CN102317781A - 细胞中变化的检测方法 - Google Patents

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Abstract

提供了不使用检测标记物而检测细胞中变化的方法。在一个实施方案中，细胞对刺激源的响应的检测包括：将一种或多种细胞外基质配体固定于比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面，和将细胞加入所述生物传感器，所述细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体。在将刺激源引入该生物传感器之前和之后，通过该生物传感器检测细胞中的变化。

Description

细胞中变化的检测方法
优先权
本申请是2008年12月15日提出的U.S.12/335,393的继续申请，本文以引用的方式将其整体并入。
本申请交叉引用2008年12月15日提出的题为“离子通道调节剂的识别方法(Methods For Identifying Modulators of Ion Channels)”的美国序号12/335,433专利，本文以引用的方式将其整体并入。
发明背景
药物探索科学需要更为有效的工具，这些工具用于测定生物材料和试验化合物对人细胞和组织的影响。通常，许多生物学平台(一些使用工程的细胞或标记物)建立在基于细胞的系统中的用于这些测定的组织内。这些平台需要许多不同的读数器，这些读数器经常提供不一致的数据集。它们经常使用工程的细胞，所述工程的细胞含有在疾病过程中涉及的特别目标的过度表达。这种工程的系统的净效果和最初所寻求的恰好相反，结果被从天然或自然的响应中除去。在其它情况下，这些平台使用标记物以监测实验结果。在标记物中引入新的化学实体也会以难以测定的方式对实验结果产生显著影响。所需要的是可以和许多不同种类的细胞一起用于试验潜在治疗法的单一平台，所述治疗法反映对试验材料的自然的细胞反应。
发明概要
本发明的一个实施方案提供细胞对刺激源的响应的检测方法。该方法包括：
(i)将一种或多种细胞外基质配体固定于比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面，其中细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；和将细胞加入生物传感器；或
(ii)将细胞和一种或多种细胞外基质配体混合，其中细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；和将带有一种或多种细胞外基质配体的细胞加入比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面。细胞在这两种情况下可以在无血清培养基中。
将细胞暴露于刺激源并检测细胞对刺激源的响应。所述刺激源可以是调节G蛋白-偶合的受体、离子通道、P13激酶、瞬时受体(transientreceptor)电势通道、磷脂酶C、受体酪氨酸激酶、细胞因子、β-抑制蛋白路径响应、细胞支架重排、后生信号(epigenetic signal)或信号转导路径的活性的化合物。和检测方法中不包括一种或多种细胞外基质配体的方法相比，细胞对刺激源的响应的检测可以增大。
本发明的另一个实施方案提供用于试验的细胞的制备方法。该方法包括：用缺乏钙和镁的缓冲盐水溶液洗涤细胞；从细胞除去所述缺乏钙和镁的缓冲盐水溶液；将等渗的乙二胺四乙酸盐螯合剂加入细胞；用缓冲盐水溶液中和所述等渗的乙二胺四乙酸盐螯合剂；用缓冲盐水溶液洗涤细胞；和将细胞加到生物传感器表面并使细胞附着于生物传感器的表面。可以在粘着调节剂的存在下将细胞加到生物传感器表面。生物传感器表面可具有固定于其的一种或多种细胞外基质配体，或者其中在细胞加入生物传感器表面前，将它们和一种或多种细胞外配体混合。可以检测到细胞和细胞外基质配体的结合。
本发明的又一个实施方案提供细胞对刺激源的响应的检测方法。该方法包括用缓冲盐水溶液洗涤所述细胞。然后：
(i)将一种或多种细胞外基质配体固定于比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面，其中细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；和将细胞加入生物传感器；或
(ii)将细胞和一种或多种细胞外基质配体混合，其中所述细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；和将所述带有一种或多种细胞外基质配体的细胞加入比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面。
将细胞暴露于刺激源并检测细胞对刺激源的响应。在所列举的方法步骤之前，可进行下列步骤：用缺乏钙和镁的缓冲盐水溶液洗涤细胞；从细胞除去所述缺乏钙和镁的缓冲盐水溶液；将等渗的乙二胺四乙酸盐螯合剂加入细胞；和用缓冲盐水溶液中和所述等渗的乙二胺四乙酸盐螯合剂。可以在粘着调节剂的存在下将细胞加到生物传感器表面。所述刺激源可以是调节G蛋白-偶合的受体、离子通道、P13激酶、瞬时受体电势通道、磷脂酶C、受体酪氨酸激酶、细胞因子、β-抑制蛋白路径响应、细胞支架重排、后生信号或信号转导路径的活性的化合物。
本发明的又一实施方案提供测定试验试剂是否影响细胞运动的方法。该方法包括将一种或多种细胞外基质蛋白配体固定于微量滴定板的孔底部，其中所述孔底部包括比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器，且其中所述孔具有微流体通道，所述微流体通道可将试验试剂递送至该孔内的一个位置。将具有对所述一种或多种细胞外基质蛋白配体特异性的细胞表面受体的细胞加入所述孔。使用所述微流体通道将试验试剂加入孔；其中所述试验试剂是疑似趋化剂(suspected chemotactic agent)。检测细胞在孔中的运动，其中如果检测到细胞在孔中的运动，则所述试验试剂影响细胞的运动。所述试验试剂可以是调节G蛋白-偶合的受体、离子通道、P13激酶、瞬时受体电势通道、磷脂酶C、受体酪氨酸激酶、细胞因子、β-抑制蛋白路径响应、细胞支架重排、后生信号或信号转导路径的活性的化合物。
本发明的又一实施方案提供测定试验化合物是否影响细胞和细胞外基质配体的特异性结合的方法。该方法包括：将第一细胞加入第一比色共振反射生物传感器表面或第一基于光栅的波导生物传感器表面，其中所述生物传感器表面包括固定的细胞外基质配体，其中第一细胞具有对所述细胞外基质配体特异性的细胞表面受体，使第一细胞附着于第一生物传感器的表面，和对第一细胞测定峰波长值或信号。将第二细胞加入第二比色共振反射生物传感器表面或第二基于光栅的波导生物传感器表面，其中所述第二生物传感器表面包括固定的细胞外基质配体，其中第二细胞具有对所述细胞外基质配体特异性的细胞表面受体，将试验化合物加入生物传感器表面，使第二细胞附着于生物传感器的表面，和对第二细胞测定峰波长值或信号。比较对第一细胞获得的峰波长值或信号和对所述第二细胞获得的峰波长值或信号；其中如果对第二细胞的峰波长值或信号基本上不同于对第一细胞的峰波长值或信号，则所述试验化合物影响细胞和细胞外基质配体的特异性结合。所述试验化合物可以是调节G蛋白-偶合的受体、离子通道、P13激酶、瞬时受体电势通道、磷脂酶C、受体酪氨酸激酶、细胞因子、β-抑制蛋白路径响应、细胞支架重排、后生信号或信号转导路径的活性的化合物。
本发明的另一实施方案提供实时分析细胞变化的方法。该方法包括：将一种或多种细胞外基质配体固定于比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面；将细胞加入生物传感器，其中所述细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；将细胞暴露于刺激源；和使用分辨率约2到10微米的检测装置检测细胞对刺激源的响应。所述刺激源可以是调节G蛋白-偶合的受体、离子通道、P13激酶、瞬时受体电势通道、磷脂酶C、受体酪氨酸激酶、细胞因子、β-抑制蛋白路径响应、细胞支架重排、后生信号或信号转导路径的活性的化合物。所述细胞变化可以是细胞生长模式、细胞死亡模式、细胞运动、细胞尺寸或体积或者细胞粘着中的变化。
本发明的又一实施方案提供检测细胞响应变化的方法。该方法包括：将一种或多种细胞外基质配体固定于比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面；在无血清培养基中将细胞加入所述生物传感器，其中所述细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；将细胞暴露于刺激源而不洗去所述无血清培养基；和检测细胞对刺激源的响应。所述刺激源可以是调节G蛋白-偶合的受体、离子通道、P13激酶、磷脂酶C、受体酪氨酸激酶、细胞因子、β-抑制蛋白路径响应、细胞支架重排、后生信号或信号转导路径的活性的化合物。
本发明的又一实施方案提供比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器表面，其中所述生物传感器通过将卵清蛋白或胎牛血清和两种或更多种细胞外基质配体施用于所述生物传感器的表面并将所述生物传感器的表面干燥而制备。
本发明的又一实施方案提供识别影响细胞粘着的化合物的方法。该方法包括：
(i)将一种或多种细胞外基质配体固定于比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面，其中细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；和将细胞加入生物传感器；或
(ii)将细胞和一种或多种细胞外基质配体混合，其中所述细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；和将所述带有一种或多种细胞外基质配体的细胞加入比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面。
用试验化合物处理细胞。检测比色共振反射光学第一PWV或信号，并将它和来自未用所述试验化合物处理的对照细胞的第二PWV或信号比较，以测定所述试验化合物是否影响所述细胞的粘着。所述试验化合物可以是调节G蛋白-偶合的受体、离子通道、P13激酶、瞬时受体电势通道或磷脂酶C的活性的化合物。在试验期间，在加入试验化合物之前或加入期间，或者在加入之后，可将粘着调节剂加入细胞，其中对照细胞也用粘着调节剂处理。
本发明的另一实施方案提供识别影响细胞粘着的经修饰的细胞外基质(ECM)配体的方法。该方法包括将细胞施用至比色共振反射光学生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面，其中将经修饰的ECM配体固定于生物传感器的表面；将粘着调节剂加入细胞；对细胞检测比色共振反射光学第一PWV或信号，并将第一PWV或信号和第二PWV或信号比较，所述第二PWV或信号来自加入比色共振反射光学生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面的对照细胞，其中将未经修饰的ECM配体固定于生物传感器的表面，以测定所述试验化合物是否影响细胞粘着。
本发明的又一实施方案提供测定转染细胞是否生产重组蛋白的方法。该方法包括：将一种或多种细胞外基质配体固定于比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面；将细胞加入所述生物传感器的表面，所述细胞已用编码重组蛋白的核酸分子转染且具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；对所述细胞测定第一PWV或信号；加入调节剂，和不表达所述重组蛋白的转染细胞相比，所述调节剂在表达所述重组蛋白的转染细胞中引起差别响应；对所述细胞测定第二PWV或信号；比较第一峰波长值或信号和第二峰波长值或信号；其中如果第二峰波长值或信号基本上不同于第一峰波长值或信号，则所述转染细胞表达所述重组蛋白。
本发明提供细胞粘着作为监测细胞对刺激源响应的模式之一。许多主要的科学来源报道，细胞性活动(cellular event)的过剩及响应和几种细胞粘着模式之一有联系。本发明描述生物传感器的操作方法，用于监测对刺激源的自然响应中的细胞粘着。
本发明提供商业上可行的高通量方法，它可以进行高灵敏度的基于细胞的试验，而没有任何类型的标记物，其在型式(format)上容易和最常用于高通量生物分子相互作用分析的基于微量滴定板或基于微阵列的基础设施相容。
附图简述
图1显示细胞-蛋白相互作用试验的示意图。
图2显示细胞-蛋白相互作用试验的结果。
发明详述
本文使用的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数个指示物，除非上下文另外清楚地指明。
生物传感器
本发明的生物传感器可以是比色共振反射生物传感器。参见例如，Cunningham等人，″Colorimetric resonant reflection as a directbiochemical assay technique(作为直接生化试验技术的比色共振反射)″，Sensors and Actuators B，81卷，316-328页，2002年1月5日；美国专利公布号2004/0091397；美国专利号7,094,595；美国专利号7,264,973。比色共振生物传感器不是表面等离子共振(SPR)生物传感器。SPR生物传感器具有薄金属层，比如银、金、铜、铝、钠和铟。该金属必须具有能够和适当波长的光共振的导带电子。暴露于光的SPR生物传感器表面必须是纯金属。氧化物、硫化物及其它膜干扰SPR。比色共振生物传感器不具有金属层，而是，它们具有高折射率材料(比如硫化锌、二氧化钛、氧化钽和氮化硅)的电介质涂层。
基于光栅的波导生物传感器描述于，例如，美国专利号5,738,825中。基于光栅的波导生物传感器包括波导膜和衍射光栅，它将入射光场耦合进入波导膜，产生衍射光场。检测到波导膜的有效折射率变化。诸如基于光栅的波导生物传感器的装置(其中波必须在装置内传输显著距离)缺乏本发明的空间分辨率。
比色共振反射生物传感器可以不使用荧光标签(tag)、比色标记物(label)或任何其它类型的检测标签或检测标记物而在生物传感器的表面上测量生物化学相互作用。生物传感器表面含有光学结构，该光学结构设计成用准直光和/或白光照明时仅反射窄波长带(“共振光栅效应”)。该窄波长带被描述为波长“峰”。当生物传感器表面上沉积或者除去材料(比如生物材料)时，该“峰波长值”(PWV)变化。使用读数仪器以准直光和/或白光照明生物传感器表面上的不同位置(distinctlocation)，并收集反射的光。将收集的光聚集于波长分光计内用以测定PWV。
通过将该结构(生物传感器一侧朝上)和无底的微量滴定板筒的底部结合，可将生物传感器并入标准的一次性实验室物品(比如微量滴定板)。由于和现有微量滴定板处理设备(比如混合器、培养箱和液体分配设备)的相容性，将生物传感器并入常见实验室型式的筒是合乎需要的。生物传感器也可并入，例如，微流体、大流体或微阵列装置(参见，例如，美国专利号7,033,819、美国专利号7,033,821)。生物传感器可以本领域公知方法(参见，例如，Jun-Lin Guan编辑的Methods ofMolecular Biology(分子生物学方法)，294卷，Humana Press，Totowa，New Jersey)用于监测暴露于一种或多种细胞外试剂时的细胞行为变化或缺乏这些变化。
比色共振反射生物传感器包括亚波长结构的表面(SWS)且是可以模仿薄膜涂层效果的非常规类型的衍射光学。(Peng和Morris，“Resonant scattering from two-dimensional gratings(二维光栅的共振散射)”，J.Opt.Soc.Am.A，13卷，No.5，993页，1996年5月；Magnusson和Wang，“New principle for optical filters(滤光器新原理)”，Appl.Phys.Lett.，61，No.9，1022页，1992年8月；Peng和Morris，“Experimentaldemonstration of resonant anomalies in diffraction from two-dimensionalgratings(二维光栅衍射中共振异常的实验证实)”，Optics Letters，21卷，No.8,549页，1996年4月)。SWS结构含有一维、二维或三维光栅，其中光栅周期和入射光的波长相比要小，从而除反射和透射的零级外没有衍射级可以传播(propagation)。导模(guided mode)沿着横向的传播不被支持。而是，导模共振效果在距任何光子进入生物传感器结构的点大约3微米的高度局部化区域内发生。
比色共振反射生物传感器的反射或透射的光可以通过将分子(比如配体或结合配偶体(binding partner)或者两者)加入生物传感器的上表面而调制。加入的分子增大入射辐射经过该结构的光程长度，并因此改变将发生最大反射或透射的波长。
在一个实施方案中，比色共振反射生物传感器设计成用白光和/或准直光照明时反射单一波长或窄波长带(“共振光栅效应”)。当物质沉积在生物传感器的表面上时，反射的波长因生物传感器上显示的光的光程变化而移动。
检测系统包括例如光源(其通过例如光纤探针以法向入射而照明生物传感器的小点)和光谱仪(其通过例如第二光纤探针收集反射的光，所述第二光纤探针也处于法向入射)。由于激发/检测系统和生物传感器表面之间不发生物理接触，因此不需要特殊的耦合棱镜，且该生物传感器可以容易地适应包括例如微量滴定板的任何常用试验平台。单个光谱仪读数可在几毫秒内进行，因此可以快速测量在生物传感器表面上并行发生的大量分子间相互作用，并可以实时监测反应动力学。
比色共振反射生物传感器包括，例如，由高折射率材料组成的光学光栅、支持光栅的衬底层，以及任选的一种或多种特异性结合物质或连接物，其固定于和衬底层相反的光栅表面上。该高折射率材料具有比衬底层更高的折射率。参见，例如，美国专利号7,094,595；美国专利号7,070,987。任选地，覆盖层覆盖光栅表面。光学光栅涂有高折射率电介质膜，该膜可由包括例如硫化锌、二氧化钛、氧化钽、氮化硅和二氧化硅的材料组成。具有光学特征的光栅的截面分布可以包括任何周期性重复功能，例如，“方波”。光学光栅也可包括选自线(一维)、正方形、圆形、椭圆形、三角形、梯形、正弦波、卵形、矩形和六边形的形状的重复图案。本发明的比色共振反射生物传感器也可包括光学光栅，该光学光栅由例如涂有高折射率材料的塑料或环氧树脂组成。
线性光栅(即，一维光栅)具有照射光偏振垂直于光栅周期而取向的共振特征。比色共振反射生物传感器也可包括，例如，二维光栅，例如，孔或正方形的六角形阵列。可使用其它形状。线性光栅具有和六角形阵列光栅相同的间距(即高和低折射率的区域之间的距离)、周期、层厚度和材料性质。然而，光必须垂直于光栅线偏振以共振地耦合进入该光学结构。因此，必须在照明源和生物传感器表面之间插入以其偏振轴垂直于线性光栅而取向的偏振滤光器。由于仅小部分照射光源被正确偏振，因此需要较长的积分时间，以收集和六角形光栅相比等量的共振反射光。
光学光栅也可包括，例如，“台阶式”分布，其中单一的固定高度的高折射率区域嵌入较低折射率覆盖层内。高和低折射率的交替区域提供平行于生物传感器顶面的光学波导。
本发明的比色共振反射生物传感器可以进一步包括在和衬底层相反的光学光栅表面上的覆盖层。存在覆盖层时，所述一种或多种特异性结合物质固定在和光栅相反的覆盖层的表面上。优选地，覆盖层包括折射率比组成光栅的材料低的材料。覆盖层可以由例如玻璃(包括旋涂玻璃(spin on glass，SOG))、环氧树脂或塑料组成。
例如，满足生物传感器的折射率要求的各种聚合物可用于覆盖层。可以使用SOG，这是由于它的良好的折射率、易于处理以及容易使用玻璃表面活化技术的资源而由特异性结合物质活化。当生物传感器表面的平坦度对于特别的系统设置不是问题时，SiN/玻璃的光栅结构可以直接用作感应表面，它的活化可以使用和玻璃表面上相同的方法来完成。
光学光栅上没有平坦化(planarizing)覆盖层也可以获得共振反射。例如，生物传感器可以仅含有涂有高折射率材料的结构化薄膜层的衬底。不使用平坦化覆盖层，则周围介质(比如空气或水)填充该光栅。因此，将特异性结合物质在暴露于该特异性结合物质的所有光学光栅表面上固定于生物传感器，而不是仅仅在上表面上。
