で卵ＰＣは液相にある。これらの実験は、支持された脂質アレイが、それらがゲル相にあるか液相にあるかにかかわらず、ＧＡＰＳ被覆基材上で機械的に頑健であることを実証する。

我々はまた、ＧＡＰＳ基材上に吸着された脂質が広範囲の横方向の流動性を有するかどうかにも関心を持った。この流動性は天然の生体膜の重要な特徴であり、（たとえば、表面でのリガンドに導かれる受容体二量化、および／またはリガンドに導かれる受容体−Ｇタンパク質相互作用といった過程にとって）生理的に意義深いと考えられている性質である。この流動性が、支持された生体膜上でのリガンドスクリーニングに必要かどうかは不明であるが、我々はそれでもなお、支持された脂質の上記の高い機械的安定性が必然的に、脂質が横方向に流動的でないことを示唆するかどうか調査したかった。我々は蛍光標識ＤＬＰＣ脂質から小胞を作製し、ＧＡＰＳ基材上に小胞融合によって、支持された脂質を形成した。蛍光顕微鏡を用いて、我々は、支持された脂質上の褪色したスポットの蛍光の回復をＦＲＡＰ実験で観察した。ＤＬＰＣ小胞を用いた裸のガラス上での比較実験は、回復はＧＡＰＳ基材で大幅に遅かったことを示唆した。これらの実験は、ＧＡＰＳ基材上の支持された脂質に伴っていくらかの横方向の流動性があることを示唆する。ＧＡＰＳ基材に関する我々の観察は、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌによって報告された、高分子クッション上の支持された膜のより低く限られた移動性と合致する（非特許文献２０）。

ＧＰＣＲアレイへの生体特異的結合
ＧＰＣＲのアレイは上記の通り、管状ピンプリンターを用いることによって製作された。アレイは次いで直接分析または競合分析で、蛍光標識同族リガンドとインキュベートした。図４は１枚のＣＭＴ−ＧＡＰＳスライド上にプリントした５つの別々のアレイの彩色蛍光画像を示す；個々のアレイそれぞれが５連のスポットを含む３列を含む；各列は異なるＧＰＣＲタンパク質を表す。これらのタンパク質は、左から右へ、それぞれアドレナリン受容体（β１）、ニューロテンシン受容体（ＮＴＲ１）およびドーパミン（Ｄ１）受容体である。第１のアレイ（図４Ａ）は結合緩衝液だけとインキュベートした。予想される通り、蛍光は観察されなかった。第２のアレイ（図４Ｂ）は蛍光標識ニューロテンシン（ＢＴ−ＮＴ、２ｎＭ）を含む緩衝液とインキュベートした。画像はＮＴＲ１に対応するアレイだけが強い蛍光シグナルを見せることを示す；この観察は、ＢＴ−ＮＴのＮＴＲ１への結合は選択的であることを示唆する。その相互作用の特異性はさらに、ＢＴ−ＮＴ（２ｎＭ）、ＣＧＰ１２１７７（１ｎＭ）（図４Ｃ）、ＳＣＨ２３３９０（１ｎＭ）（図４Ｄ）、またはニューロテンシン（１ｎＭ）（図４Ｅ）のいずれかとを含む溶液とアレイをインキュベートすることによって実証された。図４Ｂと比較して、ＮＴＲ１に対応するスポットの強度に図４Ｃおよび４Ｄでは目立った減少は見られない。ＣＧＰ１２１７７およびＳＣＨ２３３９０はＮＴＲ１と結合しない；ゆえに、それらを結合溶液に添加しても、我々の観察と合致して、ＢＴ−ＮＴのＮＴＲ１との相互作用を阻害しない。ニューロテンシンはＮＴＲ１の同族リガンドであり、ゆえに、それはＮＴＲ１アレイ上の結合部位を奪い合う。図４Ｅでは、ニューロテンシンをＢＴ−ＮＴに対して５００倍過剰に含む溶液とアレイをインキュベートした；この比率では、ニューロテンシンはＢＴ−ＮＴのＮＴＲ１への結合を完全に阻害すると予想される。我々はＮＴＲ１アレイに対応するシグナルを観察しなかった；ゆえに、ニューロテンシンはＮＴＲ１への結合を特異的に阻害することができる。これらの実験は、リガンドと阻害剤の結合を試験する分析がＧＰＣＲアレイを用いて実現可能かどうかを実証する。

用量依存結合
我々は、プリントしたＧＰＣＲアレイの、異なる濃度の同族リガンドへの反応を調べている。図５ＡはＢＴ−ＮＴで処理したニューロテンシン受容体のアレイの蛍光画像を示す；データは、より高い濃度の蛍光標識リガンドで処理された場合、アレイの蛍光強度が増加することを示す。ＢＴ−ＮＴのＮＴＲ１アレイへの結合については、検出限界は０．１−０．２ｎＭＢＴ−ＮＴであった。これらの結果は、この系については蛍光標識リガンドを利用したＧＰＣＲアレイのダイナミックレンジは〜２ｌｏｇｓであることを示唆する。図ＳＢはｃｙ５−標識アンタゴニストＤのガラニン受容体アレイへの結合についてのデータを示す；画像はマイクロスポットの蛍光強度はリガンドの濃度に依存することを示す。

