JP2005514062A - 内皮幹細胞、該細胞集団、該細胞の単離法および使用法 - Google Patents
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Abstract
Description
発明の分野
本発明は、再生する能力、並びに内皮細胞および/または内皮様細胞を生じさせる能力を有すると特徴付けられる幹細胞、こうした幹細胞を単離する方法およびその使用法を提供する。やはり提供するのは、本発明の幹細胞に由来する子孫細胞である。
哺乳動物の体は、哺乳動物の体の多くの組織を生じさせる、いくつかの系譜に拘束された(lineage−committed)細胞で構成される。系譜に拘束されたこうした細胞の性質、形態、特徴および機能が多様であるにもかかわらず、現在、系譜に拘束された細胞は、すべてではないとしても大部分、哺乳動物の体の、系譜に拘束された細胞を1以上生じさせる、多様な幹細胞に由来すると考えられている。こうした幹細胞は、体に存在する細胞総数のわずかな割合しか構成せず、そして特定の細胞種への相対的な拘束に応じて、変化することが可能である。さらに、系譜に拘束された細胞と関連するどのマーカーが、幹細胞上にもまた存在するかは、知られていない。幹細胞上に存在すると示されている1つのマーカー、CD34はまた、系譜に拘束された前駆細胞上でもかなりの数で見られる。特に、B細胞(CD19+)および骨髄性細胞(CD33+)がCD34+集団の80〜90%を構成する。さらに、CD3、8、10、15、19、20、および33の組み合わせが、すべてのCD34+細胞の>90%に存在するであろう。したがって、骨髄において、幹細胞である細胞総数の割合が低く、より分化した細胞と識別できる幹細胞関連マーカーが不確かであり、そして一般的にヒト幹細胞に関する生物学的アッセイが不可能であることを考慮すると、幹細胞の同定および精製は達成しがたいものであった。
1つの態様において、本発明は、幹細胞が濃縮されている集団を調製する方法であって、第一の細胞集団から幹細胞が濃縮されている前記集団を分離することを含んでなり、幹細胞が濃縮されている前記集団が、前記の第一の細胞集団より、少なくとも約100倍高い濃度のP1H12+幹細胞を含んでなる、前記方法を提供する。別の態様において、幹細胞が濃縮されている前記集団は、前記の第一の細胞集団より、少なくとも約1,000倍高い濃度のP1H12+幹細胞を含んでなる。別の態様において、幹細胞が濃縮されている前記集団は、前記の第一の細胞集団より、約1,000倍〜約4,000倍高い濃度のP1H12+幹細胞を含んでなる。別の態様において、幹細胞が濃縮されている前記集団はさらに、CD148、AC133、CD45およびCD34からなる群より選択される1以上のマーカーを、前記の第一の細胞集団より高い濃度で含んでなる。別の態様において、前記分離工程は、前記の第一の細胞集団を、P1H12+に特異的に結合する分子と接触させ、そして前記分子に結合する、濃縮されている前記細胞集団を選択することを含んでなる。別の態様において、前記分子は抗体である。別の態様において、前記抗体はモノクローナル抗体である。別の態様において、前記分子は抗体由来である。別の態様において、前記分子はペプチド−Fc融合分子である。別の態様において、前記分離工程は、前記の第一の細胞集団を、CD148、AC133、CD45およびCD34からなる群より選択される分子に特異的に結合する分子と接触させ、そして前記分子に結合する、濃縮されている前記細胞集団を選択することをさらに含んでなる。別の態様において、前記分離工程は、濃縮されている前記細胞集団を、CD148、AC133、CD45およびCD34からなる群より選択されるマーカーに特異的に結合する分子と接触させ、そして前記分子に結合しない細胞を、濃縮されている前記細胞集団から取り除くことをさらに含んでなる。別の態様において、前記分離工程は、前記の第一の細胞集団を、CD144、CD202b、VEGFR2からなる群より選択される分子に特異的に結合する分子と接触させ、そして濃縮されている前記細胞集団に関して、前記分子に結合しない細胞を選択することをさらに含んでなる。