MXPA04006154A

MXPA04006154A - Celulas madre endoteliales, poblaciones y metodos para el aislamiento y uso de las mismas.

Info

Publication number: MXPA04006154A
Application number: MXPA04006154A
Authority: MX
Inventors: C Rousseau Anne-Marie
Original assignee: Immunex Corp
Priority date: 2001-12-21
Filing date: 2002-12-20
Publication date: 2004-11-01
Also published as: AU2002360741B2; ES2341948T3; US20030148512A1; WO2003060077A2; EP1465983B1; CA2469472A1; PL210872B1; JP4447033B2; ATE462782T1; US7833697B2; CA2469472C; PL374312A1; EP1465983A2; JP2008148702A; JP2005514062A; DE60235836D1; WO2003060077A3; AU2002360741A1; EP1465983A4

Abstract

La presente invencion proporciona celulas madre caracterizadas por tener la capacidad de renovarse y la habilidad de dar surgimiento a celulas endoteliales y/o parecidas a endoteliales, metodos para aislar dichas celulas y metodos para usar las mismas. Tambien se proporcionan celulas de progenie derivadas de las celulas madre de la presente invencion.

Description

CÉLULAS MADRE EN DOTE LIALES , POBLACIONES Y MÉTODOS PARA EL AISLAMIENTO Y USO DE LAS MISMAS La presente solicitud reclama la prioridad de la solicitud provisional No. 60/343 ,498 , presentada el 21 de diciembre del 2001 . Cam po del Invento La presente invención proporciona células madre caracterizadas por tener la capacidad de renovar y la capacidad de dar surgimiento a cél ulas endoteliales y/o parecidas a endoteliales, métodos para aislar dichas células madre y métodos para utilizar las mismas. Tam bién se proporcionan células de progenie derivadas de las células madre de la presente invención . Antecedentes del Invento El cuerpo de los mamíferos está compuesto de diversas células que dan surgimiento a muchos tejidos en el cuerpo de un mam ífero. A pesar de la diversidad de naturalezas, morfolog ías, características y función de dichas células surgidas por linaje, en la actualidad se considera que la mayor parte, sino es que todas las células surgidas por linaje, se derivan de diversas células madre que dan surgimiento a una o más de las células surgidas por linaje del cuerpo de un mamífero. Dichas cél ulas madre constituyen ún icamente un pequeño porcentaje del número total de cél ulas presentes en el cuerpo y puede variar dependiendo de su surgimiento relativo para un tipo de célula en particular. Además, se sabe q ue marcadores asociados con las célu las que surgen por linaje también se encuentran en las cél ulas madre. Un marcador el cual ha sido marcado como presente en las células madre, CD34, tam bién se ha descubierto en un número significativo de progenitores surgidos por linaje. En particu lar, las células B (CD1 9+) y las células mieloides (CD33+) cubren del 80 al 90% de la población CD34+. Además, en >90% de todas las células CD34+, se encontrará una combinación de CD3, 8, 1 0, 1 5, 1 9 , 20 y 33. Por consiguiente, en virtud de la peq ueña proporción del número total de células que se encuentran en la méd ula ósea las cuales son células madre, de la incertidumbre de los marcadores asociados con la célu la madre que se distinguen de las células más diferenciadas y de la incapacidad general para ensayar en forma biológica las células madre, se ha evadido la identificación y la purificación de dichas células madre. Las células endoteliales son una unidad de organ ización celular de estructuras vasculares . Se requiere de su surgimiento lineal, expansión y ensamble en los vasos sanguíneos para la organogénesis durante el desarrollo del embrión . Durante la angiogenesis, las células endoteliales q ue se encuentran en los vasos existentes se activan mediante factores de angiogenesis, tales como TG F, FGF , y VEGF. Se forman nuevos vasos a través de la proliferación y migración celu lar, y la expansión y ramificación de los vasos existentes. Se necesita la identificación de una fuente fácilmente disponible de células madre que pueda dar surgimiento a células endoteliales. La necesidad es particularmente importante para células madre de fuentes adultas, debido a las restricciones recientemente impuestas en el uso de los fondos federales para la investigación de células madre embriónicas. La posesión de tales células madre permitiría la identificación de factores de crecimiento asociados con la regeneración de células endoteliales. Además, posiblemente aún no se han descubierto factores de crecimiento u otros factores biológicos (factores de transcripción) asociados con los pasos tempranos de la dedicación de la célula madre a un linaje de célula endotelial, la prevención de dicha dedicación y el control negativo de la proliferación de células madre. La disponibilidad de células madre podría ser extremadamente útil en transplantes vasculares, construcción de tejido, regulación de angiogenesis, vasculogenesis y la prevención de los mismos. Las células madre y su progenie pueden encontrar uso en el tratamiento de daño y reparación al miocardio. Tales células madre también pueden utilizarse para introducir un gen en un sujeto como parte de un régimen de terapia genética. Sumario del Invento En una modalidad, la presente invención proporciona un método para preparar una población enriquecida con células madre, en donde el método comprende separar la población enriquecida con células madre de una primera población de células, en donde la población enriquecida con células madre comprende al menos aproximadamente una concentración de cél ulas madre P 1 H12+ con más 1 00 dobleces que la pri mera población de células. En otra modalidad, dicha población enriquecida con células madre comprende al menos aproximadamente una concentración de cél ulas madre P 1 H 1 2+ con más de 1 00 dobleces que la que se encuentra en la primera población de células. En otra modalidad , la población en riquecida con células madre comprende al menos aproximadamente una concentración de células madre P1 H 1 2+ con más de desde 1 000 hasta aproximadamente 4000 dobleces que la que se encuentra en la primera población de células. En otra modalidad, la población enriq uecida con células madre comprende además una mayor concentración que la primera población de células de uno o más de los marcadores seleccionados del grupo que consiste de CD148 , AC 133 , CD45 y CD34. En otra modalidad, el paso de separación comprende contactar la primera población de células con una molécula que enlace en forma específica a P 1 H 1 2+ y seleccionar la población en riquecida con células madre que están enlazadas a la molécula. En otra modalidad, la molécula es un anticuerpo. En otra modalidad , el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En otra modalidad, la molécula se deriva de un anticuerpo, en otra modalidad, la molécula es una molécula de fusión de péptido-Fc. En otra modalidad, el paso de separación comprende además contactar la primera población de células con una molécula que enlace en forma específica a una molécula seleccionada del grupo que consiste de CD148, AC133, CD45 y CD34 y seleccionar la población enriquecida con células que está enlazada a la molécula. En otra modalidad, el paso de separación comprende además contactar la población enriquecida con células con una molécula que enlace en forma específica a un marcador seleccionado del grupo que consiste de CD148, AC133, CD45, y CD34 y eliminar la población enriquecida con células que no están enlazadas a la molécula. En otra modalidad, el paso de separación comprende además contactar la primera población de células con una molécula que enlace en forma específica a un marcador seleccionado del grupo que consiste de CD144, CD202b, VEGFR2 y seleccionar la población enriquecida con células que no están enlazadas a la molécula. En otra modalidad, el paso de separación comprende además contactar la población enriquecida con células con una molécula que enlace en forma específica a una molécula seleccionada del grupo que consiste de CD144, CD202b, VEGFR2 y eliminar la población enriquecida con células que están enlazadas a la molécula. En otra modalidad, la población enriquecida con células madre comprende al menos aproximadamente una concentración de células madre que son P1H12 + , CD148 + , AC133 + , CD144-, CD202b- ó VEGFR2- con más de 100 dobleces que la primera población de células. En otra modalidad, la población enriquecida con células madre comprende al menos aproximadamente una concentración de las células madre que son P1H12+, CD148+, AC133 + , CD144-, CD202b- ó VEGFR2- con más de 1000 dobleces que la primera población de células. En otra modalidad, la población enriquecida con células madre comprende al menos aproximadamente una concentración de las células madre que son P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202b- ó VEGFR2- con más de 1000 dobleces que la primera población de células. En otra modalidad, la población enriquecida con células madre comprende una concentración de células madre que son P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202b- ó VEGFR2-a con más de desde aproximadamente 1000 dobleces hasta aproximadamente 4000 dobleces que la primera población de células. En otra modalidad, la población enriquecida con células madre está enriquecida en forma adicional con células madre que son CD34+ ó CD45 + . En otra modalidad, la población enriquecida con células madre está enriquecida en forma adicional con células madre que son CD34- y CD45+. En otra modalidad, la población enriquecida con células madre está enriquecida en forma adicional con células madre que son CD34+ y CD45+. En otra modalidad, la molécula está enlazada a una entidad detectable. En otra modalidad, la entidad detectable es una entidad fluorescente, una entidad colorimétrica o una entidad magnética. En otra modalidad, la molécula está enlazada a un substrato sólido. En otra modalidad, el substrato sólido es una superficie de plástico, una superficie de vidrio, agarosa, acrilamida, o una partícula magnética. En otra modalidad, el método comprende además del paso de cultivar la población enriquecida con células madre para dar surgimiento a células progenie que son P1H12+, CD144+, AC133-, CD202 + , CD45-, VEGFR2+, tener una mayor capacidad de proliferación que HUVECs y MVECs y contener cuerpos Weibel-Palade. En otra modalidad, la primera población de células se deriva de un mamífero. En otra modalidad, el mamífero es un primate, en otra modalidad, el primate es un humano. En otra modalidad, la primera población de células se deriva de sangre periférica. En otra modalidad, la primera población de células se deriva de médula ósea. En otra modalidad, la primera población de células se deriva de tejido de hígado fetal. En otra modalidad, la presente invención proporciona una población de células madre preparadas como se indicó anteriormente. En otra modalidad, las células madre son positivas para uno o más de los marcadores seleccionados del grupo que consiste de CD148, AC133, CD45, y CD34. En otra modalidad, la población enriquecida con células madre está enriquecida con células madre que son P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202b- y VEGFR2-. En otra modalidad, la población enriquecida con células madre está enriquecida en forma adicional de células madre que son CD34+ ó CD45+. En otra modalidad, la población enriquecida con células madre está enriquecida en forma adicional con células madre que son CD34+ y CD45+. En otra modalidad, la población enriquecida con células madre está enriquecida en forma adicional con células madre que son CD34- y CE45 + . En otra modalidad, las células madre contienen cuerpos Weibel-Palade.