蛍光リガンドのアレイへの結合の阻害は、阻害剤および標識リガンドの相対濃度と、それらの各核の解離（Ｋｄ）に依存する。図６はＢＴ−ＮＴ（１ｎＭ）および異なる濃度のニューロテンシン（０−２５０ｎＭ）を含む溶液とインキュベートしたＮＴＲ１アレイの蛍光画像を示す。データは、ニューロテンシンの濃度が増加すると、蛍光が減少することを示す。蛍光強度対濃度のプロットを図７に示す；このプロットに基づき、我々は阻害定数（Ｋｊ）を〜２．５ｎＭと推定する。この値は蛍光偏光実験から得られたニューロテンシンについてのＫｊの報告値（２ｎＭ）と合致する。これらの実験は、ＧＰＣＲアレイを用いてリガンドと阻害剤の結合定数の推定値を得ることが可能であることを実証する。

実施例２
小麦胚芽凝集素表面修飾
スライドガラス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）は使用前にピラニアエッチング液（濃硫酸：３０％過酸化水素、７：３）に３０分間浸漬後蒸留水ですすいで洗浄した。スライドガラスは３−イソシアナートプロピルトリエトキシシラン５％を含むエタノール溶液に１時間浸漬し、次いでエタノールと水ですすぎ、最後に窒素気流下で乾燥した。

シラン化スライドは直ちに小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）結合に使用した。結合はスライドを１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ７．５に溶解した０．１ｍｇ／ｍＬ ＷＧＡを含む溶液に浸漬して行い、次いで水ですすぎ乾燥した。ヒトβ−アドレナリン受容体サブタイプ１（β１）はＢｉｏｓｉｇｎａｌ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ, Ｃａｎａｄａ）から購入した。受容体結合膜は最初は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２および１０％グリセロール、ｐＨ７．４に懸濁されており、さらに処理を行わずに直接プリントに使用した。β１受容体の８つの別々の格子を、単一のＷＧＡ表面上に管状ピンプリンター（Ｍｏｄｅｌ ＰＳ５０００ｍ Ｃａｒｔｅｓｉａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いてプリントした。プリントの１時間後、各格子をさまざまな濃度のＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ−ＣＧＰ１２１７７を含む別々の溶液と共に、１０μＭプロプラノロールの存在下および非存在下でインキュベートした。６０分間のインキュベート後、スライドをすすぎ、乾燥し、ＧｅｎｅＰｉｘスキャナのＣｙ３チャンネルでイメージングした。結果は図８Ａおよび８Ｂに図解する。

実施例３
ファミリー特異的アレイ
アドレナリン受容体という同一のファミリーに属する３種類の受容体を同じ格子の中に配列し、この格子の複製を１つのスライド上に配列した。受容体はそれぞれβ１、β２およびα２Ａであった。ＣＧＰ１２１７７はβ１／β２アンタゴニストで、またβ３部分作用剤であることが報告されている。アレイは５ｎＭ ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ−ＣＧＰ１２１７７と共にさまざまな濃度のＩＣＩ１１８５５１の存在下および非存在下でインキュベートした。図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃに図解する通り、β１およびβ２受容体と対応するスポットだけが明るい。１０ｎＭ ＩＣＩ１１８５５１（選択的β２作用剤）の存在下で、β２受容体の蛍光強度は減少し、一方でβ１受容体の強度はほぼ同じレベルに留まる。しかし、ＩＣＩ１１８５５１の濃度が５００ｎＭに上昇すると、β１の蛍光強度は劇的に低下し、一方でβ２の強度は１０ｎＭ ＩＣＩ１１８５５１の存在下で観察された強度と同様である。これらの結果は、ＩＣＩ１１８５５１はβ１およびβ２受容体の両方との結合で、しかしβ２とのほうがより高い親和性でＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ−ＣＧＰ１２１７７と競合することができること、およびＧＰＣＲテーマアレイを用いてβ１およびβ２受容体に対するＩＣＩ１１８５５１の選択性を識別できることを説明する。

実施例４
ＧＰＣＲ固定化のための金表面上のアルカンチオラートのアミノシラン化ＳＡＭ
実験の詳細
表面の調製
顕微鏡用金被覆スライド（１０ｎＭ Ｃｒ接着層、１００ｎｍＡｕ）はＥｖａｐｏｒａｔｅｄ Ｍｅｔａｌ Ｆｉｌｍｓから購入し、使用前にピラニアエッチング液（濃硫酸：３０％過酸化水素、７：３）に３０秒間浸漬後蒸留水で徹底的にすすいで洗浄した。１１−メルカプトウンデカン酸（ＭＵＡ）または１１−メルカプトウンデカノール（ＭＵＤ）のＳＡＭは金スライドをチオールの１ｍＭエタノール溶液に少なくとも１時間浸漬することによって形成した。ＭＵＡ ＳＡＭのカルボン酸基は、試料を３０分間、７５ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）および１５ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）を含む蒸留水溶液中で反応させることによって、活性エステルに変換した。この活性化工程は、アミノ末端を有するシランの結合に、必要ではないが好ましいことが分かった。ＭＵＤおよびＮＨＳ−エステル修飾ＭＵＡのＳＡＭのシラン化は、スライドを一時間、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）の５％（ｖ／ｖ）トルエン溶液に浸漬することによって達成された。試料はその後、トルエンに５分間浸漬し、エタノールですすぎ、そして乾燥した。