別の態様において、前記分離工程は、濃縮されている前記細胞集団を、CD144、CD202b、VEGFR2からなる群より選択される分子に特異的に結合する分子と接触させ、そして前記分子に結合する細胞を、濃縮されている前記細胞集団から取り除くことをさらに含んでなる。別の態様において、幹細胞が濃縮されている前記集団は、前記の第一の細胞集団より、P1H12+、CD148+、AC133+、CD144−、CD202b−またはVEGFR2−である幹細胞を、少なくとも約100倍高い濃度で含んでなる。別の態様において、幹細胞が濃縮されている前記集団は、前記の第一の細胞集団より、P1H12+、CD148+、AC133+、CD144−、CD202b−またはVEGFR2−である幹細胞を、少なくとも約1,000倍高い濃度で含んでなる。別の態様において、幹細胞が濃縮されている前記集団は、前記の第一の細胞集団より、P1H12+、CD148+、AC133+、CD144−、CD202b−またはVEGFR2−である幹細胞を、約1,000倍〜約4,000倍高い濃度で含んでなる。別の態様において、幹細胞が濃縮されている前記集団は、さらに、CD34+またはCD45+である幹細胞に関しても濃縮されている。別の態様において、幹細胞が濃縮されている前記集団は、さらに、CD34−およびCD45+である幹細胞に関しても濃縮されている。別の態様において、幹細胞が濃縮されている前記集団は、さらに、CD34+およびCD45+である幹細胞に関しても濃縮されている。別の態様において、前記分子は検出可能実体に結合している。別の態様において、前記検出可能実体は、蛍光実体、比色実体、または磁気実体である。別の態様において、前記分子は固体支持体に結合している。別の態様において、前記固体支持体はプラスチック表面、ガラス表面、アガロース、アクリルアミド、レクチンまたは磁気粒子である。別の態様において、前記方法は、幹細胞が濃縮されている前記集団を培養して、P1H12+、CD144+、AC133−、CD202+、CD45−、VEGFR2+であり、HUVECおよびMVECよりも高い増殖能を有し、そしてヴァイベル・パラーデ体を含有する子孫細胞を生じさせる工程をさらに含んでなる。別の態様において、前記の第一の細胞集団は哺乳動物由来である。別の態様において、前記哺乳動物は霊長類である。別の態様において、前記霊長類はヒトである。別の態様において、前記の第一の細胞集団は末梢血由来である。別の態様において、前記の第一の細胞集団は骨髄由来である。別の態様において、前記の第一の細胞集団は胎児肝組織由来である。
別の態様において、本発明は、上述のような幹細胞と実質的に均質の集団を含んでなる、幹細胞培養物を提供する。
別の態様において、本発明は、上述のような単離子孫細胞および薬学的に許容しうるキャリアーを含んでなる組成物を提供する。別の態様において、薬学的に許容しうるキャリアーは、生理食塩水、ゲル、ヒドロゲル、スポンジ、およびマトリックスからなる群より選択される。
別の態様において、本発明は、上述のような単離幹細胞の子孫を含んでなる、組織工学構築物を提供する。
別の態様において、本発明は、上述のような単離幹細胞の分化を誘導する剤を同定する方法であって、前記単離幹細胞を試験剤と接触させ、そして前記単離幹細胞中の変化を検出することを含んでなり、前記変化が、前記剤が前記単離幹細胞の分化を誘導することの指標となる、前記方法を提供する。
本発明は、幹細胞として増殖可能であり、そして内皮細胞および/または内皮様細胞を生じさせうる幹細胞、該幹細胞を含んでなる幹細胞組成物の単離法および使用法、並びに該幹細胞由来の細胞を提供する。本発明の幹細胞は、遺伝子治療、組織工学、組織生成、創傷修復、診断学において有用性を見出し、血管形成剤として、血管生成剤として、遺伝子搬送およびタンパク質搬送のための剤として、そして療法剤として有用性を見出す。
内皮幹細胞単離