En otra modalidad , las cél ulas mad re son células progenitoras endoteliales. En otra modalidad , la primera población de células se deriva de un mam ífero. El otra modalidad, el mamífero es un primate. En otra modalidad, el primate es un humano. En otra modalidad, la primera población de células se deriva de sangre periférica. En otra modalidad , la primera población de células se deriva de médula ósea. En otra modalidad, la primera población de células se deriva de tejido de hígado fetal . En otra modalidad , la presente invención proporciona una población de células de progenie delgadas de la población enriquecida con células madre de conformidad con la Reivindicación 31 , en donde las cél ulas de progen ie son P 1 H 12 + , CD 144+, AC 1 33-, CD202 + , CD45-, VEG FR2+, tienen una mayor capacidad de proliferación que H UVECs y MVECs y contienen cuerpos Weibel-Palade. En otra modalidad, la presente invención proporciona una célula madre aislada que es P 1 H 1 2+ y AC133+ y que puede auto-renovarse y diferenciarse en una célula endotelial . En otra modalidad, la célula madre aislada es además CD 148+, CD 144-, VEG FR2- y CD202b-. En otra modalidad, la cél ula madre aislada es además, CD34+ ó CD45+. En otra modalidad, la célula madre aislada es además CD34+ y CD45+. En una modalidad, la célula madre se deriva de un mamífero. En otra modalidad el mamífero es un primate. En otra modalidad el primate es un humano. En otra modalidad la primera población de células se deriva de sangre periférica. En otra modalidad , la primera población de células se deriva de médula ósea . En otra modalidad la primera población de cél ulas se deriva de tejido de h ígado fetal. En otra modalidad , la célula mad re aislada tiene la capacidad de ser cultivada d urante al menos 14 días en un medio completo que contiene 15% de suero. En otra modalidad, la célula madre aislada comprende además una secuencia de polin ucleótidos heterólogos . En otra modal idad la presente invención proporciona una l ínea celular que comprende una célula madre aislada, tal como se describe anteriormente, o una célula de progenie de la misma. En otra modalidad, la presente invención proporciona un cultivo de célula madre que comprende una población de células madre substancialmente homogénea, tal como describió anteriormente. En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende una célula madre aislada, tal como se describió anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, el veh ícu lo farmacéuticamente aceptable es seleccionado del grupo que consiste de solución salina , un gel , un hidrogel, una esponja y una matriz. En otra modalidad, la presente invención proporciona una célula de progenie aislada obtenida a través del cultivo de una célula aislada, tal como se describió anteriormente, d urante de aproximadamente 6 días hasta aproximadamente 3 semanas en un medio completo con 1 5% de suero , en donde la cél ula de progenie está caracterizada como P 1 H 1 2 + , CD 144+, AC 133-, CD202+, CD45-, VEG FR2 + , tienen una mayor capacidad de proliferación que H UVECs y MVECs y contiene cuerpos Weibel-Palade. En otra modalidad, la presente invención proporciona un cultivo celular de progenie que comprende una población substancialmente homogénea de una célula de progenie asilada, tal como se describió anteriormente. En otra modalidad , la presente invención proporciona una composición q ue comprende una célula de progenie aislada, tal como se describe anteriormente, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, el veh ículo farmacéuticamente aceptable es seleccionado del grupo que consiste de solución salina, un gel , un hid rogel, una esponja y una matriz. En otra modalidad , la presente invención proporciona una construcción de ingeniería celular que comprende una célula madre aislada, tal como se describió anteriormente. En otra modalidad , la presente invención proporciona una construcción de ingeniería de tejido que comprende la progenie de una célula madre aislada , tal como se describió anteriormente. En otra modalidad , la presente invención proporciona una construcción de ingeniería de tejido q ue comprende u na célula madre aislada, tal como se describió anteriormente, y una célula de progenie de la misma. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para identificar u n agente q ue induce la diferenciación de una célula madre aislada, tal como se descri bió anteriormente, que comprende contactar la célula madre aislada con el agente de prueba y detectar un cambio en la célu la madre aislada , en donde el cam bio indica que el agente ind uce la d iferenciación de la cél ula madre aislada . En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para generar una construcción de ingeniería de tejido que comprende células endoteliales en donde el método comprende cultivar u na célula madre aislada, tal como se describió anteriormente, en una construcción de ingeniería de tejido. En otra modalidad , la presente invención proporciona un método para tratar una enfermedad o padecimiento vascular, en donde el método comprende administrar a un sujeto que necesita del mismo, una célula madre aislada como la que se describió anteriormente. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar una enfermedad o padecim iento vascu lar, en donde el método com prende administrar al sujeto que necesita del mismo, una célula de progenie aislada como la que se describió anteriormente. B reve Descri pción de los Di b ujos La figura 1 , muestra el efecto de in hibidores diferentes en la migración inducida por PMA de células endoteliales de sangre humana derivadas de célula madre en un ensayo de cierre de heridas.

La figura 2 , muestra el efecto de diferentes inhibidores en la migración inducida por EGF de células endoteliales de sangre humana derivadas de célula madre en un ensayo de cierre de heridas. La figura 3 , muestra la capacidad de proliferación de las células madre y de las células de progenie de la presente invención , expresada como la producción de biomasa. Descripción Detallada del Invento La presente invención proporciona células madre que pueden ser propagadas en la forma de células madre y que pueden dar surgimiento a células endoteliales y/o parecidas a células endoteliales, métodos para aislar y utilizar las composiciones de células madre que las comprenden y células derivadas de las m ismas. Las células madre de la presente invención tienen utilidad en terapia genética, ingeniería de tejido, reparación de heridas, diagnósticos, como agentes angiogénicos, como agentes vasculogénicos, como agentes para suministro de genes y proteína y como terapéuticos. En un aspecto, la presente invención proporciona células madre que comprenden características que incluyen la capacidad de auto-renovación y diferenciación en células endoteliales y/o parecidas a células endoteliales. En una modalidad , las cél ulas madre de la presente invención tienen un tiem po de doblez de 18 a 24 horas en un cultivo de monocapa y persisten d urante períodos mayores a las células endoteliales humanas primarias conocidas en la técnica (por ejemplo H UVECs). El tiempo de doblez depende del número de días que se hayan incubado las células madre en el cultivo . En el cu ltivo, estas células madre se adhieren o migran en y/o dentro de los sustratos a base de colágeno y tienen la capacidad de diferenciarse en cél ulas con morfología y/o función celular endotelial típica. Las células madre de la presente invención, expresan uno o más marcadores asociados con un fenotipo de célula madre endotelial y/o carencia de uno o más marcadores asociados con una célula diferenciada (por ejemplo, una célula que tiene una capacidad reducida de auto renovación, regeneración y diferenciación y/o una célula de origen hematopoyético. Una molécula es un "marcador" de un tipo celular deseado, si se encuentra en un porcentaje suficientemente alto de células del tipo celular deseado , y si se encuentra en un porcentaje suficientemente bajo de células de un tipo de célu las no deseado, ya que se puede lograr un nivel deseado de purificación del tipo celular deseado a partir de u na población de células que comprende tipos celulares tanto deseados como no deseados, al seleccionar las células que se encuentran en la población de células que tienen el marcador. Por ejemplo, un marcador puede ser desplegado en el 30% , 35% , 40% , 45% , 50% , 55% , 60%, 65% , 70%, 75% , 80% , 85%, 90%, 95% , 99% , o más del tipo cel ular deseado, y puede ser desplegado en menos del 50% , 45%, 40%, 35% , 30% , 25% , 20% , 1 5%, 1 0% , 5% , 1 % , o menos de un tipo celular no deseado. Los ejemplos de características de marcación de una célula madre de la presente invención, incluyen el antígeno P1H12 (también conocido como MUC18 y CD146; Solobey et. Al., 2001, J. Lab. Clin. Med. 138: páginas 322 a 331; anticuerpos que reconocen los mismos que están disponibles, por ejemplo en CRP Inc., Denver, PA, cat. No. M S-470R) y AC133 (Bhatia, 2001, Leucemia 15: páginas 1685 a 1688). Los ejemplos de marcadores que no se encuentran normalmente en las células madre de la presente invención, incluyen CD3, CD14, CD144, CD202b (también conocidos como Tek y Tie-2; ver la publicación de Leucocyte Typing Vil, Masón et al., (ed.s), Oxford University Press, 202 páginas 344 a 346), o una combinación de los mismos. En una modalidad, las células madre de la presente invención, al momento del aislamiento, son P1H12+ y AC133+. Estas células madre también pueden ser CD34 bajo o CD34", CD148+, y/o CD45+ al momento del aislamiento. La célula madre de la presente invención, también puede carecer de uno o más de los marcadores fenotípicos CD14-, CD144, CD202b, y/o VEGRF2. Por consiguiente, en otra modalidad las células madre son P1H12+, CD148+, AC133 + , CD34+, CD45+, CD144', CD202b', y VEGRF2". Los términos "célula precursora" y "célula progenitora" y "célula madre" se utilizan de manera intercambiable en la técnica, y aquí se refieren ya sea a una célula pluripotente o no surgida por linaje, célula progenitora, la cual tiene la capacidad potencial de un número no limitado de divisiones mitóticas ya sea para renovar su l ínea o para producir células de progenie las cuales se diferenciarán en célu las endotel iales o células parecidas a endoteliales; o una célula progenitora surgida por linaje y su progenie, la cual tiene la capacidad de auto renovarse y tiene la capacidad de diferenciarse en un célula endotelial. A diferencia de las células madre pluripotentes, las célu las progen itoras su rgidas por linaje se consideran generalmente como incapaces de dar surgimiento a numerosos tipos celulares, ya que fenotípicamente difieren entre sí. Más bien , dan surgimiento a uno o posiblemente dos tipos celulares su rgidos por linaje. En un aspecto, la presente invención proporciona células madre aisladas, en forma individual o en poblaciones. Los términos "aislado" o "purificado" cuando se refieren a cél ulas madre de la presente invención , significan células que están substancialmente libres de célu las q ue llevan marcadores asociados con la dedicación del linaje. En modalidades particulares, las células madre están al menos el 30% , 35%, 40%, 45%, 50% , 55% , 60% , 65% , 70% , 75% , 80% , 85% , 90% , 95% , ó 99%, libres de la contaminación de dichos tipos celulares. En otra modalidad, las células madre aisladas también están substancialmente libres de moléculas solubles q ue surgen en la naturaleza. Tal como se describirá con mayor detalle más adelante, se puede obtener una célula madre sustancial mente purificada de la presente invención , a través de por ejemplo, extracción (por ejemplo , a través de u na centrifugación del gradiente de densidad y/o citometría de flujo) de una fuente natural, tal como una muestra de tejido o de sangre. Se puede medir la pureza a través de cualquier método adecuado. Por ejemplo, una célula madre de la presente invención puede estar del 99 al 100% purificada, mediante citometría de flujo (análisis FACS), tal como se describirá más adelante. En una modalidad, la presente invención proporciona una población enriquecida con células madre. Una "población enriquecida con células madre" es una en donde las células madre de la presente invención han sido parcialmente separadas de otros tipos celulares, de modo que la población de células madre resultante tiene una mayor concentración de células madre que de la que tenía la población de células original. La población enriquecida con células madre tiene una concentración de células madres de más de aproximadamente 10 dobleces, 100 dobleces, 500 dobleces, 1000 dobleces, 2000 dobleces, 3000 dobleces, 4000 dobleces, 5000 dobleces, 6000 dobleces, 7000 dobleces, 8000 dobleces, 9000 dobleces, 10,000 dobleces, o más que la que tenía la población original antes de la separación. Las células madre de la presente invención, pueden cubrir por ejemplo, al menos el 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% o más de la población enriquecida con células madre. Tal como se describirá más adelante, la población enriquecida con células madre puede ser obtenida mediante por ejemplo, selección contra células que despliegan marcadores asociados con células diferenciadas , u otros tipos celulares no deseados y/o seleccionar las células que despliegan marcadores asociados con las células madre de la presente invención , y/o mediante la regeneración de células madre aisladas en sistemas de cultivo defin idos. En otra modalidad, la presente invención proporciona líneas celulares de células madre. Tal como se utiliza en la presente invención , una "l ínea celular" significa u n cultivo de células madre de la presente invención, o células progenie de las mismas (por ejemplo, células endoteliales y/o parecidas a endoteliales) que pueden ser reproducidas durante un período de tiempo prolongado, preferentemente en forma indefinida, y cuyo térm ino incluye, por ejem plo , células que son cultivadas, crioconservadas y re-cultivadas después de la crioconservación . Tal como se utiliza en la presente invención, un cultivo, significa una población de células madre endoteliales crecida en un medio y pasada opcionalmente de manera correspondiente. Un cultivo de células madre puede ser un cultivo primario (por ejem plo un cultivo que no ha sido pasado) o puede ser un cultivo secundario o subsecuente (por ejemplo , una población de células q ue ha sido subcultivado o pasado una o más veces). Tal como se describió anteriormente, las células madre de la presente invención están caracterizadas por la presencia y/o ausencia de ciertos marcadores que son reconocidos en forma específica por una molécula . Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención proporciona métodos para etiq uetar células madre de la presente invención . En una modalidad, las células madre son etiq uetadas con una molécula (por ejemplo, como un anticuerpo) que reconoce en forma específica un marcador que está asociado con una célula madre de la presente invención (el antígeno P 1 H 1 2). En otra modalidad, se contacta una población de células con una molécula que enlaza en forma específica a un marcador de acuerdo con condiciones que permiten que la molécula enlace al marcador, en donde la población de células comprende al menos una célula madre que tiene dicho marcador. En otra modalidad , se contacta una población de células con una molécula que en laza en forma específica un marcador bajo condiciones q ue permiten que la molécula enlace al marcador, en donde la población de células comprende células madre que no tienen el marcador y células no madre que no tienen el marcador. Por ejemplo, la molécula utilizada puede ser un anticuerpo, un derivado de anticuerpo, un ligante, una molécula de fusión de péptido-Fc (tal como se describe en la solicitud PCT publicada WO 01 /83525 A2) u otra molécula. La molécu la puede comprender opcionalmente una porción adicional, por ejemplo, una que sea detectable (por ejemplo, una etiq ueta fluorescente o colorimétrica) o una que ayude al aislamiento de las células etiquetadas (por ejemplo, una porción que está enlazada mediante otra molécula o una partícula mag nética) . En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para aislar células madre de la presente invención. Las células madre de la presente invención , pueden ser aisladas por ejemplo, utilizando moléculas (por ejemplo, anticuerpos, derivados de anticuerpos , ligantes o moléculas de fusión de péptido-Fc) que enlazan a un marcador en las células madre (por ejemplo, el antígeno P 1 H 1 2, CD34, CD45, AC 133, y CD 148) y seleccionar en forma positiva células q ue enlacen a la molécula (por ejemplo, una selección positiva) . Otros ejemplos de los métodos de selección positiva incluyen métodos para promover en forma preferencial el crecimiento de un tipo celular deseado en una población mezclada de tipos celulares deseados y no deseados. Como alternativa, al utilizar las moléculas que enlazan a marcadores que no se encuentran en el tipo celular deseado, pero que están presentes en un tipo celular no deseado , las células no deseadas que contienen dichos marcadores pueden ser eliminadas de las células deseadas (por ejemplo, una selección negativa). Otros métodos de selección negativa incluyen preferentemente exterminar o in hibir el crecimiento de un tipo celular no deseado en una población mezclada de tipos celulares deseados y no deseados. Por consiguiente, al utilizar la selección negativa, la selección positiva o una combinación de las mismas, se puede elaborar una población en riquecida con células madre. Las células madre endoteliales de la presente invención , pueden ser aisladas de una muestra obtenida de un sujeto mam ífero. El sujeto puede ser cualquier mamífero (por ejemplo, bovino, ovino, porcino, canino, felino, equino, primate), aunque preferentemente es un humano . La muestra de células puede ser obtenida de cualquier número de fuentes diferentes que incluyen por ejemplo, médula ósea, tejido fetal (por ejemplo, tejido de hígado fetal), sangre periférica, sangre de cordón umbilical y similares. Preferentemente, la fuente celular es sangre periférica debido al uso de técnicas menos invasivas para obtener la m uestra cel ular y la población de donantes más fácilmente disponibles. Con el objeto de obtener células madre de la presente invención , es necesario aislar, separar o eliminar las células madre de la presente invención de otras células con las cuales normalmente se encuentran . Por ejemplo, cuando la fuente de cél ulas procede de sangre periférica, las células madre deben separarse o enriquecerse de otras células (por ejemplo , eritrocitos, plaquetas, monocitos, neutrófilos, macrófagos y similares). Se pueden emplear diversas técnicas para separar las células madre de la presente invención , eliminando ¡nicialmente las células madre de la presente invención de otros tipos celulares a través de características de expresión de marcador y/o eliminando células de linaje dedicado procedente de las células madre de la presente invención, en una forma similar. Los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales) son particularmente útiles para identificar los marcadores de proteína de superficie celular asociados con linajes de células particulares y/o etapas de diferenciación . Los anticuerpos pueden ser adheridos a un soporte sólido (por ejemplo, cuentas magnéticas recubiertas con anticuerpos). Los ejemplos de anticuerpo comercialmente disponibles que reconocen marcadores que dependen del linaje incluyen anti-AC133 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA); anti-CD34 (Becton Dickinson, San José, CA), anti-CD31, anti-CD62E, anti-CD104, anti-CD106, antí-CD1a, anti-CD14 (todos disponibles en Pharmingen, Hamburg, Alemania); anti-CD144 y ANTI-CD-13 (Immunotech, Marseille, Francia). El clon P1H12 (Chemicon, Temecula, CA; Número de Catálogo MAB16985), produce un anticuerpo que reacciona específicamente con el antígeno P1H12 (también conocido como CD146, MCAM, y MUC18). El anticuerpo P1H12 localiza en forma específica las células endoteliaies de todos los vasos, incluyendo microvasos de tejido normal y cancerígeno. El anticuerpo P1H12 no tíñe células hematopoyéticas. Los procedimientos para separación pueden incluir separación magnética, utilizando cuentas magnéticas recubiertas con anticuerpo, cromatografía por afinidad, agentes citotóxicos unidos a un anticuerpo monoclonal o agentes que se utilizan en conjunto con un anticuerpo monoclonal, por ejemplo, complementos y citotoxinas, y "rodando" con un anticuerpo adherido a una matriz sólida (por ejemplo, placa), u otra técnica convencional. Las técnicas que proporcionan una separación precisa, incluyen clasificadores de células activadas por fluorescencia, los cuales pueden tener diferentes grados de sofisticación, por ejemplo, una pl uralidad de canales de color, canales de detección de dispersión de luz de bajo ángulo y ángulo obtuso y canales de impedancla. En forma conveniente los anticuerpos pueden ser conjugados con marcadores, tales como cuentas magnéticas, los cuales permiten la separación directa, biotina la cual puede ser eliminada con avidina o estreptavidina enlazada a un soporte, fluorocromos, los cuales se pueden utilizar con un clasificador activado por fluorescencia, o similar, para permitir una fácil separación del tipo cel ular en particular. Se puede emplear cualquier técnica la cual no perjudiq ue en forma indebida la viabilidad de las células madre. En una modalidad, las cuentas magnéticas enlazadas a anticuerpos selectivos para marcadores de superficie cel ular que se encuentran en un gran número de células surgidas por linaje de los sistemas hematopoyéticos (por ejemplo células T, células B, (tanto pre-B y cél ulas-B) y células mielomonocíticas) y/o poblaciones celulares menores (por ejemplo, megacariocitos, células mástil , eosinófilos y basófilos) se utilizan ya sea antes de, en forma simultánea con , o después de utilizar una selección de antígeno P1 H 12 para eliminar las células surgidas por linaje u otras cél ulas procedentes de las células madre de la presente invención . Se podrán eliminar aproximadamente al menos el 30% , 35% , 40%, 45% , 50%, 55% , 60% , 65% , 70%, 75% , 80%, 85% , 90%, 95% , 99% o más de las cél ulas hematopoyéticas totales; sin embargo, no es esencial eliminar cada tipo celular diferenciado en forma terminal . Se pueden eliminar plaquetas de eritrocitos (por ejem plo mediante técnicas de gradiente de densidad) antes de clasificar o separar las células madre sin eritrocitos y sin plaquetas. Cuando se utiliza selección positiva en el protocolo, las células dedicadas que carecen de un marcador seleccionado en forma positiva se dejarán al final . Sin embargo, en una modalidad se utiliza la selección tanto positiva como negativa, de modo que en el paso final de selección positiva se minimiza el número de células dedicadas presentes. Un experto en la técnica reconocerá que debido a la carencia de capacidad proliferativa de muchos tipos celulares en la sangre periférica, la mayoría, sino es que todas las células definidas por linaje, permanecen después del proceso de selección positiva y/o negativa y fal larán en la proliferación y/o adhesión a un substrato a base de colágeno y serán eliminadas durante las técnicas de base celular. Se pueden lograr en esta forma composiciones que tengan aproximadamente el 30%, 35%, 40%, 45%, 50% , 55% , 60%, 65% , 70%, 75%, 80%, 85% , 90% , 95%, 99% o más, cuando las células madre deseadas sean identificadas por ser P1 H 12+, CD 148+, AC 133+, CD34+, CD45\ CD 144", CD202b', y VEGRF2" y por tener la capacidad de auto renovarse y dar surgimiento a células endoteliales y/o parecidas endoteliales completamente diferenciadas. Se pueden utilizar combinaciones de métodos de enriquecimiento para mejorar el tiempo o eficiencia de la purificación o enriquecimiento. Por ejemplo, después de un paso de enriquecimiento para eliminar células q ue tienen marcadores que no son indicativas del tipo cel ular de interés, las células se pueden separar o enriquecer en forma adicional a través de un clasificador de célula activada por fluorescencia (FACS) u otra metodología q ue tenga una alta especificidad. Se pueden emplear análisis de multicolor con FACS. Las células pueden ser separadas sobre la base de nivel de tinción de un antígeno en particular o la carencia del mismo . Se pueden utilizar fluorocromos para etiquetar anticuerpos específicos para un antígeno en particular. Dichos fluorocromos incluyen ficobiliproteínas, por ejem plo ficoeritina y aloficocianinas, fluorescencia , rojo Texas y simi lares. Aunque cada uno de los linajes que se encuentran en una población pueden ser separados en un paso por separado , normalmente a través de un proceso de selección negativa, se prefiere que el tipo celular de interés sea separado en un paso en un proceso de selección positiva. Las células se recolectan normalmente en un medio completo (por ejemplo EGM2, con los suplementos definidos; Clonetics Corporation) + 1 5% de suero. El suero puede ser xenogénico, autólogo o alogeneíco. Se pueden utilizar otras técnicas de selección positivas, las cuales permiten una separación precisa, tal como col umnas por afinidad y similares. Aunque el orden particular de separación es importante para la presente invención , un orden preferido incl uye una separación burda (por ejemplo, configuración de gradiente de densidad), seguido de una separación fina (por ejemplo selección positiva de un marcador asociado con células madre (por ejemplo, el antígeno P 1 H 12)). Normalmente la separación de gradiente de densidad está seguida de la selección positiva de las células P1 H 12+ que posteriormente se cultivan o se sacan del cultivo de las células madre de la presente invención. Se pueden utilizar cualesqu iera marcadores específicos a un tipo celular para seleccionar a favor o en contra un tipo celular en particular. Los ejemplos de tales marcadores incluyen CD1 Q/19/20 (asociadas con células-B), CD3/4/8 (asociadas con células-T), CD14/1 5/33 (asociadas con células m ieloide), y Thy-1 , la cual está ausente en células-T. Asimismo, se puede utilizar rodamina 123 para dividir células CD34+ en subgrupos "superiores" e "inferiores". Ver la publicación de Spangrude, 1990, Proc. Nati . Acad. Sci. 87: página 7433 para una descripción del uso de rodamina 1 23 con cél ulas madre de ratón . En una modalidad , las células madre de la presente invención son para la mayor parte de P 1 H 12+, CD 148+, AC 133+, CD 144-, CD202b", VEG RF2", y son bajas en rodamina. Una vez que se han aislado las células madre, se pueden propagar opcionalmente en un medio completo (por ejemplo EGM2 que contiene los suplementos comercialmente disponibles de Clonetics Corp . , por ejemplo. , IGF, EGF, FG F , y VEG F) + 15% de FCS, un medio acondicionado procedente de otros tipos celulares, tales como células estromales (por ejemplo, células estromales obtenidas de méd ula ósea, timo fetal o hígado fetal) , un medio que contenga factores de crecimiento asociados con la man utención de la célula madre, co-cultivo con cél ulas estromales o un medio que comprenda factores de manutención que soporte la proliferación de células madre, en donde las células estromales pueden ser, por ejemplo , alogeneícas o xenogeneícas. Antes de utilizarse en el co-cultivo, las preparaciones de células estromales mezcladas pueden ser liberadas de cél ulas hematopoyéticas empleando anticuerpos monoclonales adecuados para la eliminación de células no deseadas, por ejemplo, con conj ugados de toxinas-anticuerpo, anticuerpos y complementos, y similares. Como alternativa, se pueden utilizar l íneas celulares estromales clonadas, cuando las l íneas estromales pueden ser alogeneícas o xenogenéicas. Además , las células madre de la presente invención pueden ser cultivadas en un sistema de bioreactor. En otra modalidad, la presente invención proporciona métodos para estabilizar y/o mantener poblaciones de células madre, o la progenie de las mismas, así como poblaciones mezcladas que comprenden tanto células madre como células progen ie parecidas a endoteliales y las poblaciones de células ya producidas. Como con las células madre de la presente invención, una vez que se establece un cultivo de células parecidas a endoteliales o un cultivo mezclado de células madre y células parecidas endoteliales, la población de células se expande en forma mitótica in vitro a través del paso a un medio fresco, ya que la densidad celular se dicta bajo condiciones que conducen a proliferación celular, con o sin formación endotelial. Dichos métodos de cultivo pueden incluir, por ejemplo, el paso de células en un medio de cultivo que carece de IGF, EGF, FGF, VEGF, y/u otro factor de crecimiento. Los cultivos que comprenden células endoteliales y/o parecidas a endoteliales y cultivos mezclados que comprenden células madre y células endoteliales y/o parecidas a endoteliales, pueden transferirse a un medio fresco cuando se alcanza una suficiente densidad celular. Aunque muchos de los tipos celulares de la presente invención no demuestran inhibición-apoptosis de contacto típica, se tranquiliza cuando la densidad está a su máximo. Por lo tanto, en una modalidad, se evita o minimiza la formación de una monocapa confluente de células mediante, por ejemplo, la transferencia de una parte de las células a un nuevo recipiente de cultivo con medio fresco. Tal eliminación o transferencia puede realizarse en cualquier recipiente de cultivo que tenga una monocapa celular que exceda una densidad de aproximadamente 1x106 células por frasco de cultivo de tejido T75. Como alternativa, el sistema de cultivo puede ser agitado para evitar que las células se peguen. Una vez que las células madre de la presente invención han sido establecidas en el cultivo, tal como se describió anteriormente, pueden mantenerse o almacenarse en "bancos" celulares que comprenden cultivos ya se continuos ¡n vivo de células que requieren una transferencia regular, preferentemente, células que han sido crioconservadas.