ＧＰＣＲアレイ製作
ＧＰＣＲのアレイは、管状ピン（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ）を装備したＣａｒｔｅｓｉａｎプリンターを用いてＡＰＴＥＳシラン化金表面上にプリントした。ヒトβ−アドレナリン受容体サブタイプ１（β１）の膜調製物はＢｉｏｓｉｇｎａｌ Ｐａｃｋａｒｄ （Ｍｏｎｔｒｅａｌ, Ｃａｎａｄａ）から購入した。これらの受容体結合膜は１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４および１０％グリセロールを含む緩衝液に懸濁されて販売されており、プリントに直接用いられた。プリント後、アレイを２０μＭ非標識ＣＧＰ１２１７７、プロプラノロール、またはベタキソロールの非存在下または存在下で、５ｎＭ ＢＯＤＩＰＹ−テトラメチルローダミン（ＢＴ）標識ＣＧＰ１２１７７を含む溶液１０μＬとインキュベートした。これらの反応は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および０．１％ＢＳＡを含む結合緩衝液中で実施した。

表面プラズモン共鳴画像法
ＳＰＲ画像法のための基材は、ＳＦ−１０スライドガラス（１８ｍｍ×１８ｍｍ、Ｓｃｈｏｔｔ Ｇｌａｓｓ）上の１ｎｍのＣｒ接着層と４５ｎｍの金（金９９．９９％、粒状、Ｋｕｒｔ Ｊ． Ｌｅｓｋｅｒ Ｉｎｃ．）の熱蒸発によって調製した。ヒトガラニン受容体サブタイプ１（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびβ−アドレナリン受容体サブタイプ１で、ＡＰＴＥＳで修飾したＭＵＤ ＳＡＭ上にアレイを形成した。試料はＳＦ−１０等辺プリズムに屈折率マッチング液（ｎ＝１．７３０、Ｃａｒｇｉｌｌｅ Ｌａｂｓ）を用いて結合し、次いでＳＰＲ Ｉｍａｇｅｒ装置（ＧＷＣ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に取り付けた。要約すると、この機器は平行白色光源、帯域通過干渉フィルター（７９４ｎｍ±１ｎｍ）、回転ステージ、試料台、フローセル、および８ビットＣＣＤカメラから成る。ＣＣＤカメラレンズは６．３Ｘ顕微鏡対物レンズ（Ｍｅｌｌｅｓ Ｇｒｉｏｔ）と交換した。アレイの最初の画像は結合緩衝液中で得られた。アレイを次いでガラニン（５ｎＭ）の結合緩衝液溶液に曝露し、６０分間反応させ、その後、緩衝液で洗浄した。アレイの最後の画像を撮り、そして最後のＳＰＲ画像から最初のＳＰＲ画像を差し引いて差分ＳＰＲ画像を生成した。画像はＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）は米国国立衛生研究所にて開発された公有画像取り込みおよび解析プログラムであるＮＩＨ Ｉｍａｇｅの移植である；ｗｗｗ.ｓｃｉｏｎｃｏｒｐ.ｃｏｍを参照）を用いて解析した。

結果および考察
金表面上へのＧＰＣＲの結合のために２つの異なる表面化学が開発された（図１０Ａおよび１０Ｂを参照）。図式１（図１０Ａ）は３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）と１工程で反応する開始層として１１−メルカプトウンデカノール（ＭＵＤ）のヒドロキシル末端を有するＳＡＭを利用する。この反応はクロロ−およびアルコキシシランと、シリコンの表面水酸基とのよく知られた反応と類似している。シランの化学はアルカンチオラートのＳＡＭの修飾にも用いられてきている。たとえば、Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．は銅表面上のＭＵＤのＳＡＭを修飾するのにアルキルトリクロロシランを用い、銅の腐食耐性を向上させた。Ｓｕｎ ｅｔ ａｌは、金表面上のチオフェノールのヒドロキシルおよびアミン末端を有するＳＡＭと、ジメチルオクチルクロロシランとの気相反応を実証した。図式２（図１０Ｂ）は１１−メルカプトウンデカン酸（ＭＵＡ）の開始層を使用する。ＡＰＴＥＳとの反応の前に、このＳＡＭのカルボン酸基は最初に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）を用いて反応性のＮＨＳエステルに変換される。ＡＰＴＥＳ分子のネットワークはアミド結合形成によって共有結合で表面に固定される。ここで記載する作業については、予備的な偏光測定はＭＵＤおよびＭＵＡ表面上でそれぞれ〜４３Åおよび〜９６ÅのＡＰＴＥＳの厚みを示す。

