JP2005504519A - p53経路のモディファイヤーとしてのSLC7sおよび使用方法 - Google Patents
p53経路のモディファイヤーとしてのSLC7sおよび使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005504519A JP2005504519A JP2003502184A JP2003502184A JP2005504519A JP 2005504519 A JP2005504519 A JP 2005504519A JP 2003502184 A JP2003502184 A JP 2003502184A JP 2003502184 A JP2003502184 A JP 2003502184A JP 2005504519 A JP2005504519 A JP 2005504519A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- slc7
- function
- modulator
- assay
- assay system
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 title claims abstract description 129
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 105
- 230000037361 pathway Effects 0.000 title claims abstract description 56
- 239000003607 modifier Substances 0.000 title description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 53
- 108091006212 SLC7 Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 32
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 24
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims abstract description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 141
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 115
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 77
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 77
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 71
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 64
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 64
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 59
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 59
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 53
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 48
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 46
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 42
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 19
- 238000002805 secondary assay Methods 0.000 claims description 18
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims description 17
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 15
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 14
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 claims description 14
- 150000003384 small molecules Chemical group 0.000 claims description 14
- 102100038204 Large neutral amino acids transporter small subunit 1 Human genes 0.000 claims description 13
- 108091006232 SLC7A5 Proteins 0.000 claims description 13
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 claims description 12
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 12
- 102100035300 Cystine/glutamate transporter Human genes 0.000 claims description 10
- 108091006241 SLC7A11 Proteins 0.000 claims description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 10
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 claims description 10
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 8
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 8
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 claims description 7
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000009452 underexpressoin Effects 0.000 claims description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 5
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 claims description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 4
- 230000007547 defect Effects 0.000 claims description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 4
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims description 4
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 claims description 4
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 claims description 3
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000003569 transporter assay Methods 0.000 claims description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 claims 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 claims 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 18
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 80
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 72
- 230000006870 function Effects 0.000 description 58
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 40
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 26
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 26
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 24
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 20
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 16
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 16
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 15
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 14
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 10
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 9
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 238000002810 primary assay Methods 0.000 description 9
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 7
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 7
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 6
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 6
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 6
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 6
- 230000006702 hypoxic induction Effects 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 6
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 6
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- -1 IGF-BP3 Proteins 0.000 description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 102100033400 4F2 cell-surface antigen heavy chain Human genes 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 4
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 4
- 108091006313 SLC3A2 Proteins 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 4
- 238000003783 cell cycle assay Methods 0.000 description 4
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000034263 Amino acid transporters Human genes 0.000 description 3
- 108050005273 Amino acid transporters Proteins 0.000 description 3
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 3
- 108700008634 Drosophila p53 Proteins 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 3
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 102000016878 Hypoxia-Inducible Factor 1 Human genes 0.000 description 3
- 108010028501 Hypoxia-Inducible Factor 1 Proteins 0.000 description 3
- 108700011325 Modifier Genes Proteins 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000003352 cell adhesion assay Methods 0.000 description 3
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N Morpholine Chemical compound C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 2
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 2
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010092262 T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 2
- 230000005735 apoptotic response Effects 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000006369 cell cycle progression Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000003271 compound fluorescence assay Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N isopentane Chemical compound CCC(C)C QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 2
- 150000002611 lead compounds Chemical class 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 2
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 2
- 108700025694 p53 Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000011170 pharmaceutical development Methods 0.000 description 2
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 2
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 2
- 230000026447 protein localization Effects 0.000 description 2
- 229940076155 protein modulator Drugs 0.000 description 2
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 102220002645 rs104894309 Human genes 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 2
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 2
- 238000001086 yeast two-hybrid system Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 102100024630 Asc-type amino acid transporter 1 Human genes 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 102100038385 Coiled-coil domain-containing protein R3HCC1L Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 1
- 102000002431 Cyclin G Human genes 0.000 description 1
- 108090000404 Cyclin G1 Proteins 0.000 description 1
- 206010011778 Cystinuria Diseases 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000022963 DNA damage response, signal transduction by p53 class mediator Effects 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 241000251948 Dolophilodes major Species 0.000 description 1
- 108050002772 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Proteins 0.000 description 1
- 102000012199 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Human genes 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000702191 Escherichia virus P1 Species 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010046276 FLP recombinase Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000054184 GADD45 Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000743767 Homo sapiens Coiled-coil domain-containing protein R3HCC1L Proteins 0.000 description 1
- 101001066158 Homo sapiens Growth arrest and DNA damage-inducible protein GADD45 alpha Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000009015 Human TaqMan MicroRNA Assay kit Methods 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 1
- 108091006207 SLC-Transporter Proteins 0.000 description 1
- 102000037054 SLC-Transporter Human genes 0.000 description 1
- 108091006242 SLC7A10 Proteins 0.000 description 1
- 108091006236 SLC7A7 Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 238000012288 TUNEL assay Methods 0.000 description 1
- 241000255588 Tephritidae Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100032726 Y+L amino acid transporter 1 Human genes 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004082 amperometric method Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 1
- 238000011717 athymic nude mouse Methods 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000008238 biochemical pathway Effects 0.000 description 1
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008236 biological pathway Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 1
- BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N calcein am Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O)=C(OC(C)=O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(=O)C)C(OC(C)=O)=C1 BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000025084 cell cycle arrest Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000017455 cell-cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 1
- AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N dimethyl butane Natural products CCCC(C)C AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000005014 ectopic expression Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000000720 eyelash Anatomy 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000013100 final test Methods 0.000 description 1