La crioconservación de células madre, u otras células de la presente invención, se puede llevar a cabo de acuerdo con método conocidos, tales como los descritos en la publicación de Doyle et al. , (eds. ), 1 995, Cell & Tissue Cultura: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons, Chichester. Por ejemplo, pero no a manera de limitación , las células pueden ser suspendidas en un "medio congelado", tal como por ejemplo, un medio de cultivo que comprende además del 15 al 20% de suero bovino fetal (FBS) y el 1 0% de dimetilsulfóxido (DMSO), con o sin del 5 al 1 0% de glicerol, a una densidad de por ejemplo, 4-1 0x1 06 células/ml. Las células se suministran en frascos de vidrio o plástico los cuales posteriormente se sellan y transfieren a u na cámara de congelación de un congelador programable o pasivo. El rango óptimo de congelación puede determinarse en forma empírica. Por ejemplo, un programa de congelamiento que da un cambio en temperatura de -1 °C/min a través del calor de fusión puede ser utilizado. Una vez que los frascos que contienen las células han alcanzado una tem peratura de -80°C , se transfieren a un área de almacenamiento de nitrógeno líquido. Las cél ulas crioconservadas pueden ser almacenadas durante un período de años, aunque deben ser revisadas al menos cada 5 años para la manutención de la viabilidad . Las célu las crioconservadas de la presente invención , constituyen un banco de células, parte de las cuales pueden ser extraídas mediante descongelación y utilizarse posteriormente para producir un cultivo de células madre que comprende células madre, células endoteliales y/o parecidas a endoteliales, o tejido endotelial, según se necesite. El descongelamiento generalmente se debe de llevar a cabo en forma rápida, por ejemplo, transfiriendo un frasco de nitrógeno líquido a un baño de agua a una temperatura de 37°C. Los contenidos descongelados del frasco deben ser transferidos inmediatamente bajo condiciones estériles a un envase de cultivo que contenga un medio adecuado, tal como un medio completo (por ejemplo EG 2 que contiene IGF, EGF, FGF, y VEGF) + 15% de FACS. Es aconsejable que las células que se encuentran en el medio de cultivo sean ajustadas a una densidad inicial de aproximadamente 1-3x105 células/ml, para que las células puedan acondicionar el medio lo más pronto posible, evitando de este modo una fase de intervalo prolongado. Una vez en el cultivo las células pueden ser examinadas diariamente, por ejemplo con un microscopio invertido para detectar la proliferación celular, y pueden ser subcultivadas tan pronto como alcancen una densidad adecuada. Las células madre de la presente invención, pueden ser extraídas de un banco de células, según se necesite, y utilizadas para la producción de nuevas células madre, células endoteliales y/o parecidas a endoteliales y/o tejido endotelial ya sea in vitro, por ejemplo, como un cultivo endotelial de tercera dimensión, tal como se describirá más adelante, o in vivo por ejemplo, mediante administración directa de células al sitio en donde se necesitan nuevas células o tejido endotelial. Tal como se describe en la presente invención, las células madre de la misma se pueden utilizar para producir tejido endotelial nuevo para utilizarse en un sujeto en donde las células se aislaron originalmente de la sangre del propio sujeto u otro tejido (por ejemplo , células antologas). Como alternativa, las cél ulas de la presente invención se pueden utilizar en la forma de células de donador ubíq uitas para prod ucir tejido endotelial nuevo para utilizarse en cualquier sujeto (por ejemplo, células heterólogas). Una vez establecido, se puede utilizar un cultivo de células madre para producir células de progenie parecidas endoteliales y/o cél ulas endoteliales con la capacidad de producir n uevo tejido endotelial . La diferenciación de células madre a células endoteliales o células parecidas endoteliales, seguido de la producción del tejido endotelial del mismo , puede ser activado a través de factores de crecimiento exógeno específicos o cambiando las condiciones de cultivo (por ejemplo, la densidad) de un cultivo de célula madre. Ya que las célu las son puras, pueden util izarse para reconstituir un sujeto radiado y/o un sujeto tratado con quimioterapia; o como una fuente de células para linajes específicos, proporcionando su maduración, proliferación , y diferenciación en uno o más linajes seleccionados. Los ejemplos de factores que se pueden utilizar para inducir la diferenciación incluyen eritropoyetina , factores de estimulación de colonias, por ejemplo , G M-CSF, G-CSF , ó M-CSF , interleucinas, por ejemplo, I L-1 , -2, -3, -4 , -5 , -6. -7, -8 , y similares , Factor de I nhibición de Leucemia (L1 F), Factor de Acero (Stl), o similares , co-cultivos con miocitos card íacos u otros tipos celulares que surgen por linaje para inducir q ue las células madre surjan en un linaje en particular. En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para cultivar células madre para dar surgimiento a células de progenie, y las célu las ya producidas. En una modalidad , la célula de progenie es P 1 H 1 2+, CD 144+, AC 1 33", CD202b\ CD45", VEGFR2+, tiene una alta capacidad de proliferación comparada con H UVECs y MVECs, y contiene cuerpos Weibel-Palade. En otra modalidad , las células madre se construyen en forma genética para expresar genes de tipos específicos de factores de crecimiento, tales como, por ejem plo, TGF-ß, b-FGF , VEGF , FGF-1 8, y similares para una diferenciación exitosa y/o mejorada para cél ulas endoteliales y/o el cambio de producción endotelial ya sea en forma previa o posterior a la implantación . Otros factores o genes que se pueden inducir o transferir en las células madre o progenie de células madre de la presente invención para beneficios terapéuticos incluyen por ejemplo, I L1 7R, TNFR, angiopoyetina- 1 y -2, TWEAK, TWEAKR así como otros factores anti-inflamatorios o angiogénicos conocidos en la técnica. Se considera que el número y/o viabilidad de la célula endotelial nativa (EC) dismin uye con el tiempo. Por lo tanto, en ciertas poblaciones de pacientes , por ejemplo , pacientes de edad avanzada , la población residente de ECs que son competentes responden a citocinas angiogénicas que pueden ser limitadas. Por consig uiente , las células madre de la presente invención pueden proporcionar la población de células deseada dando como resultado una actividad angiogénica y reparación de tejido incrementadas. Las células de la presente invención se pueden utilizar para tratar sujetos que req uieren la reparación o reemplazo de tejido endotelial que resulta de una enfermedad o trauma , o para proporcionar una función cosmética, tal como aumento facial u otras características del cuerpo. El tratamiento puede comprender el uso de células de la presente invención para prod ucir nuevo tej ido endotelial , y el uso del tejido endotelial producido de este modo, de acuerdo con cualquier método actualmente conocido en la técnica o que se desarrolle en el futuro. Por ejemplo las células de la presente invención pueden ser implantadas, inyectadas, o administradas de otra forma directamente al sitio del tejido dañado, de modo que produzcan un nuevo tejido endotelial in vivo. En una modalidad , la administración incluye la administración de células madre endoteliales modificadas en forma genética. En una modalidad , se prepara una formulación que comprende las células de la presente invención para la inyección directamente al sitio en donde se desea la producción del nuevo tejido endotelial. Por ejemplo , y no a manera de limitación, las células de la presente invención pueden ser suspendidas en una solución de hidrogel para inyección . Como alternativa, la solución de h idrogel que contiene las células se puede dejar endurecer, por ejem plo en un molde (una construcción de tejido vascular o tubular) para formar una matriz que tenga células dispersas en el mismo antes de la implantación. Una vez que la matriz se ha endurecido, las formaciones celulares pueden ser cultivadas de modo que las células se expandan en forma mitótica antes del implante. Un hidrogel es un polímero orgánico (natural o sintético) el cual se retícula a través de en laces covalentes, iónicos o de hidrógeno para crear una estructura de celosía abierta de tercera dimensión, el cual atrapa moléculas de agua para formar un gel . Los ejemplos de materiales que se pueden util izar para formar un hidrogel incluyen polisacáridos tales como alginato y sales de los mismos, polifosfazinas y poliacrilatos, los cuales se reticulan en forma iónica , o polímeros de bloque tales como PLURON ICS™ o TETRON ICS™ (BASF Corp., Mount Olive, NY), copolímeros de bloque de óxido de polietileno polipropilénglicol los cuales se reticulan mediante temperatura o pH , respectivamente. En la técnica se conocen métodos de síntesis de materiales de hidrogel, así como métodos para preparar tales hidrogeles. Las form ulaciones celulares pueden comprender además uno o más de otros componentes, que incl uyen componentes de matriz extracelular seleccionados, tales como uno o más tipos de colágeno conocidos en la técnica, y/o factores de crecimiento y medicamentos. Los factores de crecimiento q ue pueden ser incorporados en forma útil en la formulación celular, incluyen uno o más factores de crecimiento de tejido conocidos en la técnica o que se identifiquen en el futuro, tales como pero sin limitarse a cualquier elemento de la familia TGF-ß , I GF-I y I I , hormona de crecimiento, BM Ps, tal como BM P-1 3 , y similares. Como alternativa , las células de la presente invención pueden ser construidas en forma genética para expresar y producir factores de crecimiento tales como BM P-1 3 ó TGF-ß. Más adelante se proporcionarán detalles con respecto a ingeniería genética de las células de la presente invención . Los medicamentos que pueden incorporarse en forma útil en la formulación celu lar, incluyen , por ejemplo, compuestos anti-inflamatorios, así como anestésicos locales. Otros componentes que también pueden ser incluidos en la formulación , son por ejemplo , amortiguadores para proporcionar un pH e isotonicidad adecuada, lubricantes, materiales viscosos para retener las células en o cerca del sitio de administración (por ejemplo , alginatos, agares y gomas de plantas) y otros tipos cel ulares que pueden producir un efecto deseado en el sitio de administración (por ejemplo aumento o modificación de formación de tejido endotelial o sus características físico químicas, soporte para la viabilidad de las células o inhibición de inflamación o rechazo). Las células pueden ser cubiertas a través de una cubierta para heridas adecuada q ue evita que las células abandonen el sitio. Tales cubiertas para heridas son conocidas por los expertos en la técnica . Como