PBMCを単離するため、1.077の比重を有するFICOLLTM(Amersham Biosciences、ニュージャージー州ピスカタウェイ)上で遠心分離することによって、体積200ccのナトリウム・ヘパリン処理したヒト血液を分画した。「バフィーコート」中に存在する単離PBMCを、完全培地(IGF、FGF、EGF、およびVEGFを含有するEGM2+15%FCS;Cambrex Bioscience, Inc.、メリーランド州ボルチモア)中、およそ100x106細胞/mlで、そしてこれを超えないように再懸濁した。10μg/mlのマウス抗P1H12抗体(Chemicon MAB 16985)を細胞に添加し、そして室温で1時間インキュベーションした。
内皮幹細胞性質決定
以下の表に示すように、単離時および多様な時点でのFACSによって、細胞を性質決定した。
表2.時間に渡る単一ドナーの表面マーカーの要約
刺激に反応したヒト末梢血幹細胞由来内皮細胞の平面遊走および遊走阻害剤の影響
平面内皮細胞遊走(創傷閉鎖)アッセイを用いて、PMA、EGFおよび他の遊走刺激に反応した、ヒト末梢血由来内皮細胞の遊走を定量化した。このアッセイでは、内皮細胞遊走を培養細胞単層中の環状創傷の閉鎖速度として測定する。創傷閉鎖速度は、腎および皮膚の微小血管内皮細胞において、直線性であり、そしてin vivoで血管形成を刺激する剤および阻害する剤によって、動的に制御される。腎微小血管内皮細胞および皮膚の微小血管内皮細胞は、PMAおよびEGFに反応して遊走し、そしてこの遊走は、遊走培養に抗血管形成剤を添加することによって制御可能である(Wileyら, 2001, Immunity 15:837−46)。末梢血ヒト幹細胞を本明細書に記載するように単離し、そして本明細書に記載するように、初代ヒト末梢血由来内皮細胞、hPBECの子孫を単離し、培養し、そして継代6〜11の間で用いた。シリコンチップドリルプレスを用いて、約80,000細胞/ウェルの、一晩血清欠乏させた(DMEM+0.5%FBS)集密hPBEC単層において、複製環状損傷、「創傷」(直径600〜800ミクロン)を生成した。創傷を与えた時点で、培地(DMEM+0.1%FBS)に、5ng/ml PMA(ホルボール−12−ミリステート−13−アセテート)、40ng/ml EGFあるいは5ng/ml PMAまたはEGFおよび遊走阻害剤の組み合わせを補った。顕微鏡および画像解析ソフトウェア(Bioquant;テネシー州ナッシュビル)を用いて、時間(0〜14時間)の関数として、残余創傷領域を測定した。各剤および剤の組み合わせに関して、時間に渡ってプロットした、残余創傷面積の線形回帰によって、相対遊走率を計算した。結果を図1〜2に示す。hPBECはPMAに反応してよく遊走し(>=50%)(図1)、そしてEGFに反応する場合は、より遅く遊走した(>=35%)(図2)。抗血管形成剤huTekΔFc(WO 00/75323)、TweakR.Fc(WO 01/45730)、ネクチン−3α−Fc(B7L4.Fc)(WO 02/28902)、およびCD148 mAbを、示す濃度で添加すると、PMAが誘導するhPBEC遊走が、huIgG対照タンパク質に比較して、それぞれ、40%、40%、70%および100%阻害された(図1)。抗血管形成剤huTekΔFc、TweakR.Fc、ネクチン−3α−Fc(B7L4.Fc)、および抗CD148 mAbを、示す濃度で添加すると、EGFが誘導するhPBEC遊走が、huIgG対照タンパク質に比較して、それぞれ、50%、100%、95%および100%阻害された(図2)。
バリア遊走アッセイ