最初の実験では、ヒトβ−アドレナリン受容体サブタイプ１（０１）ＧＰＣＲのアレイをＡＰＴＥＳ修飾された金表面上にプリントし、蛍光標識されたＣＧＰ１２１７７とインキュベートし、次いで蛍光スキャナを用いてイメージングした：図１１Ａ〜１１Ｃに示す通り、両方の化学で優れたスポットの形状と均一性を有し高いシグナル対ノイズ比を示すアレイが製造される。ＣＭＴ−ＧＡＰＳスライド上にプリントした同様なアレイと比較して、金表面上のこれらのアレイはバックグラウンド蛍光が〜４倍低い。このガラスおよび金基材上のバックグラウンド蛍光は、主に非特異的に結合した標識リガンドの量の少ないことの結果である。これらの非特異的に結合したリガンドは金表面と非常に近接している（<〜１００Å）ため、蛍光団からの蛍光は効率的に消滅する。同時に、脂質膜が蛍光団を金表面から少なくともさらに〜５０Å遠ざけるため、各アレイ位置の蛍光は消滅しない。金属の蛍光消滅特性はよく知られた現象であり、蛍光団と金属表面との間の距離の高感度の関数である（消滅量は（１／ｒ＾３）の距離依存を有する。）金属による蛍光消滅は、１５０Å未満の金属−蛍光団距離について非常に顕著であることが示されている。

修飾した金表面上のＧＰＣＲアレイへのリガンドの結合が特異的であることを実証するために、β１受容体の４連のアレイを同一のスライド上にプリントした。１つのアレイは標識ＣＧＰ１２１７７（５ｎＭ）を含む溶液とインキュベートした。残りの３つのアレイは、５ｎＭの標識ＣＧＰ１２１７７、および下記の各２０μＭの濃度の非標識阻害剤のうち１つを含む溶液とインキュベートした：ＣＧＰ１２１７７、プロプラノロール、ベタキソロール。各アレイについて、特異的阻害のパーセントを下記の式に従って計算した：
{１−（Ｓ_阻害／Ｓ_対照）}×１００
ここでＳ_阻害は標識ＣＧＰおよび非標識リガンドと共にインキュベートしたアレイの正味の蛍光シグナルで、Ｓ_対照は標識ＣＧＰだけと共にインキュベートしたアレイの正味の蛍光シグナルである。図１２はＭＵＡおよびＭＵＤのＳＡＭに結合したＡＰＴＥＳについて実施したこれらの実験の結果を示す。標識リガンドのβ１受容体への結合の強く特異的な阻害が３つすべての阻害剤について観察された；わずかに良好な阻害レベルがＭＵＡについて得られた。同様なレベルの阻害が、ＣＭＴ−ＧＡＰＳスライド上にプリントしたアレイについて観察された（データ記載せず）。

ＳＰＲ画像法を、非標識ガラニン（３．２ｋＤａ）の、ＭＵＤのＡＰＴＥＳ修飾されたＳＡＭ上にプリントされたガラニン受容体のアレイへの特異的結合を直接検出するのに用いた。この例では、３行のガラニン受容体と２行のβ１受容体を含めて５ｘ３アレイをプリントした。プリント後、表面をＳＰＲ画像処理機器に入れ、緩衝液で平衡化した。表面の最初のＳＰＲ画像が得られた。その後、ガラニンの溶液を注入し、アレイと共に１時間インキュベートした。インキュベート後、アレイは緩衝液の注入によって洗浄した。図１３は表面をガラニンの溶液に曝露した後のＳＰＲ画像から最初のＳＰＲ画像を差し引いて得られたＳＰＲ差分画像を示す。ガラニン受容体を含むアレイ位置について顕著な量の結合が観察された；対照的に、β１受容体を含むアレイ位置では結合は検出されなかった。

結論
我々は生物学的に活性な形でＧＰＣＲの固定化を可能にする金表面上の表面化学を開発した。金基材の使用の結果、ガラス基材上にプリントされたアレイと比較してシグナル対バックグラウンド比が向上した。これらの表面のもう一つの利点は、たとえばＳＰＲといった非標識技術による直接分析方式においてリガンドを検出する可能性である。本発明は金表面へのＧＰＣＲの固定化のためのＡＰＴＥＳの特定用途を記載するが、いろいろなシランによるアルカンチオールの化学修飾はさまざまなタンパク質の固定化のために広く有用であると予想される。

実施例５
機能分析
実験
ヒトオピオイド受容体サブタイプμおよびδ２はＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ （Ｂｏｓｔｏｎ, ＭＡ）から購入した。受容体結合膜は最初は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２および１０％スクロース、ｐＨ７．４に懸濁されており、それ以上の処理無しでプリントに直接用いられた。

μおよびδ２受容体の１０個の別々の格子を、１つの金スライド上の１１−メルカプトウンデカン酸のＡＰＴＥＳシラン修飾されたＳＡＭに管状ピンプリンター（Ｍｏｄｅｌ ＰＳ ５０００, Ｃａｒｔｅｓｉａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いてプリントした。格子の各列は１つの受容体の５連を含んだ。プリントの１時間後、各格子をさまざまな濃度のダイノルフィンＡ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．, Ｓｔ． ＬｏＵｉｓ, ＭＯ）を含む異なる溶液とインキュベートした。これらのインキュベートは５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ ７．４、３μＭ ＧＤＰ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｎＭ ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＧＴＰγＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を含む緩衝液中で実施した。９０分間のインキュベート後スライドを洗浄、乾燥し、ＳｃａｎＡｒｒａｙ５０００スキャナ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）のＦＩＴＣチャンネルでイメージングした。