alternativa, las células madre de la presente invención pueden ser plantadas en una estructura o andamio tridimensional y cultivadas para permitir que las células crezcan y llenen la matriz o se implanten inmediatamente in vivo, en donde las células plantadas serán proliferadas en la superficie de la estructura y formarán un tejido endotelial de reemplazo in vivo junto con las células del sujeto. Tal estructura puede ser implantada en combinación con cualesquiera de uno o más factores de crecimiento, medicamentos, tipos celulares adicionales u otros componentes descritos que estimulan la formación endotelial o aumentan o mejoran de otra manera la práctica de la presente invención . Las células de la presente invención se pueden utilizar para prod ucir tejido endotelial in vitro nuevo, el cual posteriormente puede ser implantado, transplantado o insertado de otra forma en un sitio q ue requiere reparación de tejido endotelial , reemplazo o aumento en un sujeto. En una modalidad sin limitación , las células madre de la presente invención se utilizan para prod ucir una construcción de tejido tridimensional in vitro, el cual posteriormente se implanta in vivo. Como ejemplo de la producción de construcciones de tejido tridimensional, se debe consultar la Patente Norteamericana No. 4, 963 ,489, presentada el 16 de octubre de 1 990 por Naughton y asociados, la cual está incorporada a la presente invención como referencia. Por ejemplo, las células madre endoteliales o células madre endoteliales y células endoteliales y/o células parecidas endoteliales de la presente invención , pueden ser inoculadas o "plantadas" en una estructura o andamio, tridimensional , y ser proliferadas o crecidas in vitro para formar un tejido endotelial vivo que pueda ser implantado in vivo. La estructura tridimensional puede ser de cualq uier material y/o forma que permita q ue las células se adhieran a la misma (o puedan ser modificadas para permitir que las células se adhieran a la m isma) y permita que las células crezcan en más de una capa. Se puede utilizar un número de materiales diferentes para formar la matriz, en donde los materiales incluyen pero no se limitan a: nylón (poliamidas) , - dacrón (poliésteres), poliestireno , polipropileno, poliacrilatos, compuestos de polinivilo (por ejemplo, cloruro de polivinilo), policarbonato (PVC), politetrafluoretüeno (PTFE, teflón), termanoz (TPX), nitrocelulosa , algodón , ácido polig licólico (PGA), colágeno (en la forma de esponjas, trenzas o hilos tejidos y similares), suturas de gato, celulosa, gelatina, u otros materiales biodegradables que surgen de la naturaleza o materiales sintéticos que incluyen , una variedad de polihidroxialcanoatos. Cualesquiera de estos materiales pueden ser tejidos en una malla, por ejemplo, para formar la estructura o andamio tridimensional . Los expertos en la técnica pueden ajustar los poros o espacios en la matriz para permitir o evitar la migración de células en o a través del material de la matriz. La estructura tridimensional, matriz, hidrogel y similares puede ser moldeada en una forma adecuada para el tejido que será reemplazado o reparado. Por ejemplo, cuando se desea un injerto vascular, la estructura tridimensional puede ser moldeada en la forma de estructura tubular y plantada con cél ulas madre endoteliales de la presente invención, solas o en combinación con cél ulas estromales (por ejemplo, fibroblastos) y cultivadas de manera correspondiente. Por ejem plo , además de las células de la presente invención, se pueden agregar otras cél ulas a la estructura tridimensional para mejorar el crecimiento, o alterar, una o más características del nuevo tejido endotelial formado en el mismo. Dichas células pueden incluir, pero no se limitan a fibroblastos, pericitos, macrófagos, monocitos, células de plasma, células mástil y adipositos, entre otros. Aún en otra modalidad, las células madre de la presente invención se pueden utilizar junto con un sistema de cultivo tridimensional en un "biorreactor" para producir construcciones de tejido endotelial que posean propiedades bioquímicas, físicas y estructurales importantes del tejido endotelial h umano nativo a través del cultivo de las células y el tejido resultante bajo condiciones ambientales que son experimentadas normalmente por el tejido endotelial nativo. Por lo tanto , el sistema de cultivo tridimensional puede mantenerse bajo presurizacion intermitente y periódica y abastecer a las células de la presente invención con un sum inistro adecuado de nutrientes mediante convección. Es importante mantener un suministro de n utrientes adecuado para las células de la presente invención a lo largo de una construcción de tejido endotelial de reemplazo de aproximadamente 2 a 5 mm de espesor, ya que incrementa la densidad aparente de la construcción . La presión facilita el flujo de fluido a través de la construcción endotelial tridimensional , mejorando de este modo el sumi nistro de nutrientes y la eliminación de desperdicios de las cél ulas incrustadas en la construcción. El biorreactor puede incluir un número de diseños. Normalmente las condiciones de cultivo incluirán la colocación de una tensión fisiológica en la construcción q ue contiene cél ulas similares a las que se encontrarán in vivo. Por ejemplo, la construcción vascular puede ser cultivada bajo condiciones que simulen las presiones y fuerzas de corte de los vasos sanguíneos (ver por ejemplo la Patente Norteamericana No. 6, 121 , 042, la cual está incorporada a la presente invención como referencia). Las células madre, su progenie y el tejido endotelial de la presente invención se pueden utilizar en una variedad de aplicaciones. Estas incluyen , pero no se limitan a, transplante o implantación de células ya sea en forma no ad herida o adherida, por ejemplo, a una estructura tridimensional tal como la que se describe en la presente invención . Además, la inyección de una matriz extracelular preparada a partir de tejido endotelial nuevo producido a través de las células de la presente invención, puede ser administrada a un sujeto o puede ser utilizada para células de cultivo adicionales. Dichas células, tejidos y matriz extracelular pueden servir para reparar, reemplazar o aumentar el tejido endotelial que ha sido dañado debido a una enfermedad o trauma, o que ha fallado en desarrollarse normalmente, o para propósitos cosméticos. El tejido endotelial producido de acuerdo con la presente invención , puede utilizarse para reparar o reemplazar tejido endotelial dañado o destruido, para aumentar tejido endotelial existente, para introducir tejido n uevo o alterado, para modificar prótesis artificiales o para unir tejidos o estructuras biológicas. Por ejemplo, y no a manera de limitación, las modalidades específicas de la presente invención pueden incluir una válvula de corazón de reemplazo preparada con células madre endoteliales de la presente invención o su progenie y tejido o injerto vascular. En otra modalidad , las células de la presente invención se administran en combinación con factores angiogénicos para inducir o promover nueva formación capilar o de vasos en un sujeto. Las células de la presente invención pueden ser administradas antes de, junto con o después de la inyección del factor angiogénico. Además , las células de la presente invención pueden ser administradas in mediatamente en forma adyacente a, en el mismo sitio o lejos del sitio de administración del factor angiogénico. Por factor angiogénico se entiende un factor de crecimiento, proteína o agente q ue prom ueve o induce la angiogenesis en un sujeto. Además, las células o tejido endotelial de la presente invención se pueden utilizar, por ejemplo , para clasificación in vitro de acuerdo con la eficacia o citotoxicidad de los compuestos alergénicos, factores de crecimiento/regulación , compuestos farmacéuticos y similares en células madre endoteliales, para aclarar el mecanismo de ciertas enfermedades determinando los cambios en la actividad biológica de las células madre endoteliales (por ejemplo , capacidad proliferativa, adhesión ) para estudiar el mecanismo a través del cual operan los medicamentos y/o factores de crecimiento para modular la actividad biológica de células madre endoteliales , para diagnosticar y monitorear cáncer en un paciente, para terapia genética, administración de genes o admin istración de proteínas; y para producir productos biológicamente activos. Las cél ulas madre endoteliales también se pueden utilizar en el aislamiento y evaluación de factores asociados con la diferenciación y mad uración de células madre endoteliales. Por lo tanto, las células madre pueden utilizarse en ensayos para determinar la actividad del medio, tal como medio acondicionado, fluidos evaluados para la actividad de crecimiento celular, involucramiento con la dedicación de linajes particulares o similares. Son aplicables varios sistemas y se pueden diseñar para inducir la diferenciación de las células madre con base en diversas tensiones fisiológicas. Por ejemplo, un sistema de biorreactor que se puede emplear con las células de la presente invención incluye biorreactores que estimulan el tejido vascular. Las células madre endoteliales, la progenie de las mismas (por ejemplo, células endoteliales diferenciadas y/o parecidas a endoteiiales) y tejidos endoteiiales derivados de las mismas de la presente invención, se pueden utilizar in vitro para clasificar una amplia variedad de agentes de acuerdo con la efectividad y citotoxicidad de agentes farmacéuticos , factores de crecim iento/regulación , agentes anti-inflamatorios y similares. Para este fin , las células o cultivos de tejidos de la presente invención pueden mantenerse in vitro y exponerse al agente que será probado. La actividad de un agente citotóxico puede ser medida mediante su capacidad para dañar o exterminar cél ulas madre endoteiiales o su progenie en el cultivo . Este puede ser evaluado fácilmente mediante técnicas de tinción . El efecto de los factores de crecimiento/regulación puede evaluarse analizando un número de cél ulas viva in vitro, por ejemplo, a través de conteos celulares fetales y conteos celulares diferenciales. Esto se puede lograr utilizando técnicas citológicas y/o h istológicas estándar, que incluyen el uso de técnicas inmunohistoquímicas que emplean anticuerpos que definen antígenos celulares específicos de tejido. El efecto de varios medicamentos en las células de la presente invención , puede ser evaluado ya sea en un cultivo de suspensión o en un sistema tridimensional. Las células madre endoteiiales, su progenie y tejidos y materiales derivados de las m ismas de la presente invención, pueden producir un veh ículo para introducir genes y productos genéticos in vivo para ayudar y mejorar los resultados de implantación y/o el uso en terapias genéticas.

