JP2011252888A - リガンド分析方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ステップS104で、抗体固定化基板の観察領域にリガンド候補混合膜画分を配置した試料基板を作製する。ステップS105で、GTP結合タンパク質(Gプロテイン)を試料基板の観察領域に供給し、GPCRに結合したGプロテインの量の時間変化を測定する。この後、ステップS106で、測定した結果より膜画分におけるGタンパク質共役受容体に対してリガンドとなるリガンド候補の物質を分析する。
【選択図】 図1
Description
ラットから摘出した脳の細胞を、ポッター型のホモジナイザーを用いて粉砕する。次に、粉砕した試料より、遠心分離を行って膜画分を取り出し、さらに、プロテアーゼ・インヒビターを含む溶解緩衝溶液に溶出した後、さらに遠心分離をかける。次に、緩衝剤と界面活性剤を加えて膜画分サンプルとした。次に、所定の基板上に膜画分サンプルより、レセプタ抗体(anti-δOpioid Receptor;Anti-OpiR)を用いてレセプタの存在を確認する。Anti-OpiRにより「δOpioid Receptor」の存在が確認されたサンプルを、膜画分Aとする。なお、この膜画分Aには、「δOpioid Receptor」以外の様々なレセプタおよび細胞膜を構成する脂質膜が混在し、また、Gプロテインが含まれている場合もある。
図2の平面図に示すように、膜厚50nmの金薄膜202を形成した透明基板201を用意する。透明基板201は、例えば、ガラスあるいは透明なプラスチックから構成されていればよい。また、透明基板201は、板厚1mm程度とすればよい。次に、図3Aに示すように、紫外線を照射することによるUVオゾン処理により、金薄膜202を洗浄する。次に、図2および図3Bに示すように、金薄膜202の上に、所定の間隔でブロック部203を形成する。例えば、よく知られたスポッター装置を用いてブロッキング剤をスポットすることで、ブロック部203を形成する。このブロック部203の間を、観察領域204として用いればよい。
まず、測定では、図4Aに示すように、透明基板201の上に流路シート401を挟んでカバー402を配置する。流路シート401には流路403が形成されており、カバー402の試料導入口404より導入した試料溶液は、金薄膜202に配置される流路403を流れて試料排出口405より排出される。
次に、固定化のために用いた抗体に対して、目的のGPCRが選択的に固定化されている状態、およびこのような固定化におけるGプロテインとの応答(反応)について調査した結果について説明する。
Anti-OpiRおよびアドレナリン・レセプタ抗体(anti-beta 2 Adrenergic Receptor;anti-b2AdR)を固定化した基板に、各々、膜画分Aを滴下して固定化したテスト基板Bを作製する。このテスト基板Bを用いてGiαとの反応性を観測する。総Gプロテイン濃度は2μg/mLに調整してある。図7は、この観測の結果を示す特性図であり、(a)は、Anti-OpiRの部分、(b)は、anti-b2AdRの部分の結果である。図7の(a)に示すように、Anti-OpiRを介して「δOpioid Receptor」を含む膜部分を固定化した領域においては、Giαの供給により吸着量の増加が観測され、Giαの吸着が確認できる。これに対し、図7の(b)に示すように、anti-b2AdRを固定化した領域においては、Giαの供給により反対に吸着量の減少が観測される。
次に、リガンドの特性評価について説明する。まず、膜画分Aに「δOpioid Receptor」のアゴニストであるエンケファリンを混合した膜画分A1を作製する。また、膜画分Aに「δOpioid Receptor」のアンタゴニストであるナルトインドールを混合した膜画分A2を作製する。「δOpioid Receptor」は、エンケファリンとの結合によりGiαを吸着するコンフォメーションを取る。これに対し、「δOpioid Receptor」は、ナルトインドールと結合するとGiα吸着には向かないコンフォメーションを取ることが知られている。このように、レセプタはアンタゴニストとの結合(反応)により、レセプタとしての活動が抑制されるようになる。
Claims (4)
- 分析対象の動物細胞を破砕して前記動物細胞の膜画分を分取する第1ステップと、
前記膜画分にリガンド候補の物質を加えたリガンド候補混合膜画分を作製する第2ステップと、
目的のGタンパク質共役受容体に対する抗体を基板の観察領域に固定して抗体固定化基板を作製する第3ステップと、
前記抗体固定化基板の観察領域に前記リガンド候補混合膜画分を配置した試料基板を作製する第4ステップと、
リガンドと反応している目的の前記Gタンパク質共役受容体に結合するGTP結合タンパク質を前記試料基板の観察領域に供給し、前記Gタンパク質共役受容体に結合した前記GTP結合タンパク質の量の時間変化を測定する第5ステップと、
測定した結果より膜画分における前記Gタンパク質共役受容体に対してリガンドとなる前記リガンド候補の物質を分析する第6ステップと
を少なくとも備えることを特徴とするリガンド分析方法。 - 請求項1のリガンド分析方法において、
前記第6ステップでは、前記Gタンパク質共役受容体に結合した前記GTP結合タンパク質の量の時間変化により、前記Gタンパク質共役受容体に対するリガンドの特性を分析する
ことを特徴とするリガンド分析方法。 - 請求項1または2記載のリガンド分析方法において、
前記第5ステップでは、前記GTP結合タンパク質の供給による前記観察領域における屈折率の変化により、前記Gタンパク質共役受容体に結合した前記GTP結合タンパク質の量の時間変化を測定する
ことを特徴とするリガンド分析方法。 - 請求項3記載のリガンド測定方法において、
前記第5ステップでは、表面プラズモン共鳴測定により、前記観察領域における屈折率の変化を測定することを特徴とするリガンド分析方法。
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Citations (2)
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JP2003284573A (ja) * | 2001-06-18 | 2003-10-07 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | グアノシン三リン酸結合タンパク質共役型の受容体 |
JP2005515402A (ja) * | 2001-05-14 | 2005-05-26 | コーニング インコーポレイテッド | 生体膜のアレイおよびその製造方法と用途 |
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