結果および考察
ＧＰＣＲμおよびδ２−オピオイド受容体のアレイを、固定（２５ｎＭ）濃度のＢＯＤＩＰＹ−フルオレセイン標識ＧＴＰγＳを含む溶液と、リガンドであるダイノルフィンＡの存在下および非存在下でインキュベートした。図１４Ａ、１４Ｂおよび１４Ｃはこの実験の結果を示す。ダイノルフィンＡの存在下でインキュベートしたアレイは顕著により高い蛍光を示す。具体的には、基底レベル蛍光の増加はμ受容体について〜２．５倍（図１４Ｂを参照）、δ２受容体について〜１０倍（図１４Ｃを参照）であった。この結果は（ｉ）ダイノルフィンＡは細胞膜調製物中に存在するＧαタンパク質へのＧＴＰγＳの結合を促進する；および（ｉｉ）アレイ中のＧＰＣＲは機能を有することを示唆する。

実施例６
金表面上のアミノ末端を有するアルカンチオラートのＳＡＭ上の上皮成長因子受容体マイクロアレイ
実験
ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）はＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｂｏｓｔｏｎ, ＭＡ）から購入した。受容体膜調製物は、正常上皮細胞と比較してＥＧＦＲを〜１００倍過剰に発現するヒトＡ４３１細胞（上皮腫瘍細胞）に由来した。受容体結合膜は最初は５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、１３８ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、および１０％スクロース、ｐＨ７．７に懸濁されており、それ以上の処理無しでプリントに直接用いられた。上皮成長因子（ＥＧＦ）およびテトラメチルローダミン標識上皮成長因子（ＴＭ−ＥＧＦ）はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ, ＯＲ）から購入した。ＥＧＦおよびＴＭ−ＥＧＦは２ｍＭアジ化ナトリウムを含む蒸留水中で再構成し、−８０℃での長期保存のために１回分の使用量ずつに分割した。

上皮成長因子受容体の１４の別々の格子を、１１−メルカプトウンデシルアミンのＳＡＭで修飾された１つの金スライド上に管状ピンプリンター（Ｍｏｄｅｌ ＰＳ ５０００, Ｃａｒｔｅｓｉａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いてプリントした。各格子は２ｘ３連の受容体を含んだ。プリントと湿潤室内で１時間のインキュベートの後、各格子をさまざまな濃度のＴＭＲ−ＥＧＦを含む溶液と、ＥＧＦの非存在下および存在下でインキュベートした。これらのインキュベートは５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、１３８ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、０．２％ ＢＳＡ、ｐＨ７．７を含む緩衝液中で実施した：６０分間のインキュベート後、スライドを洗浄、乾燥し、ＧｅｎｅＰｉｘスキャナのＣｙ３チャンネルでイメージングした。

結果および考察
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は１７０ｋＤａの膜結合糖タンパク質で上皮細胞の表面に発現した受容体タンパク質チロシンキナーゼである。ＥＧＦＲは細胞周期調節分子の一種であるタンパク質チロシンキナーゼの成長因子受容体ファミリーの一員である。受容体はそのリガンド（ＥＧＦ、ＴＧＦ−α）が細胞外領域に結合する場合、二量化、立体構造変化、内在化を受ける。ＥＧＦは、表皮細胞およびその他の細胞の分裂を刺激する、５３アミノ酸のポリペプチドホルモンである。

ＥＧＦ受容体のアレイを、増加する濃度のＴＭＲ−ＥＧＦを含む溶液と、ＥＧＦ（５００ｎＭ）の非存在下（図１６Ａ）および存在下（図１６Ｂ）でインキュベートした。図１６ＣはこれらのＥＧＦＲアレイの平均蛍光強度のプロットを、ＴＭＲ−ｒＥＧＦの濃度の関数として、ＥＧＦの非存在下（菱形）および存在下（四角）で示す。５００ｍＭ ＥＧＦの存在下で観察されたシグナルの量は小さく、ＴＭＲ−ＥＧＦの非特異的結合が非常に低いことを示している。アレイへのＴＭＲ−ＥＧＦの特異的結合は図１６Ｄに示す通り、典型的な飽和曲線反応を示す。これらの結果は、（ｉ）アレイ中のＥＧＦＲへのＴＭＲ−ＥＧＦの結合は特異的で高い親和性がある；および（ｉｉ）アレイ中のＥＧＦＲは機能を有することを示唆する。

本発明は特定の実施例と関連して記載されてきている一方、本発明はさらに修飾が可能であると解される。したがって、本出願は、本開示からの当該分野の既知の方法または慣行に含まれる逸脱を含め、本発明の原理に一般的に従う本発明の任意の変化、使用、または適応を含むことを意図する。

他の実施例は請求項の中にある。

本明細書全体で引用された下記に示すものを含む文献は参照により本開示に含まれる。

参考文献

本発明の精神および範囲を離れることなくさまざまな修飾および変化を本発明に行うことができることは当該分野の熟練者に明らかとなる。したがって、付記する請求項およびその同等物の範囲に入る場合、本発明はこの発明の修飾および変化を含むことが意図される。