Las células madre endoteliales que expresan un producto de gen de interés o el tejido y material producido in vito, del mismo, pueden ser implantadas en un sujeto el cual tiene deficiencia en dicho producto genético. Por ejemplo, son de particular interés los genes que expresan productos con la capacidad de evitar o aminorar síntomas de varios tipos de enfermedades o padecimientos vasculares, o que evitan o promueven padecimientos inflamatorios. En una modalidad, las células de la presente invención se construyen en forma genética para expresar un producto de gen anti-inflamatorio que podría servir para reducir el riesgo de falla en el implante o cambio degenerativo adicional en el tejido endotelial debido a una reacción inflamatoria. Por ejemplo, una célula madre endotelial de la presente invención puede ser construida en forma genética para expresar uno o más productos genéticos anti-inflamatorios, que incluyen por ejemplo, péptidos o polipéptidos que corresponden al idiotipo de anticuerpos que neutralizan el factor de estimulación de colonia de granulocito-macrófago (GM-CSF), TNF, IL-1, IL-2, u otras citocinas inflamatorias. IL-1 ha mostrado disminuir la síntesis de proteoglucanos y colágenos tipo II, IX y XI (Tyler et al., 1985, Biochem, J. 227: páginas 69 a 878; Tyler et al., 1988, Coll. Relat. Res. 82: páginas 393 a 405; Goldring et al., 1988, J. Clin. Invest. 82: páginas 2026 a 2037; y Lefebvre et al., 1990, Biophys. Acta. 1052: páginas 366 a 372). TNF también inhibe la síntesis de proteoglucanos y colágeno tipo II, aunque es mucho menos potente que IL-1 (Yaron, I., et al., 1989, Artritis Rheum. 32: páginas 173 a 180; Ikebe, T., et al., 1988, J. Immunol. 140: páginas 827 a 831; y Saklatvala, J., 1986, Nature 322: páginas 547 a 549). Por ejemplo, las células de la presente invención también pueden ser construidas para expresar la codificación del gen que codifica la proteína reguladora de complemento humana que evita el rechazo de un injerto por parte del huésped. Ver por ejemplo, la publicación de McCurry y asociados 1995, Nature Medicine 1: páginas 423 a 427. En otra modalidad, las células madre endoteliales pueden ser construidas para incluir un gen o secuencia de polinucleótidos que expresa u origina que exprese un factor angiogénico. Las células madre genéticamente alteradas son útiles para producir proteínas recombinantes tanto no terapéuticas como terapéuticas in vivo e in vitro. Las células madre endoteliales se aislan de un donante (no humano o humano) tal como se describió anteriormente, se transfectan o transforman con un polinucleótido recombinante in vitro o ex vivo, y se transplantan en el receptor o se cultivan in vitro. Las células madre endoteliales alteradas en forma genética o su progenie producen la proteína recombinante deseada in vivo o in vitro. La proteína o molécula producida puede originar un efecto terapéutico directo o indirecto o producir una proteína o molécula de diagnóstico. Como alternativa, las células madre endoteliales o progenie de la presente invención pueden ser construidas en forma genética para expresar y producir factores de crecimiento tales como VEGF, FGF, EGF , I GF, así como agentes terapéuticos tales como TWEAK, TWEAKR, TN FR, otros agentes anti-inflamatorios, o agentes angiogénicos. Por ejemplo, el gen o secuencia de codificación para dichos factores de crecimiento o agentes terapéuticos podrían colocarse en asociación operativa con un promotor regulado de modo que la producción del factor de crecimiento o agentes en el cultivo pueda ser controlada. Las células de la presente invención pueden ser construidas en forma genética para producir otros productos recombinantes benéficos para transplante tales como factores anti-inflamatorios, por ejemplo, anti-G M-CSF, anti-TNF, anti-I L-l , anti-I L-2, y similares. Como alternativa, las células pueden ser construidas en forma genética para "derribar" la expresión de productos genéticos nativos que promueven la inflamación , por ejemplo GM-CS F, TNF, I L-I , I L-2, o "derribar" la expresión de M HC con el objeto de disminuir el riesgo de rechazo. Además, las células pueden ser construidas en forma genética para utilizarse en terapia genética para aj ustar el nivel de actividad genética en un sujeto para ayudar o mejorar los resultados del transplante endotelial. Las células construidas en forma genética pueden ser clasificadas para seleccionar las líneas celulares que proporcionan la disminución de síntomas de enfermedades reumatoides o reacciones inflamatorias in vivo, y/o escape de seguridad inm unológica y rechazo. Se utilizan técnicas de ADN recombinantes convencionales para introducir el polinucleótido deseado en las cél ulas madre o su progenie. El método preciso utilizado para introducir un polin ucleótido (por ejemplo un gen de reemplazo) no es importante para la presente invención . Por ejemplo, los métodos físicos para la introd ucción de polinucleótidos en células incluyen microinyección y electroporación. Los métodos qu ímicos tales como coprecipitación con fosfato de calcio e incorporación de polin ucleótidos en liposomas, también son métodos estándar para introducir polinucleótidos en células de mamíferos . Por ejemplo, se puede introducir ADN ó ARN utilizando vectores estándar, tales como los que se derivan de retroviruses de múrido y avian (ver por ejemplo la publicación de Gluzman et al. , 1 988, Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N .Y.). Son bien conocidos en la técnica métodos de biología molecular recombinante estándar (ver por ejemplo la pu blicación de Ausubel et al . 1 989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York), y se han desarrollado vectores virales para terapia genética y han sido utilizados clínicamente con éxito (Rosenberg, et al . , 1 990 , N . Engl. J . Med , 323 : página 370). Otros métodos tales como captación de polinucleótidos descubiertos procedentes de una matriz cubierta con ADN también están comprendidos por la presente invención (ver por ejemplo la Patente Norteamericana No. 5,962,427, la cual está incorporada a la presente invención como referencia). Los ejemplos de proteínas, polinucleótidos o moléculas que pueden ser producidas a través de células madre recombinantes de la presente invención, incluyen G CSF, I GF, EG F, VEGF, FG F, y similares . En una modalidad adicional, las células madre endoteliales de la presente invención pueden ser cultivadas in vitro para producir productos biológicos en altas producciones. Por ejemplo, dichas cél ulas, las cuales ya sea que producen naturalmente un producto biológico de interés en particular (por ejemplo, un factor de crecimiento, factor de regulación u hormona de péptido y similares), o han sido construidas en forma genética para prod ucir un prod ucto biológico , podrían ser expandidas por clonación . Si las cél ulas segregan el producto biológico en el medio nutriente, el producto puede ser fácilmente aislado del medio usado o acondicionado utilizando técnicas de separación estándar, por ejemplo, tales como precipitación de proteína diferencial, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de filtración de gel , electroforesis y HPLC , por nombrar solo algunos. Como alternativa, un producto biológico de interés puede permanecer dentro de la célula , y por lo tanto, su recolección puede requerir que las células sean lisadas. Posteriormente el producto biológico puede ser purificado utilizando cualesquiera de una o más de las técn icas descritas anteriormente. Los usos terapéuticos de las células madre de la presente invención , incluyen el transplante de células madre, poblaciones de células madre o progenie de las mismas en individuos para tratar una . variedad de estados patológicos incluyendo enfermedades o padecimientos que resu ltan de daño al miocardio, padecimientos o enfermedades circulatorias o vasculares, así como reparación y regeneración de tejido . Las células madre o poblaciones de células madre (que incluyen células madre alteradas) en forma genética , se introducen en un sujeto que necesita de dichas células madre o que necesitan de la proteína o molécula codificada o producida por la célula alterada en forma genética. Por ejemplo, en una modalidad, las células madre pueden ser administradas a pacientes con cáncer quienes han pasado por quimioterapia q ue tienen células madre endoteliales, células endoteliales o el endotelio de un sujeto exterminado, reducido o dañado. Si las células madre se derivan de una fuente heteróloga en comparación con el sujeto receptor, normalmente se administra una terapia de inmunosupresión concomitante, por ejemplo, administración de la ciclosporina de agente inmu nosupresor o FK506. S in embargo, debido al estado inmad uro de las células madre de la presente invención , puede no requerirse dicha terapia inmunosupresora. Por consiguiente, en una modalidad , las cél ulas madre de la presente invención pueden ser administradas a un receptor en la a usencia de una terapia de inmunomodulación (por ejem plo, inmunosupresora). Como alternativa , las cél ulas pueden ser encapsuiadas en una membrana lo cual permite el intercambio de fluidos pero evita el contacto de célula/célula. En la técnica se conoce el transplante de células microencapsuladas, por ejemplo Ba!ladur y asociados, 1995, Surgery 117: páginas 189 a 194, 1995; y Dixit y asociados 1992, Cell Transplantation 1: páginas 275 a 279. Las células pueden ser introducidas directamente en la sangre periférica o depositada dentro de otros lugares en el cuerpo, por ejemplo, el bazo, páncreas, o en cuentas microtransportadoras que se encuentran en el peritoneo. Por ejemplo, se pueden transplantar células 102 a 109 en un solo procedimiento, y según se requiera, se pueden realizar transplantes adicionales. La diferenciación de células madre puede ser inducida ex vivo, o como alternativa puede ser inducida mediante el contacto con tejido in vivo (por ejemplo, mediante el contacto con células endoteliales o componentes de matriz celular). Opcionalmente, se puede co-administrar o administrar a un sujeto en forma subsecuente un agente de diferenciación para promover la diferenciación de células madre. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente invención tienen el mismo significado al que es comprendido por un experto en la técnica a la cual pertenece la presente invención. Todos los encabezados y subencabezados aquí proporcionados son únicamente para facilitar la lectura y no deben ser construidos como una limitante de la presente invención. Los términos "un", "uno" y "el" y "la" que se utilizan en la presente invención, significa que comprenden el plural a menos que el contexto indique claramente la forma singular. Aunque en la práctica o elaboración de pruebas de la presente invención se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los aqu í descritos, más adelante se describirán métodos y materiales adecuados. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias aquí mencionadas están i ncorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia. En caso de conflicto, se controlará la presente especificación , incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no pretenden ser limitativos. Los ejemplos que se encuentran a continuación pretenden il ustrar modalidades particulares y no limitar el alcance de la presente invención. EJ EMPLOS Ejem plo 1 Aislamiento de Célula Mad re E ndotelial Se fraccionó un volumen de 200cc de sangre humana heparinizada con sodio mediante centrifugación sobre FICOLL™ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) con una gravedad específica de 1 .077 para aislar PBMC. Se resuspendieron los PBMCs aislados que se encuentran en el "recubrimiento esponjoso" en aproximadamente no más de 1 00x1 06 célula/ml en un medio completo (EGM2 que contiene IG F, FGF, EG F, y VEG F + 1 5% de FCS; Cambrex Bioscience, I nd . , Baltimore, D). Se agregaron 1 0 µg ml de anticuerpos de ratón anti-P 1 H 1 2 (Chemicon AB 1 6985) a las células y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las células fueron lavadas dos veces en un medio completo o solución salina amortiguada por fosfato (PBS) y fueron resuspendidas en aproximadamente, pero no más de 100x1 06 células en 1 mi de PBS. Se agregaron rellenos magnéticos de anti-tnulgG-MACs (cat. No. 1 30-047- 1 01 , Miltenyi Biotec, Auburn , CA) a 20 µ? que contiene aproximadamente 1 0x1 06 cél ulas para etiquetar las cél ulas con anticuerpos, y las células fueron incubadas a una temperatura de 4° C durante 1 5 min utos. Las células etiq uetadas con anticuerpos fueron lavadas una vez en PBS + 3% de albúmina de suero bovino (BSA), y fueron resuspendidas en un volumen total de 5 mi PBS + 3% de BSA. Posteriormente las células etiquetadas con anticuerpos fueron corridas sobre una corrida MACS LS preparada en un imán VARIOMAC™ (Miltenyi Biotec). Se recolectó la fracción a través del flujo y se desechó , y la columna fue lavada tres veces con PBS + 3% BSA. Las cél ulas fueron etiquetadas eliminadas de la columna lavándola en la ausencia del campo magnético. La fracción el uída fue lavada y contada . Se cultivaron células de fracción positiva en aproximadamente, pero no más de 1 -5x1 06 células por depósito de una placa de colágeno IV de 6 depósitos (Becton Dickinson , Fran klin Lakes, NJ) en un medio completo. Después de 48 horas, se eliminaron las células no adherentes. El medio fue semi- disminuido dos veces por semana. Ejem plo 2 Caracterización de Células Mad re Endoteliales Las células fueron caracterizadas mediante FACS en aislamiento y en varios puntos de tiempo tal como se indica en la Tablas q ue se encuentran más adelante. En aislamiento, las células parecieron expresar niveles relativamente altos de antígeno P 1 H 1 2 , CD 148 y AC133. Las células fueron negativas para CD202b y CD 144. En los mismos aislados una sobrepoblación de células CD45+ también expresó CD34+. La cantidad de estas células positivas dobles CD45+/CD34+, se expresaron como un porcentaje variado de células totales y en algunos casos fue del 1 00%. La tabla 1 m uestra los marcadores medidos que se encuentran en las células al momento del aislamiento. Se utilizó lgG 1 de ratón como un control para la citometría de flujo. Los datos de control se presentan en la tabla 1 que se encuentra más adelante.