总的来说，比色共振反射生物传感器可以用白光和/或准直光照明，所述白光和/或准直光将会含有每个偏振角的光。偏振角相对于生物传感器光栅中的重复特征的取向将决定共振波长。例如，由一组重复的线和间隔组成的“线性光栅”(即，一维光栅)生物传感器将具有两种光学偏振，它们可以产生单独的共振反射。垂直于线而偏振的光称作“s-偏振”，同时平行于线而偏振的光称作“p-偏振”。入射光的s和p组分两者同时存在于未滤光的照明束中，且各自产生单独的共振信号。生物传感器可以通常设计成仅使一种偏振(s-偏振)的性能最佳，并通过偏振滤光器容易地除去未最佳化的偏振。
为了除去偏振依赖性，从而每个偏振角产生相同的共振反射光谱，可以使用由一组同心环组成的替代性生物传感器结构。在这个结构中，各个同心环的内径和外径之间的差异等于光栅周期的约一半。各个连续的环的内径大于前面的环的内径约一个光栅周期。同心环图案延伸至覆盖单个传感器位置-比如阵列点或微量滴定板孔。各个单独的微阵列点或微量滴定板孔具有位于其中心的单独的同心环图案。这种结构的所有偏振方向具有相同的截面分布。必须精确地照射在同心环结构中心以保持偏振独立性。同心环结构的光栅周期小于共振反射的光的波长。光栅周期为约0.01微米到约1微米。光栅深度为约0.01到约1微米。
在另一实施方案中，孔或柱的阵列排列为紧密地近似于上述同心圆结构，无需照明束在栅格的任何特别位置居于中心。这样的阵列图案通过在表面上以相等角度从三个方向入射的三个激光束的光学干涉而自动产生。在这个图案中，孔(或柱)在密堆积六边形阵列的角上位于中心。孔或柱也存在于各个六边形的中心。这样的孔或柱的六角形栅格具有“看得到”相同截面分布的三个偏振方向。因此，该六角形栅格结构使用任何偏振角的光提供相同的共振反射光谱。因此，不需要偏振滤光器除去不需要的反射信号组分。孔或柱的周期可以是约0.01微米到约1微米且深度或高度可以是约0.01微米到约1微米。
检测系统可以包括比色共振反射生物传感器、将光导向比色共振反射生物传感器的光源和检测从生物传感器反射的光的检测器。在一个实施方案中，可通过使用滤光器简化读数仪器，使得仅超过确定阈值的正结果触发检测。
通过测量共振波长在本发明的比色共振反射生物传感器的各个不同位置的移动，可以测定例如哪个不同位置上面沉积了生物材料。移动的程度可用于测定例如试样中的结合配偶体的量，以及一种或多种特异性结合物质和试样的结合配偶体之间的化学亲合性。
比色共振反射生物传感器可以照明两次。第一次测量在例如生物传感器上没有生物材料时测定生物传感器的一个或多个不同位置的反射光谱。第二次测量在例如将一种或多种细胞施用于生物传感器后测定反射光谱。这两次测量之间的峰波长差异是生物传感器上的细胞的存在或者数量的量度。这种照明方法可以控制生物传感器表面中的小缺陷，这些小缺陷可以引起在峰共振波长中具有轻微变化的区域。该方法也可控制生物传感器上的细胞物质的变化的浓度或密度。
生物传感器的表面
进行一种或多种配体在生物传感器上的固定，使得配体不会被任何漂洗程序洗掉，从而配体和试样中的结合配偶体的结合不受生物传感器表面妨碍。一种或多种配体可以通过物理吸附(即，不使用化学连接物)或通过化学结合(即，使用化学连接物)以及电化学结合、静电结合、疏水结合和亲水结合而附着于生物传感器表面。化学结合可以在生物传感器表面上产生较强的配体附着并提供表面结合的分子的限定的取向和构造。
配体也可通过特异性结合物质(比如核酸、肽、蛋白溶液、肽溶液、含有来自组合化学库(combinatorial chemical library)的化合物的溶液、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体(scFv)、F(ab)片段、F(ab′)2片段、Fv片段、小有机分子、病毒、聚合物或生物样品)特异性地和生物传感器表面结合，其中该特异性结合物质固定于生物传感器的表面。
此外，配体可以排列于生物传感器表面上的一个或多个不同位置的阵列中，所述表面存在于多孔板的一个或多个孔内并组成多孔板或微阵列的一个或多个表面。配体的阵列包括微孔板内的生物传感器表面上的一种或多种配体，从而表面含有一个或多个不同位置，每个具有不同配体。例如，阵列可包括1、10、100、1,000、10,000或100,000或更多的不同位置。因此，多孔板或微阵列的各个孔可在其内部具有和该多孔板的其它孔分离的一个或多个不同位置的阵列，这允许多个不同样品在一个多孔板上被处理。在任何一个孔内的阵列(一个或多个)可以和相同微量滴定板的任何其它微量滴定孔中可见的阵列(一个或多个)相同或不同。
将配体固定于生物传感器表面也可通过和例如下列官能连接物结合而起作用：镍基、胺基、醛基、酸基、烷基、烯基、炔基、芳基、醇基、醚基、酮基、酯基、酰胺基、氨基酸基、硝基、氰基、糖基、硫醇基、有机磷酸盐基、脂基、磷脂基或类固醇基。此外，配体可以通过物理吸附、化学结合、电化学结合、静电结合、疏水结合或亲水结合，以及免疫捕获(immunocapture)方法而固定于生物传感器表面上。
在本发明的一个实施方案中，生物传感器可以涂有连接物，比如，例如，镍基、胺基、醛基、酸基、烷基、烯基、炔基、芳基、醇基、醚基、酮基、酯基、酰胺基、氨基酸基、硝基、氰基、糖基、硫醇基、有机磷酸盐基、脂基、磷脂基或类固醇基。例如，胺表面可用于附着几种连接物分子而醛表面可用于直接结合蛋白，无需另外的连接物。镍表面可用于结合具有并入的组氨酸(“his”)标签的分子。用镍活化的表面检测“his-标签”的分子在本领域是公知的(Whitesides，Anal.Chem.68，490，(1996))。
连接物、配体和特异性结合物质可以固定于生物传感器的表面上，使得各个孔具有固定于其中的相同的连接物、配体和/或特异性结合物质。或者，各个孔可以含有连接物、配体和/或特异性结合物质的不同组合。
配体可以特异性地或非特异性地和固定于生物传感器表面上的连接物或特异性结合物质结合。或者，生物传感器的表面可不具有连接物或特异性结合物质且配体可以非特异性地和生物传感器表面结合。
进行一种或多种特异性结合物质或连接物在生物传感器上的固定，使得特异性结合物质或连接物不会被漂洗程序洗掉，从而它和试样中的配体的结合不受生物传感器表面妨碍。对于特异性结合物质共价附着到例如用于多种类型的微阵列和生物传感器中的玻璃，已实施了几种不同类型的表面化学策略。这些相同的方法可以容易地适应本发明的生物传感器。表面制备生物传感器，以便它含有用于结合一种或多种特异性结合物质的正确的官能团，是生物传感器制造方法的整体部分。
一种或多种特异性配体可以通过物理吸附(即，不使用化学连接物)或通过化学结合(即，使用化学连接物)以及电化学结合、静电结合、疏水结合和亲水结合而附着于生物传感器表面。化学结合可以产生配体在生物传感器表面上的较强附着，并提供表面结合的分子的限定的取向和构造。
配体固定到塑料、环氧树脂或高折射率材料可以基本上如对于固定到玻璃所描述的那样进行。然而，可以除去酸洗步骤，其中这种处理会损坏固定了特异性结合物质的材料。
配体
配体是和另一个分子结合的分子。配体和特异性结合物质是相似的术语。配体可以是，例如，核酸、肽、细胞外基质配体(参见表1)、蛋白溶液、肽溶液、单链或双链DNA溶液、RNA溶液、RNA-DNA混合溶液、含有来自组合化学库的化合物的溶液、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体(scFv)、F(ab)片段、F(ab′)2片段、Fv片段、小有机分子、细胞、病毒、细菌、聚合物或生物样品。生物样品可以是例如，血液、血浆、血清、胃肠分泌物、组织或肿瘤的匀浆、滑液、粪便、唾液、痰、囊内液、羊水、脑脊髓液、腹膜液、肺灌洗液、精液、淋巴液、泪液或前列腺液。聚合物选自每分子具有多个活性位点的长链分子的组，该组由水凝胶、葡聚糖、聚氨基酸和它们的衍生物组成，包括聚赖氨酸(包括聚-1-赖氨酸和聚-d-赖氨酸)、聚-phe-赖氨酸和聚-glu-赖氨酸。在本发明的一个实施方案中，配体是细胞外基质蛋白配体。
优选地，一种或多种配体排列于生物传感器上的一个或多个不同位置的阵列中。配体的阵列包括本发明生物传感器表面上的一种或多种配体，从而表面含有许多不同位置，每个具有不同配体或具有不同配体数量。例如，阵列可以包括1、10、100、1,000、10,000或100,000个不同的位置。这样的生物传感器表面称作阵列，因为一个或多个配体一般在x-y坐标中按规则的栅格图案布局。然而，本发明的阵列可以包括任何类型的规则或不规则图案中的一个或多个配体。例如，不同的位置可以限定一个或多个配体的点的阵列。阵列点的直径可以是约50到约500微米。阵列点的直径也可以是约150到约200微米。一种或多种配体可以和它们的特异性受体结合。
本发明生物传感器上的阵列可通过将一种或多种配体的微滴放在例如光栅或覆盖层表面上的位置的x-y栅格上而产生。当生物传感器暴露于包括一种或多种结合配偶体的试样(例如，具有针对配体的受体的细胞)时，结合配偶体会被优先吸引到微阵列的不同位置上，所述微阵列包括对该结合配偶体具有高亲合力的配体。这些不同位置中的一些会将结合配偶体聚集在它们的表面上，而其它的位置则不会。
配体特异性地和加入本发明生物传感器表面的结合配偶体结合。配体特异性地和它的结合配偶体结合，而基本上不和加入生物传感器表面的其它结合配偶体结合。例如，配体是抗体且它的结合配偶体是特别的抗原时，抗体特异性地和该特别的抗原结合，而基本上不和其它抗原结合。结合配偶体可以是，例如，核酸、肽、蛋白溶液、肽溶液、细胞外基质蛋白受体、整合蛋白(参见表1)、单链或双链DNA溶液、RNA溶液、RNA-DNA混合溶液、含有来自组合化学库的化合物的溶液、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体(scFv)、F(ab)片段、F(ab′)2片段、Fv片段、小有机分子、细胞、病毒、细菌、聚合物或生物样品。生物样品可以是，例如，血液、血浆、血清、胃肠分泌物、组织或肿瘤的匀浆、滑液、粪便、唾液、痰、囊内液、羊水、脑脊髓液、腹膜液、肺灌洗液、精液、淋巴液、泪液和前列腺液。在本发明的一个实施方案中，结合配偶体是可以和生物传感器上固定的配体结合的受体，其中该受体在细胞表面上。
尽管微量滴定板是用于生物化学试验的最常见形式，但微阵列作为使一次可测的生物化学相互作用数最大同时使贵重试剂的量最小的装置越来越多见。通过用微阵列点样器将配体施用于本发明生物传感器上，可以获得10,000配体/in2的配体密度。通过聚焦照明束以查询(interrogate)单个微阵列位置，可将生物传感器用作无标记物微阵列读数系统。
此外，可将微阵列和微量滴定板实施方案两者组合，使得一种或多种配体排列于生物传感器表面上的一个或多个不同位置的阵列中，所述表面存在于微量滴定板的一个或多个孔内并包括微量滴定板的一个或多个表面，优选为底表面。配体的阵列包括微量滴定板孔内的传感器表面上的一种或多种配体，从而表面含有一个或多个不同位置，每个具有不同配体或具有不同配体量。例如，阵列可包括1、10、100、1,000、10,000或100,000个不同位置。因此，微量滴定板实施方案的各个孔可在它之内具有一个或多个不同位置的阵列，它和微量滴定板实施方案的其它孔分离，这允许在一个本发明微量滴定板上处理多个不同样品，每个单独的孔一个或多个样品。在任何一个孔内的阵列(一个或多个)可以和相同微量滴定板的任何其它微量滴定孔中可见的阵列(一个或多个)相同或不同。
含液体容器
本发明的光栅可以构成含液体容器的内表面，例如，底表面。含液体容器可以是，例如，微量滴定板孔、试管、陪替氏培养皿或微流体通道。本发明的一个实施方案是并入到任何类型的微量滴定板中的生物传感器。例如，生物传感器可以通过将反应容器壁组装在生物传感器表面之上而并入微量滴定板的底表面，从而各个反应“点”可以暴露于不同的试样。因此，各个单独的微量滴定板孔可以充当单独的反应容器。因此，单独的化学反应可以在相邻孔内发生而不混合反应流体，且在化学上不同的试验溶液可施用于单独的孔。
为了将本发明的生物传感器或光栅附着于无底微量滴定板的底表面，可以使用几种方法，包括，例如，粘合剂附着、超声波焊接和激光焊接。
用于药物高通量筛分实验室、分子生物学研究实验室和诊断试验实验室的最常用试验形式是微量滴定板。这些板是标准尺寸的塑料筒，可含有约2、6、8、24、48、96、384、1536、3456、9600或更多个排列在栅格中的单独的反应容器。由于这些板的标准机械构造，设计了液体分配、自动化板处理和检测系统以对该常用形式作用。本发明的生物传感器可以并入标准微量滴定板的底表面。因为生物传感器表面可以以大面积制造，且因为读数系统不和生物传感器表面物理接触，可以限定任意数量的单独的生物传感器区域，这仅受照明光学装置的聚焦分辨率和x-y阶段(stage)的限制，所述x-y阶段跨生物传感器表面扫描照明/检测探针。
使用生物传感器的方法
本发明生物传感器可用于并行研究一种或许多种配体/结合配偶体相互作用。一种或多种配体和它们各自的结合配偶体的结合，可以通过将一种或多种结合配偶体施用至在其表面上固定了一种或多种配体的生物传感器进行检测，而不使用标记物。在本发明的一个实施方案中，一种或多种配体是一种或多种细胞外基质蛋白配体且一种或多种结合配偶体是细胞上的受体，其中该受体(例如，整合蛋白)对细胞外基质蛋白配体是特异性的。用光照明生物传感器，并检测来自生物传感器光的反射波长的最大值或透射波长的最小值。从基于光栅的波导生物传感器检测信号，并按照和比色共振反射生物传感器相似的方式彼此相比或和对照相比。本文描述的所有试验或方法可以在比色共振反射生物传感器和基于光栅的波导生物传感器上进行。如果一种或多种配体已经和它们各自的结合配偶体结合，则和一种或多种配体未与它们各自的结合配偶体结合的情形相比，光的反射波长移动。生物传感器覆盖有含一种或多种配体的一个或多个不同位置的阵列时，则从生物传感器的各个不同位置检测光的反射波长的最大值或透射波长的最小值。
在本发明的一个实施方案中，多种配体(例如，ECM配体)可以以阵列形式固定在本发明生物传感器上。然后将该生物传感器和包括结合配偶体(比如带有ECM配体受体(例如整合蛋白或粘着斑蛋白)的细胞)的关注的试样接触。仅有特异性地和配体结合的细胞固定于生物传感器上。一旦结合，这些细胞响应于刺激源，不像未结合的细胞。不需要使用酶或荧光标记物。对于高通量应用，生物传感器可以排列于阵列的阵列中，其中将包括特异性结合物质的阵列的几个生物传感器排列在阵列中。这种阵列的阵列可以，例如，浸入微量滴定板以一次进行许多试验。在另一实施方案中，生物传感器可以存在于纤维探针端部用于生物化学物质的体内检测。或者，可将细胞和ECM配体混合，或者作为细胞和ECM的混合物取得然后加入生物传感器表面。
本发明的一个实施方案允许直接检测细胞变化，比如细胞生长模式、细胞死亡模式的变化、细胞运动的变化、细胞尺寸或体积的变化或细胞粘着的变化，因为它们实时存在于比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器且不需要并入或者不受辐射测量、比色或荧光标记物(尽管需要的话可以使用标记物)的干扰。随着细胞被扰乱，可以检测到细胞性能和形态的变化。然后可以使用高速、高分辨率仪器(比如BIND ScannerTM(即，比色共振反射生物传感器系统))实时检测细胞变化，并使用相应算法定量化数据。参见，例如，美国专利号6,951,715和美国专利公开2004/0151626。通过组合该方法、仪器操作和计算分析，可以以无标记物的方式便利地实时监测细胞行为(即，在细胞响应于刺激源瞬间以及在细胞响应于刺激源的同时随着时间便利且方便地观察并定量细胞反应)。
比色共振反射生物传感器，比如SRU Biosystems，Inc.BINDTM技术(Woburn，MA)具有从纳米规模生物学系统测量关于大量附着的表面变化的能力。应用和方法(其中比色共振反射生物传感器在之前已实施)已随仪器分辨率改进而变化。之前，附着于比色共振反射生物传感器表面的细胞数量的测量是首要目标。然而，在观看细胞的一些较差分辨率图像时，注意到对于占据的像素数、信号/像素的强度、每个像素的PWV变化等，细胞给出有差别的信号。在设法减小这些数据的变化性时，以下变得清晰：变化性在于单独的细胞内，且它们的有差别的形态响应于刺激源。为了进一步研究这些细胞活动，构造了更高分辨率版本的BIND Scanner TM(即，比色共振反射生物传感器系统)。该扫描器具有比之前使用的扫描器更高分辨率的透镜。这些透镜具有约2-5、2-10、2-15、2-20、2-50、2-100、2-200或2-300微米的分辨率。另外，开发了以更好的分辨率实时分析细胞变化的方法。
本发明的另一实施方案提供检测细胞迁移和趋化性的方法。特别地，细胞可以在孔内，或者在阵列形式中，生长在比色共振反射光学生物传感器的一端上。通过使用半透膜或微流体通道，含有细胞的生物传感器的端部可以任选地和放置了趋化性剂的相对端分离。然后可以使用由成像光谱仪，或者可以移动以从生物传感器的多个位置读取的光纤探针所组成的检测系统以检测细胞的位置，并继而允许计算细胞迁移速度。
本发明的另一实施方案提供检测细胞生长模式的变化的方法。简单地说，细胞可以生长在比色共振反射光学生物传感器上；检测PWV；将试验试剂施用于细胞；检测PWV；并比较初始PWV和后续PWV，其中初始PWV相对于后续PWV之间的差异指示细胞生长模式的变化。PWV的差异与细胞生长模式的变化有关。
细胞生长模式的变化可以选自细胞形态、细胞粘着、细胞迁移、细胞增殖和细胞死亡。一种原核或真核细胞或者两种或更多种真核或原核细胞可以生长于生物传感器上。生物传感器可以包括选自微量滴定孔、微量滴定板、试管、陪替氏培养皿和微流体通道的容器的内表面。
通过测量光的反射波长的移动，本发明的生物传感器也能够从样品检测并定量结合配偶体的量，所述样品和界定阵列的一个或多个不同位置结合。例如，可将一个或多个不同位置的波长移动和其它不同位置的正和负对照相比，以测定结合的特异性结合物质的量。重要地，许多这样的一个或多个不同位置可以排列于生物传感器表面上，且生物传感器可以包括容器(比如约2、6、8、24、48、96、384、1536、3456、9600或更多孔的微量滴定板)的内表面。举例来说，96个生物传感器附着于固定器且各个生物传感器包括约100个不同位置时，可以同时进行约9600个生物化学试验。
检测系统
检测系统可以包括生物传感器、将光导向生物传感器的光源和检测从生物传感器反射的光的检测器。在一个实施方案中，可通过使用滤光器简化读数仪器，使得仅超过确定阈值的正结果触发检测。
光源可以从比色共振反射生物传感器顶面(即，固定了一种或多种特异性结合物质的表面)对其照明，或从其底面照明。通过测量本发明生物传感器的各个不同位置的共振波长移动，可以确定哪个不同位置具有和它们结合的结合配偶体。移动的程度可用于测定试样中的结合配偶体的量以及一种或多种特异性结合物质和试样的结合配偶体之间的化学亲合性。
生物传感器可以照明两次。第一次测量测定生物传感器上固定了一种或多种特异性结合物质的生物传感器阵列的一个或多个不同位置的反射光谱。第二次测量在将一种或多种结合配偶体施用于生物传感器后测定反射光谱。这两次测量之间的峰波长差异是特异性地和生物传感器或生物传感器的一个或多个不同位置结合的结合配偶体的量的量度。这种照明方法可以控制生物传感器表面中的小不均匀性，这些小不均匀性可以引起在峰共振波长中具有轻微变化的区域。该方法也可控制生物传感器上固定的特异性结合物质的变化的浓度或分子量。
一种用于照明生物传感器表面和用于收集反射光的检测系统是探针，它含有例如和光源连接的六条照明光学纤维，以及和光谱仪连接的单条收集光学纤维。纤维的数量不是关键的，照明或收集纤维的任何数量都是可能的。纤维排列成束，使得收集纤维位于束中心，且被六条照明纤维围绕。纤维束的端部和准直透镜连接，准直透镜将照明聚焦在生物传感器表面。
在这个探针排列中，照明和收集纤维是肩并肩的。因此，当正确地调节准直透镜以将光聚焦在生物传感器表面上时，观察到六个清楚界定的圆形照明区域，和中心暗区。因为生物传感器不散射光，而是反射准直的光束，因此没有光入射到收集纤维上，且观测不到共振信号。只有使准直透镜散焦直到六个照明区域重叠进入中心区域，才有任何光反射进入收集纤维。因为只有散焦时，稍微非准直的光才可以产生信号，生物传感器不以单个入射角照明，而是以一定范围的入射角照明。入射角的范围引起共振波长的混合。因此，测量到比另外可能的共振峰更宽的共振峰。
因此，希望照明和收集纤维探针在空间上分享相同的光程。可使用几种方法协同定位(co-locate)照明和收集光程。例如，在第一端和光源(它将光导向生物传感器)连接的单条照明纤维，和在第一端和检测器(它检测从生物传感器反射的光)连接的单条收集纤维，可以各自在它们的第二端连接第三纤维探针，第三纤维探针既可以充当照明器也可以充当收集器。第三纤维探针和生物传感器成法向入射角取向并支持反传播(counter-propagating)照明并反射光信号。
另一个检测方法包括使用光束分离器，它使单条照明纤维(其和光源连接)以和收集纤维(其和检测器连接)成90度角取向。光通过照明纤维探针导入光束分离器，光束分离器将光导向生物传感器。反射光导回到光束分离器，光束分离器将光导入收集纤维探针。光束分离器使照明光和反射光在光束分离器和生物传感器之间共享共同的光程，所以不散焦也可以使用完美准直的光。