内皮幹細胞を培地(例えばEGM−2培地、Clonetics、メリーランド州ウォーカーズビル)中、そしてPMA(50ng/ml)の存在下または非存在下で、一晩(18時間)培養し、そしてその後、細胞を洗浄し、そして4μMカルセイン色素を含有するPBS中で2時間標識した。カルセイン標識後、488nmの励起によって、蛍光を発するように細胞を励起した。細胞をPBS中で洗浄し、基本培地(EBM+/−0.1%FBS)中に再懸濁し、そして24ウェルプレート用の3ミクロン孔サイズのフルオロブロック挿入物における培養に置いた。分化した内皮細胞子孫を含む5万の幹細胞を、フルオロブロック挿入物において、基本培地300マイクロリットル中で培養して、そして細胞を含有する挿入物を、挿入物の不透性(opaque)3ミクロンフィルターから24ウェルプレートに、本発明の細胞を遊走させるかまたは移動させる潜在能力(走触性)を有するサイトカインおよび/または血清を含む1mlの培地を含有する24ウェル無菌培養プレートに入れた。マルチ標識カウンターを用いて、底部ウェルにおいて、530nmで観察される蛍光発光レベルを測定することによって、フィルターを通じた細胞の遊走を検出した。遊走結果は、上記の実施例3の平面遊走アッセイ結果と類似であった。
毛細管/索状組織(chord)形成アッセイ
エンゲルブレス−ホルム−スウォーム(EHS)マウス肉腫から抽出した、可溶化基底膜調製物である、MATRIGELTMマトリックス(Becton Dickinson、マサチューセッツ州ベッドフォード)を氷上、4℃で一晩融解した。24ウェルプレート(BD Labware、ニュージャージー州フランクリンレークス)および1000μlピペットチップもまた、4℃で一晩冷却した。アッセイ当日、泡を入れないように注意しながら、ウェルあたり300μlのMATRIGELTMでプレートウェルを均一にコーティングした。コーティングしたプレートを37℃で30分間インキュベーションして、マトリックスが重合するのを可能にした。
投与した幹細胞および幹細胞子孫のin vivo局在
本実施例は、本明細書に記載する方法によって単離した細胞が、in vivoで、血管形成活性および/または血管生成活性を有する領域に遊走することを立証する。
Claims (73)
- 幹細胞が濃縮されている集団を調製する方法であって、第一の細胞集団から幹細胞が濃縮されている前記集団を分離することを含んでなり、幹細胞が濃縮されている前記集団が、前記の第一の細胞集団より、少なくとも約100倍高い濃度のP1H12+幹細胞を含んでなる、前記方法。
- 幹細胞が濃縮されている前記集団が、前記の第一の細胞集団より、少なくとも約1,000倍高い濃度のP1H12+幹細胞を含んでなる、請求項1の方法。
- 幹細胞が濃縮されている前記集団が、前記の第一の細胞集団より、約1,000倍〜約4,000倍高い濃度のP1H12+幹細胞を含んでなる、請求項1の方法。
- 幹細胞が濃縮されている前記集団が、さらに、CD148、AC133、CD45およびCD34からなる群より選択される1以上のマーカーを、前記の第一の細胞集団より高い濃度で含んでなる、請求項1の方法。
- 前記分離工程が、前記の第一の細胞集団を、P1H12+に特異的に結合する分子と接触させ、そして前記分子に結合する、濃縮されている前記細胞集団を選択することを含んでなる、請求項1の方法。
- 前記分子が抗体である、請求項5の方法。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項6の方法。
- 前記分子が抗体由来である、請求項6の方法。
- 前記分子がペプチド−Fc融合分子である、請求項6の方法。
- 前記分離工程が、前記の第一の細胞集団を、CD148、AC133、CD45およびCD34からなる群より選択される分子に特異的に結合する分子と接触させ、そして濃縮されている前記細胞集団に関して、前記分子に結合する細胞を選択することをさらに含んでなる、請求項1の方法。
- 前記分離工程が、濃縮されている前記細胞集団を、CD148、AC133、CD45およびCD34からなる群より選択されるマーカーに特異的に結合する分子と接触させ、そして前記分子に結合しない細胞を、濃縮されている前記細胞集団から取り除くことをさらに含んでなる、請求項1の方法。
- 前記分離工程が、前記の第一の細胞集団を、CD144、CD202b、VEGFR2からなる群より選択される分子に特異的に結合する分子と接触させ、そして濃縮されている前記細胞集団に関して、前記分子に結合しない細胞を選択することをさらに含んでなる、請求項1の方法。