図１は本発明のアレイの平面図を示す図である。 図２は、ＢＴ−ＴＭＲ ＣＧＰ１２１７７溶液（５ｎＭ）とインキュベートしたβ−アドレナリン受容体（サブタイプ１）のマイクロスポットの１ｘ５アレイの蛍光画像を示す図である。 図３は本発明のマイクロアレイの蛍光画像を示す図である。 図４はＧＰＣＲアレイの蛍光画像を示す図である。 図５は本発明のアレイの蛍光画像を示す図である。 図６は、結合緩衝液中に固定濃度（１ｎＭ）のＢＴ−ニューロテンシンおよび異なる濃度の非標識ニューロテンシンを含む溶液中でインキュベートしたＮＴＲ１受容体アレイの蛍光画像を示す図である。 図７は、ＢＴ−ニューロテンシンの存在下においてニューロテンシンの濃度の関数としてＮＴＲ１受容体アレイの蛍光強度のプロットを示す図である 図８は、β−受容体アンタゴニストである１０μＭプロプラノロールの非存在下（図８Ａ）および存在下（図８Ｂ）で、Ｂｏｄｉｐｙ−ＴＭＲ ＣＧＰ１２１７７（ＢＴ−ＣＧＰ）の、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）表面上のヒトβ１受容体アレイとの結合の用量依存性結合を示す図である。 図９は、単一のサブファミリーに関して受容体に対する目的の化合物の選択性を差別化するのに用いるＧＰＣＲテーマアレイを説明する図である。 図１０は、金表面上のアルカンチオールの自己組織化単層膜（ＳＡＭ）のシラン修飾の化学的説明を示す図である。 図１１はＧＰＣＲアレイの蛍光画像を説明する図である。 図１２は、ＡＰＴＥＳ修飾された金表面上にプリントされたβ１アドレナリン受容体のアレイへの標識リガンドの結合の特異的阻害を示す図である。 図１３は、ＡＰＴＥＳ修飾された金表面上にプリントされたガラニン受容体およびβ１受容体のアレイへのガラニン結合のＳＰＲ画像検出を説明する図である。 図１４は、ダイノルフィンＡの存在下および非存在下でのミューおよびデルタ２受容体のアレイ（ＡＰＴＥＳ修飾された金表面上にプリント）の蛍光画像とヒストグラム分析を示す図である。 図１５は、ＧＰＣＲの配向固定化のためのガラスまたは金属表面の化学修飾を説明する図である。 図１６は、５００ｎＭ ＥＧＦの非存在下または存在下で、異なる濃度のテトラメチルローダミン−上皮成長因子（ＴＭＲ−ＥＧＦ）とインキュベート後の、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の７つの別々のアレイの蛍光画像、ＴＭＲ−ＥＧＦ濃度の関数としてのＥＧＦＲアレイの蛍光強度、および特異的結合に由来するＥＧＦＲアレイの蛍光強度を示す。

Claims (85)