角扫描
本发明的检测系统基于生物传感器表面的准直白光照明和反射光束的共振峰的光学光谱学测量。生物传感器表面上的分子结合通过峰波长值的移动而指示，同时波长增大相当于分子吸收增大。
如理论模拟和实验数据所示，共振峰波长强烈依赖于检测光束的入射角。由于共振峰波长的角依赖性，入射的白光需要良好准直。光束的角分散使共振峰变宽，并减小生物传感器检测灵敏度。另外，来自光谱测量的信号质量取决于光源的功率和检测器的灵敏度。为了获得高信噪比，对于每个检测位置可能需要非常长的积分时间，因此延长生物传感器板读数的整个时间。可将可调激光源用于光栅共振的检测，但是昂贵。
在本发明的一个实施方案中，这些劣势通过使用用于生物传感器照明的激光束，和用于反射光束功率测量的光检测器而克服。可以使用扫描镜装置改变激光束的入射角，并使用光学系统维持入射激光束的准直。参见，例如，“Optical Scanning(光学扫描)”(Gerald F.Marchall编，Marcel Dekker(1991)。任何类型的激光扫描均可使用。例如，可以以约2线到约1,000线每秒的速率产生扫描线的扫描装置可用于本发明。在本发明的一个实施方案中，扫描装置以约50线到约300线每秒扫描。
在一个实施方案中，反射光束穿过激光扫描光学系统的一部分，并通过单个光检测器测量。激光源可以是波长为例如780nm、785nm、810nm或830nm的二极管激光器。诸如这些的激光二极管在最高150mW的功率水平下易于获得，且它们的波长相当于Si光电二极管的高灵敏度。因此检测器可以基于光电二极管生物传感器。光源提供光给扫描器装置，它将光导入光学系统。光学系统将光导入生物传感器。光从生物传感器反射到光学系统，然后它将光导入光信号检测器。在一个实施方案中，随着扫描镜改变它的角位置，激光束在表面上的入射角在名义上以镜角位移的两倍变化。扫描镜装置可以是线性电流计，在约2Hz到最高约120Hz的频率下，和约10度到约20度的机械扫描角下工作。在该实例中，单次扫描可在约10毫秒内完成。也可使用共振电流计或多边形扫描器。用于角扫描的简单光学系统可以由一对透镜组成，它们之间具有共同焦点。光学系统可以设计成，为了激光准直和反射光束的收集而实现最佳性能。
角分辨率取决于电流计规格和反射光采样频率。假设电流计机械分辨率为30弧秒，相应的生物传感器角扫描分辨率为60弧秒，即0.017度。另外，假设采样速率为100千样品/秒，且在10毫秒内扫描20度。结果，量化步长(quantization step)为1000样品20度，即每样品0.02度。在这个实例中，如Peng和Morris(Experimental demonstration ofresonant anomalies in diffraction from two-dimensional gratings(二维光栅衍射中的共振异常的实验演示)，Optics Lett.，21：549(1996))所示，0.2度的共振峰宽度将被10个数据点覆盖，每一个相当于检测系统的分辨率。
这样的检测系统的优势包括：通过激光束的优良的入射光准直、由激光二极管的高光束功率引起的高信噪比、由单元素光检测器代替光谱仪引起的低成本和由角扫描引起的共振峰高分辨率。
细胞粘着和细胞响应试验
整合蛋白是和细胞外基质(ECM)相互作用的细胞表面受体并调节细胞内信号。整合蛋白对细胞支架组织、细胞运动性、细胞周期的调节、细胞和整合蛋白亲合力的调节、细胞和病毒的附着、细胞和其它细胞或ECM的附着负责。整合蛋白也对信号转导负责，转导是细胞借此在细胞内和细胞间将一种信号或刺激转化成另一种的过程。整合蛋白可以转导从ECM到细胞的信息和从细胞到其它细胞(例如，通过其它细胞上的整合蛋白)或到ECM的信息。整合蛋白和它们的ECM配体的列表可见于Takada等人，Genome Biology 8：215(2007)，如表1所示。
表1
Figure BPA00001423331700241
Figure BPA00001423331700251
缩写：ADAM，非整合蛋白金属蛋白酶(disintegrin metalloprotease)；BSP，骨唾液酸蛋白；CCN3，细胞外基质蛋白；COMP，软骨低聚基质蛋白；Cyr61，富半胱氨酸蛋白61；L1，CD171；LAP-TGF-β，潜在相关肽(latency-associated peptide)；iC3b，灭活补体组分3；PECAM-1，血小板和内皮细胞粘着分子1；uPA，尿激酶；uPAR，尿激酶受体；VEGF，血管内皮生长因子；vWF，冯·维勒布兰德(vonWillebrand)因子。
和ECM相互作用的其它细胞表面受体包括粘着斑蛋白(focaladhesion protein)。粘着斑蛋白。粘着斑蛋白形成将细胞的细胞支架和ECM连接的大络合物。粘着斑蛋白包括，例如，踝蛋白、α-放线素、细丝蛋白、纽蛋白(vinculin)、粘着斑激酶、桩蛋白、小细胞蛋白(parvin)、actopaxin、nexilin、丝束蛋白(fimbrin)、G-肌动蛋白、波形蛋白(vimentin)、同线蛋白(syntenin)和许多其它的。
而其它细胞表面受体可包括但不局限于可以和ECM相互作用的那些，包括分化簇(cluster of differentiation)(CD)分子。CD分子以多种方式起作用且经常充当细胞的受体或配体。和ECM相互作用的其它细胞表面受体包括钙粘着蛋白、粘附素和选凝素。
ECM具有许多功能，包括为细胞提供支持和锚定、将组织彼此分离和细胞内通讯的调节。ECM由纤维蛋白和葡萄糖氨基聚糖组成。葡萄糖氨基聚糖是通常附着于ECM蛋白以形成蛋白聚糖(包括，例如，硫酸肝素蛋白聚糖、硫酸软骨素蛋白聚糖、硫酸角质素蛋白聚糖)的糖聚合物。未作为蛋白聚糖发现的葡萄糖氨基聚糖是透明质酸。ECM蛋白包括，例如，胶原蛋白(包括纤丝、facit、短链、基底膜及其它形式的胶原蛋白)、纤连蛋白、弹力素和层粘连蛋白(ECM蛋白的另外的实例参见表1)。本文可以使用的ECM配体包括ECM蛋白、葡萄糖氨基聚糖、蛋白聚糖和透明质酸。
“特异性结合”或“对...特异性”指的是细胞表面受体(例如，整合蛋白或粘着斑蛋白等)以比其它非特异性分子更大的亲合力和同源细胞外基质配体结合。非特异性分子基本上不和细胞受体结合。例如，整合蛋白α4/β1特异性地和ECM配体纤连蛋白结合，但不特异性地和非特异性ECM配体胶原蛋白或层粘连蛋白结合。在本发明的一个实施方案中，细胞表面受体和细胞外基质配体的特异性结合(其中细胞外基质配体固定于表面，例如生物传感器表面)将把细胞固定于细胞外基质配体，并因此固定于该表面，从而细胞不被正常的细胞试验洗涤程序从表面上洗掉。
本发明的一个实施方案提供比色共振反射生物传感器技术或其它生物传感器技术(包括例如基于光栅的波导生物传感器技术)的用途，用于测量细胞表面受体对于它们的同源ECM配体的特异性识别，其中ECM配体固定在生物传感器表面上。通过细胞表面受体(比如整合蛋白)和固定于生物传感器的ECM配体的结合而特异性地将细胞固定于生物传感器表面，和非特异性地固定于生物传感器表面的细胞相比，细胞和生物传感器的结合以及细胞对刺激源的响应发生引人注目的变化。也就是说，细胞对刺激源的响应的检测被大大提高或增大，其中细胞通过ECM配体结合而固定于生物传感器。在本发明的一个实施方案中，细胞处在无血清培养基中。无血清培养基含有约10、5、4、3、2、1、0.5％或以下的血清。无血清培养基可以包括约0％血清或约0％到约1％血清。在本发明的一个实施方案中将细胞加入生物传感器表面，其中一种或多种ECM配体已固定于生物传感器表面。在本发明的另一实施方案中，将细胞和一种或多种ECM配体组合然后加入生物传感器的表面。
在本发明的一个实施方案中，将ECM配体纯化。纯化的ECM配体是基本上不含细胞材料、其它类型的ECM配体、化学前驱体、ECM配体制备中使用的化学品或它们的组合的ECM配体制品。基本上不含其它类型的ECM配体、细胞材料、培养基、化学前驱体、ECM配体制备中使用的化学品等的ECM配体制品，具有小于约30％、20％、10％、5％、1％或以上的其它ECM配体、培养基、化学前驱体和/或制备中使用的其它化学品。因此，纯化的ECM配体约为70％、80％、90％、95％、99％或以上纯。纯化的ECM配体不包括小于70％纯的ECM配体的未纯化或半纯化制品或混合物，例如胎牛血清。在本发明的一个实施方案中，ECM配体未经纯化并包括ECM蛋白和非ECM蛋白的混合物。未纯化的ECM配体制品的实例包括胎牛血清、牛血清白蛋白和卵清蛋白。
例如，表达α4/β1整合蛋白受体(已知它和纤连蛋白配体结合，但不和胶原蛋白或层粘连蛋白配体结合)的细胞在涂布了纤连蛋白的孔上产生PWV移动，该移动是在胶原蛋白或层粘连蛋白表面上观测到的PWV移动的约8到10倍大。在生物传感器表面(具有固定于它们的胶原蛋白或层粘连蛋白)上表达α4/β1整合蛋白受体的细胞的PWV移动类似于在涂布了BSA的对照孔上观测到的背景细胞附着信号。
在本发明的一个实施方案中，当ECM配体对于细胞表面上存在的细胞表面受体(例如，整合蛋白或粘着斑蛋白)是特异性的时，细胞和ECM配体结合的检测增大约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多倍(或2和20倍之间的任何范围)。在本发明的另一实施方案中，当通过对于细胞表面受体(例如，整合蛋白)特异性的ECM配体将细胞固定于生物传感器表面时，对刺激源的细胞响应的检测增大约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多倍(或2和20倍之间的任何范围)。
在一个具体实例中，缺乏细胞和ECM配体(它们固定于生物传感器表面)的细胞受体衔接可以导致细胞和生物传感器物理接触，并且非特异性地粘着在生物传感器上。然而，由于缺乏特异性的细胞受体/ECM配体结合，检测不到结合或刺激源响应或者检测到显著减少的结合或刺激源(例如，PWV的移动)。通过使导致细胞表面受体活化的条件最佳，本发明可以保证以增大的水平使细胞表面受体(比如整合蛋白)和它们的ECM配体结合。最佳化可通过使用不同的缓冲条件(例如，pH、盐、细胞营养物)就细胞的粘着-发信号(adhesion-signaling)对不同的ECM进行试验而实现。对试验仪器内的细胞密度进行试验并就粘着能力的拥有性对细胞健康进行评价。这些方法对于细胞健康和培养维持领域的技术人员是公知的。该最佳化导致对不同刺激源(比如GPCR、细胞因子或趋化因子)的细胞响应信号增大。
活细胞和生物传感器上的ECM配体的特异性结合以及细胞对刺激源的响应可通过本发明方法检测。本发明的试验可以包括，例如，将一种或多种ECM配体固定于生物传感器(它可以是，例如，涂布了TiO2的聚苯乙烯)的表面上，其中生物传感器作为一个或多个微孔板孔的底表面存在。生物传感器未涂有TiO2的任何表面部分可用例如卵清蛋白或牛血清白蛋白(BSA)封闭。在本发明的一个实施方案中，将一种或多种ECM配体连同卵清蛋白或BSA的组合物加入生物传感器表面并干燥储存。然后可以将生物传感器重新润湿以供稍后的试验中使用。例如，可将纤连蛋白、层粘连蛋白及胶原蛋白和卵清蛋白组合，施用于生物传感器并干燥储存。或者，可以连同卵清蛋白或FBS将多肽的组合物(已知其和不同的整合蛋白结合，比如和α-4/β-1整合蛋白结合的RGD(Arg-Gly-Asp)蛋白)固定于生物传感器表面上并干燥以供后续使用。已知和不同的整合蛋白结合的其它多肽包括在胶原蛋白中发现的和α11/β1整合蛋白结合的GFOGER蛋白和在胶原蛋白中发现的DGEA蛋白。
将细胞加入表面并任选培养一段时间。可任选在粘着调节剂的存在下将细胞加入生物传感器。粘着调节剂可以增大或减小细胞附着于生物传感器表面的能力，且可以是例如一种或多种抗体、金属、整合蛋白、ECM配体、小有机分子、蛋白或细胞受体蛋白。如果结合和未结合细胞的辨别通过眼睛完成，则可将不和表面结合的细胞洗掉。如果结合和未结合细胞的辨别用生物传感器完成，则不必将未结合的细胞从表面洗掉。结合的细胞可通过比色、发光、荧光或其它方式检测。结合的细胞可通过细胞数量或质量而定量。
任何类型的生物传感器均可用于本发明方法中。使用比色共振反射生物传感器时，细胞受体-ECM配体相互作用(例如，细胞表面受体和生物传感器表面上的ECM配体的特异性结合)促进涂布了ECM的生物传感器的本征吸收的峰波长(PWV)的移动，该试验不依赖于洗掉未结合的细胞，或依赖于加入任何标记形式以区别配位的细胞(即，和生物传感器表面结合的细胞)和未配位的细胞(即，不和生物传感器表面结合的细胞)。试验可以以微孔板(例如具有约96、384、1536、3,456、9,600或更多的孔的微孔板)形式进行，为进行小分子或生物制品的大规模筛分活动提供机会，这些小分子或生物制品改变超高通量筛分(uHTS)模式中的细胞粘着。uHTS模式指筛分超过约50,000、75,000、100,000种化合物或者更快速地筛分，且一般可以是1536孔板的形式，或者其它允许非常大量的条件或试验试剂(比如小有机分子)的经济试验的方法。
活细胞发信号活动(该发信号活动受多种细胞外刺激源促进)的测量能力可取决于细胞和生物传感器之间的ECM界面偶合(即，具有细胞表面受体(例如，整合蛋白)的细胞至固定于生物传感器表面上的ECM配体的固定)的存在，所述细胞外刺激源通过例如受体酪氨酸激酶、GPCR、瞬时受体电势通道、磷脂酶C、信号转导路径(例如P13激酶)、细胞因子、β-抑制蛋白路径响应、细胞支架重排、后生信号(例如，后生调节剂(例如组蛋白脱乙酰化酶)的变化可以引起信号转导的变化和细胞、核受体、转录因子、新陈代谢酶的ECM相互作用的下游变化)和离子通道响应而起作用。也就是说，在细胞没有通过和ECM配体(它们固定于生物传感器表面)的特异性结合而特异性地固定于生物传感器的情况下，这些对刺激源的细胞响应将不会被检测到或者仅仅被微弱地检测到。可以刺激细胞的化合物包括，例如，激素、生长因子、分化因子、成形素、细胞因子、趋化因子、胰岛素、EGF、ATP、UTP、羰基胆碱、乙酰胆碱、肾上腺素、蕈毒碱、诱发同渗容摩(osmolarity)变化的化合物、诱发膜去极化的化合物、小分子试验化合物、病毒、抗体、多肽、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体(scFv)、F(ab)片段、F(ab′)2片段、Fv片段、小有机分子(小有机分子可具有大于100和小于约2,500道尔顿(D)的分子量；在一个实施方案中，小分子小于2000，或小于1500或小于1000或小于500D)、细胞、细菌和生物样品，例如血液、血浆、血清、胃肠分泌物、组织或肿瘤的匀浆、滑液、粪便、唾液、痰、囊内液、羊水、脑脊髓液、腹膜液、肺灌洗液、精液、淋巴液、泪液和前列腺液。
生物传感器检测细胞(所述细胞带有细胞表面受体，例如整合蛋白受体等)的存在性的能力(仅当细胞表面受体特异性地和ECM配体结合)使细胞试验可以以均相的(homogenous)形式进行。也就是说，在将细胞加入试验表面后立即检测(例如通过比色共振反射检测)结合的细胞，无需洗涤未配合(即，未结合)的细胞。
本发明提供均相的试验，它在重建的系统中测量对于细胞外刺激源的细胞响应，该系统避免了冗长的、依赖于洗涤的传统方案。目前，在高通量筛分活动中使用的典型的基于细胞的试验比如FLIPR(荧光成像板读数器Fluorescent Imaging Plate Reader)需要冗长的依赖于洗涤的步骤。例如，传统的试验包括下列步骤：
1)在完全培养基中平板培养细胞过夜；
2调饥饿缓冲液洗涤细胞；
3)饥饿2到4h；
4调各种配体刺激细胞。
本发明的均相的试验可以包括用基本缺乏钙和镁的缓冲盐水溶液(比如Hank’s缓冲盐水溶液)洗涤细胞。基本缺乏或者缺乏钙和镁的缓冲盐水溶液含有小于约1、0.5、0.01、0.001％或更少的钙和镁。从细胞除去缓冲盐水溶液，并将等渗的乙二胺四乙酸盐螯合剂加入细胞。用缺乏钙和镁的缓冲盐水溶液中和等渗的乙二胺四乙酸盐螯合剂。上述步骤任选地进行。用任选缺乏钙和镁的缓冲盐水溶液洗涤细胞。生物传感器具有固定于表面的一种或多种ECM配体，其中ECM配体对于细胞的一种或多种细胞表面受体是特异性的。将细胞加入生物传感器表面并使它们附着于生物传感器表面。任选地，可在存在或不存在粘着调节剂的情况下将细胞加入生物传感器表面。任选地，生物传感器表面可具有和它固定的一种或多种细胞外基质配体。任选地，在加入生物传感器表面前，将细胞和一种或多种细胞外配体混合或者作为混合物取得。细胞可具有对所述一种或多种ECM配体特异性的细胞表面受体。
和测量细胞响应的其它无标记物或者依赖于标记物的系统相比，在通过细胞表面受体(例如，整合蛋白等)将细胞特异性地粘着(而不是非特异性的相互作用)时信号响应的增大是显著的优势。
通过加入背景单独组分(因为它们对于促进特别的细胞功能可以是需要的，或者它们被发现促进特别的细胞功能)，本发明方法可用于重建复杂生物学响应。也就是说，将纯化的ECM配体固定在生物传感器上然后将带有细胞表面受体(比如整合蛋白受体)的细胞平板培养在生物传感器上。如果建立了可行的ECM配体和细胞表面受体的相互作用，则对于阻碍细胞粘着的细胞外刺激源的细胞响应得到或正或负的移动(可能反映细胞表面受体和有关的粘着斑位置的进一步衔接(正移动)或脱离)。在这点上，通过加入纯化的ECM配体或刺激源，经过试验，可以容易地评价任何其它ECM配体或刺激源对给定的细胞响应的贡献。
在生物传感器(例如，比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器)上独特地监测特异性的细胞表面受体/细胞外基质相互作用的能力，允许研究许多独特的生物过程。例如，直接将整合蛋白和细胞迁移及趋化性相联系。因此，使用特别设计的具有嵌入的微流体的微孔板，可以创造共用孔向周围孔递送趋化性材料的梯度的系统。对于通过特异性的细胞表面受体/ECM配体结合而粘着的加入周围孔中的细胞，可以响应于进入周围孔的梯度，对细胞因子的活化以及迁移性质进行监测。被吸引至趋化剂的细胞将在微流体通道的进入点周围累积，并会产生正PWV信号(在孔中的那个位置监测到)，而和该趋化剂排斥的细胞会得到减小的PWV信号。这样的系统可用于已知存在趋化现象的任何细胞类型，除粘着细胞外，包括悬浮细胞比如血小板、中性白细胞、单核细胞等。
另一个适用的系统用于离子通道，包括配体门控离子通道(ligandgated ion channel)。整合蛋白可以调节离子通道并形成大分子络合物。此外，配体门控离子通道反馈并可控制整合蛋白活化和/或表达。因此独特地监测整合蛋白相互作用的能力可以涉及在配体门控离子通道上观察到的效果。
例如，可通过特异性的ECM配体将细胞固定于生物传感器表面(为此细胞含有互补整合蛋白或其它蛋白)并可采用静态信号。改变细胞培养基的离子条件或者其它离子通道刺激源的加入导致细胞体积的变化，原因是改变了同渗容摩或离子通道活性(电压-和配体-门控两者)。例如，高同渗容摩引起增大的细胞体积而低同渗容摩引起较小的细胞体积。离子通道的打开和关闭引起穿过细胞膜的离子流，这也被报道引起细胞体积变化。当细胞通过细胞表面受体锚定于最佳化的ECM配体上时，这个体积上的细胞变化可通过生物传感器测量。
另外，整合蛋白和GPCR(内源性和过度表达两者)或受体酪氨酸激酶(RTK)发信号之间存在联系。事实上，受体的整合蛋白家族在调节和RTK相关联的促有丝分裂信号转导路径上起关键作用。GPCR通过它们的信号转导路径最终集中于由RTK共享的相同路径。事实上，已经描述了遗传缺陷，其中受损的GPCR发信号导致粒细胞有缺陷的粘着(Blood(101)4437-4445(2003))。因此，监测整合蛋白和细胞外基质蛋白之间的特异性相互作用的变化的能力可用于监测GPCR和RTK响应。
例如，在发炎期间细胞因子和趋化因子参与良好组织的多受体系统，该系统将来自血液流的快速移动的单核细胞以及其它循环细胞的吸引协调至发炎组织周围的血管壁(内皮细胞)上。该过程首先通过选凝素调节的低亲合力细胞粘着，使循环细胞减速而触发，最后通过整合蛋白将细胞附着于发炎组织周围的内皮。趋化因子(通过许多不同种类的GPCR起作用)促进内-外发信号，这导致整合蛋白受体的打开，整合蛋白受体通常以其封闭构造存在(因此大多数血细胞的非粘性)。在它们的整合蛋白打开时，单核细胞和一些如血管细胞粘着分子(VCAM)的整合蛋白配体(它们的表达在发炎内皮内受短暂的正-调节)接触。附着后，单核细胞从VCAM脱离它们的整合蛋白受体并穿过血管壁并首先攻击触发发炎过程的微生物剂。
在另一实施方案中，生长因子和细胞外基质结合并调节细胞生长、分化和活化。生长因子通过GPCR或RTK起作用促进有丝分裂期间的细胞形状变化或转移(metastasis)期间的细胞迁移和入侵，其机理的重要部分包括整合蛋白的衔接水平的调节。将不同类型的ECM配体固定于生物传感器并将潜在生长因子加入生物传感器表面。在不同的涂层之间可以观察到特定的PWV移动差异。或者，将细胞加入表面上固定了ECM配体的生物传感器。细胞通过细胞表面受体和ECM配体特异性地结合。用不同的生长因子处理细胞并通过例如检测PWV移动来检测细胞的响应。