Tabla 1 : Análisis de Citcmetrta de Flujo y Fenotipo de Células después del Enriquecimiento de Células P1H12+ Durante el cultivo cambió la apariencia de las células madre endoteliales y los marcadores presentes en las células cambiaron tal como se muestran en la tabla 2. Tabla 2. Resumen con el Tiempo de Marcadores de Superficie de un Solo Donante Ejemplo 3 Migración Plana de Células Endoteliales Derivadas de Células madre de sangre periférica humana en respuesta a un estímulo y el efecto de inhibidores de migración Se utilizó un ensayo de migración de células endoteliales planas (cierre de heridas) para cuantificar la migración de células endoteliales derivadas de sangre periférica humana en respuesta a PMA, EGF y otros estímulos de migración. En este ensayo, se midió la migración celular endotelial como el rango de cierre de una herida circular en una monocapa de célula cultivada. El rango de cierre de herida es lineal en células endoteliales microvasculares renales y de piel, y se regula en forma dinámica mediante agentes que estimulan e inhiben la angiogenesis in vivo. Tanto las células endoteliales microvasculares renales como las células microvasculares dérmicas emigran en respuesta a PMA y EGF y esta migración puede ser regulada mediante la adición de agentes angiogénicos al cultivo de migración (Wiley et al., 2001, Immunity 15: páginas 837 a 846). Se aislaron células madre humanas de sangre periférica tal como se describió en la presente invención, y su progenie de células endoteliales derivadas de sangre periférica humana primaria, hPBEC se aisló, cultivó y utilizó entre los pasajes 6 al 11, tal como se describió en al presente invención. Durante la noche se generaron lesiones circulares de réplica, "heridas" (diámetro de 600 a 800 mieras) en monocapas hPBEC de confluente sin suero (DMEM + 0.5% FBS) en aproximadamente 80,000 células/depósito utilizando una prensa de perforación con punta de silicona. Ai momento de la herida, se suplemento el medio (DMEM + 0.1% FBS) con 5 ng/ml de PMA (phorbol- 2-miristato- 3-acetato), 40 ng/ml EGF o combinaciones de 5 ng/ml PMA ó EG F e inhibidores de migración . El área con herida residual se midió como una función de tiempo (0 a 14 horas) utilizando un microscopio y un software de análisis de imagen (Bioquant; Nashville, TN) . Se calculó el rango de migración relativa para cada agente y la combinación de agentes mediante regresión lineal del área de herida residual trazada con el tiempo. Los resultados se m uestran en las figuras 1 y 2. El hPBEC emigró bien en respuesta a PMA (> = 50%) (figura 1 ) y más lentamente en respuesta a EGF (> = 35% a) (figura 2). Además, los agentes anti-angiogénicos huTeKAFc (WO 00/75323) , TweakR. Fc (WO 01 /45730), nectina-3a-Fc (B7L4. Fc) (WO 02/28902), y CD 148 mAb en las concentraciones indicadas inhibieron la migración hPBEC inducida por PMA en un 40%, 40% , 70% y 100% , respectivamente, en comparación con la proteína de control hu lgG (figura 1 ). Además, los agentes anti-angiogénicos huTekAFc, TweakR. Fc, nectina-3oc-Fc (B7L4. Fc), y anti-CD 148 mAb en las concentraciones indicadas, inhibieron la migración de hPBEC ind ucida por EGF en un 50%, 100% , 95% y 100% , respectivamente en comparación con la proteína de control h u lgG (fig ura 2). Ejemplo 4 Ensayo de Migración de Barrera Se cultivaron durante la noche ( 1 8 horas) células madre endoteliales en un medio (por ejemplo, EGM-2 medios, Clonetics, Walkersville, MD) y en la presencia o a usencia de PMA (50 ng/ml) , y posteriormente las células fueron lavadas y etiquetadas en PBS que contiene 4 µ? de una tinta de calceína durante dos horas. Después de la etiquetación con calceína las células fueron excitadas para fluorescencia mediante excitación a 488 nm . Las célu las fueron lavadas en PBS, resuspendidas en un medio basal (EBM +/- 0.1 % FBS ) y colocadas en un cultivo en insertos de fluorobloques con un tamaño de poro de 3 mieras en placas de 24 depósitos . Se cultivaron cincuenta mil células madre incluyendo la progenie de células endoteliales diferenciadas en 300 microlitros de un medio basal en el inserto de bloq ue de flúor y los insertos que contienen las células se colocaron en placas de cultivo estériles de 24 depósitos que contienen 1 mi de medio con citocinas y/o suero que tiene el potencial de originar la migración o movimiento (haptotaxis) de las cél ulas de la presente invención a través del filtro opaco de 3 mieras del inserto en la placa de 24 depósitos. La migración de las células a través del filtro fue detectada midiendo el nivel de emisión de fluorescencia observado a 530 nm en el fondo del depósito , utilizando un contador de etiqueta múltiple. Los resultados de migración fueron similares a los resultados del ensayo de migración plana del ejemplo 3 anterior. Ejem plo 5 Ensayo de Tu bo Capilar/Formación de Cordón Se descongeló durante la noche a una temperatura de 4°C sobre hielo una matriz MATRI GEL™ (Becton Dickinson , Bedford, MA), una preparación de membrana de base solubilizada extractada de sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Tam bién se enfriaron durante la noche a una temperatura de 4°C una placa de 24 depósitos (BD Labware, franklin Lakes, NJ) y puntas de pipeta de 1 000 µ?. El día del ensayo, los depósitos de la placa se cubrieron de manera uniforme con 300 µ? de MATRIG EL™ por depósito, teniendo cuidado de no introducir burbujas. Se dejaron incubar las placas recubiertas a una temperatura de 37°C durante 30 minutos para permitir que la matriz se polimerizara . Las células madre endoteliales y/o células endoteliales derivadas de células madre, fueron tripsinizadas, lavadas en un medio completo fresco (tal como se describe en el ejemplo 1 ) y contadas. Se plaquearon treinta mil células por depósito en 100 µ| de medio de crecimiento y se incubaron a una temperatura de 37°C durante 30 min utos. Se agregaron 500 microlitros de medio de crecimiento fresco. Se observaron las células a las 4 y 5 horas después del plaqueo. Las células de control fueron tratadas en forma idéntica excepto que para el plaqueo sobre MATRI G EL™ se utilizaron como comparación. A las 4 horas de control , una adherencia dispersa general característica de células crecidas en cultivos de tejido de plástico. Las cél ulas crecidas sobre MATRI GEL™ durante 4 horas, formaron múltiples foci con células q ue conectan el foci que proporcionan la apariencia de cordones luminares. La apariencia de estructuras l uminares abundantes fue clara durante la observación a las 24 horas del cultivo. Ejem plo 6 Localización In vivo de Células Madre y Progenie de Células Madre Adm i nistradas. Este ejemplo dem uestra que las cél ulas aisladas a través del método , mig raron in vivo a áreas que tienen actividad angiogénica y/o vasculogénica. Se marcaron in vitro células endoteliales derivadas de sangre periférica de donante humano 1017 (h PBEC; expandida de las células progenitoras endoteliales derivadas de sangre tal como se describe en el ejemplo 3), con cuentas amarillo verdosas fluorescentes de una miera (emisión a 51 5 nM; Molecular Probes, Eugene, OR). Se logró la etiquetación de las células mediante la incubación del hPBEC del donante 1 01 7(cuentas de 5x1 06 por células 1 x1 0e) durante 1 8 horas. Las células adherentes que habían incorporado cuentas, fueron eliminadas con una tripsin ización breve y se lavaron una vez en PBS para eliminar las cuentas no incorporadas, y se replaquearon en un medio de crecimiento EC (tal como se describe en el ejemplo 1 ) y se dejaron adherir nuevamente. Se confirmó la etiquetación celular mediante microscopía de l uz invertida e ¡nmunofluorescencia. El día de la inversión (ver más adelante), el h PBEC 1 01 7 etiquetado se eliminó mediante tripsinización breve y se resuspend ío en PBS para inyección intradérmica (i .d.) o intravenosa (i.v. ). Las células endoteliales microvasculares dérmicas humanas etiquetadas (hMVEC-d) sirvieron como un control y las cuentas fluorescentes de 5x1 06 solas admin istradas mediante i .d sirvieron como control negativo . Se transplantaron corazones de BALB/c neonatales con menos de 24 horas de edad en el pineo del oído (bilateral) de ratones BALB/c SCI D hembras de doce semanas de edad anestesiados (Jackson Labs, Bar Harbor, M E). I nmediatamente después del transplante, se inyectaron a los ratones en el oído , 4-5 mm a partir del oído transplantado, con células hPBEC de donante 101 7 etiquetadas (cél ulas 1 x1 06, i. d. ó células 2X106, i .v. ), cuentas fluorescentes únicamente (cuentas de 5x1 06 i.d . ) o células hMVEC-d etiquetadas (células 1 x1 06). Inmediatamente después de la inyección i.d de las células, se generaron imágenes del oído del ratón anestesiado utilizando un sistema de microscopio q ue comprende un microscopio invertido motorizado ajustado con 4x y 1 0x objetivos y una cámara CCD para detectar la fluorescencia a baja luz, controlada mediante el software OPEN LAB™ (I mprovision, I nc. , Lexington , MA)) para confirmar el depósito de células inmunofluorescentes verdes en el sitio de la inyección. Se generaron imágenes de los isoinjertos de oído en cada ratón receptor tanto a las 24 como a las 144 horas posteriores a la inyección del transplante/ inyección de células. Se observaron depósitos tanto de hPBEC etiquetado vivo (donante 1 01 7) como de cuentas fluorescentes solas confinadas al sitio de inyección inmediatamente ( 1 -2 horas) después de la inyección . A las 24 horas posteriores a la inyección, se pudo observar que el hPBEC etiquetado migra lejos del sitio de inyección hacia el corazón isquém ico. A las 144 horas posteriores a la inyección , los isoinjertos de corazón tuvieron pulsación y un mayor número de hPBEC inyectado mediante i .d. etiquetado migró del sitio de inyección hacia el isoinjerto de corazón. Algunas hPBEC emigraron dentro de la parte del isoinjerto de corazón latente, en donde ocurre la neovascularización o dentro del área i nmediatamente adyacente al mismo. No se pudieron detectar las cuentas inyectadas mediante i . d . ni las cél ulas etiquetadas inyectadas mediante i.v. a las 24 ó 144 horas posteriores a la inyección. Las células inyectadas mediante i. d fueron colocadas en el espacio interdérmico, cerca de la superficie de piel expuesta, permitiendo q ue el aparato de generación de imágenes las rastree más fácil mente que las células inyectadas mediante i .v. , las cuales necesitan ser rastreadas en forma histológica. Aunq ue la presente invención ha sido descrita con detalle a manera de ilustración y de ejemplo para propósitos de claridad y comprensión, los expertos en la técnica podrán apreciar que a la luz de las enseñanzas de la presente invención se pueden realizar ciertos cambios y modificaciones a la misma sin apartarse del espíritu o alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