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004545 gene duplication Effects 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000010448 genetic screening Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 108010038082 heparin proteoglycan Proteins 0.000 description 1
- 229940094991 herring sperm dna Drugs 0.000 description 1
- 238000005734 heterodimerization reaction Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000021 kinase assay Methods 0.000 description 1
- 229910052747 lanthanoid Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002687 nonaqueous vehicle Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000006508 oncogene activation Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- CMPQUABWPXYYSH-UHFFFAOYSA-N phenyl phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=CC=C1 CMPQUABWPXYYSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 238000013077 scoring method Methods 0.000 description 1
- 238000009288 screen filtration Methods 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N sn-glycerol 3-phosphate Chemical compound OC[C@@H](O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 208000001608 teratocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 1
- 230000009772 tissue formation Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000040811 transporter activity Human genes 0.000 description 1
- 108091092194 transporter activity Proteins 0.000 description 1
- 238000011277 treatment modality Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N trisodium vanadate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-][V]([O-])([O-])=O IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 238000011311 validation assay Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000004865 vascular response Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
- C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/527—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving lyase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
- G01N33/5017—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity for testing neoplastic activity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57419—Specifically defined cancers of colon
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57449—Specifically defined cancers of ovaries
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/5748—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving oncogenic proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57496—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving intracellular compounds
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4739—Cyclin; Prad 1
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/82—Translation products from oncogenes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/91—Transferases (2.)
- G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/988—Lyases (4.), e.g. aldolases, heparinase, enolases, fumarase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2510/00—Detection of programmed cell death, i.e. apoptosis
Abstract
ヒトSLC7遺伝子はp53経路のモジュレーターとして同定されており、したがってこれらは欠陥p53機能に関連する疾患の治療上の標的である。SLC7の活性を調節する作用剤を探すためにスクリーニングすることを含む、p53のモジュレーターを同定する方法が提供される。
Description
【発明の開示】
【0001】
(関連出願への言及)
本出願は、2001年6月5日出願の米国特許仮出願第60/296,076号、2001年10月10日出願の米国特許仮出願第60/328,605号、2001年10月22日出願の米国特許仮出願第60/338,733号、2002年2月15日出願の米国特許仮出願第60/357,253号、および2002年2月15日出願の米国特許仮出願第60/357,600号の優先権を主張するものである。先の出願の内容は、その全体が本明細書中に組み込まれる。
【0002】
(発明の背景)
p53遺伝子は、家族性および自発性の癌を含めた50種類を超える種類の異なるヒト癌にわたって変異しており、ヒト癌の中で最も広く変異した遺伝子であると考えられている(ZambettiおよびLevine、FASEB、1993年、7:855〜865;Hollstein他、Nucleic Acids Res.、1994年、22:3551〜3555)。p53遺伝子中の変異のうち90%を超えるものが、p53機能を不活性化させる、単一アミノ酸を変化させるミスセンス変異である。ヒトp53の異常型は、予後不良、より活動性の高い腫瘍、転移、および短期生存率に関連している(Mitsudomi他、Clin Cancer Res、2000年10月、6(10):4055〜63;Koshland、Science、1993年、262:1953)。
【0003】
ヒトp53タンパク質は通常、DNA損傷、低酸素症、ヌクレオチド欠乏、および発癌遺伝子活性化を含めたシグナルの中枢インテグレーター(central integrator)として機能する(Prives、Cell、1998年、95:5〜8)。これらのシグナルに応答して、p53タンパク質レベルが大きく上昇し、その結果、蓄積したp53がこれらシグナルの性質および強度に応じて細胞周期抑止またはアポトーシスを活性化させる。実際、複数系統の実験的証拠により、腫瘍抑制因子としてのp53の主要な役割が指摘された(Levine、Cell、1997年、88:323〜331)。たとえば、ホモ接合性のp53「ノックアウト」マウスでは、発生は正常であるが、生後1年のうちにほぼ100%の新組織形成の発生率が示された(Donehower他、Nature、1992年、356:215〜221)。
【0004】
正常細胞および癌細胞内でp53が機能する生化学的機構および経路は完全には分かっていないが、p53機能の明らかに重要な一面は、遺伝子特異的な転写活性化因子としての活性である。既知のp53応答エレメントを有する遺伝子の中には、GADD45、p21/Waf1/Cip1、サイクリンG、Bax、IGF−BP3、およびMDM2を含めた、細胞周期またはアポトーシスのいずれかの制御における役割がよく特徴づけられたものが、いくつか存在する(Levine、Cell、1997年、88:323〜331)。
【0005】
細胞膜を越えてのアミノ酸の輸送は、特定の細胞だけでなく局所的および全体的な要求に適合される。例えば、活性アミノ酸の取り込みは細胞の成長に必要である。糖タンパク質関連アミノ酸トランスポーターの新規ファミリーの様々なメンバー、すなわちヘテロ二量体アミノ酸トランスポーターまたは溶質担体ファミリー7(SLC7)の軽いサブユニットが同定されており、塩基性および中性アミノ酸の細胞性取り込みおよび/または側底放出に機能することが示されている(Rossier G他、1999年、J Biol Chem, 274: 34948-34954)。これら12の膜貫通ドメインを有するパーミアーゼ関連タンパク質は、その機能を発現するためには、4F2hc(4F2重鎖)またはrBATなどのII型重鎖糖タンパク質とのヘテロ二量体化を必要とする。糖タンパク質関連アミノ酸トランスポーターと、4F2hcまたは場合によってはrBATとの結合は、トランスポーターが細胞表面に到達するための必要条件である(Mastroberardino L, 他、1998年、Nature 395:288-291)。例えば、上皮組織内での4F2hcサブユニットの輸送により、トランスポーターにより中性または陽イオンアミノ酸の血液への放出が可能となる側底位置が確保される(Broer A他、2000年、Biochem. J. 349:787-795; Verrey F他、1999年、J Membr Biol. 172:181-192; Christensen HN、1990年、Physiol Rev. 70:43-77; Broer S、1998年、Nova Acta Leopoldinana 306:79-91)。
【0006】
トランスポーターのSLC7ファミリーのメンバーは進化的に保存されている。大腸癌に対してSLC7A5(LAT1)が関係している可能性が報告されている(Wolf D他、1996年、Cancer Res. 56:5012-5022)。SLC7A7はLPI(リジン尿性タンパク不耐症)に関係している(Torrents D他、1999年、Nature Genet 21:293-296; Borsani G他、1999年、Nature Genet 21:297-301)。さらに、メンバーLSC7A9およびSLC7A10は、シスチン尿症に関係している(Feliubadalo L他、1999年、Nat Genet. 23:52-57; Leclerc D他、2001年、Mol Genet Metab. 73:333-339)。
【0007】
ショウジョウバエなどモデル生物のゲノムを操作できると、顕著な進化的保存の数により複雑な脊椎動物との直接の関連性を有する生化学プロセスを分析する、強力な手段が提供される。遺伝子および経路の保存レベルが高いこと、細胞プロセスの類似性が高いこと、ならびにこれらモデル生物と哺乳動物との間で遺伝子の機能が保存されていることにより、特定の経路における新規遺伝子の関与およびこのようなモデル生物中におけるその機能の同定は、哺乳動物中における相関経路およびこれらを調節する方法を理解するのに直接寄与することができる(たとえば、Mechler BM他、1985年、EMBO J、4:1551〜1557;Gateff E.、1982年、Adv.Cancer Res.、37:33〜74;Watson KL.他、1994年、J Cell Sci.、18:19〜33;Miklos GLおよびRubin GM.、1996年、Cell、86:521〜529;Wassarman DA他、1995年、Curr Opin Gen Dev、5:44〜50;Booth DR.、1999年、Cancer Metastasis Rev.、18:261〜284参照)。たとえば、目に見える表現型がもたらされる遺伝子の過少発現(たとえばノックアウト)または過剰発現(「遺伝的エントリーポイント(genetic entry point)」と呼ばれる)を有する脊椎モデル生物で、遺伝子スクリーニングを行うことができる。追加の遺伝子を、無作為にまたは標的を定めた方式で変異させる。ある遺伝子の変異によって遺伝的エントリーポイントにより引き起こされた最初の表現型が変化する場合、この遺伝子は、遺伝的エントリーポイントと同じまたは重複する経路に関与する「モディファイヤー」として同定される。遺伝的エントリーポイントがp53などの疾病経路に関係づけられているヒト遺伝子のオルソログである場合、新規の治療薬の魅力的な候補標的となり得るモディファイヤー遺伝子を同定することができる。
【0008】
参照したGenbank識別番号およびウェブサイトの参照を含めた本明細書中で引用するすべての参考文献は、その全体として本明細書中に組み込まれる。
【0009】
(発明の概要)
本発明者らは、ショウジョウバエでp53経路を改変させる遺伝子を発見し、ヒトにおけるそのオルソログを同定し、本明細書中では以降これをSLC7sと呼ぶ。本発明は、これらのp53モディファイヤー遺伝子およびポリペプチドを利用して、欠陥または損傷p53および/またはSLC7機能に関連する疾患の治療に使用できる候補治療剤であるSLC7調整剤(modulating agent)を同定する方法を提供する。好ましいSLC7調節剤は、SLC7ポリペプチドに特異的に結合してp53機能を修復する。他の好ましいSLC7調節剤は、アンチセンスオリゴマーなど核酸モジュレーターや、たとえば対応する核酸(すなわちDNAまたはmRNA)に結合してそれを阻害することによってSLC7遺伝子発現または生成物の活性を抑制するRNAiである。
【0010】
SLC7調節剤は、SLC7ポリペプチドまたは核酸との分子相互作用のための任意の都合のよいin vitroまたはin vivoのアッセイによって評価することができる。一実施形態では、SLC7ポリペプチドまたは核酸を含むアッセイ系を用いて候補SLC7調節剤を試験する。好ましい一実施形態では、SLC7ポリペプチドまたは核酸は、SLC7A5またはSLC7A11である。対照と比べてアッセイ系の活性に変化を生じさせる候補作用剤は、候補p53調節剤として同定される。このアッセイ系は細胞に基づくものでも、細胞を含まないものでもよい。SLC7調節剤には、SLC7関連タンパク質(たとえばドミナントネガティブ変異体やバイオ治療薬);SLC7に特異的な抗体;SLC7に特異的なアンチセンスオリゴマーおよび他の核酸モジュレーター;SLC7に特異的に結合するかまたは相互作用する(たとえばSLC7結合パートナーに結合することにより)化学剤が含まれる。特定の一実施形態では、トランスポーターアッセイを用いて小分子モジュレーターを同定する。特定の実施形態では、スクリーニングアッセイは、結合アッセイ、アポトーシスアッセイ、細胞増殖アッセイ、血管形成アッセイ、および低酸素誘発アッセイから選択される。
【0011】
別の実施形態では、最初に同定した候補作用剤や最初の作用剤から誘導した作用剤によって生じた血管形成、アポトーシス、または細胞増殖の変化など、p53経路における変化を検出する第2アッセイ系を使用して、候補p53経路調節剤をさらに試験する。第2アッセイ系には、培養細胞または非ヒト動物を使用することができる。特定の実施形態では、この二次アッセイ系は、血管形成、アポトーシス、または細胞増殖の疾患(たとえば癌)などp53経路に関係づけられた疾病または疾患を有することが事前に確定されている動物を含めた、非ヒト動物を使用する。
【0012】
本発明はさらに、哺乳動物細胞をSLC7ポリペプチドまたは核酸に特異的に結合する作用剤と接触させることによって、哺乳動物細胞中のp53経路および/またはSLC7機能を調節する方法を提供する。好ましい実施形態では、SLC7ポリペプチドまたは核酸はSLC7A5またはSLC7A11である。この作用剤は、小分子モジュレーター、核酸モジュレーター、または抗体であってよく、p53経路に関連する病状を有することが事前に確定されている哺乳動物に投与することができる。
【0013】
(発明の詳細な記載)
翅中にp53が過剰発現されていたショウジョウバエにおけるp53経路のモディファイヤーを同定するために、遺伝子モディファイヤースクリーニングを設計した(Ollmann M他、Cell、2000年、101:91〜101)。CG1607遺伝子は、p53経路のモディファイヤーとして同定された。したがって、これらモディファイヤーの脊椎動物のオルソログ、好ましくはヒトのオルソログであるSLC7遺伝子(すなわち核酸およびポリペプチド)は、癌など欠陥p53シグナル伝達経路に関連する病状の治療における魅力的な薬剤標的である。
【0014】
本発明では、SLC7機能を評価するin vitroおよびin vivoの方法を提供する。SLC7またはその対応する結合パートナーの変調は、正常状態および病態におけるp53経路とそのメンバーとの関連性を理解し、p53に関連する病状の診断方法および治療様式を開発するのに有用である。本発明で提供する方法を使用して、直接的または間接的に、たとえば輸送活性または結合活性などのSLC7機能に影響を与えてSLC7の発現を阻害または亢進することによって作用するSLC7調節剤を同定することができる。SLC7調節剤は、診断、治療、および製薬の開発に有用である。
【0015】
本発明の核酸およびポリペプチド
本発明で使用することができるSLC7核酸およびポリペプチドに関連する配列は、核酸はGI#13649338(配列番号1)、GI#19923169(配列番号2)、GI#14424513(配列番号4)、GI#3639057(配列番号5)、GI#181907(配列番号6)、GI#7706245(配列番号7)、GI#13647529(配列番号8)、GI#4507052(配列番号9)、GI#13111751(配列番号11)、GI#6642957(配列番号13)、GI#6642959(配列番号14)、GI#6912269(配列番号15)、GI#9187132(配列番号17)、GI#9187131(配列番号18)、GI#6179884(配列番号19)、GI#4581469(配列番号20)GI#5823977(配列番号21)、GI#1476395(配列番号22)、GI#7657590(配列番号23)、GI#10863043(配列番号25)、GI#9790234(配列番号26)、GI#18490890(配列番号28)、GI#13924719(配列番号29)、GI#7657682(配列番号30)、GI#18141306(配列番号31)、GI#18557166(配列番号32)、GI#13516845(配列番号34)、GI#13654279(配列番号35)、およびGI#14775898(配列番号36)、ポリペプチドはGI#11432073(配列番号37)、GI#4519803(配列番号38)、GI#7706246(配列番号39)、GI#4507053(配列番号40)、GI#13111752(配列番号41)、GI#4507055(配列番号42)、GI#12643348(配列番号43)、GI#14751168(配列番号44)、GI#5823978(配列番号45)、GI#7657591(配列番号46)、GI#9790235(配列番号47)、GI#13924720(配列番号48)、GI#7657683(配列番号49)、およびGI#13654280(配列番号50)として、Genbankに開示されている(Genbank識別(GI)番号により参照)。これらに加えて、配列番号3、10、12、16、24、27、33および51ないし53の核酸配列、および配列番号54のアミノ酸配列も本発明において使用できる。
【0016】
SLC7は、パーミアーゼドメインを有する膜輸送タンパク質である。用語「SLC7ポリペプチド」とは、完全長のSLC7タンパク質またはその機能的に活性のある断片または誘導体を言う。「機能的に活性のある」SLC7断片または誘導体は、抗原活性や免疫原性活性、酵素活性、天然の細胞基質に結合する能力など完全長の野生型SLC7タンパク質に関連する機能活性を1つまたは複数示す。SLC7タンパク質、誘導体および断片の機能活性は、当業者に周知の様々な方法によって(Current Protocols in Protein Science、1998年、Coligan他編、John Wiley & Sons, Inc.、ニュージャージー州ソマーセット)また以下にさらに述べるようにアッセイすることができる。本発明の目的のために、機能的に活性のある断片には、パーミアーゼドメインや結合ドメインなどSLC7の構造ドメインを1つまたは複数含む断片も含まれる。タンパク質ドメインは、PFAMプログラムを使用して同定することができる(Bateman A.他、Nucleic Acids Res、1999年、27:260〜2;http://pfam.wustl.edu)。たとえば、GI#4519803(配列番号38)のSLC7A5のパーミアーゼドメインはほぼアミノ酸残基46〜481に位置している(PFAM00324)。SLC7ポリペプチドを得る方法も、以下にさらに記載する。一部の実施形態では、好ましい断片は、機能的に活性のある、配列番号37から50のいずれか1つ(SLC7)の少なくとも25個の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも50個、より好ましくは75個、最も好ましくは100個の連続したアミノ酸を含むドメイン含有断片である。さらに好ましい実施形態では、この断片はパーミアーゼ(の機能的に活性のある)ドメインの全体を含む。
【0017】