本发明的一个实施方案提供测定试验化合物是否影响细胞和细胞外基质配体的特异性结合的方法。该方法包括将第一细胞群加入第一比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器表面，比如微量滴定板孔。生物传感器表面包括固定的细胞外基质配体，其中第一细胞群具有对所述细胞外基质配体特异性的细胞表面受体。使第一细胞附着于第一生物传感器表面并对第一细胞测定峰波长值或信号。
将第二细胞群加入第二比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器表面，比如第二微量滴定板孔。第二生物传感器表面包括固定的细胞外基质配体。第二细胞群具有对所述细胞外基质配体特异性的细胞表面受体。将试验化合物加入第二生物传感器表面并使第二细胞附着于生物传感器的第二表面。对第二细胞测定峰波长值或信号。将对第一细胞获得的峰波长值或信号和对第二细胞获得的峰波长值或信号相比。如果对第二细胞的峰波长值或信号基本上不同于对第一细胞的峰波长值或信号，则试验化合物影响细胞和细胞外基质配体的特异性结合。
本发明的另一实施方案提供识别影响细胞粘着的化合物的方法。将一种或多种细胞外基质配体固定于比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面，其中细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体。将细胞加入生物传感器。或者，将细胞和一种或多种细胞外基质配体混合或者作为细胞和ECM的混合物取得，其中细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体。然后将细胞和一种或多种细胞外基质配体加入比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面。用试验化合物处理细胞。检测比色共振反射光学第一PWV或信号并和来自未用试验化合物处理的对照细胞的第二PWV或信号相比，以测定试验化合物是否影响细胞粘着。试验化合物可以是调节G蛋白偶合的受体、离子通道、P13激酶、瞬时受体电势通道或磷脂酶C的活性的化合物。任选地，用试验化合物处理细胞后，可将已知影响细胞粘着的试剂加入试验细胞和加入对照细胞。调节指的是蛋白或化合物的活性改变，例如，被抑制或增大。
本发明的另一实施方案提供识别影响细胞粘着的经修饰ECM配体的方法。如纤连蛋白和胶原蛋白的ECM配体是大蛋白性质的材料。细胞整合蛋白和ECM配体的特定的氨基酸序列结合，不需要或者不严格要求较大的蛋白内容。因此经修饰的ECM配体可以独自是非常短的肽(例如，含有RGD基元的多肽)或者融合至另一个蛋白比如IgG的Fc区域。经修饰的ECM配体可以是已知的和细胞上特别的整合蛋白或粘着蛋白结合的稍微修饰的氨基酸序列。经修饰的序列的目的可能是使治疗应用更易于处理、减小细胞结合的强度但不改特异性、使特异性更好/更紧密、使细胞适应附着于其它材料比如矫形、支架(stent)或其它身体植入体、修饰用于选择性细胞类型的附着的矫形、支架或其它身体植入体。
将细胞施用于比色共振反射光学生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面，其中经修饰的ECM配体固定于生物传感器的表面。将已知影响细胞粘着的试剂加入细胞。对细胞检测比色共振反射光学第一PWV或信号并和来自对照细胞(对照细胞加入到比色共振反射光学生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面，其中未经修饰的ECM配体固定于生物传感器的表面)的第二PWV或信号相比，以测定试验化合物是否影响细胞粘着。
本发明的另一实施方案提供测定转染细胞是否产生重组蛋白的方法。当细胞用编码蛋白的核酸转染时，细胞必须经过试验以测定细胞是否确实表达该蛋白。可将已知和细胞表面上表达的蛋白互相作用的一种或多种细胞外基质配体或同源蛋白固定于比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面。将已用编码重组蛋白的核酸分子转染并具有对一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体的细胞加入生物传感器的表面。或者，转染的细胞可以和一种或多种细胞外基质配体混合，或者作为与该配体的混合物取得，然后加入生物传感器的表面。测定第一PWV或信号。将调节剂加入生物传感器，和不表达重组蛋白的转染细胞相比，该调节剂在表达重组蛋白的转染细胞中引起差别响应。例如，可以试验经转染以过度表达特别的G-蛋白偶合的受体(GPCR)或受体酪氨酸激酶(RTK)的细胞，使用生物传感器分别试验该细胞对GPCR或RTK已知配体的特异性响应。另外，可以使用已知配体(一或多种)对任一转染的细胞系统和未转染的“亲代”细胞系(“parental”cell line)进行响应的比较。对细胞测定第二PWV或信号。将第一峰波长值或信号和第二峰波长值或信号相比。如果第二峰波长值或信号基本上不同于第一峰波长值或信号，则转染细胞表达重组蛋白。在测定第二PWV或信号之前可进行另外的步骤。例如，可以测定选择培养基(例如，含有抗生素的培养基)和第二PWV或信号。在本发明的一个实施方案中，使用高分辨率扫描器(具有约1微米到约300微米的分辨率的扫描器)测定PWV。
以引用的方式，将本文无论何处引用的所有专利、专利申请和其它科学或技术著作整体并入。本文说明性地适当描述的本发明，可以在没有本文具体公开的任何一个或多个元素、一个或多个限制的情况下实施。因此，例如，本文处的各种情况下，术语“包括”、“基本由...组成”和“包含”的任意一项可替换为其它两个术语的任何一个，同时保留它们的普通含义。所采用的术语和表述用作描述的术语而非限制的术语，且在使用这些术语和表述时，没有将所显示或描述的特征或其部分特征的任何等价体排除在外的意图，而是认为在本发明要求保护的范围内可能有多种修改。因此，应当理解，尽管通过实施方案、任选特征具体公开了本发明，但本领域技术人员可寻求本文公开的概念的修改和变化，且认为这些修改和变化在说明书和所附权利要求限定的本发明范围内。
另外，本发明的特征或方面根据马库什组或其它代替组描述时，本领域技术人员将认识到本发明也因而通过该马库什组或其它组的任何单独成员或者成员的亚组而描述。
实施例
实施例1
现有用于研究细胞-蛋白相互作用和其它细胞相互作用的技术费时且劳动密集，因为它们可包括许多步骤，包括放射性同位素或荧光标记、洗涤、封闭和检测。参见例如表2。现有用于研究细胞-蛋白相互作用和其它细胞相互作用的技术也可使用大量昂贵试剂。本发明提供用于测定细胞相互作用的组合物和方法，比常规方法更快，且需要使用比常规方法更少的试剂。
本方法和组合物提供无标记物、简单、高通量的试验，以识别细胞对特异性结合物质(包括蛋白)的专一性、细胞迁移、细胞趋化性、特异性结合物质-细胞相互作用、细胞-细胞外基质相互作用和细胞-细胞相互作用。
在本发明的一个实施方案中，该方法和组合物可以显著减少细胞试验中的试剂用量。和微量滴定板整孔试验(whole well assay)相比，试剂用量可以至少减少到1/100。更重要地，本发明的简单成像细胞试验可以以更大的准确度和重现性代替现有的耗时和劳动密集的细胞迁移试验和细胞趋化性试验。
比色共振反射光学生物传感器技术对生物分子及生物学细胞和生物传感器表面互相作用而导致的光学性质变化非常敏感。该特征为这些生物传感器在生物学应用(比如研究生物分子之间的相互作用，包括生物分子和细胞表面上结合的生物分子(比如细胞表面受体或细胞表面标记)之间的相互作用)中提供了重大优势。由于比色共振反射光学生物传感器技术直接检测生物相互作用，因此不需要荧光标记物、放射性同位素标记物或生物学标签比如酶和生物学基元。比色共振反射光学生物传感器细胞附着试验为直接检测分子和它在细胞表面上的配对物之间的相互作用提供新的方法。比色共振反射光学生物传感器细胞附着试验的原理是，经固定的目标分子和它在细胞表面上的配对物之间的亲合结合将导致细胞和生物传感器表面相互作用，其中该相互作用可检测。
本发明的一个实施方案提供包括比色共振反射光学生物传感器的容器，其中比色共振反射光学生物传感器构成该容器的内表面。例如，比色共振反射光学生物传感器可以构成该容器的底表面。将一种或多种特异性结合物质(比如两种或更多种特异性结合物质)固定在容器的内表面(其包括比色共振反射光学生物传感器)上的两个或更多个不同位置。在两个或更多个不同位置可能有不同量的一种特异性结合物质。容器可以包括，例如，微量滴定孔、试管、陪替氏培养皿或微流体通道。本发明的一个实施方案提供包括一个或多个微量滴定孔的微量滴定板，其中该一个或多个微量滴定孔的底表面包括比色共振反射光学生物传感器。一种或多种特异性结合物质可以固定于各个微量滴定孔的底表面上的两个或更多个不同位置。
本发明提供检测一种或多种细胞和一种或多种特异性结合物质的结合的方法。在本发明的一个实施方案中，将一种或多种细胞施用于容器的内表面。可使用任何类型的细胞，包括，例如，原核细胞、真核细胞、人造细胞、细胞膜或人造细胞膜。细胞可以作为例如培养物中的粘着细胞或者作为培养物中的悬浮细胞而生长。容器的内表面包括比色共振反射光学生物传感器，其中两种或更多种特异性结合物质固定于容器的内表面(它包括比色共振反射光学生物传感器)上的两个或更多个不同位置。用光照明该容器并检测每个不同位置的一个或多个峰波长值(PWV)。峰波长值(PWV)是结合物质和/或与生物传感器结合的细胞的相对量度。如果一种或多种细胞已经和特异性结合物质结合，则PWV在结合了一种或多种细胞的不同位置移动。将移动的PWV和例如未结合特异性结合物质的一部分生物传感器、或和仅结合了特异性结合物质的一部分生物传感器或和给定的基线PWV相比。
该一种或多种特异性结合物质可以在包括比色共振反射光学生物传感器的容器的内表面上排列在例如不同位置的阵列中。这些不同位置可以界定直径约50-500微米的微阵列点。该一种或多种特异性结合物质可以随机排列于容器的内表面上。该一种或多种特异性结合物质例如可以通过诸如物理吸附、化学结合、电化学结合、静电结合、疏水结合和亲水结合的方法固定于容器的内表面(其包括比色共振反射光学生物传感器)上。
本发明的另一实施方案提供检测一种或多种细胞和特异性结合物质的结合的方法。该方法包括将一种或多种特异性结合物质(比如两种或更多种特异性结合物质)固定于容器内表面上的两个或更多个不同位置，其中容器的内表面包括比色共振反射光学生物传感器，并用光照明容器。测定每个不同位置的一个或多个峰波长值。将一种或多种细胞施用于容器的内表面。用光照明容器并对每个不同位置检测一个或多个峰波长值。比较峰波长。如果该一种或多种细胞和特异性结合物质结合，则PWV在结合了特异性结合物质的不同位置移动。
在一个工作实施例中，包括线性光栅比色共振反射光学生物传感器作为内表面的微量滴定孔具有1μl抗-人CD3和1μl抗-小鼠CD3单克隆抗体，其固定于该生物传感器的表面上。参见图1和图2。扫描微量滴定孔并分析抗体涂层。参见图2。将Jurkat细胞(1X105)用生物传感器表面培养20分钟后，扫描微量滴定孔并观察细胞附着模式，如图2所示。
该试验清楚地证明，Jurkat细胞和96微孔板生物传感器的孔内覆盖有ahCD3的不同位置相互作用，且从带有抗-小鼠CD3单克隆抗体的不同位置没有观察到可检测信号。
这些细胞附着试验可用于识别例如细胞粘着、迁移、趋化和入侵中涉及的分子。该试验也可用于识别调节例如细胞粘着、迁移、趋化和细胞入侵的细胞表面分子。另外，这些试验可以提供研究细胞-细胞相互作用、细胞-基质相互作用和细胞-分子相互作用的新的工具。竞争细胞附着试验可以为医药药物筛分提供新的工具以识别化合物，所述化合物特异性地靶向细胞相互作用中所涉及的分子。
表2.
Figure BPA00001423331700401
Figure BPA00001423331700411
实施例2
免洗CBA方案的开发：将CHO和HEK细胞直接在饥饿培养基中平板培养
使用生物传感器技术为基于细胞的试验建立的第一个方案主要依赖于称为细胞洗涤和饥饿的两个重要步骤。
这些步骤对于减小试验时间是重要的，因为细胞采收目前通过大规模培养物的胰蛋白酶处理而进行。细胞单层的胰蛋白酶消化是有效的且可重现的并可以容易地适应大多数细胞系。实际上，胰蛋白酶介导的细胞采收是两步骤过程，由此补充的组织培养基在没有二价阳离子的缓冲液(Hank′s缓冲盐水溶液，HBSS)中从组织培养瓶洗掉，接着是EDTA存在下的细胞连接(cellularjunction)的胰蛋白酶消化。Ca++的缺乏使蛋白-蛋白相互作用活动减弱和/或中止，该活动介导细胞-细胞(粘着、间隙和紧密连接，取决于细胞类型)接触和细胞-底物(细胞外，ECM)相互作用，受整合蛋白和其它EMC受体的介导。这些跨-膜组分连同所有其它跨膜受体的蛋白水解，产生不能响应于细胞外刺激的均相的细胞悬浮液。
对每个细胞系将细胞在合适的细胞培养基中(用来自不同的动物来源(牛、马和小牛或者胎儿等)的所需血清补体进行补充)平板培养过夜，保证细胞生长在同渗容摩-平衡、pH-受控的富-氨基酸、-维生素、-糖和-生长因子的培养基中。这使培养在生物传感器板上的细胞能完全恢复，然后通过胰蛋白酶处理而采收。
尽管细胞已经重新建立了跨膜蛋白的完全补充并具有经修复的细胞-细胞和细胞-底物相互作用，富-生长因子培养基的存在可以掩蔽由生长因子受体(RTK和GPCR)促进的细胞刺激或者对激素、细胞因子、生长因子和任何通过以下路径发信号的细胞外刺激源的细胞响应，所述细胞外刺激源通过诸如PI-3激酶/Akt路径、Ras超家族小G-蛋白/MAP/Erk/JNK激酶路径的路径发信号。另一方面，氨基酸的存在触发mTor/Akt/S6-激酶路径的活化，减弱通过这些AGC激酶的信号传输。
如上所述，除去补充的培养基因此是关键步骤，它拓宽了确立给定的目标或路径是否将易于通过生物传感器技术处理的可行性研究。
伴随在化合物和/或配体试验前洗涤微量滴定生物传感器板的需要，出现几个问题。缺乏精确的细胞洗涤器或自动液体处理(ALH)导致板的各个孔中的可变体积，这继而导致被试验的化合物的可变稀释，使得不能进行精确的直接的孔对孔的比较。然而，使用ALH系统的精确的板洗涤导致每个板可能花费12到25分钟的冗长方案。为了克服细胞-洗涤和饥饿的瓶颈步骤，我们已研究了可选择的方案：a)省略使用胰蛋白酶的细胞采收；和b)仍然依赖胰蛋白酶采收，但在使细胞保持在悬浮液中的同时使通常粘着的细胞恢复。这些选项已使我们可以将细胞在营养物减少或耗尽的培养基中和生长因子减少或耗尽的培养基中平板培养。也就是说，可将细胞直接在饥饿缓冲液中平板培养。
如下所述将维尔烯(Versene)采收的CHO和HEK细胞平板培养在有或者没有血清涂层的饥饿培养基中。用缺乏Ca++和Mg++的HBSS温和地洗涤约80％的汇合的细胞单层。将细胞置于HBSS 2到3分钟后，吸出缓冲液并在37℃用等渗的维尔烯溶液(Gibco)处理细胞约10分钟。通过另外轻叩2分钟将细胞从瓶中释放。通过将维尔烯稀释于10体积的HBSS而将它中和，所述HBSS含有10mM Hepes、5mM葡萄糖、2mM Ca++和Mg++以及1％青霉素/链霉素抗生素(SM)，并将细胞旋落(spin down)，并用SM洗涤一次，然后在含有25μl SM的384传感器上平板培养。将细胞旋落并使之附着不同的时间段。
正刺激源对照包括(1)胰岛素和ATP或(2)UTP，它们分别刺激RTK和GPCR型内源性表达的受体。这些刺激源在洗涤和饥饿后，在完全培养基中平板培养过夜的细胞中产生100-300pm的强健的PWV移动，在没有聚-D-赖氨酸(PDL)或血清预涂层的生物传感器板上，在补充的HBSS中平板培养的维尔烯采收的细胞都不能和对照孔(没有刺激源)区分，移动＜20pM。在具有PDL且没有血清预涂层的传感器板上，在补充HBSS中培养的维尔烯采收的细胞的刺激源响应不能和对照孔(没有刺激源)区分，移动＜20pM。在涂有增大的血清浓度(没有PDL预涂层)的TiO2生物传感器板传感器上，在补充的HBSS中培养的维尔烯采收的细胞对刺激源的细胞响应得到事实上不能和完全培养基中平板培养过夜的细胞区分(就动力学而言)的移动大小和EC50值。
将胰蛋白酶采收的CHO和HEK细胞平板培养在血清涂层浓度变化的饥饿培养基中。用HBSS温和洗涤约80％汇合的细胞单层然后胰蛋白酶消化2到5分钟。用完全培养基使胰蛋白酶消化停止，并将细胞旋落并再次悬浮于完全培养基，然后使之在50ml Falcon管中的完全培养基(约100K细胞/ml)中于室温下“恢复”(也可完成37℃下的保温)。
7小时后，使细胞旋落并用HBSS洗涤两次，所述HBSS含有10mM Hepes、5mM葡萄糖、2mM Ca++和Mg++以及1％Pen/Strep(SM)的，然后平板培养在含有25μl的SM的384传感器上。使细胞旋落并使之附着过夜。
按此方式平板培养的细胞看起来不能和完全培养基中培养的细胞区分并得到强健的响应。PWV移动响应的动力学、PWV移动的大小或幅度和刺激源的EC50剂量)对ATP(25uM)、UTP(100uM)、EGF(50nM)、胰岛素(1.5uM)、前列腺素(100pM)和蕈毒碱(10uM)进行了测试。响应在科学文献中报道的常见平板培养过夜条件中可见的那些响应的约60％到120％的范围内。
除省略细胞洗涤步骤并改进工作流外，免洗方案将更为重要地允许使用HTS形式的生物传感器，它使用1536或更多的孔板。将ECM配体(一或多种)的涂层加入工作体积的一半，然后将细胞加入另一半，然后加入化合物，这些将1536孔板的使用简化成免洗的、三个加入步骤的方案。
其它方法可以为那些通过本文描述的方案不能附着并发出信号的细胞提供代替方案。在低血清(0.25％)、其它方面的完全培养基中平板培养细胞，可帮助增敏细胞或新近解冻的细胞(直接将液体N2存料平板培养和试验)。完全培养基的稀释可以证明足以使细胞饥饿并降低磷酸-发信号路径。本发明方法使饥饿缓冲液培养基中不必包含大量血清以提高敏感的初级细胞的性能。
具有多种纤连蛋白和胶原蛋白浓度的涂层比色共振反射生物传感器证实，饥饿缓冲液中的直接细胞平板培养对于下列细胞类型是可行的：CHO-K1、HEK-293、THP-1(内源性受体)和重组细胞mP-M4、mP-M5、mP-ET和CHO-M3，除了别的以外。
根据细胞类型和表面涂层，使用“不洗”、短平板培养方案的细胞响应提供约10-300pm之间的PWV移动、或约100-200pm移动或约＞150pm。
实施例3：比色共振反射生物传感器的胶原蛋白涂布和储存：使用mP-M4细胞的性能评价
对用细胞外基质(ECM)蛋白胶原蛋白(COLL)涂布比色共振反射生物传感器并储存得到的经涂布的生物传感器进行条件评价。胶原蛋白I已被识别为培养底物，它调节肌细胞、肝细胞、脊神经节、胚胎肺细胞、施万(Schwann)细胞连同其它初级细胞的附着。胶原蛋白对14Chem-1细胞是特异性的ECM配体。当在新近沉积的胶原蛋白覆盖的比色共振反射生物传感器上平板培养时，这些细胞过度表达蕈毒碱性GPCR M4，且以剂量依赖的方式响应于碳酰胆碱。
用不同浓度的胶原蛋白以偶联排列涂布三个不同的比色共振反射384-孔生物传感器板。这些板干燥储存或储存于甘油或者新近制成。将新近制成的胶原蛋白板和已经制成并干燥的板以及制成并储存在60％甘油溶液中的板相比。
将裸露的比色共振反射TiO2 384孔生物传感器板用血浆(plasma)处理2分钟。ECM蛋白购自Sigma-Aldrich。胶原蛋白来自于小牛皮溶液，经无菌过滤，是在0.1M乙酸中的1mg/ml蛋白，经细胞培养试验。纤连蛋白来自于人血浆，经细胞培养试验。
该板用1X PBS水合15分钟并使用Biotek洗板器(plate washer)用1X PBS洗涤。将ECM涂布溶液(25ml/孔)加入孔。在1X PBS中无菌制备ECM、PDL和FBS涂布溶液。以几个浓度(0.62、1.25、2.5、5.0、10.0、20.0ug/ml)使用胶原蛋白，并以2mg/ml使用PDL和2％使用FBS。在37℃用2小时将胶原蛋白涂布在板上，然后使用洗板器用1XPBS洗涤。在室温下，生物传感器用含0.2％BSA的PBS封闭30分钟，然后使用洗板器用1X HBBS洗涤。将25ml饥饿缓冲液(HBSS，补充了2mM Ca++和Mg++、5mM葡萄糖[最终10mM]、10mMHepes、青霉素和链霉素1％v/v和0.01％BSA)加入板中并对孔测定PWV。这是饥饿缓冲液基线。
在组织培养(TC)瓶中隔夜生长细胞单层并洗涤。在37℃通过胰蛋白酶处理约5到6分钟使细胞分离。mP-M4及mP-M5对聚苯乙烯TC瓶的附着特别牢固。用完全培养基中和胰蛋白酶并使细胞旋落。将细胞再次悬浮于完全培养基(约25ml每瓶，80到90％汇合度)并在TC恒温箱中培养3到4小时。使细胞旋落并再次悬浮于饥饿缓冲液中。然后读取细胞用于平板培养。