- 前記分離工程が、濃縮されている前記細胞集団を、CD144、CD202b、VEGFR2からなる群より選択される分子に特異的に結合する分子と接触させ、そして前記分子に結合する細胞を、濃縮されている前記細胞集団から取り除くことをさらに含んでなる、請求項1の方法。
- 幹細胞が濃縮されている前記集団が、前記の第一の細胞集団より、P1H12+、CD148+、AC133+、CD144−、CD202b−またはVEGFR2−である幹細胞を、少なくとも約100倍高い濃度で含んでなる、請求項1の方法。
- 幹細胞が濃縮されている前記集団が、前記の第一の細胞集団より、P1H12+、CD148+、AC133+、CD144−、CD202b−またはVEGFR2−である幹細胞を、少なくとも約1,000倍高い濃度で含んでなる、請求項14の方法。
- 幹細胞が濃縮されている前記集団が、前記の第一の細胞集団より、P1H12+、CD148+、AC133+、CD144−、CD202b−またはVEGFR2−である幹細胞を、約1,000倍〜約4,000倍高い濃度で含んでなる、請求項15の方法。
- 幹細胞が濃縮されている前記集団が、さらに、CD34+またはCD45+である幹細胞に関しても濃縮されている、請求項14の方法。
- 幹細胞が濃縮されている前記集団が、さらに、CD34−およびCD45+である幹細胞に関しても濃縮されている、請求項14の方法。
- 幹細胞が濃縮されている前記集団が、さらに、CD34+およびCD45+である幹細胞に関しても濃縮されている、請求項14の方法。
- 前記分子が検出可能実体に結合している、請求項5の方法。
- 前記検出可能実体が、蛍光実体、比色実体、または磁気実体である、請求項20の方法。
- 前記分子が固体支持体に結合している、請求項5の方法。
- 前記固体支持体がプラスチック表面、ガラス表面、アガロース、アクリルアミド、レクチンまたは磁気粒子である、請求項22の方法。
- 幹細胞が濃縮されている前記集団を培養して、P1H12+、CD144+、AC133−、CD202+、CD45−、VEGFR2+であり、HUVECおよびMVECよりも高い増殖能を有し、そしてヴァイベル・パラーデ体を含有する子孫細胞を生じさせる工程をさらに含んでなる、請求項1の方法。
- 前記の第一の細胞集団が哺乳動物由来である、請求項1の方法。
- 前記哺乳動物が霊長類である、請求項25の方法。
- 前記霊長類がヒトである、請求項26の方法。
- 前記の第一の細胞集団が末梢血由来である、請求項1の方法。
- 前記の第一の細胞集団が骨髄由来である、請求項1の方法。
- 前記の第一の細胞集団が胎児肝組織由来である、請求項1の方法。
- 請求項1の方法によって調製した、幹細胞が濃縮されている集団。
- 前記幹細胞が、CD148、AC133、CD45およびCD34からなる群より選択されるマーカーの1またはそれより多くに関して陽性である、請求項31の、幹細胞が濃縮されている集団。
- P1H12+、CD148+、AC133+、CD144−、CD202b−およびVEGFR2−である幹細胞に関して濃縮されている、請求項31の、幹細胞が濃縮されている集団。
- さらに、CD34+またはCD45+である幹細胞に関しても濃縮されている、請求項31の、幹細胞が濃縮されている集団。
- さらに、CD34+およびCD45+である幹細胞に関しても濃縮されている、請求項31の、幹細胞が濃縮されている集団。
- さらに、CD34−およびCD45+である幹細胞に関しても濃縮されている、請求項31の、幹細胞が濃縮されている集団。
- 前記幹細胞が、ヴァイベル・パラーデ体を含有する、請求項31の、幹細胞が濃縮されている集団。
- 前記幹細胞が内皮前駆細胞である、請求項31の、幹細胞が濃縮されている集団。
- 前記の第一の細胞集団が哺乳動物由来である、請求項31の、幹細胞が濃縮されている集団。
- 前記哺乳動物が霊長類である、請求項39の、幹細胞が濃縮されている集団。
- 前記霊長類がヒトである、請求項40の、幹細胞が濃縮されている集団。