用語「SLC7核酸」とは、SLC7ポリペプチドをコードするDNAまたはRNA分子を言う。好ましくは、このSLC7ポリペプチドまたは核酸あるいはその断片はヒト由来であるが、SLC7と少なくとも70%の配列同一性、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは85%、さらに好ましくは90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するオルソログまたはその誘導体でもよい。通常、異なる種のオルソログは、1つ以上のタンパク質モチーフの存在および/または3次元構造のために、同じ機能を保持している。一般に、オルソログは、通常タンパク質ベイトシーケンスを使用し、BLAST分析シーケンス相同分析により同定される。フォワードBLAST結果のうち最も合致するシーケンスが、リバースBLASTの元のクエリシーケンスを取り出すのであれば、シーケンスを潜在的オルソログとして指定する(Huynen MAおよびBork P, Proc Natl Acad Sci、1998年、95:5849-5856; Huynen MA他、Genome Research、2000年、10:1204-1210)。CLUSTAL(Thompson JD他、1994年、Nucleic Acids Res 22:4673-4680)など、多重シーケンス整列のためのプログラムを使用して、オルソログのタンパク質の保存域および/または残基をハイライトし、系統樹を作成してもよい。多様種の多重相同シーケンス(例えばBLAST分析により取り出されたもの)を表す系統樹において、2種のオルソログシーケンスは、それら2種のそれ以外の全シーケンスに対し、系統樹中最も接近して現われる。構造のスレッディング、またはタンパク質の折りたたみのその他分析法(例えばProCeryon(バイオサイエンス、オーストリア国ザルツブルク)を使用したもの)により潜在的なオルソログを同定してもよい。進化において、種分化に続いて遺伝子重複が起こるとき、ショウジョウバエなど単一種の単一遺伝子は、ヒトなど別の種の複数の遺伝子に対応する場合がある(パラログ)。本明細書において、「オルソログ」という表現は、パラログも含む。対象配列または対象配列の特定の一部分に関して本明細書中で使用する「パーセント(%)配列同一性」とは、配列のアラインメントを行い、最大のパーセント配列同一性を得るために必要な場合はすべての検索パラメータを初期値に設定したプログラムWU−BLAST−2.0a19(Altschul他、J.Mol.Biol.、1997年、215:403〜410;http://blast.wustl.edu/blast/README.html)によって作成されたギャップを導入した後の、対象配列(またはその特定の一部分)中のヌクレオチドやアミノ酸と同一である候補誘導体の配列中のヌクレオチドやアミノ酸の割合として定義される。HSP SおよびHSP S2パラメータは動的値であり、プログラム自体により、具体的な配列の組成と、目的配列と比較して検索する個々のデータベースの組成とに応じて確定される。%同一性値は、一致する同一ヌクレオチドまたはアミノ酸の数を、パーセント同一性が報告される対象となる配列の長さで割ることによって決定される。「パーセント(%)アミノ酸配列類似性」は、%アミノ酸配列同一性の決定と同じ計算を行うが、同一アミノ酸に加えて保存的アミノ酸置換を含めて算定することによって決定される。
【0018】
保存的アミノ酸置換とは、タンパク質のフォールディングや活性が顕著に影響されないように、あるアミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸で置換される置換である。互いに置換できる芳香族アミノ酸はフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンであり、互換性のある疎水性アミノ酸はロイシン、イソロイシン、メチオニン、およびバリンであり、互換性のある極性アミノ酸はグルタミンおよびアスパラギンであり、互換性のある塩基性アミノ酸はアルギニン、リジンおよびヒスチジンであり、互換性のある酸性アミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸であり、互換性のある小さいアミノ酸はアラニン、セリン、スレオニン、システインおよびグリシンである。
【0019】
あるいは、核酸配列のアラインメントは、SmithおよびWatermanの局所相同性アルゴリズムによって提供される(SmithおよびWaterman、1981年、Advances in Applied Mathematics、2:482〜489;database:European Bioinformatics Institute http://www.ebi.ac.uk/MPsrch/;SmithおよびWaterman、1981年、J.of Molec.Biol.、147:195〜197;Nicholas他、1998年、「A Tutorial on Searching Sequence Databases and Sequence Scoring Methods」(www.psc.edu)およびこれに引用される参考文献であるW.R.Pearson、1991年、Genomics、11:635〜650)。このアルゴリズムは、Dayhoffによって開発され(Dayhoff:Atlas of Protein Sequences and Structure、M.O.Dayhoff編、第5補遺、3:353〜358、National Biomedical Research Foundation、米国ワシントンD.C.)、Gribskovによって正規化された(Gribskov、1986年、Nucl.Acids Res.14(6):6745〜6763)スコアマトリックス(scoring matrix)を使用することによって、アミノ酸配列に適用することができる。スコアをつけるのに初期パラメータを用いたSmith−Watermanアルゴリズムを使用することができる(たとえば、ギャップ隙間ペナルティー(gap open penalty)12、ギャップ伸張ペナルティー(gap extension penalty)2)。作成されたデータでは、「一致」値は「配列同一性」を反映している。
【0020】
対象核酸分子から誘導した核酸分子には、配列番号1ないし36のいずれかの核酸配列とハイブリダイズする配列が含まれる。ハイブリダイゼーションの緊縮性は、温度、イオン強度、pH、ならびにハイブリダイズおよび洗浄中にホルムアミドなど変性剤を存在させることによって調節することができる。日常的に使用される条件は、容易に入手可能な手順書に記載されている(たとえば、Current Protocol in Molecular Biology、第1巻、第2.10章、John Wiley&Sons, Publishers、1994年;Sambrook他、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor、1989年)。一部の実施形態では、本発明の核酸分子は、6×単位強度クエン酸(single strength citrate)(SSC)(1×SSCは0.15MのNaCl、0.015Mのクエン酸Na、pH7.0である)、5×デンハルト溶液、0.05%のピロリン酸ナトリウムおよび100μg/mlのニシン精子DNAを含む溶液中で、核酸を含むフィルターを8時間〜終夜、65℃でプレハイブリダイゼーションを行うこと;6×SSC、1×デンハルト溶液、100μg/mlの酵母tRNAおよび0.05%のピロリン酸ナトリウムを含む溶液中で、18〜20時間、65℃でハイブリダイゼーションを行うこと、および;0.2×SSCおよび0.1%のSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を含む溶液で、65℃で1時間フィルターを洗浄することを含むストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号1ないし36のいずれか1つのヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズすることができる。
【0021】
他の実施形態では、35%のホルムアミド、5×SSC、50mMのTris−HCl(pH7.5)、5mMのEDTA、0.1%のPVP、0.1%のフィコール、1%のBSA、および500μg/mlの変性サケ精子DNAを含む溶液中で、核酸を含むフィルターを6時間、40℃で前処理すること;35%のホルムアミド、5×SSC、50mMのTris−HCl(pH7.5)、5mMのEDTA、0.02%のPVP、0.02%のフィコール、0.2%のBSA、100μg/mlのサケ精子DNA、および10%(重量/体積)のデキストラン硫酸を含む溶液中で、18〜20時間、40℃でハイブリダイゼーションを行うこと;次いで、2×SSCおよび0.1%のSDSを含む溶液で2度、1時間55℃で洗浄することを含む、中程度の緊縮性のハイブリダイゼーション条件を使用する。
【0022】
あるいは、20%のホルムアミド、5×SSC、50mMのリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハルト溶液、10%のデキストラン硫酸、および20μg/mlの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中で、8時間〜終夜、37℃でインキュベートすること;同じ緩衝液中で18〜20時間、ハイブリダイゼーションを行うこと、および;1×SSCで、約37℃で1時間フィルターを洗浄することを含む、低い緊縮性の条件を使用することができる。
【0023】
SLC7核酸およびポリペプチドの単離、生成、発現、およびミスエクスプレッション
SLC7核酸およびポリペプチドは、SLC7機能を調節する薬剤の同定および試験、ならびにp53経路におけるSLC7の関与に関連する他の用途に有用である。SLC7核酸ならびにその誘導体およびオルソログは、当業者に周知の方法を使用して得ることができる。たとえば、DNAライブラリをスクリーニングすることによって、またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用することによって、目的のcDNAまたはゲノムDNA配列を単離する技術が、当分野で周知である。一般的に、タンパク質の具体的な使用により、発現、生成、および精製方法の詳細が規定される。たとえば、スクリーニングして調節剤を探すために使用するタンパク質を生成するには、これらタンパク質の特異的生物活性を保存する方法が必要であるかもしれないが、抗体を産生するためのタンパク質を生成するには、特定のエピトープの構造的な完全性が必要であるかもしれない。スクリーニングまたは抗体を産生するために精製すべきタンパク質を発現させるには、特定のタグの付加が必要であるかもしれない(たとえば融合タンパク質の生成)。細胞周期制御や低酸素性応答の関与などSLC7機能を評価するのに使用するアッセイのためのSLC7タンパク質を過剰発現させるには、これらの細胞活動が可能な真核細胞系中での発現が必要であるかもしれない。タンパク質を発現、生成、および精製する方法は当分野で周知であり、したがって、任意の適切な手段を使用することができる(たとえば、Higgins SJおよびHames BD編、Protein Expression:A Practical Approach、Oxford University Press Inc.、ニューヨーク、1999年;Stanbury PF他、Principles of Fermentation Technology、第2版、Elsevier Science、ニューヨーク、1995年;Doonan S編、Protein Purification Protocols、Humana Press、ニュージャージー、1996年;Coligan JE他、Current Protocols in Protein Science編、1999年、John Wiley&Sons、ニューヨーク)。具体的な実施形態では、組換えSLC7は、欠陥p53機能を有することで知られている細胞系(たとえば、とりわけアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)、バージニア州マナサスから入手可能なSAOS−2骨芽細胞、H1299肺癌細胞、C33AおよびHT3子宮頚癌細胞、HT−29およびDLD−1大腸癌細胞、)中で発現される。この組換え細胞は、以下にさらに記載する本発明の細胞に基づくスクリーニングアッセイ系で使用する。
【0024】
SLC7ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、任意の適切な発現ベクター内に挿入することができる。プロモーター/エンハンサーエレメントを含めて必要な転写シグナルおよび翻訳シグナルは、ネイティブSLC7遺伝子および/またはそのフランキング領域由来のものでよく、また異種性のものでもよい。ウイルス(たとえばワクシニアウイルス、アデノウイルスなど)で感染させた哺乳動物細胞システム;ウイルス(たとえばバキュロウイルス)で感染させた昆虫細胞システム;酵母ベクターを含む酵母、あるいはバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドDNAで形質転換させた細菌などの微生物など、様々な宿主−ベクター発現システムが利用できる。遺伝子産物の発現を変調させ、修飾し、かつ/または特異的にプロセッシングする宿主細胞系を使用することができる。
【0025】
SLC7遺伝子産物の発現を検出するために、発現ベクターは、SLC7遺伝子の核酸に発現可能に連結されたプロモーター、1つまたは複数の複製起点、および1つまたは複数の選択可能なマーカー(たとえばチミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性など)を含むことができる。あるいは、in vitroアッセイ系(たとえば免疫アッセイ)におけるSLC7タンパク質の物理的または機能的特性に基づいてSLC7遺伝子産物の発現をアッセイすることによって、組換え発現ベクターを同定することもできる。
【0026】
たとえば精製または検出を促進するために、SLC7タンパク質、断片、またはその誘導体を、任意選択で融合体またはキメラタンパク質産物(すなわち、SLC7タンパク質が異なるタンパク質の異種タンパク質配列にペプチド結合を介して結合されている)として発現させることができる。標準の方法を使用して所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を互いにライゲートさせ、キメラ産物を発現させることによって、キメラ産物を作製することができる。また、タンパク質合成技術、たとえばペプチド合成機の使用(Hunkapiller他、Nature、1984年、310:105〜111)によってキメラ産物を作製することもできる。
【0027】
SLC7遺伝子配列を発現する組換え細胞が同定された後は、標準の方法(たとえばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、およびゲル排除クロマトグラフィー;遠心分離;溶解度差;電気泳動、精製の文献を引用)を使用して遺伝子産物を単離および精製することができる。あるいは、標準の方法(たとえば免疫親和性精製)によって、天然源からネイティブSLC7タンパク質を精製することができる。タンパク質を得た後は、免疫アッセイ、バイオアッセイ、または結晶学など他の物理的特性の測定など適切な方法によってこれを定量し、その活性を測定することができる。
【0028】
本発明の方法では、SLC7またはp53経路に関連する他の遺伝子の発現が変化するように(ミスエクスプレスされるように)操作した細胞を使用することもできる。本明細書中で使用するミスエクスプレッションとは、異所性発現、過剰発現、過少発現、および無発現(たとえば遺伝子のノックアウトまたは通常は正常に引き起こされる発現の遮断による)を包含する。
【0029】
遺伝子改変動物
候補p53調節剤の活性を試験するため、またはアポトーシスや細胞増殖などp53経路のプロセスにおけるSLC7の役割をさらに評価するために、SLC7の発現が変化するように遺伝子が改変された動物モデルを、in vivoアッセイで使用することができる。好ましくは、変化したSLC7の発現により、正常なSLC7発現を有する対照動物に比べて低減または上昇した細胞増殖、血管形成、またはアポトーシスのレベルなど、検出可能な表現型がもたらされる。この遺伝子改変動物はさらに、p53発現が変化していてもよい(たとえばp53ノックアウト)。好ましい遺伝子改変動物は、霊長類、げっ歯類(好ましくはマウス)、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌおよびネコなどの哺乳動物である。好ましい哺乳動物でない種には、ゼブラフィッシュ、線虫(C.elegans)、およびショウジョウバエが含まれる。好ましい遺伝子改変動物は、染色体外エレメントとして存在する異種核酸配列をその細胞の一部分内に有するトランスジェニック動物、すなわちモザイク動物(たとえば、Jakobovits、1994年、Curr.Biol.、4:761〜763によって記載されている技術参照)、または異種核酸が生殖系列DNA内(すなわち細胞のほとんどまたはすべてのゲノム配列中)に安定に組み込まれているトランスジェニック動物である。異種核酸は、たとえば宿主動物の胚または胚性幹細胞を遺伝子操作することによって、このようなトランスジェニック動物の生殖系列内に導入される。
【0030】
トランスジェニック動物を作製する方法は当分野で周知である(トランスジェニックマウスには、Brinster他、Proc.Nat.Acad.Sci.USA、82:4438〜4442、1985年、どちらもLeder他による米国特許第4,736,866号および第4,870,009号、Wagner他による米国特許第4,873,191号、ならびにHogan, B.、Manipulating the Mouse Embryo、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1986年参照;パーティクルボンバードメントについては、Sandford他による米国特許第4,945,050号参照;トランスジェニックショウジョウバエについては、RubinおよびSpradling、Science、1982年、218:348〜53および米国特許第4,670,388号参照;トランスジェニック昆虫については、Berghammer A.J.他、A Universal Marker for Transgenic Insects、1999年、Nature、402:370〜371参照;トランスジェニックゼブラフィッシュについては、Lin S.、Transgenic Zebrafish、Methods Mol Biol.、2000年、136:375〜3830参照);魚、両生類卵および鳥でのマイクロインジェクションについては、HoudebineおよびChourrout、Experientia、1991年、47:897〜905参照;トランスジェニックラットについては、Hammer他、Cell、1990年、63:1099〜1112参照;胚性幹(ES)細胞を培養し、その後、電気穿孔、リン酸カルシウム/DNA沈降、直接注入などの方法を使用してDNAをES細胞に導入することによるトランスジェニック動物の作製には、たとえばTeratocarcinomas and Embryonic Stem Cells, A Practical Approach、E.J.Robertson編、IRL Press、1987年参照)。利用可能な方法に従って非ヒトトランスジェニック動物のクローンを作製することができる(Wilmut, I.他、1997年、Nature、385:810〜813;PCT国際公開公報WO97/07668号およびWO97/07669号参照)。
【0031】
一実施形態では、このトランスジェニック動物は、好ましくはSLC7発現が検出不可能または僅かとなるようにSLC7機能の低下をもたらす、内因性SLC7遺伝子の配列中のヘテロ接合性またはホモ接合性の変化を有する「ノックアウト」動物である。ノックアウト動物は通常、ノックアウトする遺伝子の少なくとも一部分を有する導入遺伝子を含むベクターを用いた相同組換えによって作製される。通常、導入遺伝子を機能的に破壊するために、これに欠失、追加、または置換を導入しておく。この導入遺伝子はヒト遺伝子(たとえばヒトゲノムクローン由来)でもよいが、より好ましくは、トランスジェニック宿主種由来の、ヒト遺伝子のオルソログである。たとえば、マウスゲノム中の内因性SLC7遺伝子を変化させるのに適した相同組換えベクターを構築するためには、マウスSLC7遺伝子を使用する。マウスにおける相同組換えの詳細な方法が利用可能である(Capecchi、Science、1989年、244:1288〜1292;Joyner他、Nature、1989年、338:153〜156参照)げっ歯類でない哺乳動物および他の動物のトランスジェニックを作製する手順も、利用可能である(HoudebineおよびChourrout、上掲;Pursel他、Science、1989年、244:1281〜1288;Simms他、Bio/Technology、1988、6:179〜183)。好ましい実施形態では、特定の遺伝子がノックアウトされたマウスなどのノックアウト動物を使用して、ノックアウトされた遺伝子のヒトでの対応物に対する抗体を産生させることができる(Claesson MH他、1994年、Scan J Immunol、40:257〜264;Declerck PJ他、1995年、J Biol Chem.、270:8397〜400)。
【0032】
別の実施形態では、このトランスジェニック動物は、たとえばSLC7の追加のコピーを導入することによって、またはSLC7遺伝子の内因性コピーの発現を変化させる制御配列を動作可能に挿入することによって、SLC7遺伝子の発現の変化(たとえば発現の増大(異所性の増大を含む)および低減)をもたらす変化をそのゲノム中に有する「ノックイン」動物である。このような制御配列としては、誘発性であり、組織特異的で構成的なプロモーターおよびエンハンサーエレメントが含まれる。このノックインは、ホモ接合性またはヘテロ接合性であることができる。
【0033】
導入遺伝子の発現を制限可能にする選択された系を含む非ヒト動物のトランスジェニックも、作製することができる。作製し得るこのような系の一例は、バクテリオファージP1のcre/loxPリコンビナーゼ系である(Lakso他、PNAS、1992、89:6232〜6236;米国特許第4,959,317号)。導入遺伝子の発現を制御するためにcre/loxPリコンビナーゼ系を使用する場合、Creリコンビナーゼと選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要となる。このような動物は、たとえば、一方が選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、他方がリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む2匹のトランスジェニック動物を交配させることによって「ダブル」トランスジェニック動物を作製することによって、提供することができる。リコンビナーゼ系の別の例は、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のFLPリコンビナーゼ系である(O'Gorman他、1991年、Science、251:1351〜1355;米国特許第5,654,182号)。好ましい実施形態では、導入遺伝子の発現を制御するため、また同一細胞内でのベクター配列が順次削除されるように、Cre−LoxPおよびFlp−Frtの両方が同一系内で使用される(Sun X他、2000年、Nat Genet、25:83〜6)。
【0034】
遺伝学の研究において欠陥p53機能に関係する疾病および疾患の動物モデルとして、また以下に記載するスクリーニングで同定されたものなど候補治療剤のin vivo試験のために、遺伝子改変動物を使用してp53経路をさらに解明することができる。この候補治療剤をSLC7機能が変化した遺伝子改変動物に投与し、表現型の変化を、偽薬による処置を与えた遺伝子改変動物および/または候補治療剤を与えたSLC7発現が変化していない動物などの適切な対照動物と比較する。
【0035】
SLC7機能が変化した上述の遺伝子改変動物に加えて、欠陥p53機能(およびそれ以外は正常なSLC7機能)を有する動物モデルを本発明の方法において使用することができる。たとえば、以下に記載するin vitroアッセイのうち1つで同定された候補p53調節剤の活性をin vivoで評価するために、p53ノックアウトマウスを使用することができる。p53ノックアウトマウスは文献に記載されている(Jacks他、Nature、2001年;410:1111〜1116、1043〜1044;Donehower他、上掲)。好ましくは、候補p53調節剤をp53機能に欠陥がある細胞を有するモデル系に投与した場合、モデル系において検出可能な表現型の変化がもたらされ、これにより、p53機能が修復されている、すなわち細胞が正常な細胞周期進行を示していることが示される。
【0036】
調節剤