将饥饿缓冲液中的细胞悬浮液(25ml)(约40,000个细胞)加入384生物传感器板的孔。在离心机上使细胞板旋转(2分钟)以帮助细胞附着。在37℃的三小时保温期间使细胞再次附着于生物传感器板。对孔测定PWV。这是细胞附着读数。将25μl的碳酰胆碱溶液(细胞刺激源)加入生物传感器板的孔。用碳酰胆碱处理表达M1-M5蕈毒碱性受体的细胞得到500到2000pm范围内的正PWV移动。细胞通过GPCR受体和碳酰胆碱结合且生物传感器可以通过PWV移动而检测对GPCR结合活动的细胞响应。
在细胞试验2天前涂布两个板，一个干燥储存且一个甘油储存。第三个板在细胞试验当天“新近”制成。制造单个深孔复合板，它含有碳酰胆碱从10mM开始的连续稀释(1/3)，并覆盖11个浓度+缓冲液对照，各个浓度作为柱子的复制组而加载。
具有胶原蛋白的生物传感器涂层提供表面，和经PDL和FBS涂布的表面相比，该表面产生优越的mP-M4细胞性能和更低的EC50浓度。和新制及甘油储存的胶原蛋白板相比，干燥的胶原蛋白上的细胞移动明显更高，但得到更差的EC50响应。甘油储存的经胶原蛋白涂布的板具有和新制的胶原蛋白板类似的结果。这些实验证明，对于Mp-M4细胞，和已经干燥的表面相比，对新制的PDL表面观察到低至1/10的EC50浓度。甘油储存的板在-20C展示和新制的板相同的性能。

Claims (27)

1.细胞对刺激源的响应的检测方法，其包括：
(a)(i)将一种或多种细胞外基质配体固定于比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面，其中所述细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；和将所述细胞加入所述生物传感器；或
(ii)将细胞和一种或多种细胞外基质配体混合，其中所述细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；和将所述带有一种或多种细胞外基质配体的细胞加入比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面；
(b)将所述细胞暴露于刺激源；和
(d)检测所述细胞对所述刺激源的响应。
2.权利要求1的方法，其中所述刺激源是调节以下的活性的化合物：G蛋白-偶合的受体、离子通道、P13激酶、瞬时受体电势通道、磷脂酶C、受体酪氨酸激酶、细胞因子、β-抑制蛋白路径响应、细胞支架重排、后生信号或信号转导路径。
3.权利要求1的方法，其中(a)的细胞处于无血清培养基中。
4.权利要求1的方法，其中和检测方法中不包括一种或多种细胞外基质配体的方法相比，细胞对刺激源的响应的检测增大。
5.用于试验的细胞的制备方法，其包括：
(a)用缺乏钙和镁的缓冲盐水溶液洗涤细胞；
(b)从所述细胞除去所述缺乏钙和镁的缓冲盐水溶液；
(c)将等渗的乙二胺四乙酸盐螯合剂加入所述细胞；
(d)用缓冲盐水溶液中和所述等渗的乙二胺四乙酸盐螯合剂；
(e)用缓冲盐水溶液洗涤所述细胞；
(f)将所述细胞加到生物传感器表面并使所述细胞附着于生物传感器的表面。
6.权利要求5的方法，其中在粘着调节剂的存在下将所述细胞加入所述生物传感器表面。
7.权利要求5的方法，其中所述生物传感器表面具有固定于其的一种或多种细胞外基质配体，或者，其中在将所述细胞加到生物传感器表面前，将所述细胞和一种或多种细胞外配体混合。
8.权利要求7的方法，其中检测所述细胞和所述细胞外基质配体的结合。
9.细胞对刺激源的响应的检测方法，其包括：
(a)用缓冲盐水溶液洗涤所述细胞；
(b)(i)将一种或多种细胞外基质配体固定于比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面，其中所述细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；和将所述细胞加入所述生物传感器；或
(ii)将细胞和一种或多种细胞外基质配体混合，其中所述细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；和将所述带有一种或多种细胞外基质配体的细胞加入比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面；
(c)将所述细胞暴露于刺激源；和
(d)检测所述细胞对所述刺激源的响应。
10.权利要求9的方法，其中在步骤(a)之前，进行下列步骤：
(i)用缺乏钙和镁的缓冲盐水溶液洗涤细胞；
(ii)从所述细胞除去所述缺乏钙和镁的缓冲盐水溶液；
(iii)将等渗的乙二胺四乙酸盐螯合剂加入所述细胞；
(iv)用缓冲盐水溶液中和所述等渗的乙二胺四乙酸盐螯合剂。
11.权利要求9的方法，其中在粘着调节剂的存在下将所述细胞加入所述生物传感器表面。
12.权利要求9的方法，其中所述刺激源是调节以下的活性的化合物：G蛋白-偶合的受体、离子通道、P13激酶、瞬时受体电势通道、磷脂酶C、受体酪氨酸激酶、细胞因子、β-抑制蛋白路径响应、细胞支架重排、后生信号或信号转导路径。
13.测定试验试剂是否影响细胞运动的方法，其包括：
(a)将一种或多种细胞外基质蛋白配体固定于微量滴定板的孔底部，其中所述孔底部包括比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器，且其中所述孔具有微流体通道，所述微流体通道可将试验试剂递送至该孔内的一个位置；
(b)将具有对所述一种或多种细胞外基质蛋白配体特异性的细胞表面受体的细胞加入所述孔；
(c)使用所述微流体通道将试验试剂递送至所述孔；其中所述试验试剂是疑似趋化剂；
(d)检测所述细胞在所述孔中的运动，其中如果检测到所述细胞在所述孔中的运动，则所述试验试剂影响所述细胞的运动。
14.权利要求13的方法，其中所述试验试剂是调节以下的活性的化合物：G蛋白-偶合的受体、离子通道、P13激酶、瞬时受体电势通道、磷脂酶C、受体酪氨酸激酶、细胞因子、β-抑制蛋白路径响应、细胞支架重排、后生信号或信号转导路径。
15.测定试验化合物是否影响细胞和细胞外基质配体的特异性结合的方法，包括：
(a)将第一细胞加入第一比色共振反射生物传感器表面或第一基于光栅的波导生物传感器表面，其中所述生物传感器表面包括固定的细胞外基质配体，其中所述第一细胞具有对所述细胞外基质配体特异性的细胞表面受体，使所述第一细胞附着于所述第一生物传感器的表面，和对所述第一细胞测定峰波长值或信号；
(b)将第二细胞加入第二比色共振反射生物传感器表面或第二基于光栅的波导生物传感器表面，其中所述第二生物传感器表面包括固定的细胞外基质配体，其中所述第二细胞具有对所述细胞外基质配体特异性的细胞表面受体，将试验化合物加入所述生物传感器表面，使所述第二细胞附着于所述生物传感器的表面，和对所述第二细胞测定峰波长值或信号；和
(c)比较对所述第一细胞获得的峰波长值或信号和对所述第二细胞获得的峰波长值或信号；其中如果对所述第二细胞的峰波长值或信号基本上不同于对所述第一细胞的峰波长值或信号，则所述试验化合物影响细胞和细胞外基质配体的特异性结合。
16.权利要求15的方法，其中所述试验化合物是调节以下的活性的化合物：G蛋白-偶合的受体、离子通道、P13激酶、瞬时受体电势通道、磷脂酶C、受体酪氨酸激酶、细胞因子、β-抑制蛋白路径响应、细胞支架重排、后生信号或信号转导路径。
17.实时分析细胞变化的方法，其包括：
(a)将一种或多种细胞外基质配体固定于比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面；
(b)将细胞加入所述生物传感器，其中所述细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；
(c)将所述细胞暴露于刺激源；和
(d)使用分辨率为约2到10微米的检测装置检测所述细胞对所述刺激源的响应。
18.权利要求17的方法，其中所述刺激源是调节以下的活性的化合物：G蛋白-偶合的受体、离子通道、P13激酶、瞬时受体电势通道、磷脂酶C、受体酪氨酸激酶、细胞因子、β-抑制蛋白路径响应、细胞支架重排、后生信号或信号转导路径。
19.权利要求17的方法，其中所述细胞变化是细胞生长模式、细胞死亡模式、细胞运动、细胞尺寸或体积或者细胞粘着中的变化。
20.检测细胞响应变化的方法，其包括：
(a)将一种或多种细胞外基质配体固定于比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面；
(b)在无血清培养基中将细胞加入所述生物传感器，其中所述细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；
(c)将所述细胞暴露于刺激源而不洗去所述无血清培养基；和
(d)检测所述细胞对所述刺激源的响应。
21.权利要求20的方法，其中所述刺激源是调节以下的活性的化合物：G蛋白-偶合的受体、离子通道、P13激酶、磷脂酶C、受体酪氨酸激酶、细胞因子、β-抑制蛋白路径响应、细胞支架重排、后生信号或信号转导路径。
22.比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器表面，其中所述生物传感器通过将卵清蛋白或胎牛血清和两种或更多种细胞外基质配体施用于所述生物传感器的表面并将所述生物传感器的表面干燥而制备。
23.影响细胞粘着的化合物的识别方法，其包括：
(a)(i)将一种或多种细胞外基质配体固定于比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面，其中所述细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；和将所述细胞加入所述生物传感器；或
(ii)将细胞和一种或多种细胞外基质配体混合，其中所述细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；和将所述带有一种或多种细胞外基质配体的细胞加入比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面；
(b)用试验化合物处理所述细胞；
(c)检测比色共振反射光学的第一PWV或信号，并将所述第一PWV或信号和来自未用所述试验化合物处理的对照细胞的第二PWV或信号比较，以测定所述试验化合物是否影响所述细胞的粘着。
24.权利要求23的方法，其中所述试验化合物是调节以下的活性的化合物：G蛋白-偶合的受体、离子通道、P13激酶、瞬时受体电势通道或磷脂酶C。
25.权利要求23的方法，其中在(b)后将粘着调节剂加入所述细胞，其中所述对照细胞也用所述粘着调节剂处理。
26.影响细胞粘着的经修饰的细胞外基质(ECM)配体的识别方法，包括：
(a)将细胞施用于比色共振反射光学生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面，其中将经修饰的ECM配体固定于所述生物传感器的表面；
(b)将粘着调节剂加入所述细胞；
(c)对所述细胞检测比色共振反射光学的第一PWV或信号，并将所述第一PWV或信号和来自对照细胞的第二PWV或信号比较，所述对照细胞加到比色共振反射光学生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面，其中将未经修饰的ECM配体固定于所述生物传感器的表面，以测定所述试验化合物是否影响细胞粘着。
27.测定转染细胞是否生产重组蛋白的方法，其包括：
(a)将一种或多种细胞外基质配体固定于比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面；
(b)将细胞加到所述生物传感器的表面，所述细胞已用编码重组蛋白的核酸分子转染且具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；
(c)对所述细胞测定第一PWV或信号；
(e)加入调节剂，和不表达所述重组蛋白的转染细胞相比，所述调节剂在表达所述重组蛋白的转染细胞中引起差别响应；
(e)对所述细胞测定第二PWV或信号；
(f)比较第一峰波长值或信号和第二峰波长值或信号；其中如果第二峰波长值或信号基本上不同于第一峰波长值或信号，则所述转染细胞表达所述重组蛋白。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103398952A (zh) * 2013-08-13 2013-11-20 上海理工大学 生物传感器检测中的导模共振滤波片反射率优化方法
CN103940752A (zh) * 2014-04-28 2014-07-23 上海理工大学 一种背照式检测96-微孔板中抗原抗体的方法
CN105793705A (zh) * 2013-09-30 2016-07-20 X博迪公司 抗原受体的筛选测试
CN113474637A (zh) * 2018-11-29 2021-10-01 乐卓博大学 鉴定结构的方法

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7167615B1 (en) 1999-11-05 2007-01-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Resonant waveguide-grating filters and sensors and methods for making and using same
US7094595B2 (en) 2000-10-30 2006-08-22 Sru Biosystems, Inc. Label-free high-throughput optical technique for detecting biomolecular interactions
US7524625B2 (en) * 2000-10-30 2009-04-28 Sru Biosystems, Inc. Real time binding analysis of antigens on a biosensor surface
US7575939B2 (en) 2000-10-30 2009-08-18 Sru Biosystems, Inc. Optical detection of label-free biomolecular interactions using microreplicated plastic sensor elements
US7927822B2 (en) 2002-09-09 2011-04-19 Sru Biosystems, Inc. Methods for screening cells and antibodies
US7309614B1 (en) 2002-12-04 2007-12-18 Sru Biosystems, Inc. Self-referencing biodetection method and patterned bioassays
US8298780B2 (en) 2003-09-22 2012-10-30 X-Body, Inc. Methods of detection of changes in cells
AU2006249657B2 (en) * 2005-04-12 2011-02-10 Sru Biosystems, Inc. Proteolipid membrane & lipid membrane biosensor
US7854505B2 (en) * 2006-03-15 2010-12-21 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Passive and active photonic crystal structures and devices
JP2010532998A (ja) 2007-07-11 2010-10-21 エス アール ユー バイオシステムズ，インコーポレイテッド イオンチャネルのモジュレータを識別する方法
US9134307B2 (en) 2007-07-11 2015-09-15 X-Body, Inc. Method for determining ion channel modulating properties of a test reagent
US7988918B2 (en) * 2007-11-01 2011-08-02 Complete Genomics, Inc. Structures for enhanced detection of fluorescence
US9551026B2 (en) 2007-12-03 2017-01-24 Complete Genomincs, Inc. Method for nucleic acid detection using voltage enhancement
US8257936B2 (en) 2008-04-09 2012-09-04 X-Body Inc. High resolution label free analysis of cellular properties
AU2009269037A1 (en) * 2008-07-11 2010-01-14 Sru Biosystems, Inc. Methods for identifying modulators of ion channels
US20100130829A1 (en) * 2008-11-25 2010-05-27 Ye Fang Materials and methods for detecting early cell migration events
CA2761114A1 (en) * 2009-05-15 2010-11-18 Sru Biosystems, Inc. Detection of changes in cell populations and mixed cell populations
WO2011120042A1 (en) * 2010-03-26 2011-09-29 Sru Biosystems, Inc. Use of induced pluripotent cells and other cells for screening compound libraries
WO2012065003A2 (en) * 2010-11-11 2012-05-18 Microstem, Inc. Screening and culturing device and methods for the use thereof
US10837879B2 (en) 2011-11-02 2020-11-17 Complete Genomics, Inc. Treatment for stabilizing nucleic acid arrays
US20130330761A1 (en) 2012-06-12 2013-12-12 Celcuity, LLC Whole cell assays and methods
JP6066492B2 (ja) * 2013-08-22 2017-01-25 富士フイルム株式会社 細胞画像評価装置および方法並びにプログラム
WO2015089380A2 (en) 2013-12-12 2015-06-18 Celcuity Llc Assays and methods for determining the responsiveness of an individual subject to a therapeutic agent
EP3517932B1 (en) * 2016-07-14 2020-09-23 Dai Nippon Printing Co., Ltd. Image analysis system, culture management system, image analysis method, culture management method, cell group structure method, and program
EP3602050A1 (en) 2017-03-20 2020-02-05 Celcuity Inc. Methods of measuring signaling pathway activity for selection of therapeutic agents
US10605735B2 (en) 2017-10-20 2020-03-31 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Photonic resonator outcoupler microscopy (PROM)