- 前記の第一の細胞集団が末梢血由来である、請求項31の、幹細胞が濃縮されている集団。
- 前記の第一の細胞集団が骨髄由来である、請求項31の、幹細胞が濃縮されている集団。
- 前記の第一の細胞集団が胎児肝組織由来である、請求項31の、幹細胞が濃縮されている集団。
- 請求項31の、幹細胞が濃縮されている前記集団由来の、子孫細胞集団であって、P1H12+、CD144+、AC133−、CD202+、CD45−、VEGFR2+であり、HUVECおよびMVECよりも高い増殖能を有し、そしてヴァイベル・パラーデ体を含有する、前記子孫細胞集団。
- P1H12+およびAC133+であり、そして自己再生(self−renew)可能であり、そして内皮細胞に分化する、単離幹細胞。
- さらに、CD148+、CD144−、VEGFR2−およびCD202b−である、請求項46の単離幹細胞。
- さらに、CD34+またはCD45+である、請求項46の単離幹細胞。
- さらに、CD34+およびCD45+である、請求項46の単離幹細胞。
- さらに、CD34−およびCD45+である、請求項46の単離幹細胞。
- 哺乳動物由来である、請求項46の単離幹細胞。
- 前記哺乳動物が霊長類である、請求項46の単離幹細胞。
- 前記霊長類がヒトである、請求項46の単離幹細胞。
- 末梢血由来である、請求項46の単離幹細胞。
- 骨髄由来である、請求項46の単離幹細胞。
- 胎児肝組織由来である、請求項46の単離幹細胞。
- 15%血清を含んでなる完全培地中で、少なくとも14日間培養可能である、請求項46の単離幹細胞。
- 異種ポリヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項46の単離幹細胞。
- 請求項46の前記単離幹細胞またはその子孫細胞を含んでなる細胞株。
- 請求項38の前記幹細胞と実質的に均質の集団を含んでなる、幹細胞培養物。
- 請求項46の前記単離幹細胞および薬学的に許容しうるキャリアーを含んでなる組成物。
- 前記の薬学的に許容しうるキャリアーが、生理食塩水、ゲル、ヒドロゲル、スポンジ、およびマトリックスからなる群より選択される、請求項61の組成物。
- 15%血清を含む完全培地中で、約6日間〜約3週間、請求項38の前記単離幹細胞を培養することによって得られる単離子孫細胞であって、P1H12+、CD144+、AC133−、CD202+、CD45−、VEGFR2+であり、HUVECおよびMVECよりも高い増殖能を有し、そしてヴァイベル・パラーデ体を含有することで特徴付けられる、前記単離子孫細胞。
- 請求項63の前記単離子孫細胞と実質的に均質の集団を含んでなる、子孫細胞培養物。
- 請求項63の前記単離子孫細胞および薬学的に許容しうるキャリアーを含んでなる組成物。
- 薬学的に許容しうるキャリアーが、生理食塩水、ゲル、ヒドロゲル、スポンジ、およびマトリックスからなる群より選択される、請求項65の組成物。
- 請求項46の前記単離幹細胞を含んでなる、組織工学構築物。
- 請求項46の前記単離幹細胞の子孫を含んでなる、組織工学構築物。
- 請求項46の前記単離幹細胞およびその子孫細胞を含んでなる、組織工学構築物。
- 請求項46の前記単離幹細胞の分化を誘導する剤を同定する方法であって、前記単離幹細胞を試験剤と接触させ、そして前記単離幹細胞中の変化を検出することを含んでなり、前記変化が、前記剤が前記単離幹細胞の分化を誘導することの指標となる、前記方法。
- 内皮細胞を含んでなる組織工学構築物を生成する方法であって、請求項46の前記単離幹細胞を組織工学構築物中で培養することを含んでなる、前記方法。
- 血管疾患または血管障害の治療が必要な被験者に、請求項46の前記単離幹細胞を投与することを含んでなる、血管疾患または血管障害の治療法。
- 血管疾患または血管障害の治療が必要な被験者に、請求項63の前記単離子孫細胞を投与することを含んでなる、血管疾患または血管障害の治療法。
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