本発明は、SLC7の機能および/またはp53経路と相互作用しかつ/またはこれを調節する作用剤を同定する方法を提供する。これらの方法によって同定された調節剤もまた本発明の一部である。このような作用剤は、p53経路に関連する様々な診断および治療用途、ならびにSLC7タンパク質およびp53経路におけるその寄与のより詳しい分析に有用である。したがって、本発明はまた、SLC7相互作用剤または調節剤を投与することによってSLC7活性を特異的に調節するステップを含む、p53経路を調節する方法も提供する。
【0037】
本明細書で使用する「SLC7調節剤」という表現は、SLC7機能を調節する任意の作用剤、たとえば、SLC7と相互作用してSLC7活性を抑制または亢進する作用剤、あるいは正常なSLC7機能に影響を与える作用剤である。SLC7機能は、転写、タンパク質発現、タンパク質の局在化、細胞活性または細胞外活性を含め、いかなるレベルにおいても影響を受けうる。好ましい実施形態では、SLC7調節剤はSLC7の機能を特異的に調節する。表現「特異的調節剤」、「特異的に調節する」などは、本明細書中では、SLC7ポリペプチドまたは核酸に直接結合し、好ましくはSLC7の機能を阻害、増強、または他の形で変化させる調節剤を言うために使用する。また、この用語は、(たとえば、SLC7の結合パートナーと、またはタンパク質/結合パートナー複合体と結合してSLC7機能を改変することによって)SLC7と結合パートナー、基質、または補因子との相互作用を変化させる調節剤も包含する。さらに好ましい実施形態では、SLC7調節剤は、p53経路のモジュレーターであり(たとえば、p53機能を回復および/または上方制御する)、したがってまた「p53調節剤」である。
【0038】
好ましいSLC7調節剤には、小分子化合物;抗体およびその他生物療法剤を含むSLC7相互作用タンパク質;およびアンチセンスやRNA阻害剤などの核酸調節剤が含まれる。調節剤を、たとえば組合せ療法などにおけるような他の活性成分および/または適切な担体や賦形剤を含んでもよい組成物として、薬剤組成物中に配合してもよい。化合物を配合または投与する技術は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、Mack Publishing Co.、ペンシルベニア州イーストン、第19版に出ている。
【0039】
小分子モジュレーター
小分子は多くの場合、酵素機能を有しかつ/またはタンパク質相互作用ドメインを含むタンパク質の機能を調節することが好ましい。当分野で「小分子」化合物と呼ばれる化学剤は通常、分子量が10,000未満、好ましくは5,000未満、より好ましくは1,000未満、最も好ましくは500未満である有機非ペプチド分子である。このクラスのモジュレーターには、化学的に合成した分子、たとえばコンビナトリアル化学ライブラリからの化合物が含まれる。合成化合物は、既知または推定SLC7タンパク質の特性に基づいて合理的に設計または同定する、あるいは化合物ライブラリをスクリーニングすることによっても同定することができる。このクラスの代わりの適切なモジュレーターは、天然産物、特に、やはり化合物ライブラリをスクリーニングしてSLC7変調活性を探すことによって同定することができる、植物や真菌類など生物由来の二次代謝産物である。化合物を作製して得る方法は、当分野で周知である(Schreiber SL、Science、2000年、151:1964〜1969;Radmann JおよびGunther J、Science、2000、151:1947〜1948)。
【0040】
以下に記載するスクリーニングアッセイから同定された小分子モジュレーターをリード化合物として使用することができ、それから候補臨床化合物を設計し、最適化し、合成することができる。このような臨床化合物は、p53経路に関連する病状を処置するのに有用であるかもしれない。候補小分子調節剤の活性は、以下にさらに記載する反復性の二次的な機能検証、構造決定、および候補モジュレーターの改変および試験によって、数倍改善されるかもしれない。さらに、候補臨床化合物は、臨床的および薬理的特性に特に注意を払って作製される。たとえば、活性を最適化し、製薬開発における毒性を最小限に抑えるために、試薬を誘導体化し、in vitroおよびin vivoアッセイを使用して再スクリーニングすることができる。
【0041】
タンパク質モジュレーター
特異的なSLC7相互作用タンパク質は、p53経路および関連疾患に関連する様々な診断上および治療上の用途、ならびに他のSLC7調節剤の検証アッセイにおいて有用である。好ましい実施形態では、SLC7相互作用タンパク質は、転写、タンパク質の発現、タンパク質の局在化、細胞活性または細胞外活性を含めた正常なSLC7機能に影響を与える。別の実施形態では、SLC7相互作用タンパク質は、癌などp53に関連する疾患に関連性があるので、SLC7タンパク質の機能に関する情報を検出および提供するのに有用である(たとえば診断上の手段用)。
【0042】
SLC7相互作用タンパク質は、SLC7発現、局在化、および/または活性を調節するSLC7経路のメンバーなど内因性のもの、すなわちSLC7と自然に遺伝学的または生化学的に相互作用するものであってよい。SLC7モジュレーターには、SLC7相互作用タンパク質およびSLC7タンパク質自体のドミナントネガティブの形が含まれる。酵母2ハイブリッドおよび変異体スクリーニングにより、内因性SLC7相互作用タンパク質同定する好ましい方法が提供されている(Finley, R.L.他、1996年、DNA Cloning-Expression Systems:A Practical Approach、Glover D.およびHames B.D編、Oxford University Press、英国オックスフォード、ページ169〜203;Fashema SF他、Gene、2000年、250:1〜14;Drees BL、Curr Opin Chem Biol、1999、3:64〜70;Vidal MおよびLegrain P、Nucleic Acids Res、1999年、27:919〜29;米国特許第5,928,868号)。タンパク質複合体を解明するための好ましい代替方法は、質量分析である(たとえば、Pandley AおよびMann M、Nature、2000年、405:837〜846;Yates JR 3rd、Trends Genet、2000年、16:5〜8の総説)。
【0043】
SLC7相互作用タンパク質は、SLC7に特異的な抗体やT細胞抗原受容体などの外因性タンパク質でよい(たとえば、HarlowおよびLane、1988年、Antibodies, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory;HarlowおよびLane、1999年、Using antibodies:a laboratory manual.、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー:Cold Spring Harbor Loboratory Press参照)。SLC7抗体については以下でさらに論じる。
【0044】
好ましい実施形態では、SLC7相互作用タンパク質はSLC7タンパク質に特異的に結合する。好ましい代替実施形態では、SLC7調節剤はSLC7基質、結合パートナー、またはコファクターと結合する。
【0045】
抗体
別の実施形態では、このタンパク質モジュレーターはSLC7に特異的な抗体アゴニストまたはアンタゴニストである。この抗体は治療上および診断上の用途を有しており、SLC7モジュレーターを同定するスクリーニングアッセイで使用することができる。また、様々な細胞応答ならびにSLC7の通常のプロセッシングおよび成熟を担当するSLC7経路の部分の分析においても、この抗体を使用することができる。
【0046】
周知の方法を使用してSLC7ポリペプチドと特異的に結合する抗体を作製することができる。好ましくは、この抗体はSLC7ポリペプチドの哺乳動物オルソログ、より好ましくはヒトSLC7に、特異的である。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAbs)、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖抗体、Fab断片、F(ab’)2断片、FAb発現ライブラリによって産生された断片、抗イディオタイプ(抗−Id)抗体、および上記のうちいずれかのエピトープ結合断片であってよい。たとえば、配列番号37ないし50のいずれかに示すアミノ酸配列に対する抗原性を探すための通常のSLC7ポリペプチドのスクリーニングによって、またはこれに対するタンパク質の抗原性領域を選択する理論的な方法を施用することによって、特に抗原性であるSLC7のエピトープを選択することができる(HoppおよびWood、1981年、Proc.Nati.Acad.Sci.U.S.A.、78:3824〜28;HoppおよびWood、1983年、Mol.Immunol.、20:483〜89;Sutcliffe他、1983年、Science、219:660〜66)。記載の標準手順によって、108M−1、好ましくは109M−1〜1010M−1、またはそれより強力な親和性を有するモノクローナル抗体を作製することができる(HarlowおよびLane、上掲;Goding、1986年、Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(第2版)、Academic Press、ニューヨーク;米国特許第4,381,292号;米国特許第4,451,570号;米国特許第4,618,577号)。SLC7の粗細胞抽出物または実質的に精製されたその断片に対する抗体を作製することができる。SLC7断片を使用する場合は、これらは、好ましくはSLC7タンパク質の少なくとも10個、より好ましくは少なくとも20個の連続したアミノ酸を含む。特定の実施形態では、SLC7に特異的な抗原および/または免疫原は、免疫応答を刺激する担体タンパク質に結合している。たとえば、対象ポリペプチドはキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)担体に共有結合しており、このコンジュゲートは免疫応答を増強させるフロイント完全アジュバント中で乳化されている。従来のプロトコルに従って実験ウサギやマウスなど適切な免疫系を免疫化する。
【0047】
固定した対応するSLC7ポリペプチドを使用した固相酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)など適切なアッセイによって、SLC7に特異的な抗体の存在をアッセイした。ラジオイムノアッセイや蛍光アッセイなど他のアッセイを使用することもできる。
【0048】
異なる動物種由来の異なる部分を含む、SLC7ポリペプチドに特異的なキメラ抗体を作製することができる。たとえば、抗体の生物活性はヒト抗体由来であり、その結合特異性はネズミ断片由来となるように、ヒト免疫グロブリン定常領域をネズミmAbの可変領域に連結させてもよい。それぞれの種由来の適切な領域をコードする遺伝子を継ぎ合わせることによってキメラ抗体を作製する(Morrison他、Proc.Natl.Acad.Sci.、1984、81:6851〜6855;Neuberger他、Nature、1984、312:604〜608;Takeda他、Nature、1985、31:452〜454)。キメラ抗体の一形態であるヒト化抗体は、組換えDNA技術によって(Riechmann LM他、1988年、Nature、323:323〜327)マウス抗体の相補性決定領域(CDR)をヒトフレームワーク領域および定常領域のバックグラウンドに移植することによって(Carlos, T.M.、J.M.Harlan、1994年、Blood、84:2068〜2101)作製することができる。ヒト化抗体は約10%のネズミ配列および約90%のヒト配列を含み、それにより、抗体特異性を保持したままで免疫原性がさらに低下または排除される(Co MSおよびQueen C.、1991年、Nature、351:501〜501;Morrison SL.、1992年、Ann.Rev.Immun.、10:239〜265)。ヒト化抗体およびそれらを産生させる方法は当分野で周知である(米国特許第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,762号、および第6,180,370号)。
【0049】
アミノ酸架橋によってFv領域の重鎖断片と軽鎖断片とを連結させて形成した組換え単鎖ポリペプチドであるSLC7特異的単鎖抗体を、当分野で周知の方法によって産生することができる(米国特許第4,946,778号;Bird、Science、1988年、242:423〜426;Huston他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1988年、85:5879〜5883;Ward他、Nature、1989、334:544〜546)。
【0050】
抗体を産生するための他の適切な技術は、リンパ球をin vitroで、抗原ポリペプチド、または代わりにファージや類似のベクター中の選定抗体ライブラリに曝すことを含む(Huse他、Science、1989年、246:1275〜1281)。本明細書中で使用するT細胞抗原受容体は、抗体モジュレーターの範囲内に含まれる(HarlowおよびLane、1988年、上掲)。
【0051】
本発明のポリペプチドおよび抗体は、改変してまたは改変せずに使用することができる。多くの場合、検出可能なシグナルをもたらす基質または標的タンパク質を発現する、細胞にとって毒性である基質を共有結合または非共有結合のどちらかによって結合させることによって抗体を標識する(Menard S他、Int J.Biol Markers、1989、4:131〜134)。幅広い種類の標識およびコンジュゲーション技術が知られており、科学文献および特許文献のどちらにも広く報告されている。適切な標識には、放射性核種、酵素、基質、コファクター、阻害剤、蛍光部分(moiety)、蛍光発光ランタニド金属、化学発光部分、生物発光部分、磁気粒子などが含まれる(米国特許第3,817,837号;第3,850,752号;第3,939,350号;第3,996,345号;第4,277,437号;第4,275,149号;第4,366,241号)。また、組換え免疫グロブリンを産生させてもよい(米国特許第4,816,567号)。膜貫通毒素タンパク質とコンジュゲートさせることによって細胞質ポリペプチドに対する抗体をその標的に送達し到達させることができる(米国特許第6,086,900号)。
【0052】
患者で治療的に使用する場合は、可能な場合は標的部位に非経口的投与によって、または静脈投与によって本発明の抗体を投与する。臨床研究によって治療上有効な用量および投与計画を決定する。通常、投与する抗体の量は患者の重量1kgあたり約0.1mg〜約10mgである。非経口投与には、薬学的に許容されるベヒクルを含む単位用量の注射可能な形態(たとえば溶液、懸濁液、乳濁液)で抗体を配合する。このようなベヒクルは本質的に無毒性で治療作用がない。例は、水、生理食塩水、リンゲル溶液、ブドウ糖溶液、および5%のヒト血清アルブミンである。また、不揮発性油、オレイン酸エチル、またはリポソーム担体などの非水性ベヒクルを使用してもよい。ベヒクルには、等張性や化学的安定性を高めるまたは他の形で治療の可能性を高める緩衝剤や保存料など少量の添加剤が含まれ得る。このようなベヒクル中の抗体濃度は、通常約1mg/ml〜約10mg/mlである。免疫療法的な方法は文献にさらに記載されている(米国特許第5,859,206号;国際公開公報WO0073469号)。
【0053】
特定の生物療法
好ましい実施形態では、SLC7相互作用タンパク質は生物療法に適用できる。製薬的に許容可能な担体中に処方された生物療法剤と用量は、シグナル伝達経路を活性化または阻害するために使用できる。この調節は、リガンドを結合させ、よって経路の活性を阻害するか;または受容体を結合させ、受容体の活性化を阻害するかまたは受容体を活性化することにより達成することができる。あるいは、生物療法剤自体が、受容体を活性化または阻害可能なリガンドであってもよい。生物療法剤とその製造方法は、米国特許第6,146,628号に詳述されている。
【0054】
SLC7リガンド、リガンドの抗体、またはSLC7自体を生物療法剤として使用して、p53経路のSLC7の活性を調節してもよい。
【0055】
核酸モジュレーター
他の好ましいSLC7調節剤としては、一般的にSLC7活性を阻害するアンチセンスオリゴマーや二本鎖RNA(dsRNA)などの核酸分子が含まれる。好ましい核酸モジュレーターは、DNAの複製、転写、タンパク質翻訳部位へのSLC7 RNAの転位、SLC7 RNAからのタンパク質の翻訳、SLC7 RNAをスプライシングして1つまたは複数のmRNA種を得ること、またはSLC7 RNAに関与しまたはそれによって促進され得る触媒活性など、SLC7核酸の機能を妨げる。
【0056】
一実施形態では、このアンチセンスオリゴマーは、好ましくは5’非翻訳領域に結合することによってSLC7 mRNAと結合して、翻訳を阻止するのに十分相補的なオリゴヌクレオチドである。SLC7に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも6〜約200個の範囲のヌクレオチドである。一部の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも10、15、または20ヌクレオチド長である。他の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、好ましくは50未満、40、または30ヌクレオチド長である。このオリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のDNAまたはRNA、あるいはそのキメラ混合物や誘導体またはそれを改変した変形であり得る。このオリゴヌクレオチドの塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格を改変してもよい。このオリゴヌクレオチドは、ペプチド、細胞膜を横切る輸送を促進する作用剤、ハイブリダイゼーションによってトリガーされる切断剤、インターカレーション剤など他の付属基を含んでいてもよい。
【0057】
別の実施形態では、このアンチセンスオリゴマーはホスホチオエートモルホリノオリゴマー(PMO)である。PMOは、それぞれがモルフォリンの六員環に結合している4種の遺伝子塩基(A、C、G、またはT)のうちの1つを含む、4種の異なるモルフォリノサブユニットから組み立てられている。これらサブユニットのポリマーは、非イオン性のホスホジアミデートサブユニット間の連結によって結合されている。PMOおよび他のアンチセンスオリゴマーの詳細な作成方法および使用方法は、当分野で周知である(たとえば、国際公開公報WO99/18193号;Probst JC、Antisense Oligodeoxynucleotide and Ribozyme Design, Methods.、2000年、22(3):271〜281;Summerton JおよびWeller D.、1997年、Antisense Nucleic Acid Drug Dev.、7:187〜95;米国特許第5,235,033号;米国特許第5,378,841号参照)。
【0058】
好ましい代替SLC7核酸モジュレーターは、RNA干渉(RNAi)を媒介する二本鎖RNA種である。RNAiは、動物および植物における配列特異的な翻訳後の遺伝子サイレンシングプロセスであり、サイレンシングされる遺伝子と相同の配列をもつ二本鎖RNA(dsRNA)によって開始される。線虫、ショウジョウバエ、植物、およびヒトで遺伝子をサイレンシングするためのRNAiの使用に関する方法は、当分野で周知である(Fire A他、1998年、Nature、391:806〜811;Fire, A.、Trends Genet.、15、358〜363、1999年;Sharp, P.A.、RNA interference 2001.、Genes Dev.、15、485〜490、2001年;Hammond, S.M.他、Nature Rev.Genet.、2、110〜1119、2001年;Tuschl, T.、Chem.Biochem.、2、239〜245、2001年;Hamilton, A.他、Science、286、950〜952、1999年;Hammond, S.M.他、Nature、404、293〜296、2000年;Zamore, P.D.他、Cell、101、25〜33、2000年;Bernstein, E.他、Nature、409、363〜366、2001;Elbashir, S.M.他、Genes Dev.、15、188〜200、2001年;国際公開公報WO0129058号;国際公開公報WO9932619号;Elbashir SM他、2001年、Nature、411:494〜498)。
【0059】
核酸モジュレーターは一般的に、探索試薬、診断薬、治療薬として使用される。たとえば、遺伝子の発現を厳密な特異性で阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、しばしば特定の遺伝子の機能を解明するのに使用される(たとえば、米国特許第6,165,790号参照)。また、核酸モジュレーターは、たとえば生体経路の様々なメンバーの機能を識別するためにも使用される。たとえば、アンチセンスオリゴマーは、病態の動物および人の処置における治療的部分として利用されてきており、安全かつ効果的であることが数々の臨床治験で実証されてきた(Milligan JF他、Current Concepts in Antisense Drug Design、J Med、Chem.、1993年、36:1923〜1937;Tonkinson JL他、Antisense Oligodeoxynucleotides as Clinical Therapeutic Agents、Cancer Invest.、1996年、14:54〜65)。したがって、本発明の一態様では、p53経路におけるSLC7の役割、および/またはSLC7とこの経路の他のメンバーとの関係をさらに解明するためのアッセイで、SLC7に特異的な核酸モジュレーターを使用する。本発明の別の態様では、p53に関連する病態を処置する治療剤として、SLC7に特異的なアンチセンスオリゴマーを使用する。
【0060】
アッセイ系
本発明は、SLC7活性の特異的なモジュレーターを同定するアッセイ系およびスクリーニング方法を提供する。本明細書中で使用する「アッセイ系」とは、具体的な事象を検出かつ/または測定するアッセイを実施してその結果を分析するのに必要なすべての構成要素を包含する。一般的に、一次アッセイを使用して、SLC7核酸またはタンパク質に関するモジュレーターの特異的な生化学的効果または分子効果を同定または確認する。一般的に、二次アッセイでは、一次アッセイによって同定されたSLC7調節剤の活性がさらに評価され、この調節剤がp53経路に関連する方式でSLC7に影響を与えることが確認されることもある。場合によっては、SLC7モジュレーターを直接二次アッセイで試験する。
【0061】
好ましい実施形態では、スクリーニング方法は、候補剤が存在しなければスクリーニング方法で検出される特定の分子事象に基づく対照活性(たとえばトランスポーター活性)が系によってもたらされる条件下で、SLC7ポリペプチドまたは核酸を含む適切なアッセイ系を候補剤と接触させることを含む。作用剤の影響を受ける活性と対照活性との統計的に有意な差により、この候補剤がSLC7活性を、したがってp53経路を調節することが示される。このアッセイで使用されるSLC7ポリペプチドまたは核酸は、前記核酸またはポリペプチド(たとえば配列番号1−54)のいずれを含んでもよい。好ましい一実施形態では、SLC7は配列番号1−6、および51のいずれか1つから選択される核酸配列、または配列番号37、38および54のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含むSLC7A5である。さらに好ましい実施形態では、SLC7A5核酸は配列番号51を含み、タンパク質は配列番号54を含む。別の好ましい実施形態では、SLC7は、配列番号29−34、52、および53のいずれか1つから選択される核酸配列、または配列番号48または49から選択されるアミノ酸配列を含むSLC7A11である。さらに好ましい実施形態では、SLC7A11核酸は配列番号52またはそのスプライスバリアントである配列番号53を含む。