US11041187B2 (en) 2017-10-26 2021-06-22 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Photonic resonator absorption microscopy (PRAM) for digital resolution biomolecular diagnostics
US20230384290A1 (en) * 2020-10-16 2023-11-30 Biomems Analytics Llc Cellular Response Analysis Method
CN113740423B (zh) * 2021-09-03 2022-11-22 电子科技大学 一种实时检测细胞形貌变化和细胞粘附特性变化的eqcm方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030104479A1 (en) * 2001-08-01 2003-06-05 Cellomics, Inc. Novel fusion proteins and assays for molecular binding
US20040132214A1 (en) * 2000-10-30 2004-07-08 Sru Biosystems, Llc Label-free methods for performing assays using a colorimetric resonant optical biosensor
US6951715B2 (en) * 2000-10-30 2005-10-04 Sru Biosystems, Inc. Optical detection of label-free biomolecular interactions using microreplicated plastic sensor elements
WO2008106048A1 (en) * 2007-02-28 2008-09-04 Corning Incorporated Surfaces and methods for biosensor cellular assays

Family Cites Families (192)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US244312A (en) * 1881-07-12 riley
US303028A (en) * 1884-08-05 mcdomxljg-h
US283314A (en) * 1883-08-14 Tebritory
US3689346A (en) * 1970-09-29 1972-09-05 Rowland Dev Corp Method for producing retroreflective material
US3810688A (en) * 1973-05-21 1974-05-14 A Ballman Optical waveguiding devices using monocrystalline materials of the sillenite family of bismuth oxides
US3856404A (en) 1973-06-06 1974-12-24 Phys Chem Res Corp Method and apparatus for measuring vapor pressure
US4009933A (en) * 1975-05-07 1977-03-01 Rca Corporation Polarization-selective laser mirror
US4050895A (en) * 1975-09-26 1977-09-27 Monsanto Research Corporation Optical analytical device, waveguide and method
US4668558A (en) * 1978-07-20 1987-05-26 Minnesota Mining And Manufacturing Company Shaped plastic articles having replicated microstructure surfaces
US4576850A (en) * 1978-07-20 1986-03-18 Minnesota Mining And Manufacturing Company Shaped plastic articles having replicated microstructure surfaces
US4344438A (en) * 1978-08-02 1982-08-17 The United States Of America As Represented By The Department Of Health, Education And Welfare Optical sensor of plasma constituents
US4240751A (en) 1978-11-09 1980-12-23 Akzona Incorporated Method and apparatus for specific binding substances
US4289371A (en) * 1979-05-31 1981-09-15 Xerox Corporation Optical scanner using plane linear diffraction gratings on a rotating spinner
US4420502A (en) 1980-09-05 1983-12-13 Conley Kenneth E Apparatus and method for producing a flexible sheet material having a predetermined surface characteristic
GB2103786A (en) 1981-08-14 1983-02-23 Ici Plc Fibre optic sensor
EP0075353B1 (en) 1981-09-18 1987-08-19 Battelle Memorial Institute Method and apparatus for the determination of species in solution with an optical wave-guide
USRE33064E (en) * 1981-09-18 1989-09-19 Prutec Limited Method for the determination of species in solution with an optical wave-guide
EP0112721B1 (en) 1982-12-21 1988-05-18 Ares-Serono N.V. Assay technique
US4536608A (en) * 1983-04-25 1985-08-20 Exxon Research And Engineering Co. Solar cell with two-dimensional hexagonal reflecting diffraction grating
US4652290A (en) * 1983-07-05 1987-03-24 Motorola, Inc. Method for making optical channel waveguides and product manufactured thereby
GB2156970B (en) 1984-01-06 1987-09-16 Plessey Co Plc Optical detection of specific molecules
EP0170375B1 (en) * 1984-06-13 1990-05-16 Unilever Plc Devices for use in chemical test procedures
US4701008A (en) 1984-08-10 1987-10-20 Motorola, Inc. Optical waveguide including superstrate of niobium or silicon oxynitride and method of making same
GB8423204D0 (en) 1984-09-14 1984-10-17 Comtech Res Unit Assay technique and equipment
US4650329A (en) * 1984-11-29 1987-03-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Optical 3-d signature device for detecting chemical agents
DE3481644D1 (de) * 1984-12-10 1990-04-19 Prutec Ltd Verfahren zum optischen nachweis von parametern von substanzen in einem fluessigen analyt.
GB8509491D0 (en) * 1985-04-12 1985-05-15 Plessey Co Plc Optic waveguide biosensors
CH670521A5 (en) 1985-05-29 1989-06-15 Oerlikon Buehrle Holding Ag Optical sensor detecting specific substances in material
JPH0627703B2 (ja) 1985-05-29 1994-04-13 アーティフィシャル センシング インスツルメンツ エイエスアイ アクチェンゲゼルシャフト 物質の選択的検出および測定物質内の屈折率変化検知を行なう光学センサ
CH669050A5 (de) 1985-05-29 1989-02-15 Oerlikon Buehrle Holding Ag Sensor zum nachweis von aenderungen der brechzahl einer festen oder fluessigen messsubstanz.
GB8618133D0 (en) * 1986-07-24 1986-09-03 Pa Consulting Services Biosensors
US4876208A (en) 1987-01-30 1989-10-24 Yellowstone Diagnostics Corporation Diffraction immunoassay apparatus and method
GB8705649D0 (en) * 1987-03-10 1987-04-15 Pa Consulting Services Assay sensor
US4999234A (en) * 1987-08-10 1991-03-12 Polaroid Corporation Holographic optical data storage medium
US4888260A (en) 1987-08-10 1989-12-19 Polaroid Corporation Volume phase reflection holograms and methods for fabricating them
NL8800219A (nl) 1988-01-29 1989-08-16 Philips Nv Roteerbare magneetkopeenheid voor een magneetbandapparaat.
US4952056A (en) * 1988-05-17 1990-08-28 Entwicklungsgemeinschaft Asi Method of determining the autocollimation angle of a grating coupler
GB2220080A (en) * 1988-06-24 1989-12-28 Marconi Gec Ltd Improvements in optical waveguides
US6235488B1 (en) * 1988-09-29 2001-05-22 Agilent Technologies, Inc. Surface preparation for chemical-specific binding
SE462454B (sv) * 1988-11-10 1990-06-25 Pharmacia Ab Maetyta foer anvaendning i biosensorer
SE8804074D0 (sv) * 1988-11-10 1988-11-10 Pharmacia Ab Sensorenhet och dess anvaendning i biosensorsystem
GB2227089A (en) 1989-01-11 1990-07-18 Plessey Co Plc An optical biosensor
US5175030A (en) 1989-02-10 1992-12-29 Minnesota Mining And Manufacturing Company Microstructure-bearing composite plastic articles and method of making
GB8916764D0 (en) * 1989-07-21 1989-09-06 Sambles John R Surface plasmon optical sensor
US5156785A (en) 1991-07-10 1992-10-20 Cordis Corporation Extruded tubing and catheters having increased rotational stiffness
US5541057A (en) * 1989-09-18 1996-07-30 Biostar, Inc. Methods for detection of an analyte
JPH05504626A (ja) 1990-03-02 1993-07-15 ファイソンズ　ピーエルシー 化学又は生化学試験に用いる試料セル
EP0455067B1 (de) 1990-05-03 2003-02-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Mikrooptischer Sensor
IL98150A0 (en) 1990-05-17 1992-08-18 Adeza Biomedical Corp Highly reflective biogratings and method for theirhighly reflective biogratings and method production
US5478756A (en) 1990-07-24 1995-12-26 Fisons Plc Chemical sensor for detecting binding reactions
US5337183A (en) * 1991-02-01 1994-08-09 Yeda Research And Development Co. Ltd. Distributed resonant cavity light beam modulator
SE468188B (sv) * 1991-04-08 1992-11-16 Stiftelsen Inst Foer Mikroelek Metod foer inkoppling av straalning i en infraroeddetektor, jaemte anordning
CA2086338C (en) * 1991-04-26 2002-03-26 Rino E. Kunz Process and device for determining measured quantities by means of an integrated optical sensor module
US5155785A (en) 1991-05-01 1992-10-13 At&T Bell Laboratories Optical fiber interconnection apparatus and method
GB9111912D0 (en) * 1991-06-04 1991-07-24 Fisons Plc Analytical methods
GB2256477B (en) * 1991-06-07 1995-03-08 Marconi Gec Ltd An optical sensor
US5216680A (en) 1991-07-11 1993-06-01 Board Of Regents, The University Of Texas System Optical guided-mode resonance filter
US5170448A (en) 1992-01-06 1992-12-08 Motorola, Inc. Optical waveguide apparatus and method for partially collecting light
US5268782A (en) 1992-01-16 1993-12-07 Minnesota Mining And Manufacturing Company Micro-ridged, polymeric liquid crystal display substrate and display device
US5494829A (en) * 1992-07-31 1996-02-27 Biostar, Inc. Devices and methods for detection of an analyte based upon light interference
US5413884A (en) * 1992-12-14 1995-05-09 American Telephone And Telegraph Company Grating fabrication using electron beam lithography
US5615052A (en) * 1993-04-16 1997-03-25 Bruce W. McCaul Laser diode/lens assembly
US5512492A (en) * 1993-05-18 1996-04-30 University Of Utah Research Foundation Waveguide immunosensor with coating chemistry providing enhanced sensitivity
JP3298887B2 (ja) * 1993-06-11 2002-07-08 ミネソタ マイニング アンド マニュファクチャリング カンパニー レーザー加工複製工具
US5475780A (en) 1993-06-17 1995-12-12 At&T Corp. Optical waveguiding component comprising a band-pass filter
GB9314991D0 (en) * 1993-07-20 1993-09-01 Sandoz Ltd Mechanical device
BR9407536A (pt) * 1993-09-13 1997-08-26 Minnesota Mining & Mfg Artigo abrasivo processos de fabricação e de refino de peça em trabalho corn o mesmo ferramenta de produção para fabricação do mesmo e processo de produção de matriz mestra para formação da mesma
US6042998A (en) * 1993-09-30 2000-03-28 The University Of New Mexico Method and apparatus for extending spatial frequencies in photolithography images