1. 基材の表面に結合した複数の生体膜マイクロスポットを含むアレイ。
2. 前記生体膜マイクロスポットが膜結合タンパク質を含むことを特徴とする請求項１記載のアレイ。
3. 前記膜結合タンパク質がＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）であることを特徴とする請求項２記載のアレイ。
4. 前記生体膜マイクロスポットがさまざまなＧＰＣＲを含み、該ＧＰＣＲが、ＧＰＣＲサブファミリーの一員であり、同様な組織分布または同様な生理的もしくは薬理的機能を有することを特徴とする請求項３記載のアレイ。
5. 前記膜結合タンパク質がイオンチャンネルであることを特徴とする請求項２記載のアレイ。
6. ＧＰＣＲが細胞内領域を含み、かつ該細胞内領域が基材の表面を向くようにＧＰＣＲが配向されていることを特徴とする請求項３記載のアレイ。
7. ＧＰＣＲが細胞外領域を含み、かつ該細胞外領域が基材の表面を向くようにＧＰＣＲが配向されていることを特徴とする請求項３記載のアレイ。
8. 前記膜結合タンパク質が受容体チロシンキナーゼであることを特徴とする請求項２記載のアレイ。
9. 前記膜結合タンパク質が受容体セリン／スレオニンキナーゼであることを特徴とする請求項２記載のアレイ。
10. 前記膜結合タンパク質が受容体グアニル酸シクラーゼであることを特徴とする請求項２記載のアレイ。
11. 前記基材が、ガラス、金属、シリコン、またはプラスチックを含むことを特徴とする請求項１記載のアレイ。
12. 前記基材が、チップ、スライドまたはマイクロプレートとして構成されていることを特徴とする請求項１記載のアレイ。
13. 前記基剤の表面が被覆されていることを特徴とする請求項１記載のアレイ。
14. 生体膜マイクロスポットまたは膜結合タンパク質の基材に対する親和性を増大させる材料で前記基剤の表面が被覆されていることを特徴とする請求項１３記載のアレイ。
15. 前記材料が、約１５°から８０°までの範囲の接触角を与えることを特徴とする請求項１４記載のアレイ。
16. 前記材料が、シラン、チオール、ジスルフィド、または高分子であることを特徴とする請求項１４記載のアレイ。
17. チオールが、金被覆表面を含む基材上にあることを特徴とする請求項１４記載のアレイ。
18. チオールが、疎水性または親水性部分を含むことを特徴とする請求項１６記載のアレイ。
19. チオールがチオアルキル化合物であることを特徴とする請求項１８記載のアレイ。
20. シランがガラスを含む基材上にあることを特徴とする請求項１６記載のアレイ。
21. シランが末端の極性部分を提示していることを特徴とする請求項１６記載のアレイ。
22. 末端の極性部分がヒドロキシル、カルボキシル、リン酸、スルホン酸、またはアミノ基であることを特徴とする請求項２１記載のアレイ。
23. 前記基剤の表面が、陽性電荷を帯び、かつアミノ基を含むことを特徴とする請求項２１記載のアレイ。
24. 前記材料がγ−アミノプロピルシランであることを特徴とする請求項１４記載のアレイ。
25. 前記材料がレクチンであることを特徴とする請求項１４記載のアレイ。
26. 前記基剤の表面が、小麦胚芽凝集素で被覆されていることを特徴とする請求項２５記載のアレイ。
27. 前記材料が、膜タンパク質に対する特異的結合親和性を有する抗体であることを特徴とする請求項１４記載のアレイ。
28. 前記材料が、Ｇタンパク質に対する特異的結合親和性を有する抗体であることを特徴とする請求項２７記載のアレイ。
29. 前記材料が、誘導体化された単層であることを特徴とする請求項１４記載のアレイ。
30. 前記誘導体化された単層が、共有結合したリンカー部分を含むことを特徴とする請求項２９記載のアレイ。
31. 前記単層が、自己組織化単層膜（ＳＡＭ）であることを特徴とする請求項２９記載のアレイ。
32. 前記単層が、チオアルキル化合物またはシラン化合物を含むことを特徴とする請求項２９記載のアレイ。
33. チオアルキル化合物が、チオアルキル酸、チオアルキルアルコール、チオアルキルアミン、およびハロゲン含有チオアルキル化合物より成る群から選択されることを特徴とする請求項３２記載のアレイ。
34. チオアルキル化合物がチオアルキル酸であることを特徴とする請求項３３記載のアレイ。
35. チオアルキル化合物が１６−メルカプトヘキサデカン酸であることを特徴とする請求項３４記載のアレイ。
36. シラン化合物が、シリル無水物、シリル酸、シリルアミン、シリルアルコール、シリルチオール、ビニルシランまたはアクリル酸シリルより成る群から選択されることを特徴とする請求項３２記載のアレイ。
37. 前記リンカー部分が、
    （ｉ）誘導体化された単層と反応できる末端官能基；
    （ｉｉ）親水性スペーサー領域；および
    （ｉｉｉ）疎水性膜接着領域
    を含む、直鎖または分枝鎖Ｃ_１０〜Ｃ_２５アルキル、アルキニル、アルケニル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアルキニル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアリール、ヘテロアラルキル分子を含むことを特徴とする請求項２９記載のアレイ。
38. 前記末端官能基が、カルボン酸、ハロゲン、アミン、チオール、アルケン、アクリル酸、無水物、エステル、酸ハロゲン化物、イソシアナート、ヒドラジン、マレイミドおよび水酸基より成る群から選択されることを特徴とする請求項３７記載のアレイ。
39. 前記親水性スペーサー領域が、ｎ個のオキシエチレン基（ｎ＝２〜２５）を含むことを特徴とする請求項３７記載のアレイ。
40. 前記膜接着領域が、直鎖または分枝鎖Ｃ_１０〜Ｃ_２５疎水性尾部を含むことを特徴とする請求項３７記載のアレイ。
41. ＳＡＭが、シランで修飾されたアルカンチオールであることを特徴とする請求項３１記載のアレイ。
42. アルカンチオールが、１１−メルカプトウンデカノール、１１−メルカプトウンデカン酸、１１−メルカプトウンデシルアミン、１６−メルカプトヘキサデカノール、および１６−メルカプトヘキサデカン酸より成る群から選択されることを特徴とする請求項４１記載のアレイ。
43. シランが３−アミノプロピルトリエトキシシランであることを特徴とする請求項４１記載のアレイ。
44. 前記基材が金であることを特徴とする請求項４１記載のアレイ。
45. 前記被覆がニトリロトリ酢酸またはエチレンジアミントリ酢酸基を含み、かつ前記生体膜マイクロスポットがＣ末端にヒスチジンタグを有するＧＰＣＲを含むことを特徴とする請求項１３記載のアレイ。
46. 前記基剤の表面が多孔質であることを特徴とする請求項１記載のアレイ。