【0062】
一次アッセイ
一般的に、試験するモジュレーターの種類によって一次アッセイの種類が決まる。
【0063】
小分子モジュレーター用の一次アッセイ
小分子モジュレーターには、候補モジュレーターを同定するためにスクリーニングアッセイを使用する。スクリーニングアッセイは、細胞に基づくものでもよく、またこの標的タンパク質に関連する生化学的反応を再度引き起こさせるまたは保持する無細胞系を使用してもよい(Sittampalam GS他、Curr Opin Chem Biol、1997年、1:384〜91および付随の参考文献に総説がある)。本明細書中で使用する用語「細胞に基づく」とは、生細胞、死滅細胞、または膜分画、小胞体分画、ミトコンドリア分画など特定の細胞分画を使用したアッセイを言う。用語「無細胞」とは、実質的に精製されたタンパク質(内因性または組換えによって生成された)、部分的に精製したまたは粗細胞抽出物を使用したアッセイを包含する。スクリーニングアッセイでは、タンパク質−DNA相互作用、タンパク質−タンパク質相互作用(たとえば受容体−リガンド結合)、転写活性(たとえばレポーター遺伝子)、酵素活性(たとえば基質の特徴を介するもの)、セカンドメッセンジャーの活性、免疫原性、および細胞形態や他の細胞性特徴の変化を含めた様々な分子事象を検出することができる。適切なスクリーニングアッセイでは、蛍光、放射活性、比色、分光光度、および電流滴定を含めた広範囲の検出方法を使用して、検出する具体的な分子事象の読出しを行うことができる。
【0064】
通常、細胞に基づくスクリーニングアッセイには、SLC7を組換えによって発現する系および個々のアッセイで要求される任意の補助タンパク質が必要である。組換えタンパク質を生じさせる適切な方法では、関連する生物活性を保持しており、活性を最適化してアッセイの再現性を保証するのに十分な純度のタンパク質が、十分な量で生成される。酵母2ハイブリッドスクリーニング、変異体スクリーニングおよび質量分析は、タンパク質−タンパク質相互作用を決定し、タンパク質複合体を解明する好ましい方法を提供する。ある種の用途では、小分子モジュレーターを同定するスクリーニングにSLC7相互作用タンパク質を使用する場合、SLC7タンパク質に対する相互作用タンパク質の結合特異性を、基質による処理(たとえば候補SLC7に特異的に結合する作用剤の、SLC7発現性細胞におけるネガティブエフェクターとして機能する能力)、結合平衡定数(通常少なくとも約107M−1、好ましくは少なくとも約108M−1、より好ましくは少なくとも約109M−1)、免疫原性(たとえばマウス、ラット、ヤギまたはウサギなどの異種宿主中でSLC7に特異的な抗体を誘発する能力)など様々な周知の方法によってアッセイすることができる。酵素および受容体について、結合はそれぞれ基質およびリガンドによる処理によってアッセイすることができる。
【0065】
スクリーニングアッセイでは、SLC7ポリペプチド、その融合タンパク質、またはこのポリペプチドもしくは融合タンパク質を含む細胞または膜に特異的に結合する、あるいはその活性を調節する、候補剤の能力を測定することができる。SLC7ポリペプチドは、完全長のものでも、また機能的なSLC7活性を保持しているその断片でもよい。SLC7ポリペプチドは、検出または固定用のペプチドタグあるいは別のタグなど別のポリペプチドに融合させてもよい。SLC7ポリペプチドは、好ましくはヒトSLC7、あるいは上記のようなそのオルソログまたは誘導体である。好ましい実施形態では、スクリーニングアッセイで、SLC7と内因性タンパク質、外因性タンパク質、またはSLC7に特異的な結合活性を有する他の基質などの結合標的との相互作用の候補剤に基づく変調を検出し、これを使用して正常なSLC7遺伝子機能を評価することができる。
【0066】
SLC7モジュレーターを探すためのスクリーニングに適合させることのできる適切なアッセイ様式は、当分野で周知である。好ましいスクリーニングアッセイは高スループットまたは超高スループットであり、したがって、リード化合物用の化合物ライブラリをスクリーニングする、自動化された費用効果の高い手段を提供する(Fernandes PB、Curr Opin Chem Biol、1998年、2:597〜603;Sundberg SA、Curr Opin Biotechnol、2000年、11:47〜53)。好ましい一実施形態では、スクリーニングアッセイで、蛍光偏光、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動を含めた蛍光技術を使用する。これらの系は、色素で標識した分子から放出されたシグナルの強度がそのパートナー分子との相互作用に依存する、タンパク質−タンパク質またはDNA−タンパク質相互作用をモニターする手段を提供する(たとえば、Selvin PR、Nat Struct Biol、2000年、7:730〜4;Fernandes PB、上掲;Hertzberg RPおよびPope AJ、Curr Opin Chem Biol、2000年、4:445〜451)。
【0067】
候補SLC7およびp53経路モジュレーターを同定するために様々な適切なアッセイ系を使用することができる(たとえば、米国特許第6,020,135号(p53の変調)、米国特許第5,550,019号および第6,133,437号(アポトーシスアッセイ))。特定の好ましいアッセイを以下に詳述する。
【0068】
トランスポーターアッセイ。トランスポータータンパク質は、栄養素、イオン、アミノ酸および薬剤を含むある範囲の基質を細胞を越えて運ぶ。トランスポーターのモジュレーターのアッセイは標識基質を使用することができる。たとえば、異なるペプチドと相互作用する化合物を同定するための例示的ハイスループットスクリーニングおよびアニオントランスポーターは双方とも蛍光標識基質を使用する;これに加えて、ペプチド輸送のアッセイは、多重スクリーンろ過プレートを使用する(Blevitt JM他、J Biomol Screen、1999年、4:87-91; Cihlar TおよびHo ES、Anal Biochem、2000年、283:49-55)。
【0069】
アポトーシスアッセイ。アポトーシス用のアッセイは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼに媒介されたジゴキシゲニン−11−dUTPニックエンド標識(TUNEL)アッセイによって実施することができる。TUNELアッセイは、フルオレセイン−dUTPの取り込み(Yonehara他、1989、J.Exp.Med.、169、1747)を追跡することによってアポトーシスに特徴的な核DNAの断片化を測定すること(Lazebnik他、1994、Nature、371、346)に使用される。組織培養細胞のアクリジンオレンジ染色によってアポトーシスをさらにアッセイすることができる(Lucas, R.他、1998、Blood、15:4730〜41)。アポトーシスアッセイ系は、SLC7を発現する細胞、および任意選択で欠陥p53機能を有する(たとえば、野生型細胞に比べてp53が過剰発現または過少発現されている)ものを含むことができる。このアポトーシスアッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較したアポトーシスの誘発における変化により、候補p53調節剤が同定される。本発明の一部の実施形態では、無細胞系を使用して最初に同定された候補p53調節剤を試験する二次アッセイとして、アポトーシスアッセイを使用することができる。また、SLC7機能がアポトーシスにおいて直接役割を果たすかどうかを試験するためにアポトーシスアッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてSLC7を過剰発現または過少発現する細胞でアポトーシスアッセイを実施することができる。野生型細胞と比較したアポトーシス応答の差により、SLC7がアポトーシス応答において直接役割を果たすことが示唆される。アポトーシスアッセイは、米国特許第6,133,437号にさらに記載されている。
【0070】
細胞増殖および細胞周期アッセイ。細胞増殖は、ブロモデオキシウリジン(BRDU)の取り込みを介してアッセイすることができる。このアッセイでは、新しく合成されたDNAにBRDUが取り込まれることにより、DNAが合成されている細胞集団が同定される。その後、抗BRDU抗体を用いて(Hoshino他、1986年、Int.J.Cancer、38、369;Campana他、1988年、J.Immunol.Meth.、107、79)、または他の手段によって、新しく合成されたDNAを検出することができる。
【0071】
また、[3H]−チミジンの取り込みを使用して細胞増殖を検査することもできる(Chen, J.、1996年、Oncogene、13:1395〜403;Jeoung, J.、1995年、J.Biol.Chem.、270:18367〜73)。このアッセイにより、S期のDNA合成の定量的な特徴づけが可能になる。このアッセイでは、DNAを合成している細胞が新しく合成されるDNA中に[3H]−チミジンを取り込む。その後、シンチレーション計数器(たとえば、Beckman LS 3800液体シンチレーション計数器)による放射性同位元素の計数など標準の技術によって取り込みを測定することができる。
【0072】
また、軟寒天中のコロニー形成によって細胞増殖をアッセイすることもできる(Sambrook他、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor、1989年)。たとえば、SLC7で形質転換させた細胞を軟寒天プレートに播種し、2週間インキュベートした後コロニーを測定して計数する。
【0073】
フローサイトメトリーによって細胞周期における遺伝子の関与をアッセイすることができる(Gray JW他、1986年、Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med、49:237〜55)。SLC7で形質移入させた細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリー(Beckton Dickinsonから入手可能)で評価することができる。
【0074】
したがって、細胞増殖または細胞周期アッセイ系は、SLC7を発現する細胞、および任意選択で欠陥p53機能を有する(たとえば、野生型細胞に比べてp53が過剰発現または過少発現されている)ものを含むことができる。このアッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較した細胞増殖または細胞周期の変化により候補p53調節剤が同定される。本発明の一部の実施形態では、無細胞キナーゼアッセイ系など別のアッセイ系を使用して最初に同定された候補p53調節剤を試験する二次アッセイとして、細胞増殖または細胞周期アッセイを使用することができる。また、SLC7機能が細胞増殖または細胞周期において直接役割を果たすかどうかを試験するために細胞増殖アッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてSLC7を過剰発現または過少発現する細胞で細胞増殖または細胞周期アッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した増殖または細胞周期の差により、SLC7が細胞増殖または細胞周期において直接役割を果たすことが示唆される。
【0075】
血管形成。臍帯、冠動脈、または真皮細胞など様々なヒト内皮細胞系を用いて血管形成をアッセイすることができる。適切なアッセイには、増殖を測定するアラマーブルーに基づいたアッセイ(Biosource Internationalから入手可能);血管形成エンハンサーまたはサプレッサーが存在するまたは存在しない場合の細胞が膜を通り抜ける遊走を測定するBecton Dickinson Falcon HTS FluoroBlockセルカルチャーインサートの使用など蛍光分子を用いた遊走アッセイ;Matrigel(登録商標)(Beckton Dickinson)上の内皮細胞による管状構造の形成に基づいた細管形成アッセイが含まれる。したがって、血管形成アッセイ系は、SLC7を発現する細胞、および任意選択で欠陥p53機能を有する(たとえば、野生型細胞に比べてp53が過剰発現または過少発現されている)ものを含むことができる。この血管形成アッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較した血管形成の変化により候補p53調節剤が同定される。本発明の一部の実施形態では、別のアッセイ系を使用して最初に同定された候補p53調節剤を試験する二次アッセイとして、血管形成アッセイを使用することができる。また、SLC7機能が細胞増殖において直接役割を果たすかどうかを試験するために血管形成アッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてSLC7を過剰発現または過少発現する細胞で血管形成アッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した血管形成の差により、SLC7が血管形成において直接役割を果たすことが示唆される。
【0076】
低酸素誘発。転写因子である低酸素誘発性因子−1(HIF−1)のαサブユニットは、in vitroで低酸素に曝した後に腫瘍細胞中で上方制御される。低酸素条件下では、HIF−1は、糖分解酵素やVEGFをコードする遺伝子など腫瘍細胞の生存に重要であることで知られている遺伝子の発現を刺激する。低酸素条件によるこのような遺伝子の誘発は、SLC7で形質移入させた細胞を(たとえばNapco7001インキュベーター(Precision Scientific)で発生させた0.1%のO2、5%のCO2、および残りはN2を用いた)低酸素条件下および正常酸素(normoxic)条件下で増殖させ、その後Taqman(登録商標)によって遺伝子の活性または発現を評価することによってアッセイすることができる。たとえば、低酸素誘発アッセイ系は、SLC7を発現する細胞、および任意選択で変異したp53を有する(たとえば、野生型細胞に比べてp53が過剰発現または過少発現されている)ものを含むことができる。この低酸素誘発アッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較した低酸素応答の変化により候補p53調節剤が同定される。本発明の一部の実施形態では、別のアッセイ系を使用して最初に同定された候補p53調節剤を試験する二次アッセイとして、低酸素誘発アッセイを使用することができる。また、SLC7機能が低酸素応答において直接役割を果たすかどうかを試験するために低酸素誘発アッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてSLC7を過剰発現または過少発現する細胞で低酸素誘発アッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した低酸素応答の差により、SLC7が低酸素誘発において直接役割を果たすことが示唆される。
【0077】
細胞接着。細胞接着アッセイでは、候補調節剤が存在するまたは存在しない場合の、細胞と精製した接着タンパク質との接着、または細胞の相互接着を測定する。細胞−タンパク質接着アッセイでは、細胞が精製したタンパク質に接着することを調節する作用剤の能力を測定する。たとえば、組換えタンパク質を生成し、PBSで2.5g/mLまで希釈し、マイクロタイタープレートのウェルをコーティングするのに使用する。陰性対照で使用するウェルはコーティングしない。その後、コーティングしたウェルを洗浄し、1%のBSAで遮断し、再度洗浄する。化合物を2×最終試験濃度まで希釈し、ブロッキングした、コーティングしたウェルに加える。その後、細胞をウェルに加え、結合しなかった細胞を洗い流す。カルセイン−AMなど膜透過性蛍光色素を加えることによって保持された細胞をプレート上で直接標識し、蛍光マイクロプレート読取装置でシグナルを定量する。
【0078】
細胞−細胞接着アッセイでは、ネイティブリガンドとの細胞接着タンパク質の結合を調節する作用剤の能力を測定する。これらのアッセイには、自然にまたは組換えによって選択した接着タンパク質を発現する細胞を使用する。例示的なアッセイでは、細胞接着タンパク質を発現している細胞をマルチウェルプレートのウェル内に植え付ける。リガンドを発現している細胞をBCECFなど膜透過性蛍光色素で標識し、候補剤の存在下で単層に接着させる。結合しなかった細胞を洗い流し、蛍光プレート読取装置を使用して結合した細胞を検出する。
【0079】
ハイスループット細胞接着アッセイも記載されている。このようなアッセイの1つでは、マイクロアレイスポッターを使用して小分子リガンドおよびペプチドを顕微鏡スライドの表面に結合させ、その後、未処置の細胞をスライドと接触させ、結合しなかった細胞を洗い流す。このアッセイでは、細胞系に対するペプチドおよびモジュレーターの結合特異性が決定されるだけでなく、付着した細胞の機能的細胞シグナル伝達も、マイクロチップ上で免疫蛍光技術をin situで使用して測定される(Falsey JR他、Bioconjug Chem.、2001年5-6月、12(3):346〜53)。
【0080】
抗体モジュレーターの一次アッセイ
抗体モジュレーターでは、適切な一次アッセイ試験は、SLC7タンパク質に対する抗体の親和性および特異性を試験する結合アッセイである。抗体の親和性および特異性を試験する方法は当分野で周知である(HarlowおよびLane、1988年、1999年、上掲)。SLC7に特異的な抗体を検出する好ましい方法は酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)である。他の方法には、FACSアッセイ、ラジオイムノアッセイ、および蛍光アッセイが含まれる。
【0081】
核酸モジュレーターの一次アッセイ
核酸モジュレーターでは、一次アッセイにより核酸モジュレーターがSLC7遺伝子の発現、好ましくはmRNAの発現を阻害または増強する能力を試験し得る。一般的に、発現分析には、核酸モジュレーター存在下または非存在下の細胞の類似集団(たとえば、内因的にまたは組換えによってSLC7を発現する2種の細胞プール)中のSLC7発現を比較することが含まれる。mRNAおよびタンパク質の発現を分析する方法は当分野で周知である。たとえば、ノーザンブロッティング、スロットブロッティング、RNA分解酵素保護、定量的RT−PCR(たとえばTaqMan(登録商標)、PE Applied Biosystemsを使用)、またはマイクロアレイ分析を使用して、核酸モジュレーターで処置した細胞中でSLC7 mRNAの発現が低減していることを確認することができる(たとえば、Current Protocols in Molecular Biology、1994年、Ausubel FM他編、John Wiley&Sons, Inc.、第4章;Freeman WM他、Biotechniques、1999年、26:112〜125;Kallioniemi OP、Ann Med、2001年、33:142〜147;Blohm DHおよびGuiseppi-Elie、A Curr Opin Biotechnol、2001年、12:41〜47)。タンパク質の発現をモニターすることもできる。タンパク質は、最も一般的にはSLC7タンパク質または特異的なペプチドのどちらかに対する特異的な抗体または抗血清を用いて検出される。ウエスタンブロッティング、ELISA、in situ検出を含めた様々な手段が利用可能である(Harlow EおよびLane D、1988年および1999年、上掲)。
【0082】
二次アッセイ
調節剤がp53経路に関連する様式でSLC7に影響を与えることを確認するために、二次アッセイを使用して上記の任意の方法によって同定したSLC7調節剤の活性をさらに評価することができる。本明細書中で使用するSLC7調節剤は、以前に同定した調節剤から誘導した候補臨床化合物または他の作用剤を包含する。また、二次アッセイを使用して、特定の遺伝的または生化学的経路における調節剤の活性を試験するために、あるいは調節剤がSLC7と相互作用する特異性を試験することもできる。
【0083】
二次アッセイでは一般的に、候補モジュレーター存在下または非存在下において、細胞や動物の類似集団(たとえば、内因的にまたは組換えによってSLC7を発現する2種の細胞プール)を比較する。一般的に、このようなアッセイでは、候補SLC7調節剤を用いて細胞や動物を処置することにより、処置しない(あるいはモック処置または偽薬で処置した)細胞や動物と比較してp53経路に変化がもたらされるかどうかを試験する。特定のアッセイでは、「感作させた遺伝的バックグラウンド」を使用する。本明細書中で使用する「感作させた遺伝的バックグラウンド」とは、p53または相互作用する経路における遺伝子の発現が変化するように操作した細胞や動物を表す。
【0084】
細胞に基づいたアッセイ
細胞に基づいたアッセイでは、欠陥p53機能を有することで知られている様々な哺乳動物細胞系(たとえば、とりわけアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)、バージニア州マナサスから入手可能であるSAOS−2骨芽細胞、H1299肺癌細胞、C33AおよびHT3子宮頚癌細胞、HT−29およびDLD−1大腸癌細胞)を使用してもよい。細胞に基づいたアッセイでは内因性p53経路活性を検出するか、あるいはこれはp53経路構成要素の組換えによる発現に依存し得る。前述の任意のアッセイをこの細胞に基づいた形式で使用することができる。候補モジュレーターは、通常は細胞培地に加えるが、細胞に注入するまたは任意の他の有効な手段によって送達してもよい。
【0085】
動物アッセイ
候補SLC7モジュレーターを試験するために、正常または欠陥のあるp53経路の様々な非ヒト動物のモデルを使用することができる。通常、欠陥p53経路のモデルでは、p53経路に関与する遺伝子がミスエクスプレスされる(たとえば過剰発現または発現が欠けている)ように操作された遺伝子改変動物を使用する。一般的に、アッセイには、経口投与、注入などによって候補モジュレーターを全身に送達する必要がある。
【0086】
好ましい実施形態では、新血管新生および血管形成をモニターすることによってp53経路の活性を評価する。Matrigel(登録商標)アッセイにおける、SLC7に対する候補モジュレーターの影響を試験するために、欠陥のあるp53および正常なp53を有する動物モデルを使用する。Matrigel(登録商標)は基底膜タンパク質の抽出物であり、主にラミニン、コラーゲンIV、およびヘパリン硫酸プロテオグリカンから構成される。これは、4℃の無菌的な液体として提供されるが、37℃で迅速にゲルを形成する。液体のMatrigel(登録商標)を、bFGFおよびVEGFなど様々な血管形成剤、またはSLC7を過剰発現するヒト腫瘍細胞と混合する。その後、激しい血管性応答をサポートするためにこの混合物を雌の無胸腺ヌードマウス(Taconic、ニューヨーク州ジャーマンタウン)に皮下注入(SC)する。Matrigel(登録商標)ペレットを有するマウスに、経口(PO)、腹腔内(IP)、または静脈内(IV)経路で候補モジュレーターを投薬してもよい。注入後5〜12日にマウスを安楽死させ、ヘモグロビン分析のためにMatrigel(登録商標)ペレットを回収する(Sigma plasma hemoglobin kit)。ゲルのヘモグロビン含有量は、ゲル中の新血管新生の程度と相関していることが判明した。
【0087】
別の好ましい実施形態では、SLC7における候補モジュレーターの効果を腫瘍形成アッセイによって評価する。一例では、異種移植ヒト腫瘍をSCで、既存の腫瘍由来またはin vitro培養物由来のいずれかの単一細胞懸濁液として、6〜7週齢の雌の無胸腺マウスに移植する。内因的にSLC7を発現する腫瘍を、マウス1匹あたり1×105〜1×107個の細胞を100μLの体積で、27ゲージの針を用いて脇腹に注入する。その後、マウスの耳に札をつけ、週2回腫瘍を測定した。平均腫瘍重量が100mgに達した日に候補モジュレーターによる処置を開始した。候補モジュレーターは、ボーラス投与によってIV、SC、IP、またはPOで送達される。それぞれの独特な候補モジュレーターの薬理動態に応じて、1日に複数回投薬を行うことができる。腫瘍の重量を、カリパーを用いて垂直直径を測定することによって評価し、2つの次元の直径の測定値を掛け合わせることによって計算した。実験の最後に、切除した腫瘍をさらなる分析用のバイオマーカーの同定に利用することができる。免疫組織化学染色では、異種移植腫瘍を4%のパラホルムアルデヒド、0.1Mのリン酸、pH7.2で6時間、4℃に固定し、PBS中30%のショ糖に浸し、液体窒素で冷却したイソペンタン中で迅速に凍結させる。