US5691846A (en) 1993-10-20 1997-11-25 Minnesota Mining And Manufacturing Company Ultra-flexible retroreflective cube corner composite sheetings and methods of manufacture
US5559338A (en) * 1994-10-04 1996-09-24 Excimer Laser Systems, Inc. Deep ultraviolet optical imaging system for microlithography and/or microfabrication
US5955335A (en) * 1994-10-08 1999-09-21 Foschungszentrum Julich GmbH Biomaterial immobilization on an Si3 N4 surface containing Si-NH2 groups with a heterobifunctional cross-linking agent
TW323341B (zh) * 1995-01-09 1997-12-21 Minnesota Mining & Mfg
US5606170A (en) * 1995-02-03 1997-02-25 Research International, Inc. Multifunctional sensor system
JP4168179B2 (ja) * 1995-03-03 2008-10-22 スリーエム カンパニー 種々の高さの構造化面を有する光指向性フィルム及び該フィルムから作製された光指向性製品
US5690894A (en) 1995-05-23 1997-11-25 The Regents Of The University Of California High density array fabrication and readout method for a fiber optic biosensor
US5598300A (en) * 1995-06-05 1997-01-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Efficient bandpass reflection and transmission filters with low sidebands based on guided-mode resonance effects
US6200737B1 (en) * 1995-08-24 2001-03-13 Trustees Of Tufts College Photodeposition method for fabricating a three-dimensional, patterned polymer microstructure
WO1997009594A1 (de) 1995-09-01 1997-03-13 Paul Scherrer Institut Verfahren und vorrichtung zur messung von lichtbündeln
GB9518429D0 (en) 1995-09-08 1995-11-08 Pharmacia Biosensor A rapid method for providing kinetic and structural data in molecular interaction analysis
US5814516A (en) * 1995-10-13 1998-09-29 Lockheed Martin Energy Systems, Inc. Surface enhanced Raman gene probe and methods thereof
US6174677B1 (en) * 1995-10-13 2001-01-16 Ut-Battelle, Llc Advanced surface-enhanced Raman gene probe systems and methods thereof
US5822486A (en) * 1995-11-02 1998-10-13 General Scanning, Inc. Scanned remote imaging method and system and method of determining optimum design characteristics of a filter for use therein
US5814524A (en) * 1995-12-14 1998-09-29 Trustees Of Tufts College Optical sensor apparatus for far-field viewing and making optical analytical measurements at remote locations
GB9602542D0 (en) * 1996-02-08 1996-04-10 Fisons Plc Analytical device
US5801390A (en) * 1996-02-09 1998-09-01 Nikon Corporation Position-detection method and apparatus with a grating mark
US5804453A (en) * 1996-02-09 1998-09-08 Duan-Jun Chen Fiber optic direct-sensing bioprobe using a phase-tracking approach
EP0970397B1 (en) * 1996-03-27 2005-06-29 BRITISH TELECOMMUNICATIONS public limited company Optical demultiplexer comprising a diffraction grating
US5821343A (en) 1996-04-25 1998-10-13 Medtronic Inc Oxidative method for attachment of biomolecules to surfaces of medical devices
IL118209A0 (en) * 1996-05-09 1998-02-08 Yeda Res & Dev Active electro-optical wavelength-selective mirrors and active electro-optic wavelength-selective filters
US6174497B1 (en) * 1997-06-04 2001-01-16 Euro-Celtique, S.A. Detection systems and methods for predicting the dissolution curve of a drug from a pharmaceutical dosage form
US6088505A (en) * 1996-06-10 2000-07-11 Holographic Lithography Systems, Inc. Holographic patterning method and tool for production environments
US5666197A (en) 1996-08-21 1997-09-09 Polaroid Corporation Apparatus and methods employing phase control and analysis of evanescent illumination for imaging and metrology of subwavelength lateral surface topography
AU4207897A (en) 1996-08-29 1998-03-19 Novartis Ag Optical chemical / biochemical sensor
US5846843A (en) 1996-11-18 1998-12-08 The University Of Toledo Sensor using long range surface plasmon resonance with diffraction double-grating
US5922550A (en) * 1996-12-18 1999-07-13 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Biosensing devices which produce diffraction images
US5864641A (en) * 1997-04-11 1999-01-26 F&S, Inc. Optical fiber long period sensor having a reactive coating
US6035089A (en) * 1997-06-11 2000-03-07 Lockheed Martin Energy Research Corporation Integrated narrowband optical filter based on embedded subwavelength resonant grating structures
US5955378A (en) * 1997-08-20 1999-09-21 Challener; William A. Near normal incidence optical assaying method and system having wavelength and angle sensitivity
US5925878A (en) * 1997-08-20 1999-07-20 Imation Corp. Diffraction anomaly sensor having grating coated with protective dielectric layer
US6902703B2 (en) * 1999-05-03 2005-06-07 Ljl Biosystems, Inc. Integrated sample-processing system
US6128431A (en) 1997-10-08 2000-10-03 The Regents Of The University Of California High efficiency source coupler for optical waveguide illumination system
US5994150A (en) 1997-11-19 1999-11-30 Imation Corp. Optical assaying method and system having rotatable sensor disk with multiple sensing regions
US6338968B1 (en) * 1998-02-02 2002-01-15 Signature Bioscience, Inc. Method and apparatus for detecting molecular binding events
US6210910B1 (en) * 1998-03-02 2001-04-03 Trustees Of Tufts College Optical fiber biosensor array comprising cell populations confined to microcavities
DE19814811C1 (de) * 1998-04-02 1999-08-05 Inst Physikalische Hochtech Ev Anordnung für die Oberflächenplasmonen-Resonanz-Spektroskopie
JP4564655B2 (ja) 1998-04-21 2010-10-20 ユニバーシティ オブ コネチカット 多光子励起を用いたフリーフォームナノ製作
US5998298A (en) 1998-04-28 1999-12-07 Sandia Corporation Use of chemical-mechanical polishing for fabricating photonic bandgap structures
TW460758B (en) * 1998-05-14 2001-10-21 Holographic Lithography System A holographic lithography system for generating an interference pattern suitable for selectively exposing a photosensitive material
US6346376B1 (en) * 1998-06-03 2002-02-12 Centre Suisse D'electronique Et De Mictotechnique Sa Optical sensor unit and procedure for the ultrasensitive detection of chemical or biochemical analytes
US5986762A (en) 1998-06-15 1999-11-16 Imation Corp. Optical sensor having optimized surface profile
US6406921B1 (en) * 1998-07-14 2002-06-18 Zyomyx, Incorporated Protein arrays for high-throughput screening
US6684007B2 (en) 1998-10-09 2004-01-27 Fujitsu Limited Optical coupling structures and the fabrication processes
US6320991B1 (en) 1998-10-16 2001-11-20 Imation Corp. Optical sensor having dielectric film stack
US6579673B2 (en) * 1998-12-17 2003-06-17 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Patterned deposition of antibody binding protein for optical diffraction-based biosensors
US6303179B1 (en) 1999-02-08 2001-10-16 Medtronic, Inc Method for attachment of biomolecules to surfaces through amine-functional groups
EP1031828B1 (en) 1999-02-25 2006-09-13 C.S.E.M. Centre Suisse D'electronique Et De Microtechnique Sa Integrated-optical sensor and method for integrated-optically sensing a substance
US6332663B1 (en) 1999-06-16 2001-12-25 Xerox Corporation Methods and apparatus for marking images and obtaining image data using a single marking engine platform
US6771376B2 (en) 1999-07-05 2004-08-03 Novartis Ag Sensor platform, apparatus incorporating the platform, and process using the platform
DK1192448T3 (da) * 1999-07-05 2007-01-15 Novartis Ag Fremgangsmåde til anvendelse af en sensorplatform
EP1085315B1 (en) 1999-09-15 2003-07-09 CSEM Centre Suisse d'Electronique et de Microtechnique SA Integrated-optical sensor
US6376177B1 (en) 1999-10-06 2002-04-23 Virtual Pro, Inc. Apparatus and method for the analysis of nucleic acids hybridization on high density NA chips
KR100390875B1 (ko) * 1999-10-27 2003-07-10 (주)해빛정보 위상 회절 격자형 광 저대역 통과필터
US7167615B1 (en) 1999-11-05 2007-01-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Resonant waveguide-grating filters and sensors and methods for making and using same
FR2801977B1 (fr) 1999-12-02 2002-05-17 Commissariat Energie Atomique Amplification d'un signal de fluorescence emis par un echantillon surfacique
JP3512775B2 (ja) 2000-02-16 2004-03-31 ウイスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション 液晶アッセイ用の生化学的ブロッキング層
AU774638B2 (en) 2000-02-16 2004-07-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Method and apparatus for detection of microscopic pathogens
AU2001245787A1 (en) * 2000-03-17 2001-10-03 Zograph, Llc High acuity lens system
US6639674B2 (en) 2000-03-28 2003-10-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and apparatus for polarized reflectance spectroscopy
AU2001274068A1 (en) * 2000-06-02 2001-12-11 Zeptosens Ag Kit and method for determining a plurality of analytes
US6449097B1 (en) 2000-06-05 2002-09-10 Lightchip, Inc. Diffraction grating for wavelength division multiplexing/demultiplexing devices
US6969449B2 (en) 2000-07-10 2005-11-29 Vertex Pharmaceuticals (San Diego) Llc Multi-well plate and electrode assemblies for ion channel assays
US20040219619A1 (en) 2000-07-21 2004-11-04 Ester Fernandez-Salas Methods of identifying compounds that alter toxin persistence and/or protease activity
AU2001282276A1 (en) * 2000-08-18 2002-03-04 Lattice Intellectual Property Ltd. Method and apparatus for detecting chemical contamination