47. 前記基材が、ガラス、シリコン、高分子材料、および金属基材より成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載のアレイ。
48. アレイを製造する方法において：
    表面を有する基材を提供し；
    生体膜溶液を提供し；
    ピンの先端を前記溶液に浸し；
    前記ピンの先端を溶液から取り出して、先端に付着した溶液を提供し；
    溶液を前記基剤の表面と接触させることによって、溶液をピンの先端から基剤の表面へ移し；そして、
    前記接触工程を複数回繰り返して、アレイの表面に生体膜マイクロスポットのパターンを描く；
    各工程を含む方法。
49. 前記溶液がタンパク質を含むことを特徴とする請求項４８記載の方法。
50. 前記タンパク質がＧタンパク質共役受容体であることを特徴とする請求項４９記載の方法。
51. 前記タンパク質がイオンチャンネルであることを特徴とする請求項４９記載の方法。
52. マイクロスポットをタンパク質を含む溶液と接触させる工程をさらに含むことを特徴とする請求項４８記載の方法。
53. ピンの先端が基材に接触するとき、基材の表面が周囲湿度または調節された湿度の空気に曝露されることを特徴とする請求項４８記載の方法。
54. プローブと標的化合物との間の結合事象を検出する方法において：
    １またはそれ以上の構成要素を有する標的化合物を含む溶液を、基材の表面に結合したプローブ生体膜マイクロスポットのアレイと接触させ；さらに、
    １またはそれ以上のプローブと、標的化合物の１またはそれ以上の構成要素との間の結合事象を検出する；
    各工程を含む方法。
55. 前記標的化合物の構成要素の少なくとも１つが標識であり、前記検出工程が標識の存在を検出することを含むことを特徴とする請求項５４記載の方法。
56. 標識の検出が、結合した標的化合物からの放射能、蛍光、燐光、化学発光、または共鳴光散乱に基づいたイメージングによって行われることを特徴とする請求項５５記載の方法。
57. 前記検出工程の前に、基材から結合していない標的化合物を洗浄する工程をさらに含むことを特徴とする請求項５５記載の方法。
58. マイクロスポットのアレイを、標識同族標的および非標識標的化合物とインキュベートし、そして標識同族標的と非標識標的化合物との間のプローブに対する競合による標識の信号の減少を測定することによって、非標識標的化合物とプローブとの間の結合事象が測定されることを特徴とする請求項５４記載の方法。
59. 非標識標的化合物とのインキュベートの前に、標識同族標的をアレイとインキュベートすることを特徴とする請求項５８記載の方法。
60. 前記標的化合物が非標識であり、結合事象を界面における物理的性質の変化によって測定することを特徴とする請求項５４記載の方法。
61. 界面における物理的性質の変化が、屈折率または電気インピーダンスの変化であることを特徴とする請求項６０記載の方法。
62. 前記標的化合物が非標識であって、標的化合物の結合を質量分析によって検出することを特徴とする請求項５４記載の方法。
63. 前記プローブ生体膜マイクロスポットがＧタンパク質共役受容体を含むことを特徴とする請求項５４記載の方法。
64. 前記プローブ生体膜マイクロスポットがイオンチャンネルを含むことを特徴とする請求項５４記載の方法。
65. 前記標的化合物が非標識であって、標識された加水分解されないＧＴＰの濃度を測定することによって標的化合物の結合を検出することを特徴とする請求項６３記載の方法。
66. 前記加水分解されないＧＴＰがＧＴＰγＳであることを特徴とする請求項６５記載の方法。
67. ＧＴＰγＳが放射性同位体または蛍光化合物で標識されていることを特徴とする請求項６６記載の方法。
68. ＧＴＰγＳが[^３５ｓ]ＧＴＰγＳまたはＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＧＴＰγＳであることを特徴とする請求項６７記載の方法。
69. 前記プローブ生体膜マイクロスポットが受容体チロシンキナーゼを含むことを特徴とする請求項５４記載の方法。
70. ガラス基材の表面に結合した複数の生体膜マイクロスポットを含み、前記表面がγ−アミノプロピルシランで被覆されており、かつ前記生体膜マイクロスポットがＧタンパク質共役受容体を含むことを特徴とするアレイ。
71. 末端にアミンを有する化合物で被覆された基材の表面に結合した複数の生体膜マイクロスポットを含むアレイ。
72. 前記基材が、ガラス、金属またはプラスチックを含むことを特徴とする請求項７１記載のアレイ。
73. 前記末端にアミンを有する化合物がシランであることを特徴とする請求項７１記載のアレイ。
74. シランがガンマアミノプロピルシランであることを特徴とする請求項７３記載のアレイ。
75. 前記末端にアミンを有する化合物が１１−メルカプトウンデシルアミンであり、かつ前記基材が金を含むことを特徴とする請求項７１記載のアレイ。
76. 前記生体膜マイクロスポットが膜結合タンパク質を含むことを特徴とする請求項７１記載のアレイ。
77. 前記膜結合タンパク質が、Ｇタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、イオンチャンネル、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、または受容体グアニル酸シクラーゼであることを特徴とする請求項７６記載のアレイ。
78. 前記基材が、チップ、スライドまたはマイクロプレートとして構成されていることを特徴とする請求項７１記載のアレイ。
79. 末端にアミンを有する化合物で被覆された基材の表面に結合した生体膜を含む固定化膜。
80. 前記基材が、ガラス、金属またはプラスチックであることを特徴とする請求項７９記載の固定化膜。
81. 前記アミン末端を有する化合物がシランであることを特徴とする請求項７９記載の固定化膜。
82. シランがガンマアミノプロピル−シランであることを特徴とする請求項８１記載の固定化膜。
83. 前記アミン末端を有する分子が１１−メルカプトウンデシルアミンであり、かつ前記基材が金を含むことを特徴とする請求項７９記載の固定化膜。
84. 前記生体膜が膜結合タンパク質を含むことを特徴とする請求項７９記載の固定化膜。
85. 前記膜結合タンパク質が、Ｇタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、イオンチャンネル、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、または受容体グアニル酸シクラーゼであることを特徴とする請求項８４記載の固定化膜。

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