【0088】
診断および治療上の使用
特異的なSLC7調節剤は、疾病または疾病予後が血管形成、アポトーシス、または増殖疾患などp53経路の欠陥に関連している様々な診断および治療用途に有用である。したがって、本発明は、SLC7活性を特異的に調節する作用剤を細胞に投与するステップを含む、細胞、好ましくは(たとえば、p53の過剰過剰、過小発現、またはミスエクスプレッション、あるいは遺伝子突然変異に起因する)欠陥p53機能を有することが事前に確定されている細胞におけるp53経路を調節する方法も提供する。好ましくは、調節剤は細胞中に検出可能な表現型の変化を生じさせ、これにより、p53機能が修復されたことが示される。「機能が修復された」という語句、および等価な表現は、本明細書では、所望の表現型が達成されたこと、または処理されていない細胞と比較して正常に近い状態になったことを意味する。たとえば、p53機能が修復されると、細胞増殖および/または細胞周期の進行が正常化するか、または未処理細胞と比較して正常に近い状態になる。本発明はまた、p53経路を調節するSLC7調節剤を治療上有効な量で投与することによる、損傷したp53機能に関連する疾患および疾病の治療方法を提供する。本発明は、さらに、細胞、好ましくは欠陥または損傷SLC7機能を持つと予め判断された細胞において、SLC7調節剤を投与することにより、SLC7機能を調節する方法を提供する。加えて、本発明は、SLC7調節剤を治療上有効な量で投与することにより、損傷SLC7機能に関する疾患または疾病の治療する方法を提供する。ある実施形態では、損傷したSLC7機能が損傷したSLC7A5またはSLC7A11に起因するものである。
【0089】
SLC7がp53経路に関係しているという発見により、p53経路の欠陥に関与する疾病および疾患の診断および予後評価、ならびにこのような疾病および疾患の素因を有する対象の同定に使用可能な様々な方法が提供される。
【0090】
特定の試料でSLC7が発現されるかどうかを診断するために、ノーザンブロッティング、スロットブロッティング、RNA分解酵素保護、定量的RT−PCR、およびマイクロアレイ分析など様々な発現分析方法を使用することができる(たとえば、Current Protocols in Molecular Biology、1994年、Ausubel FM他編、John Wiley&Sons, Inc.、第4章;Freeman WM他、Biotechniques、1999年、26:112〜125;Kallioniemi OP、Ann Med、2001年、33:142〜147;BlohmおよびGuiseppi-Elie、Curr Opin Biotechnol、2001年、12:41〜47)。SLC7を発現する欠陥p53シグナル伝達に関係づけられている疾病または疾患を有する組織は、SLC7調節剤を用いた処置を受け入れることが同定されている。好ましい用途では、p53欠陥組織は正常組織に比べてSLC7を過剰発現する。たとえば、完全または部分SLC7 cDNA配列をプローブとして使用した、腫瘍および正常細胞系由来、または腫瘍および同一患者からの対応する正常組織試料由来のmRNAのノーザンブロット分析により、具体的な腫瘍がSLC7を発現または過剰発現するかどうかを決定することができる。あるいは、細胞系、正常組織および腫瘍試料中のSLC7発現の定量的RT−PCR分析のために、TaqMan(登録商標)を使用する(PE Applied Biosystems)。
【0091】
たとえばSLC7オリゴヌクレオチドなどの試薬、およびSLC7に対する抗体を利用して、上に記載した(1)SLC7遺伝子変異の存在の検出、または疾患でない状態と比較したSLC7 mRNAの過剰発現または過少発現のいずれかの検出、(2)疾患でない状態と比較したSLC7遺伝子産物の過剰存在または過少存在のいずれかの検出、ならびに(3)SLC7に媒介されたシグナル伝達経路における摂動または異常の検出のために、様々な他の診断方法を実施することができる。
【0092】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、(a)患者から生体試料を得ること、(b)試料をSLC7発現用のプローブと接触させること、(c)ステップ(b)からの結果を対照と比較すること、および(d)ステップ(c)が疾病または疾患の可能性を示しているかどうかを決定することを含む、SLC7発現の変化に起因する患者の疾病または疾患を診断する方法を対象としている。好ましくは、この疾病は癌であり、最も好ましくは表1に示す癌である。プローブは、DNAまたは抗体を含めたタンパク質のどちらであってもよい。
【実施例】
【0093】
以下の実験セクションおよび実施例は、限定ではなく例示のために提供するものである。
【0094】
I.ショウジョウバエp53のスクリーニング
痕跡翅マージンクアドラントエンハンサー(vestigial margin quadrant enhancer)を用いて、ショウジョウバエのp53遺伝子を翅中に特異的に過剰発現させた。ショウジョウバエのp53の量を増加させることにより(様々な強度のトランスジェニックインサートを1または2コピー使用して力価を測定)、翅毛のパターンおよび極性が破壊されること、翅脈が短縮および肥厚されること、翅に進行的なしわが寄ること、翅翼(wing blade)に暗色の「死」の封入体が現れることを含む表現型を伴う、正常な翅形態の中程度から強度の劣化が引き起こされた。ショウジョウバエのp53のエンハンサーおよびサプレッサーを同定するために設計されたスクリーニングでは、p53を2コピー保有しているホモ接合性の雌を、piggyBacトランスポゾンの無作為なインサートを含む5633雄と交配させた(Fraser M他、Virology、1985年、145:356〜361)。p53表現型の亢進または抑制について、インサートを含む子孫をインサートを含まない兄弟子孫(sibling progeny)と比較した。piggyBac挿入部位の周囲の配列情報を使用してモディファイヤー遺伝子を同定した。翅の表現型のモディファイヤーはp53経路のメンバーとして同定された。CG1607は翅の表現型のエンハンサーであった。このモディファイヤーのヒトにおけるオルソログを、本明細書中ではSLC7と呼ぶ。
【0095】
BLAST分析(Altschul他、上掲)を行ってショウジョウバエのモディファイヤーのターゲットを同定した。例えば、SLC7Aの代表的配列GI#4519803、4507053、4507055、14751168、7657591、9790235、7657683および13654280(それぞれ配列番号38、40、42、44、46、47、49および50)は、ショウジョウバエCG1607と、それぞれ49%、48%、47%、49%、42%、43%、44%および57%のアミノ酸同一性を共有している。
【0096】
タンパク質の様々なドメイン、シグナル、および機能的サブユニットを、PSORT(Nakai K.およびHorton P.、Trends Biochem Sci、1999年、24:34-6; Kenta Nakai、Protein sorting signals and prediction of subcellular localization, Adv. Protein Chem. 54, 277-344、2000年)、PFAM(Bateman A.他、Nucleic Acids Res、1999年、27:260-2; http://pfam.wustl.edu)、SMART(Ponting CP他、SMART: identification and annotation of domains from signaling and extracellular protein sequences. Nucleic Acids Res.、1999年1月 1;27(1):229-32)、TM−HMM(Erik L.L. Sonnhammer, Gunnar von Heijne、およびAnders Krogh: A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences. In Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, P175-182 Ed J. Glasgow, T. Littlejohn, F. Major, R. Lathrop, D. Sankoff, and C. Sensen Menlo Park, CA: AAAI Press、1998年)、およびクラスト(clust)(Remm MおよびSonnhammer E. Classification of transmembrane protein families in the Caenorhabditis elegans genome and identification of human orthologs. Genome Res. 2000年11月;10(11):1679-89)プログラムを使用して分析した。例えば、PFAMを使用して、SLC7の代表的な配列(GI#4519803、配列番号38)、(GI#4507053、配列番号40)、(GI#4507055、配列番号42)、(GI#14751168、配列番号44)、(GI#7657591、配列番号46)、(GI#9790235、配列番号47)および(GI#7657683、配列番号49)のパーミアーゼドメインは、それぞれアミノ酸46−481、41−467、33−468、36−474、26−462、36−471および40−475に位置している。
【0097】
II.ハイスループットのIn Vitro蛍光偏光アッセイ
蛍光標識したSLC7ペプチド/基質を、試験緩衝液(10mMのHEPES、10mMのNaCl、6mMの塩化マグネシウム、pH7.6)中の試験剤と共に96ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。Fluorolite FPM−2 Fluorescence Polarization Microtiter System(Dynatech Laboratories,Inc)を用いて決定した蛍光偏光の対照値に対する変化により、試験化合物がSLC7活性の候補モディファイヤーであることが示される。
【0098】
III.ハイスループットのIn Vitro結合アッセイ
33P標識のSLC7ペプチドを、試験剤と共にアッセイ緩衝液(100mMのKCl、20mMのHEPES pH7.6、1mMのMgCl2、1%のグリセロール、0.5%のNP−40、50mMのβ−メルカプトエタノール、1mg/mlのBSA、プロテアーゼ阻害剤の反応混液)中で、Neutralite−アビジンでコーティングしたアッセイプレートに加え、25℃で1時間インキュベートした。その後、ビオチン標識した基質を各ウェルに加え、1時間インキュベートした。PBSで洗浄することによって反応を停止させ、シンチレーション計数器で計数した。試験剤を用いない対照に比べて活性に変化を引き起こさせる試験剤が、候補p53調節剤として同定された。
【0099】
IV.免疫沈降および免疫ブロッティング
形質移入させたタンパク質の共沈では、SLC7タンパク質を含む3×106個の適切な組換え細胞を10cmのディッシュに植え付け、発現用コンストラクトを用いて次の日に形質移入させた。空ベクターを加えることによって、それぞれの形質移入で総DNA量を一定に保った。24時間後、細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水で1回洗浄し、50mMのHepes、pH7.9、250mMのNaCl、20mMのグリセロホスフェート、1mMのオルトバナジン酸ナトリウム、5mMのp−ニトロフェニルリン酸、2mMのジチオスレイトール、プロテアーゼ阻害剤(complete、Roche Molecular Biochemicals)、および1%のノニデットP−40を含む溶解緩衝液1ml中、氷上で20分間溶解させた。15,000×g、15分間の遠心分離2回によって、細胞細片を取り除いた。細胞溶解物を25μlのM2ビーズ(Sigma)と共に2時間、4℃で緩やかに揺り動かしながらインキュベートした。
【0100】
溶解緩衝液でよく洗浄した後、SDS試料緩衝液中で煮沸することによってビーズに結合したタンパク質を溶解させ、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画し、ポリ二フッ化ビニリデン膜に移し、標識した抗体を用いてブロットした。適切な二次抗体に結合した西洋わさびペルオキシダーゼおよび高感度化学発光(ECL)ウエスタンブロッティング検出システム(Amersham Pharmacia Biotech)によって、反応性のあるバンドを可視化させた。
【0101】
V.発現分析
以下の実験で使用したすべての細胞系はNCI(米国立癌センター)の系であり、ATCC(アメリカンタイプカルチャーコレクション、バージニア州マナサス、20110−2209)から入手可能である。正常組織および腫瘍組織は、Impath、UC Davis、Clontech、Stratagene、およびAmbionから得た。
【0102】
様々な試料中における開示した遺伝子の発現レベルを評価するために、TaqMan分析を使用した。
【0103】
Qiagen(カリフォルニア州バレンシア)のRNeasy kitを使用し、製造者のプロトコルに従って各組織試料からRNAを抽出して最終濃度50ng/μlにした。その後、ランダムの六量体および各反応500ngの全RNAを使用して、Applied Biosystems(カリフォルニア州フォスターシティー、http://www.appliedbiosystems.com/)のプロトコル4304965に従ってRNA試料を逆転写させることによって一本鎖cDNAを合成した。
【0104】
TaqManプロトコルならびに以下の基準に従って、TaqManアッセイ(Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティー)を使用した発現分析用のプライマーを調製した。その基準は、a)ゲノムの混入を排除するために、イントロンにまたがるようにプライマーの対を設計すること、およびb)各プライマーの対が1つの産物のみを生成することである。
【0105】
製造者のプロトコルに従って、300nMのプライマーおよび250nMのプローブならびに約25ngのcDNAを、96ウェルプレートでは25μlの全体積、384ウェルプレートでは10μlの全体積で使用して、Taqman反応を実施した。標的が大量に存在する可能性が高くなるように広範囲の組織由来のcDNAを含む混合物である、ヒトcDNA試料のユニバーサルプール(universal pool)を使用して結果分析用の標準曲線を作成した。18SのrRNA(すべての組織および細胞中で普遍的に発現される)を使用して生データを正規化した。
【0106】
それぞれの発現分析について、腫瘍組織試料を、同一患者からの対応する正常組織と比較した。対応する正常試料と比べて腫瘍中の遺伝子発現レベルが2倍以上高い場合に、ある遺伝子は腫瘍中で過剰発現されているとみなされる。正常組織が入手可能でない場合は、cDNA試料のユニバーサルプールを代わりに使用する。これらの場合では、腫瘍試料と同じ組織タイプからのすべての正常試料の平均との発現レベルの差が、すべての正常試料の標準偏差(すなわち、腫瘍−平均(すべての正常試料)>2×STDEV(すべての試料))の2倍を超える場合に、遺伝子は腫瘍試料中で過剰発現されているとみなされる。
【0107】
結果を表1に示す。太字で表したデータは、第1列に示した組織タイプの試験した腫瘍試料のうち50%を超えるものが正常試料に比べて列1に記載した遺伝子を過剰発現したことを示す。下線を引いたデータは、試験した腫瘍試料のうち25%〜49%が過剰発現を示したことを示す。遺伝子が過剰発現されている腫瘍に投与することによって、本明細書中に記載したアッセイによって同定されたモジュレーターの治療上の効果をさらに検証することができる。腫瘍増殖の低下により、モジュレーターの治療上の有用性が確認される。患者から腫瘍試料を得、モジュレーターが標的としている遺伝子の発現をアッセイすることによって、モジュレーターを用いて患者を処置する前に患者が処置に応答する可能性を診断することができる。この遺伝子(または複数の遺伝子)の発現データも、疾病の進行を診断する上でのマーカーとして使用することができる。このアッセイは、上記の発現分析によって、遺伝子標的に対する抗体によって、または任意の他の利用可能な検出方法によって実施することができる。
【0108】
【表1】
【0001】
(関連出願への言及)
本出願は、2001年6月5日出願の米国特許仮出願第60/296,076号、2001年10月10日出願の米国特許仮出願第60/328,605号、2001年10月22日出願の米国特許仮出願第60/338,733号、2002年2月15日出願の米国特許仮出願第60/357,253号、および2002年2月15日出願の米国特許仮出願第60/357,600号の優先権を主張するものである。先の出願の内容は、その全体が本明細書中に組み込まれる。
【0002】
(発明の背景)
p53遺伝子は、家族性および自発性の癌を含めた50種類を超える種類の異なるヒト癌にわたって変異しており、ヒト癌の中で最も広く変異した遺伝子であると考えられている(ZambettiおよびLevine、FASEB、1993年、7:855〜865;Hollstein他、Nucleic Acids Res.、1994年、22:3551〜3555)。p53遺伝子中の変異のうち90%を超えるものが、p53機能を不活性化させる、単一アミノ酸を変化させるミスセンス変異である。ヒトp53の異常型は、予後不良、より活動性の高い腫瘍、転移、および短期生存率に関連している(Mitsudomi他、Clin Cancer Res、2000年10月、6(10):4055〜63;Koshland、Science、1993年、262:1953)。
【0003】
ヒトp53タンパク質は通常、DNA損傷、低酸素症、ヌクレオチド欠乏、および発癌遺伝子活性化を含めたシグナルの中枢インテグレーター(central integrator)として機能する(Prives、Cell、1998年、95:5〜8)。これらのシグナルに応答して、p53タンパク質レベルが大きく上昇し、その結果、蓄積したp53がこれらシグナルの性質および強度に応じて細胞周期抑止またはアポトーシスを活性化させる。実際、複数系統の実験的証拠により、腫瘍抑制因子としてのp53の主要な役割が指摘された(Levine、Cell、1997年、88:323〜331)。たとえば、ホモ接合性のp53「ノックアウト」マウスでは、発生は正常であるが、生後1年のうちにほぼ100%の新組織形成の発生率が示された(Donehower他、Nature、1992年、356:215〜221)。
【0004】
正常細胞および癌細胞内でp53が機能する生化学的機構および経路は完全には分かっていないが、p53機能の明らかに重要な一面は、遺伝子特異的な転写活性化因子としての活性である。既知のp53応答エレメントを有する遺伝子の中には、GADD45、p21/Waf1/Cip1、サイクリンG、Bax、IGF−BP3、およびMDM2を含めた、細胞周期またはアポトーシスのいずれかの制御における役割がよく特徴づけられたものが、いくつか存在する(Levine、Cell、1997年、88:323〜331)。
【0005】
細胞膜を越えてのアミノ酸の輸送は、特定の細胞だけでなく局所的および全体的な要求に適合される。例えば、活性アミノ酸の取り込みは細胞の成長に必要である。糖タンパク質関連アミノ酸トランスポーターの新規ファミリーの様々なメンバー、すなわちヘテロ二量体アミノ酸トランスポーターまたは溶質担体ファミリー7(SLC7)の軽いサブユニットが同定されており、塩基性および中性アミノ酸の細胞性取り込みおよび/または側底放出に機能することが示されている(Rossier G他、1999年、J Biol Chem, 274: 34948-34954)。これら12の膜貫通ドメインを有するパーミアーゼ関連タンパク質は、その機能を発現するためには、4F2hc(4F2重鎖)またはrBATなどのII型重鎖糖タンパク質とのヘテロ二量体化を必要とする。糖タンパク質関連アミノ酸トランスポーターと、4F2hcまたは場合によってはrBATとの結合は、トランスポーターが細胞表面に到達するための必要条件である(Mastroberardino L, 他、1998年、Nature 395:288-291)。例えば、上皮組織内での4F2hcサブユニットの輸送により、トランスポーターにより中性または陽イオンアミノ酸の血液への放出が可能となる側底位置が確保される(Broer A他、2000年、Biochem. J. 349:787-795; Verrey F他、1999年、J Membr Biol. 172:181-192; Christensen HN、1990年、Physiol Rev. 70:43-77; Broer S、1998年、Nova Acta Leopoldinana 306:79-91)。
【0006】
トランスポーターのSLC7ファミリーのメンバーは進化的に保存されている。大腸癌に対してSLC7A5(LAT1)が関係している可能性が報告されている(Wolf D他、1996年、Cancer Res. 56:5012-5022)。SLC7A7はLPI(リジン尿性タンパク不耐症)に関係している(Torrents D他、1999年、Nature Genet 21:293-296; Borsani G他、1999年、Nature Genet 21:297-301)。さらに、メンバーLSC7A9およびSLC7A10は、シスチン尿症に関係している(Feliubadalo L他、1999年、Nat Genet. 23:52-57; Leclerc D他、2001年、Mol Genet Metab. 73:333-339)。
【0007】
ショウジョウバエなどモデル生物のゲノムを操作できると、顕著な進化的保存の数により複雑な脊椎動物との直接の関連性を有する生化学プロセスを分析する、強力な手段が提供される。遺伝子および経路の保存レベルが高いこと、細胞プロセスの類似性が高いこと、ならびにこれらモデル生物と哺乳動物との間で遺伝子の機能が保存されていることにより、特定の経路における新規遺伝子の関与およびこのようなモデル生物中におけるその機能の同定は、哺乳動物中における相関経路およびこれらを調節する方法を理解するのに直接寄与することができる(たとえば、Mechler BM他、1985年、EMBO J、4:1551〜1557;Gateff E.、1982年、Adv.Cancer Res.、37:33〜74;Watson KL.他、1994年、J Cell Sci.、18:19〜33;Miklos GLおよびRubin GM.、1996年、Cell、86:521〜529;Wassarman DA他、1995年、Curr Opin Gen Dev、5:44〜50;Booth DR.、1999年、Cancer Metastasis Rev.、18:261〜284参照)。たとえば、目に見える表現型がもたらされる遺伝子の過少発現(たとえばノックアウト)または過剰発現(「遺伝的エントリーポイント(genetic entry point)」と呼ばれる)を有する脊椎モデル生物で、遺伝子スクリーニングを行うことができる。追加の遺伝子を、無作為にまたは標的を定めた方式で変異させる。ある遺伝子の変異によって遺伝的エントリーポイントにより引き起こされた最初の表現型が変化する場合、この遺伝子は、遺伝的エントリーポイントと同じまたは重複する経路に関与する「モディファイヤー」として同定される。遺伝的エントリーポイントがp53などの疾病経路に関係づけられているヒト遺伝子のオルソログである場合、新規の治療薬の魅力的な候補標的となり得るモディファイヤー遺伝子を同定することができる。
【0008】
参照したGenbank識別番号およびウェブサイトの参照を含めた本明細書中で引用するすべての参考文献は、その全体として本明細書中に組み込まれる。
【0009】
(発明の概要)