US7524625B2 (en) 2000-10-30 2009-04-28 Sru Biosystems, Inc. Real time binding analysis of antigens on a biosensor surface
US7094595B2 (en) 2000-10-30 2006-08-22 Sru Biosystems, Inc. Label-free high-throughput optical technique for detecting biomolecular interactions
US7142296B2 (en) 2000-10-30 2006-11-28 Sru Biosystems, Inc. Method and apparatus for detecting biomolecular interactions
US7101660B2 (en) * 2000-10-30 2006-09-05 Sru Biosystems, Inc. Method for producing a colorimetric resonant reflection biosensor on rigid surfaces
US7371562B2 (en) 2000-10-30 2008-05-13 Sru Biosystems, Inc. Guided mode resonant filter biosensor using a linear grating surface structure
US7217574B2 (en) * 2000-10-30 2007-05-15 Sru Biosystems, Inc. Method and apparatus for biosensor spectral shift detection
US7300803B2 (en) 2000-10-30 2007-11-27 Sru Biosystems, Inc. Label-free methods for performing assays using a colorimetric resonant reflectance optical biosensor
US7575939B2 (en) 2000-10-30 2009-08-18 Sru Biosystems, Inc. Optical detection of label-free biomolecular interactions using microreplicated plastic sensor elements
US7153702B2 (en) 2000-10-30 2006-12-26 Sru Biosystems, Inc. Label-free methods for performing assays using a colorimetric resonant reflectance optical biosensor
US7023544B2 (en) 2000-10-30 2006-04-04 Sru Biosystems, Inc. Method and instrument for detecting biomolecular interactions
US6870624B2 (en) 2000-10-30 2005-03-22 Coho Holdings Llc Optical wavelength resonant device for chemical sensing
US7070987B2 (en) * 2000-10-30 2006-07-04 Sru Biosystems, Inc. Guided mode resonant filter biosensor using a linear grating surface structure
US20030113766A1 (en) * 2000-10-30 2003-06-19 Sru Biosystems, Llc Amine activated colorimetric resonant biosensor
US20030092075A1 (en) * 2000-10-30 2003-05-15 Sru Biosystems, Llc Aldehyde chemical surface activation processes and test methods for colorimetric resonant sensors
US7175980B2 (en) 2000-10-30 2007-02-13 Sru Biosystems, Inc. Method of making a plastic colorimetric resonant biosensor device with liquid handling capabilities
US7202076B2 (en) * 2000-10-30 2007-04-10 Sru Biosystems, Inc. Label-free high-throughput optical technique for detecting biomolecular interactions
US7306827B2 (en) * 2000-10-30 2007-12-11 Sru Biosystems, Inc. Method and machine for replicating holographic gratings on a substrate
US7615339B2 (en) 2000-10-30 2009-11-10 Sru Biosystems, Inc. Method for producing a colorimetric resonant reflection biosensor on rigid surfaces
US6661952B2 (en) 2001-05-04 2003-12-09 Ut Battelle, Llc Sub-wavelength efficient polarization filter (SWEP filter)
US6748138B2 (en) * 2001-09-14 2004-06-08 Fibera, Inc. Optical grating fabrication
EP1451375A4 (en) 2001-11-07 2006-03-22 Univ Auburn PHAGENLIGANDEN SENSOR DEVICES AND USES THEREOF
US20030224369A1 (en) 2002-02-25 2003-12-04 Surber Mark W. Reverse screening and target identification with minicells
US7074311B1 (en) 2002-05-08 2006-07-11 Sru Biosystems Inc. Biosensor electrophoresis
US7927822B2 (en) 2002-09-09 2011-04-19 Sru Biosystems, Inc. Methods for screening cells and antibodies
US20040091397A1 (en) 2002-11-07 2004-05-13 Corning Incorporated Multiwell insert device that enables label free detection of cells and other objects
US7309614B1 (en) 2002-12-04 2007-12-18 Sru Biosystems, Inc. Self-referencing biodetection method and patterned bioassays
KR100937649B1 (ko) 2002-12-30 2010-01-19 동부일렉트로닉스 주식회사 반도체 장치의 트렌지스터 형성 방법
US7497992B2 (en) 2003-05-08 2009-03-03 Sru Biosystems, Inc. Detection of biochemical interactions on a biosensor using tunable filters and tunable lasers
US8298780B2 (en) 2003-09-22 2012-10-30 X-Body, Inc. Methods of detection of changes in cells
US20050214803A1 (en) 2003-11-06 2005-09-29 Sru Biosystems, Llc High-density amine-functionalized surface
US6990259B2 (en) 2004-03-29 2006-01-24 Sru Biosystems, Inc. Photonic crystal defect cavity biosensor
CA2572459A1 (en) 2004-06-28 2006-08-17 Sru Biosystems, Inc. Integration of direct binding sensors with mass spectrometry for functional and structural characterization of molecules
US7803619B2 (en) 2004-11-24 2010-09-28 Geneprotech, Inc. Embryoid body-based screen
JP5129119B2 (ja) * 2005-04-05 2013-01-23 コーニング インコーポレイテッド 標識フリーバイオセンサおよび細胞
AU2006249657B2 (en) 2005-04-12 2011-02-10 Sru Biosystems, Inc. Proteolipid membrane & lipid membrane biosensor
US7197198B2 (en) 2005-06-23 2007-03-27 Sru Biosystems, Inc. Biosensor substrate structure for reducing the effects of optical interference
US7162125B1 (en) 2005-06-23 2007-01-09 Sru Biosystems, Inc. Optimized grating based biosensor and substrate combination
US7521769B2 (en) 2005-07-08 2009-04-21 Sru Biosystems, Inc. Photonic crystal biosensor structure and fabrication method
US7479404B2 (en) 2005-07-08 2009-01-20 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Photonic crystal biosensor structure and fabrication method
US7483127B1 (en) 2005-08-08 2009-01-27 Sru Biosystems, Inc. Method and apparatus for generating an image of biomolecular sensor target area
US7790406B2 (en) 2005-08-11 2010-09-07 Sru Biosystems, Inc Grating-based sensor combining label-free binding detection and fluorescence amplification and readout system for sensor
AU2006279060B2 (en) 2005-08-11 2009-08-27 Sru Biosystems, Inc. Grating-based sensor combining label-free binding detection and fluorescence amplification and readout system for sensor
EP2041554A2 (en) 2006-07-07 2009-04-01 The Board of Trustees of the University of Illinois Near ultraviolet-wavelength photonic-crystal biosensor with enhanced surface to bulk sensitivity ratio
CN101646943A (zh) 2006-10-31 2010-02-10 Sru生物系统公司 阻断官能化表面上的非特异性蛋白结合的方法
EP2091646A1 (en) 2006-11-09 2009-08-26 The Board of Trustees for the University of Illinois Photonic crystal sensors with integrated fluid containment structure
US7628085B2 (en) 2006-11-17 2009-12-08 Sru Biosystems, Inc. Simultaneous aspirator and dispenser for multiwell plates and similar devices
US20080240543A1 (en) 2007-03-30 2008-10-02 Wolfgang Ernst Gustav Budach Calibration and normalization method for biosensors
EP2153203A4 (en) 2007-04-19 2010-04-21 Sru Biosystems Inc METHOD FOR USING A BIOSENSOR TO DETECT SMALL MOLECULES BINDING DIRECTLY TO IMMOBILIZED OBJECTIVES
JP2010532998A (ja) 2007-07-11 2010-10-21 エス アール ユー バイオシステムズ，インコーポレイテッド イオンチャネルのモジュレータを識別する方法
US9134307B2 (en) 2007-07-11 2015-09-15 X-Body, Inc. Method for determining ion channel modulating properties of a test reagent
US20090093011A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-09 Ye Fang Biosensors for ligand-directed functional selectivity
US8268637B2 (en) 2008-01-11 2012-09-18 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Label-free biosensors based upon distributed feedback laser
WO2009114133A1 (en) 2008-03-10 2009-09-17 The J. David Gladstone Institutes Cells and assays for use in detecting long qt syndrome
US8257936B2 (en) 2008-04-09 2012-09-04 X-Body Inc. High resolution label free analysis of cellular properties
WO2009149285A1 (en) 2008-06-04 2009-12-10 Sru Biosystems, Inc. Detection of promiscuous small submicrometer aggregates
US20100008826A1 (en) 2008-07-10 2010-01-14 Sru Biosystems, Inc. Biosensors featuring confinement of deposited material and intra-well self-referencing
AU2009269037A1 (en) 2008-07-11 2010-01-14 Sru Biosystems, Inc. Methods for identifying modulators of ion channels
CA2748946A1 (en) 2009-02-02 2010-08-05 Sru Biosystems, Inc. Efficient optical arrangement for illumination and detection of label-free biosensors and method to reduce interference fringes in label-free imaging
CA2761114A1 (en) 2009-05-15 2010-11-18 Sru Biosystems, Inc. Detection of changes in cell populations and mixed cell populations

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040132214A1 (en) * 2000-10-30 2004-07-08 Sru Biosystems, Llc Label-free methods for performing assays using a colorimetric resonant optical biosensor
US6951715B2 (en) * 2000-10-30 2005-10-04 Sru Biosystems, Inc. Optical detection of label-free biomolecular interactions using microreplicated plastic sensor elements
US20030104479A1 (en) * 2001-08-01 2003-06-05 Cellomics, Inc. Novel fusion proteins and assays for molecular binding
WO2008106048A1 (en) * 2007-02-28 2008-09-04 Corning Incorporated Surfaces and methods for biosensor cellular assays

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUG等: "Optical waveguide lightmode spectroscopy as a new method to study adhesion of anchorage-dependent cells as an indicator of metabolic state", 《BIOSENSORS & BIOELECTRONICS》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103398952A (zh) * 2013-08-13 2013-11-20 上海理工大学 生物传感器检测中的导模共振滤波片反射率优化方法
CN103398952B (zh) * 2013-08-13 2016-01-20 上海理工大学 生物传感器检测中的导模共振滤波片反射率优化方法
CN105793705A (zh) * 2013-09-30 2016-07-20 X博迪公司 抗原受体的筛选测试
CN103940752A (zh) * 2014-04-28 2014-07-23 上海理工大学 一种背照式检测96-微孔板中抗原抗体的方法
CN113474637A (zh) * 2018-11-29 2021-10-01 乐卓博大学 鉴定结构的方法

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