R E I V I N D I C A C I O N E S 1. - Un método para preparar una población enriquecida de células madre, en donde el método comprende separar la población de células madre de la primera población de células, en donde la población enriquecida de células madre comprende al menos aproximadamente una concentración de células madre P1H12+ mayor a aproximadamente 100 dobleces que las primera población de células. 2. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la población enriquecida de células madre comprende al menos una concentración de células madre P1H12+ mayor a aproximadamente 1000 dobleces que la primera población de células. 3. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la población enriquecida de células madre comprende una concentración de células madre P1H12+ desde mayor a aproximadamente 1000 dobleces hasta 4000 dobleces más que la primera población de células. 4. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la población enriquecida de células madre comprende además una concentración mayor que la primera población de células de uno o más de los marcadores seleccionados del grupo que consiste de CD148, AC133, CD45 y CD34. 5.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de separación comprende contactar la primera población de células con una molécula que enlaza específicamente a P 1 H 1 2+ y separar la población enriquecida de células que están unidas a la molécula . 6.- El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la molécu la es un anticuerpo . 7. - El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal . 8. - El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la molécula se deriva de un anticuerpo. 9. - El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la molécula es una molécula de fusión de péptido-Fc. 1 0. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el paso de separación comprende además contactar la primera población de células con una molécula que en laza en forma específica a una molécula seleccionada del grupo que consiste de CD 148, AC 133, CD45 Y CD34 y seleccionar la población enriquecida de células que están unidas a la molécula. 1 1 .- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el paso de separación comprende además contactar la población enriquecida de cél ulas con una molécula que enlaza en forma específica a un marcador seleccionado del grupo que consiste de CD148, AC 1 33, CD45 y CD34 y eliminar la población enriq uecida de células que no están enlazadas a la molécula. 12. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de separación comprende además contactar la primera población de células con una molécula que enlaza en forma específica a una molécula seleccionada del grupo que consiste de CD144, CD202b, VEGFR2 y seleccionar la población enriquecida de células que no están enlazadas a la molécula. 13. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de separación comprende además contactar la población enriquecida de células con una molécula que enlaza en forma específica a una molécula seleccionada del grupo que consiste de CD144, CD202b, VEGFR2 y eliminar la población enriquecida de células que están enlazadas a la molécula. 14. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la población enriquecida de células madre comprende al menos una concentración de células madre que son P1H12+, CD148 + , AC133 + , CD144-, CD202b- ó VEGFR2- de con aproximadamente 100 dobleces más que la primera población de células. 15. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la población enriquecida de células madre comprende al menos una concentración de células madre que son P1H12+, CD148 + , AC133 + , CD144-, CD202b- ó VEGFR2- con aproximadamente 1 000 dobleces más que la primera población de células. 1 6. - El método de conformidad con la reivindicación 1 5, caracterizado porque la población enriquecida de células madre comprende un concentración de células madre que son P 1 H12 + , CD 148 + , AC 1 33 + , CD 144-, CD202b- ó VEGFR2- con desde aproximadamente 1 000 dobleces hasta aproximadamente 4000 más que la primera población de células. 1 7. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la población enriquecida de células madre están enriquecidas en forma adicional con células madre que son CD34+ ó CD45 + . 1 8. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la población enriquecida de células madre están enriquecidas en forma adicional con células madre que son CD34- ó CD45 + . 1 9. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la población enriquecida de células madre están en riquecidas en forma adicional con células madre que son CD34+ ó C D45 + . 20. - El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la molécula está enlazada a una entidad detectable. 21 . - El método de conformidad con la reivindicación 20 , caracterizado porq ue la entidad detectable es una entidad fluorescente, una entidad colorimétrica o una entidad magnética. 22.- El método de conformidad con la reivindicación 5 , caracterizado porque la molécula está enlazada a un substrato sólido . 23.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el substrato sólido es una superficie de plástico, una superficie de vidrio, azarosa , archilamida, lectina o una partícula magnética. 24. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque comprende además el paso de cultivar la población enriquecida de células madre para dar surgimiento a células madre que son P 1 H 12+ , CD 144+ , AC 1 33-, CD202 + , CD45-, VEG FR2 + , tienen una mayor capacidad de proliferación que las HUVECs y MVECs y contienen cuerpos Weibel-Palade. 25. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la primera población de células se deriva de un mamífero. 26.- El método de conformidad con la reivindicación 25 caracterizado porque el mamífero es un primate. 27.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el primate es un h umano . 28.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la primera población de células se deriva de sangre periférica. 29. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la primera población de células se deriva de médula ósea. 30. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la primera población de células se deriva de tejido de h ígado fetal . 31 . - Una población enriquecida de cél ulas madre preparada a través dei método de conformidad con la reivindicación 1 . 32. - La población enriquecida de células madre de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada porque las cél ulas madre son positivas para uno o más de un marcador seleccionado del grupo que consiste de CD 148, AC 1 33, CD45 y CD34. 33. - La población enriquecida de células madre de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada porque la población en riq uecida de células madre está enriquecida con células madre que son P 1 H 12 + , CD 148 + , AC 133 + , CD 144-, CD202b- ó VEG FR2-. 34. - La población enriquecida de células madre de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada porque la población enriquecida de células madre está enriquecida además con células madre que son CD34+ ó CD45+. 35. - La población enriquecida de células madre de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada porque la población enriquecida de células madre está enriquecida en forma adicional con células madre que son CD34+ y CD45 + . 36. - La población enriquecida de cél ulas madre de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada porq ue la población enriquecida de células madre está en riquecida en forma adicional con células madre que son CD34- y CD45-. 37.- La población enriquecida de células madre de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada porque las células madre contienen cuerpos Weibel-Palade. 38. - La población enriquecida de células madre de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada porque las cél ulas madre son células progenitoras endoteliales. 39. - La población enriquecida de cél ulas madre de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada porque la primera población de célu las se deriva de un mamífero. 40. - La población enriquecida de células madre de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque el mamífero es un primate. 41 . - La población enriquecida de cél ulas madre de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque el primate es un humano. 42.- La población enriquecida de cél ulas madre de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada porque la primera población de células se deriva de sangre periférica. 43.- La población enriquecida de células madre de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada porque la primera población de células se deriva de médula ósea. 44. - La población enriquecida de células madre de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada porque la primera población de células se deriva de tejido de h ígado fetal. 45. - Una población de células de progenie derivada de la población enriquecida de células madre de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque las cél ulas de progenie son P1 H 12+, CD 144+ , AC 133-, CD202 + , CD45-, VEGFR2+, tienen una mayor capacidad de proliferación que las H UVECs y VECs, y contienen cuerpos Weibel-Palade. 46.- Una célula madre aislada que es P 1 H 12+ y AC1 33+ y que puede auto-renovarse y diferenciarse en una célula endotelial. 47.- La célula madre aislada de conformidad con la reivindicación 46 , que es además CD 148+, CD 144-, VEGFR2- y CD202b-, 48.- La célula madre aislada de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque la cél ula madre aislada es además CD34+ ó CD45 + . 49. - La célula madre aislada de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque la célula madre aislada es además CD34+ y CD45+. 50. - La célula madre aislada de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque la célula madre aislada es además CD34- y CD45 + . 51 . - La célula madre aislada de conformidad con la reivindicación 46 , caracterizada porque la célula madre se deriva de un mam ífero. 52. - La cél ula madre aislada de conformidad con la reivindicación 46 , caracterizada porque el mam ífero es un primate. 53. - La célula madre aislada de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque el primate es un humano. 54. - La célula madre aislada de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque la célula madre aislada se deriva de sangre periférica. 55. - La célula madre aislada de conformidad con la reivindicación 46 , caracterizada porque la célula madre aislada se deriva de médula ósea . 56. - La célula madre aislada de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque la célula madre aislada se deriva de tejido de hígado fetal . 57.- La célula madre aislada de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque la célula madre aislada tiene la capacidad de ser cultivada durante al menos 14 días en un medio completo que comprende 15% de suero. 58. - La célula madre aislada de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque comprende además una secuencia de polinucleótidos heteróloga. 59. - Una línea celular que comprende la célula madre aislada de conformidad con la reivindicación 46 o una célula de progenie de la misma. 60.- Un cultivo de célu la madre q ue comprende una población substancialmente homogénea de la célula madre de conformidad con la reivindicación 38. 61 . - Una composición que comprende la célula madre aislada de conformidad con la reivindicación 46 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 62. - La composición de conformidad con la reivindicación 61 , caracterizada porque el vehículo farmacéuticamente aceptable es seleccionado del grupo que consiste de solución salina , un gel , un hidrogel , una esponja y una matriz. 63.- Una célula de progenie aislada obtenida mediante el cu ltivo de la célula madre aislada de conformidad con la reivindicación 38 durante desde aproximadamente 6 días hasta aproximadamente 3 semanas en un medio completo con el 1 5% de suero, en donde la célula de progenie está caracterizada como P 1 H 12+, CD 144 + , AC 1 33-, CD202+, CD45-, VEGFR2+ , tiene una mayor capacidad de proliferación que H UVECs y MVECs, y contiene Weibel-Palade. 64. - Un cultivo de célula de progen ie que comprende una población substancialmente homogénea de la célula de progenie aislada de conformidad con la reivindicación 63. 65. - Una composición que comprende la célula de progenie aislada de conformidad con la reivindicación 63 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 66. - La composición de conformidad con la reivindicación 65 , caracterizada porque el vehículo farmacéuticamente aceptable es seleccionado del grupo que consiste de solución salina , gel, un hidrogel , una esponja y una matriz. 67. - Una construcción de ingeniería de tejido que comprende la cél ula madre aislada de conformidad con la reivind icación 46. 68. - Una construcción de ingeniería de tejido que comprende la progen ie de la célula madre aislada de conformidad con la reivindicación 46. 69. - La construcción de ingeniería de tejido que comprende la célula madre aislada de conformidad con la reivindicación 46 y una célula de progenie de la misma. 70. - Un método para identificar un agente que induce la diferenciación de la célula madre aislada de conformidad con la reivindicación 46, en donde el método comprende contactar la cél ula madre aislada con un agente de prueba y detectar un cambio en la célula madre aislada , en donde todo indica que el agente ind uce la diferenciación de la célula madre aislada. 71 . - Un método para generar una construcción de ingeniería de tejido que comprende células endoteliales, en donde el método comprende cultivar la célula mad re aislada de conformidad con la reivindicación 46 y una construcción de ingeniería de tejido. 72. - Un método para tratar una enfermedad o padecimiento vascular, en donde el método comprende administrar a un sujeto que necesita del mismo la cél ula madre aislada de conformidad con la reivindicación 46. 73.- Un método para tratar una enfermedad o padecimiento vascular, en donde el método comprende administrar a un sujeto que necesita del mismo la célula de progenie aislada de conformidad con la reivindicación 63. R E S U M E La presente invención proporciona células madre caracterizadas por tener la capacidad de renovarse y la habilidad de dar surgimiento a células endoteliales y/o parecidas a endoteliales, métodos para aislar dichas células y métodos para usar las mismas. También se proporcionan cél ulas de progenie derivadas de las cél ulas madre de la presente invención.