本発明者らは、ショウジョウバエでp53経路を改変させる遺伝子を発見し、ヒトにおけるそのオルソログを同定し、本明細書中では以降これをSLC7sと呼ぶ。本発明は、これらのp53モディファイヤー遺伝子およびポリペプチドを利用して、欠陥または損傷p53および/またはSLC7機能に関連する疾患の治療に使用できる候補治療剤であるSLC7調整剤(modulating agent)を同定する方法を提供する。好ましいSLC7調節剤は、SLC7ポリペプチドに特異的に結合してp53機能を修復する。他の好ましいSLC7調節剤は、アンチセンスオリゴマーなど核酸モジュレーターや、たとえば対応する核酸(すなわちDNAまたはmRNA)に結合してそれを阻害することによってSLC7遺伝子発現または生成物の活性を抑制するRNAiである。
【0010】
SLC7調節剤は、SLC7ポリペプチドまたは核酸との分子相互作用のための任意の都合のよいin vitroまたはin vivoのアッセイによって評価することができる。一実施形態では、SLC7ポリペプチドまたは核酸を含むアッセイ系を用いて候補SLC7調節剤を試験する。好ましい一実施形態では、SLC7ポリペプチドまたは核酸は、SLC7A5またはSLC7A11である。対照と比べてアッセイ系の活性に変化を生じさせる候補作用剤は、候補p53調節剤として同定される。このアッセイ系は細胞に基づくものでも、細胞を含まないものでもよい。SLC7調節剤には、SLC7関連タンパク質(たとえばドミナントネガティブ変異体やバイオ治療薬);SLC7に特異的な抗体;SLC7に特異的なアンチセンスオリゴマーおよび他の核酸モジュレーター;SLC7に特異的に結合するかまたは相互作用する(たとえばSLC7結合パートナーに結合することにより)化学剤が含まれる。特定の一実施形態では、トランスポーターアッセイを用いて小分子モジュレーターを同定する。特定の実施形態では、スクリーニングアッセイは、結合アッセイ、アポトーシスアッセイ、細胞増殖アッセイ、血管形成アッセイ、および低酸素誘発アッセイから選択される。
【0011】
別の実施形態では、最初に同定した候補作用剤や最初の作用剤から誘導した作用剤によって生じた血管形成、アポトーシス、または細胞増殖の変化など、p53経路における変化を検出する第2アッセイ系を使用して、候補p53経路調節剤をさらに試験する。第2アッセイ系には、培養細胞または非ヒト動物を使用することができる。特定の実施形態では、この二次アッセイ系は、血管形成、アポトーシス、または細胞増殖の疾患(たとえば癌)などp53経路に関係づけられた疾病または疾患を有することが事前に確定されている動物を含めた、非ヒト動物を使用する。
【0012】
本発明はさらに、哺乳動物細胞をSLC7ポリペプチドまたは核酸に特異的に結合する作用剤と接触させることによって、哺乳動物細胞中のp53経路および/またはSLC7機能を調節する方法を提供する。好ましい実施形態では、SLC7ポリペプチドまたは核酸はSLC7A5またはSLC7A11である。この作用剤は、小分子モジュレーター、核酸モジュレーター、または抗体であってよく、p53経路に関連する病状を有することが事前に確定されている哺乳動物に投与することができる。
【0013】
(発明の詳細な記載)
翅中にp53が過剰発現されていたショウジョウバエにおけるp53経路のモディファイヤーを同定するために、遺伝子モディファイヤースクリーニングを設計した(Ollmann M他、Cell、2000年、101:91〜101)。CG1607遺伝子は、p53経路のモディファイヤーとして同定された。したがって、これらモディファイヤーの脊椎動物のオルソログ、好ましくはヒトのオルソログであるSLC7遺伝子(すなわち核酸およびポリペプチド)は、癌など欠陥p53シグナル伝達経路に関連する病状の治療における魅力的な薬剤標的である。
【0014】
本発明では、SLC7機能を評価するin vitroおよびin vivoの方法を提供する。SLC7またはその対応する結合パートナーの変調は、正常状態および病態におけるp53経路とそのメンバーとの関連性を理解し、p53に関連する病状の診断方法および治療様式を開発するのに有用である。本発明で提供する方法を使用して、直接的または間接的に、たとえば輸送活性または結合活性などのSLC7機能に影響を与えてSLC7の発現を阻害または亢進することによって作用するSLC7調節剤を同定することができる。SLC7調節剤は、診断、治療、および製薬の開発に有用である。
【0015】
本発明の核酸およびポリペプチド
本発明で使用することができるSLC7核酸およびポリペプチドに関連する配列は、核酸はGI#13649338(配列番号1)、GI#19923169(配列番号2)、GI#14424513(配列番号4)、GI#3639057(配列番号5)、GI#181907(配列番号6)、GI#7706245(配列番号7)、GI#13647529(配列番号8)、GI#4507052(配列番号9)、GI#13111751(配列番号11)、GI#6642957(配列番号13)、GI#6642959(配列番号14)、GI#6912269(配列番号15)、GI#9187132(配列番号17)、GI#9187131(配列番号18)、GI#6179884(配列番号19)、GI#4581469(配列番号20)GI#5823977(配列番号21)、GI#1476395(配列番号22)、GI#7657590(配列番号23)、GI#10863043(配列番号25)、GI#9790234(配列番号26)、GI#18490890(配列番号28)、GI#13924719(配列番号29)、GI#7657682(配列番号30)、GI#18141306(配列番号31)、GI#18557166(配列番号32)、GI#13516845(配列番号34)、GI#13654279(配列番号35)、およびGI#14775898(配列番号36)、ポリペプチドはGI#11432073(配列番号37)、GI#4519803(配列番号38)、GI#7706246(配列番号39)、GI#4507053(配列番号40)、GI#13111752(配列番号41)、GI#4507055(配列番号42)、GI#12643348(配列番号43)、GI#14751168(配列番号44)、GI#5823978(配列番号45)、GI#7657591(配列番号46)、GI#9790235(配列番号47)、GI#13924720(配列番号48)、GI#7657683(配列番号49)、およびGI#13654280(配列番号50)として、Genbankに開示されている(Genbank識別(GI)番号により参照)。これらに加えて、配列番号3、10、12、16、24、27、33および51ないし53の核酸配列、および配列番号54のアミノ酸配列も本発明において使用できる。
【0016】
SLC7は、パーミアーゼドメインを有する膜輸送タンパク質である。用語「SLC7ポリペプチド」とは、完全長のSLC7タンパク質またはその機能的に活性のある断片または誘導体を言う。「機能的に活性のある」SLC7断片または誘導体は、抗原活性や免疫原性活性、酵素活性、天然の細胞基質に結合する能力など完全長の野生型SLC7タンパク質に関連する機能活性を1つまたは複数示す。SLC7タンパク質、誘導体および断片の機能活性は、当業者に周知の様々な方法によって(Current Protocols in Protein Science、1998年、Coligan他編、John Wiley & Sons, Inc.、ニュージャージー州ソマーセット)また以下にさらに述べるようにアッセイすることができる。本発明の目的のために、機能的に活性のある断片には、パーミアーゼドメインや結合ドメインなどSLC7の構造ドメインを1つまたは複数含む断片も含まれる。タンパク質ドメインは、PFAMプログラムを使用して同定することができる(Bateman A.他、Nucleic Acids Res、1999年、27:260〜2;http://pfam.wustl.edu)。たとえば、GI#4519803(配列番号38)のSLC7A5のパーミアーゼドメインはほぼアミノ酸残基46〜481に位置している(PFAM00324)。SLC7ポリペプチドを得る方法も、以下にさらに記載する。一部の実施形態では、好ましい断片は、機能的に活性のある、配列番号37から50のいずれか1つ(SLC7)の少なくとも25個の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも50個、より好ましくは75個、最も好ましくは100個の連続したアミノ酸を含むドメイン含有断片である。さらに好ましい実施形態では、この断片はパーミアーゼ(の機能的に活性のある)ドメインの全体を含む。
【0017】
用語「SLC7核酸」とは、SLC7ポリペプチドをコードするDNAまたはRNA分子を言う。好ましくは、このSLC7ポリペプチドまたは核酸あるいはその断片はヒト由来であるが、SLC7と少なくとも70%の配列同一性、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは85%、さらに好ましくは90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するオルソログまたはその誘導体でもよい。通常、異なる種のオルソログは、1つ以上のタンパク質モチーフの存在および/または3次元構造のために、同じ機能を保持している。一般に、オルソログは、通常タンパク質ベイトシーケンスを使用し、BLAST分析シーケンス相同分析により同定される。フォワードBLAST結果のうち最も合致するシーケンスが、リバースBLASTの元のクエリシーケンスを取り出すのであれば、シーケンスを潜在的オルソログとして指定する(Huynen MAおよびBork P, Proc Natl Acad Sci、1998年、95:5849-5856; Huynen MA他、Genome Research、2000年、10:1204-1210)。CLUSTAL(Thompson JD他、1994年、Nucleic Acids Res 22:4673-4680)など、多重シーケンス整列のためのプログラムを使用して、オルソログのタンパク質の保存域および/または残基をハイライトし、系統樹を作成してもよい。多様種の多重相同シーケンス(例えばBLAST分析により取り出されたもの)を表す系統樹において、2種のオルソログシーケンスは、それら2種のそれ以外の全シーケンスに対し、系統樹中最も接近して現われる。構造のスレッディング、またはタンパク質の折りたたみのその他分析法(例えばProCeryon(バイオサイエンス、オーストリア国ザルツブルク)を使用したもの)により潜在的なオルソログを同定してもよい。進化において、種分化に続いて遺伝子重複が起こるとき、ショウジョウバエなど単一種の単一遺伝子は、ヒトなど別の種の複数の遺伝子に対応する場合がある(パラログ)。本明細書において、「オルソログ」という表現は、パラログも含む。対象配列または対象配列の特定の一部分に関して本明細書中で使用する「パーセント(%)配列同一性」とは、配列のアラインメントを行い、最大のパーセント配列同一性を得るために必要な場合はすべての検索パラメータを初期値に設定したプログラムWU−BLAST−2.0a19(Altschul他、J.Mol.Biol.、1997年、215:403〜410;http://blast.wustl.edu/blast/README.html)によって作成されたギャップを導入した後の、対象配列(またはその特定の一部分)中のヌクレオチドやアミノ酸と同一である候補誘導体の配列中のヌクレオチドやアミノ酸の割合として定義される。HSP SおよびHSP S2パラメータは動的値であり、プログラム自体により、具体的な配列の組成と、目的配列と比較して検索する個々のデータベースの組成とに応じて確定される。%同一性値は、一致する同一ヌクレオチドまたはアミノ酸の数を、パーセント同一性が報告される対象となる配列の長さで割ることによって決定される。「パーセント(%)アミノ酸配列類似性」は、%アミノ酸配列同一性の決定と同じ計算を行うが、同一アミノ酸に加えて保存的アミノ酸置換を含めて算定することによって決定される。
【0018】
保存的アミノ酸置換とは、タンパク質のフォールディングや活性が顕著に影響されないように、あるアミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸で置換される置換である。互いに置換できる芳香族アミノ酸はフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンであり、互換性のある疎水性アミノ酸はロイシン、イソロイシン、メチオニン、およびバリンであり、互換性のある極性アミノ酸はグルタミンおよびアスパラギンであり、互換性のある塩基性アミノ酸はアルギニン、リジンおよびヒスチジンであり、互換性のある酸性アミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸であり、互換性のある小さいアミノ酸はアラニン、セリン、スレオニン、システインおよびグリシンである。
【0019】
あるいは、核酸配列のアラインメントは、SmithおよびWatermanの局所相同性アルゴリズムによって提供される(SmithおよびWaterman、1981年、Advances in Applied Mathematics、2:482〜489;database:European Bioinformatics Institute http://www.ebi.ac.uk/MPsrch/;SmithおよびWaterman、1981年、J.of Molec.Biol.、147:195〜197;Nicholas他、1998年、「A Tutorial on Searching Sequence Databases and Sequence Scoring Methods」(www.psc.edu)およびこれに引用される参考文献であるW.R.Pearson、1991年、Genomics、11:635〜650)。このアルゴリズムは、Dayhoffによって開発され(Dayhoff:Atlas of Protein Sequences and Structure、M.O.Dayhoff編、第5補遺、3:353〜358、National Biomedical Research Foundation、米国ワシントンD.C.)、Gribskovによって正規化された(Gribskov、1986年、Nucl.Acids Res.14(6):6745〜6763)スコアマトリックス(scoring matrix)を使用することによって、アミノ酸配列に適用することができる。スコアをつけるのに初期パラメータを用いたSmith−Watermanアルゴリズムを使用することができる(たとえば、ギャップ隙間ペナルティー(gap open penalty)12、ギャップ伸張ペナルティー(gap extension penalty)2)。作成されたデータでは、「一致」値は「配列同一性」を反映している。
【0020】
対象核酸分子から誘導した核酸分子には、配列番号1ないし36のいずれかの核酸配列とハイブリダイズする配列が含まれる。ハイブリダイゼーションの緊縮性は、温度、イオン強度、pH、ならびにハイブリダイズおよび洗浄中にホルムアミドなど変性剤を存在させることによって調節することができる。日常的に使用される条件は、容易に入手可能な手順書に記載されている(たとえば、Current Protocol in Molecular Biology、第1巻、第2.10章、John Wiley&Sons, Publishers、1994年;Sambrook他、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor、1989年)。一部の実施形態では、本発明の核酸分子は、6×単位強度クエン酸(single strength citrate)(SSC)(1×SSCは0.15MのNaCl、0.015Mのクエン酸Na、pH7.0である)、5×デンハルト溶液、0.05%のピロリン酸ナトリウムおよび100μg/mlのニシン精子DNAを含む溶液中で、核酸を含むフィルターを8時間〜終夜、65℃でプレハイブリダイゼーションを行うこと;6×SSC、1×デンハルト溶液、100μg/mlの酵母tRNAおよび0.05%のピロリン酸ナトリウムを含む溶液中で、18〜20時間、65℃でハイブリダイゼーションを行うこと、および;0.2×SSCおよび0.1%のSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を含む溶液で、65℃で1時間フィルターを洗浄することを含むストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号1ないし36のいずれか1つのヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズすることができる。
【0021】
他の実施形態では、35%のホルムアミド、5×SSC、50mMのTris−HCl(pH7.5)、5mMのEDTA、0.1%のPVP、0.1%のフィコール、1%のBSA、および500μg/mlの変性サケ精子DNAを含む溶液中で、核酸を含むフィルターを6時間、40℃で前処理すること;35%のホルムアミド、5×SSC、50mMのTris−HCl(pH7.5)、5mMのEDTA、0.02%のPVP、0.02%のフィコール、0.2%のBSA、100μg/mlのサケ精子DNA、および10%(重量/体積)のデキストラン硫酸を含む溶液中で、18〜20時間、40℃でハイブリダイゼーションを行うこと;次いで、2×SSCおよび0.1%のSDSを含む溶液で2度、1時間55℃で洗浄することを含む、中程度の緊縮性のハイブリダイゼーション条件を使用する。
【0022】
あるいは、20%のホルムアミド、5×SSC、50mMのリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハルト溶液、10%のデキストラン硫酸、および20μg/mlの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中で、8時間〜終夜、37℃でインキュベートすること;同じ緩衝液中で18〜20時間、ハイブリダイゼーションを行うこと、および;1×SSCで、約37℃で1時間フィルターを洗浄することを含む、低い緊縮性の条件を使用することができる。
【0023】
SLC7核酸およびポリペプチドの単離、生成、発現、およびミスエクスプレッション
SLC7核酸およびポリペプチドは、SLC7機能を調節する薬剤の同定および試験、ならびにp53経路におけるSLC7の関与に関連する他の用途に有用である。SLC7核酸ならびにその誘導体およびオルソログは、当業者に周知の方法を使用して得ることができる。たとえば、DNAライブラリをスクリーニングすることによって、またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用することによって、目的のcDNAまたはゲノムDNA配列を単離する技術が、当分野で周知である。一般的に、タンパク質の具体的な使用により、発現、生成、および精製方法の詳細が規定される。たとえば、スクリーニングして調節剤を探すために使用するタンパク質を生成するには、これらタンパク質の特異的生物活性を保存する方法が必要であるかもしれないが、抗体を産生するためのタンパク質を生成するには、特定のエピトープの構造的な完全性が必要であるかもしれない。スクリーニングまたは抗体を産生するために精製すべきタンパク質を発現させるには、特定のタグの付加が必要であるかもしれない(たとえば融合タンパク質の生成)。細胞周期制御や低酸素性応答の関与などSLC7機能を評価するのに使用するアッセイのためのSLC7タンパク質を過剰発現させるには、これらの細胞活動が可能な真核細胞系中での発現が必要であるかもしれない。タンパク質を発現、生成、および精製する方法は当分野で周知であり、したがって、任意の適切な手段を使用することができる(たとえば、Higgins SJおよびHames BD編、Protein Expression:A Practical Approach、Oxford University Press Inc.、ニューヨーク、1999年;Stanbury PF他、Principles of Fermentation Technology、第2版、Elsevier Science、ニューヨーク、1995年;Doonan S編、Protein Purification Protocols、Humana Press、ニュージャージー、1996年;Coligan JE他、Current Protocols in Protein Science編、1999年、John Wiley&Sons、ニューヨーク)。具体的な実施形態では、組換えSLC7は、欠陥p53機能を有することで知られている細胞系(たとえば、とりわけアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)、バージニア州マナサスから入手可能なSAOS−2骨芽細胞、H1299肺癌細胞、C33AおよびHT3子宮頚癌細胞、HT−29およびDLD−1大腸癌細胞、)中で発現される。この組換え細胞は、以下にさらに記載する本発明の細胞に基づくスクリーニングアッセイ系で使用する。
【0024】
SLC7ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、任意の適切な発現ベクター内に挿入することができる。プロモーター/エンハンサーエレメントを含めて必要な転写シグナルおよび翻訳シグナルは、ネイティブSLC7遺伝子および/またはそのフランキング領域由来のものでよく、また異種性のものでもよい。ウイルス(たとえばワクシニアウイルス、アデノウイルスなど)で感染させた哺乳動物細胞システム;ウイルス(たとえばバキュロウイルス)で感染させた昆虫細胞システム;酵母ベクターを含む酵母、あるいはバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドDNAで形質転換させた細菌などの微生物など、様々な宿主−ベクター発現システムが利用できる。遺伝子産物の発現を変調させ、修飾し、かつ/または特異的にプロセッシングする宿主細胞系を使用することができる。
【0025】
SLC7遺伝子産物の発現を検出するために、発現ベクターは、SLC7遺伝子の核酸に発現可能に連結されたプロモーター、1つまたは複数の複製起点、および1つまたは複数の選択可能なマーカー(たとえばチミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性など)を含むことができる。あるいは、in vitroアッセイ系(たとえば免疫アッセイ)におけるSLC7タンパク質の物理的または機能的特性に基づいてSLC7遺伝子産物の発現をアッセイすることによって、組換え発現ベクターを同定することもできる。
【0026】
たとえば精製または検出を促進するために、SLC7タンパク質、断片、またはその誘導体を、任意選択で融合体またはキメラタンパク質産物(すなわち、SLC7タンパク質が異なるタンパク質の異種タンパク質配列にペプチド結合を介して結合されている)として発現させることができる。標準の方法を使用して所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を互いにライゲートさせ、キメラ産物を発現させることによって、キメラ産物を作製することができる。また、タンパク質合成技術、たとえばペプチド合成機の使用(Hunkapiller他、Nature、1984年、310:105〜111)によってキメラ産物を作製することもできる。
【0027】
SLC7遺伝子配列を発現する組換え細胞が同定された後は、標準の方法(たとえばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、およびゲル排除クロマトグラフィー;遠心分離;溶解度差;電気泳動、精製の文献を引用)を使用して遺伝子産物を単離および精製することができる。あるいは、標準の方法(たとえば免疫親和性精製)によって、天然源からネイティブSLC7タンパク質を精製することができる。タンパク質を得た後は、免疫アッセイ、バイオアッセイ、または結晶学など他の物理的特性の測定など適切な方法によってこれを定量し、その活性を測定することができる。
【0028】
本発明の方法では、SLC7またはp53経路に関連する他の遺伝子の発現が変化するように(ミスエクスプレスされるように)操作した細胞を使用することもできる。本明細書中で使用するミスエクスプレッションとは、異所性発現、過剰発現、過少発現、および無発現(たとえば遺伝子のノックアウトまたは通常は正常に引き起こされる発現の遮断による)を包含する。
【0029】
遺伝子改変動物
候補p53調節剤の活性を試験するため、またはアポトーシスや細胞増殖などp53経路のプロセスにおけるSLC7の役割をさらに評価するために、SLC7の発現が変化するように遺伝子が改変された動物モデルを、in vivoアッセイで使用することができる。好ましくは、変化したSLC7の発現により、正常なSLC7発現を有する対照動物に比べて低減または上昇した細胞増殖、血管形成、またはアポトーシスのレベルなど、検出可能な表現型がもたらされる。この遺伝子改変動物はさらに、p53発現が変化していてもよい(たとえばp53ノックアウト)。好ましい遺伝子改変動物は、霊長類、げっ歯類(好ましくはマウス)、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌおよびネコなどの哺乳動物である。好ましい哺乳動物でない種には、ゼブラフィッシュ、線虫(C.elegans)、およびショウジョウバエが含まれる。好ましい遺伝子改変動物は、染色体外エレメントとして存在する異種核酸配列をその細胞の一部分内に有するトランスジェニック動物、すなわちモザイク動物(たとえば、Jakobovits、1994年、Curr.Biol.、4:761〜763によって記載されている技術参照)、または異種核酸が生殖系列DNA内(すなわち細胞のほとんどまたはすべてのゲノム配列中)に安定に組み込まれているトランスジェニック動物である。異種核酸は、たとえば宿主動物の胚または胚性幹細胞を遺伝子操作することによって、このようなトランスジェニック動物の生殖系列内に導入される。
【0030】
トランスジェニック動物を作製する方法は当分野で周知である(トランスジェニックマウスには、Brinster他、Proc.Nat.Acad.Sci.USA、82:4438〜4442、1985年、どちらもLeder他による米国特許第4,736,866号および第4,870,009号、Wagner他による米国特許第4,873,191号、ならびにHogan, B.、Manipulating the Mouse Embryo、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1986年参照;パーティクルボンバードメントについては、Sandford他による米国特許第4,945,050号参照;トランスジェニックショウジョウバエについては、RubinおよびSpradling、Science、1982年、218:348〜53および米国特許第4,670,388号参照;トランスジェニック昆虫については、Berghammer A.J.他、A Universal Marker for Transgenic Insects、1999年、Nature、402:370〜371参照;トランスジェニックゼブラフィッシュについては、Lin S.、Transgenic Zebrafish、Methods Mol Biol.、2000年、136:375〜3830参照);魚、両生類卵および鳥でのマイクロインジェクションについては、HoudebineおよびChourrout、Experientia、1991年、47:897〜905参照;トランスジェニックラットについては、Hammer他、Cell、1990年、63:1099〜1112参照;胚性幹(ES)細胞を培養し、その後、電気穿孔、リン酸カルシウム/DNA沈降、直接注入などの方法を使用してDNAをES細胞に導入することによるトランスジェニック動物の作製には、たとえばTeratocarcinomas and Embryonic Stem Cells, A Practical Approach、E.J.Robertson編、IRL Press、1987年参照)。利用可能な方法に従って非ヒトトランスジェニック動物のクローンを作製することができる(Wilmut, I.他、1997年、Nature、385:810〜813;PCT国際公開公報WO97/07668号およびWO97/07669号参照)。
【0031】
一実施形態では、このトランスジェニック動物は、好ましくはSLC7発現が検出不可能または僅かとなるようにSLC7機能の低下をもたらす、内因性SLC7遺伝子の配列中のヘテロ接合性またはホモ接合性の変化を有する「ノックアウト」動物である。ノックアウト動物は通常、ノックアウトする遺伝子の少なくとも一部分を有する導入遺伝子を含むベクターを用いた相同組換えによって作製される。通常、導入遺伝子を機能的に破壊するために、これに欠失、追加、または置換を導入しておく。この導入遺伝子はヒト遺伝子(たとえばヒトゲノムクローン由来)でもよいが、より好ましくは、トランスジェニック宿主種由来の、ヒト遺伝子のオルソログである。たとえば、マウスゲノム中の内因性SLC7遺伝子を変化させるのに適した相同組換えベクターを構築するためには、マウスSLC7遺伝子を使用する。マウスにおける相同組換えの詳細な方法が利用可能である(Capecchi、Science、1989年、244:1288〜1292;Joyner他、Nature、1989年、338:153〜156参照)げっ歯類でない哺乳動物および他の動物のトランスジェニックを作製する手順も、利用可能である(HoudebineおよびChourrout、上掲;Pursel他、Science、1989年、244:1281〜1288;Simms他、Bio/Technology、1988、6:179〜183)。好ましい実施形態では、特定の遺伝子がノックアウトされたマウスなどのノックアウト動物を使用して、ノックアウトされた遺伝子のヒトでの対応物に対する抗体を産生させることができる(Claesson MH他、1994年、Scan J Immunol、40:257〜264;Declerck PJ他、1995年、J Biol Chem.、270:8397〜400)。
【0032】
別の実施形態では、このトランスジェニック動物は、たとえばSLC7の追加のコピーを導入することによって、またはSLC7遺伝子の内因性コピーの発現を変化させる制御配列を動作可能に挿入することによって、SLC7遺伝子の発現の変化(たとえば発現の増大(異所性の増大を含む)および低減)をもたらす変化をそのゲノム中に有する「ノックイン」動物である。このような制御配列としては、誘発性であり、組織特異的で構成的なプロモーターおよびエンハンサーエレメントが含まれる。このノックインは、ホモ接合性またはヘテロ接合性であることができる。
【0033】
導入遺伝子の発現を制限可能にする選択された系を含む非ヒト動物のトランスジェニックも、作製することができる。作製し得るこのような系の一例は、バクテリオファージP1のcre/loxPリコンビナーゼ系である(Lakso他、PNAS、1992、89:6232〜6236;米国特許第4,959,317号)。導入遺伝子の発現を制御するためにcre/loxPリコンビナーゼ系を使用する場合、Creリコンビナーゼと選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要となる。このような動物は、たとえば、一方が選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、他方がリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む2匹のトランスジェニック動物を交配させることによって「ダブル」トランスジェニック動物を作製することによって、提供することができる。リコンビナーゼ系の別の例は、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のFLPリコンビナーゼ系である(O'Gorman他、1991年、Science、251:1351〜1355;米国特許第5,654,182号)。好ましい実施形態では、導入遺伝子の発現を制御するため、また同一細胞内でのベクター配列が順次削除されるように、Cre−LoxPおよびFlp−Frtの両方が同一系内で使用される(Sun X他、2000年、Nat Genet、25:83〜6)。
【0034】
遺伝学の研究において欠陥p53機能に関係する疾病および疾患の動物モデルとして、また以下に記載するスクリーニングで同定されたものなど候補治療剤のin vivo試験のために、遺伝子改変動物を使用してp53経路をさらに解明することができる。この候補治療剤をSLC7機能が変化した遺伝子改変動物に投与し、表現型の変化を、偽薬による処置を与えた遺伝子改変動物および/または候補治療剤を与えたSLC7発現が変化していない動物などの適切な対照動物と比較する。
【0035】
SLC7機能が変化した上述の遺伝子改変動物に加えて、欠陥p53機能(およびそれ以外は正常なSLC7機能)を有する動物モデルを本発明の方法において使用することができる。たとえば、以下に記載するin vitroアッセイのうち1つで同定された候補p53調節剤の活性をin vivoで評価するために、p53ノックアウトマウスを使用することができる。p53ノックアウトマウスは文献に記載されている(Jacks他、Nature、2001年;410:1111〜1116、1043〜1044;Donehower他、上掲)。好ましくは、候補p53調節剤をp53機能に欠陥がある細胞を有するモデル系に投与した場合、モデル系において検出可能な表現型の変化がもたらされ、これにより、p53機能が修復されている、すなわち細胞が正常な細胞周期進行を示していることが示される。
【0036】
調節剤
本発明は、SLC7の機能および/またはp53経路と相互作用しかつ/またはこれを調節する作用剤を同定する方法を提供する。これらの方法によって同定された調節剤もまた本発明の一部である。このような作用剤は、p53経路に関連する様々な診断および治療用途、ならびにSLC7タンパク質およびp53経路におけるその寄与のより詳しい分析に有用である。したがって、本発明はまた、SLC7相互作用剤または調節剤を投与することによってSLC7活性を特異的に調節するステップを含む、p53経路を調節する方法も提供する。
【0037】
本明細書で使用する「SLC7調節剤」という表現は、SLC7機能を調節する任意の作用剤、たとえば、SLC7と相互作用してSLC7活性を抑制または亢進する作用剤、あるいは正常なSLC7機能に影響を与える作用剤である。SLC7機能は、転写、タンパク質発現、タンパク質の局在化、細胞活性または細胞外活性を含め、いかなるレベルにおいても影響を受けうる。好ましい実施形態では、SLC7調節剤はSLC7の機能を特異的に調節する。表現「特異的調節剤」、「特異的に調節する」などは、本明細書中では、SLC7ポリペプチドまたは核酸に直接結合し、好ましくはSLC7の機能を阻害、増強、または他の形で変化させる調節剤を言うために使用する。また、この用語は、(たとえば、SLC7の結合パートナーと、またはタンパク質/結合パートナー複合体と結合してSLC7機能を改変することによって)SLC7と結合パートナー、基質、または補因子との相互作用を変化させる調節剤も包含する。さらに好ましい実施形態では、SLC7調節剤は、p53経路のモジュレーターであり(たとえば、p53機能を回復および/または上方制御する)、したがってまた「p53調節剤」である。
【0038】
好ましいSLC7調節剤には、小分子化合物;抗体およびその他生物療法剤を含むSLC7相互作用タンパク質;およびアンチセンスやRNA阻害剤などの核酸調節剤が含まれる。調節剤を、たとえば組合せ療法などにおけるような他の活性成分および/または適切な担体や賦形剤を含んでもよい組成物として、薬剤組成物中に配合してもよい。化合物を配合または投与する技術は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、Mack Publishing Co.、ペンシルベニア州イーストン、第19版に出ている。
【0039】
小分子モジュレーター
小分子は多くの場合、酵素機能を有しかつ/またはタンパク質相互作用ドメインを含むタンパク質の機能を調節することが好ましい。当分野で「小分子」化合物と呼ばれる化学剤は通常、分子量が10,000未満、好ましくは5,000未満、より好ましくは1,000未満、最も好ましくは500未満である有機非ペプチド分子である。このクラスのモジュレーターには、化学的に合成した分子、たとえばコンビナトリアル化学ライブラリからの化合物が含まれる。合成化合物は、既知または推定SLC7タンパク質の特性に基づいて合理的に設計または同定する、あるいは化合物ライブラリをスクリーニングすることによっても同定することができる。このクラスの代わりの適切なモジュレーターは、天然産物、特に、やはり化合物ライブラリをスクリーニングしてSLC7変調活性を探すことによって同定することができる、植物や真菌類など生物由来の二次代謝産物である。化合物を作製して得る方法は、当分野で周知である(Schreiber SL、Science、2000年、151:1964〜1969;Radmann JおよびGunther J、Science、2000、151:1947〜1948)。
【0040】
以下に記載するスクリーニングアッセイから同定された小分子モジュレーターをリード化合物として使用することができ、それから候補臨床化合物を設計し、最適化し、合成することができる。このような臨床化合物は、p53経路に関連する病状を処置するのに有用であるかもしれない。候補小分子調節剤の活性は、以下にさらに記載する反復性の二次的な機能検証、構造決定、および候補モジュレーターの改変および試験によって、数倍改善されるかもしれない。さらに、候補臨床化合物は、臨床的および薬理的特性に特に注意を払って作製される。たとえば、活性を最適化し、製薬開発における毒性を最小限に抑えるために、試薬を誘導体化し、in vitroおよびin vivoアッセイを使用して再スクリーニングすることができる。
【0041】
タンパク質モジュレーター
特異的なSLC7相互作用タンパク質は、p53経路および関連疾患に関連する様々な診断上および治療上の用途、ならびに他のSLC7調節剤の検証アッセイにおいて有用である。好ましい実施形態では、SLC7相互作用タンパク質は、転写、タンパク質の発現、タンパク質の局在化、細胞活性または細胞外活性を含めた正常なSLC7機能に影響を与える。別の実施形態では、SLC7相互作用タンパク質は、癌などp53に関連する疾患に関連性があるので、SLC7タンパク質の機能に関する情報を検出および提供するのに有用である(たとえば診断上の手段用)。
【0042】
SLC7相互作用タンパク質は、SLC7発現、局在化、および/または活性を調節するSLC7経路のメンバーなど内因性のもの、すなわちSLC7と自然に遺伝学的または生化学的に相互作用するものであってよい。SLC7モジュレーターには、SLC7相互作用タンパク質およびSLC7タンパク質自体のドミナントネガティブの形が含まれる。酵母2ハイブリッドおよび変異体スクリーニングにより、内因性SLC7相互作用タンパク質同定する好ましい方法が提供されている(Finley, R.L.他、1996年、DNA Cloning-Expression Systems:A Practical Approach、Glover D.およびHames B.D編、Oxford University Press、英国オックスフォード、ページ169〜203;Fashema SF他、Gene、2000年、250:1〜14;Drees BL、Curr Opin Chem Biol、1999、3:64〜70;Vidal MおよびLegrain P、Nucleic Acids Res、1999年、27:919〜29;米国特許第5,928,868号)。タンパク質複合体を解明するための好ましい代替方法は、質量分析である(たとえば、Pandley AおよびMann M、Nature、2000年、405:837〜846;Yates JR 3rd、Trends Genet、2000年、16:5〜8の総説)。
【0043】
SLC7相互作用タンパク質は、SLC7に特異的な抗体やT細胞抗原受容体などの外因性タンパク質でよい(たとえば、HarlowおよびLane、1988年、Antibodies, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory;HarlowおよびLane、1999年、Using antibodies:a laboratory manual.、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー:Cold Spring Harbor Loboratory Press参照)。SLC7抗体については以下でさらに論じる。
【0044】
好ましい実施形態では、SLC7相互作用タンパク質はSLC7タンパク質に特異的に結合する。好ましい代替実施形態では、SLC7調節剤はSLC7基質、結合パートナー、またはコファクターと結合する。
【0045】
抗体
別の実施形態では、このタンパク質モジュレーターはSLC7に特異的な抗体アゴニストまたはアンタゴニストである。この抗体は治療上および診断上の用途を有しており、SLC7モジュレーターを同定するスクリーニングアッセイで使用することができる。また、様々な細胞応答ならびにSLC7の通常のプロセッシングおよび成熟を担当するSLC7経路の部分の分析においても、この抗体を使用することができる。
【0046】
周知の方法を使用してSLC7ポリペプチドと特異的に結合する抗体を作製することができる。好ましくは、この抗体はSLC7ポリペプチドの哺乳動物オルソログ、より好ましくはヒトSLC7に、特異的である。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAbs)、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖抗体、Fab断片、F(ab’)2断片、FAb発現ライブラリによって産生された断片、抗イディオタイプ(抗−Id)抗体、および上記のうちいずれかのエピトープ結合断片であってよい。たとえば、配列番号37ないし50のいずれかに示すアミノ酸配列に対する抗原性を探すための通常のSLC7ポリペプチドのスクリーニングによって、またはこれに対するタンパク質の抗原性領域を選択する理論的な方法を施用することによって、特に抗原性であるSLC7のエピトープを選択することができる(HoppおよびWood、1981年、Proc.Nati.Acad.Sci.U.S.A.、78:3824〜28;HoppおよびWood、1983年、Mol.Immunol.、20:483〜89;Sutcliffe他、1983年、Science、219:660〜66)。記載の標準手順によって、108M−1、好ましくは109M−1〜1010M−1、またはそれより強力な親和性を有するモノクローナル抗体を作製することができる(HarlowおよびLane、上掲;Goding、1986年、Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(第2版)、Academic Press、ニューヨーク;米国特許第4,381,292号;米国特許第4,451,570号;米国特許第4,618,577号)。SLC7の粗細胞抽出物または実質的に精製されたその断片に対する抗体を作製することができる。SLC7断片を使用する場合は、これらは、好ましくはSLC7タンパク質の少なくとも10個、より好ましくは少なくとも20個の連続したアミノ酸を含む。特定の実施形態では、SLC7に特異的な抗原および/または免疫原は、免疫応答を刺激する担体タンパク質に結合している。たとえば、対象ポリペプチドはキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)担体に共有結合しており、このコンジュゲートは免疫応答を増強させるフロイント完全アジュバント中で乳化されている。従来のプロトコルに従って実験ウサギやマウスなど適切な免疫系を免疫化する。
【0047】
固定した対応するSLC7ポリペプチドを使用した固相酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)など適切なアッセイによって、SLC7に特異的な抗体の存在をアッセイした。ラジオイムノアッセイや蛍光アッセイなど他のアッセイを使用することもできる。
【0048】
異なる動物種由来の異なる部分を含む、SLC7ポリペプチドに特異的なキメラ抗体を作製することができる。たとえば、抗体の生物活性はヒト抗体由来であり、その結合特異性はネズミ断片由来となるように、ヒト免疫グロブリン定常領域をネズミmAbの可変領域に連結させてもよい。それぞれの種由来の適切な領域をコードする遺伝子を継ぎ合わせることによってキメラ抗体を作製する(Morrison他、Proc.Natl.Acad.Sci.、1984、81:6851〜6855;Neuberger他、Nature、1984、312:604〜608;Takeda他、Nature、1985、31:452〜454)。キメラ抗体の一形態であるヒト化抗体は、組換えDNA技術によって(Riechmann LM他、1988年、Nature、323:323〜327)マウス抗体の相補性決定領域(CDR)をヒトフレームワーク領域および定常領域のバックグラウンドに移植することによって(Carlos, T.M.、J.M.Harlan、1994年、Blood、84:2068〜2101)作製することができる。ヒト化抗体は約10%のネズミ配列および約90%のヒト配列を含み、それにより、抗体特異性を保持したままで免疫原性がさらに低下または排除される(Co MSおよびQueen C.、1991年、Nature、351:501〜501;Morrison SL.、1992年、Ann.Rev.Immun.、10:239〜265)。ヒト化抗体およびそれらを産生させる方法は当分野で周知である(米国特許第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,762号、および第6,180,370号)。
【0049】
アミノ酸架橋によってFv領域の重鎖断片と軽鎖断片とを連結させて形成した組換え単鎖ポリペプチドであるSLC7特異的単鎖抗体を、当分野で周知の方法によって産生することができる(米国特許第4,946,778号;Bird、Science、1988年、242:423〜426;Huston他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1988年、85:5879〜5883;Ward他、Nature、1989、334:544〜546)。
【0050】
抗体を産生するための他の適切な技術は、リンパ球をin vitroで、抗原ポリペプチド、または代わりにファージや類似のベクター中の選定抗体ライブラリに曝すことを含む(Huse他、Science、1989年、246:1275〜1281)。本明細書中で使用するT細胞抗原受容体は、抗体モジュレーターの範囲内に含まれる(HarlowおよびLane、1988年、上掲)。
【0051】
本発明のポリペプチドおよび抗体は、改変してまたは改変せずに使用することができる。多くの場合、検出可能なシグナルをもたらす基質または標的タンパク質を発現する、細胞にとって毒性である基質を共有結合または非共有結合のどちらかによって結合させることによって抗体を標識する(Menard S他、Int J.Biol Markers、1989、4:131〜134)。幅広い種類の標識およびコンジュゲーション技術が知られており、科学文献および特許文献のどちらにも広く報告されている。適切な標識には、放射性核種、酵素、基質、コファクター、阻害剤、蛍光部分(moiety)、蛍光発光ランタニド金属、化学発光部分、生物発光部分、磁気粒子などが含まれる(米国特許第3,817,837号;第3,850,752号;第3,939,350号;第3,996,345号;第4,277,437号;第4,275,149号;第4,366,241号)。また、組換え免疫グロブリンを産生させてもよい(米国特許第4,816,567号)。膜貫通毒素タンパク質とコンジュゲートさせることによって細胞質ポリペプチドに対する抗体をその標的に送達し到達させることができる(米国特許第6,086,900号)。
【0052】
患者で治療的に使用する場合は、可能な場合は標的部位に非経口的投与によって、または静脈投与によって本発明の抗体を投与する。臨床研究によって治療上有効な用量および投与計画を決定する。通常、投与する抗体の量は患者の重量1kgあたり約0.1mg〜約10mgである。非経口投与には、薬学的に許容されるベヒクルを含む単位用量の注射可能な形態(たとえば溶液、懸濁液、乳濁液)で抗体を配合する。このようなベヒクルは本質的に無毒性で治療作用がない。例は、水、生理食塩水、リンゲル溶液、ブドウ糖溶液、および5%のヒト血清アルブミンである。また、不揮発性油、オレイン酸エチル、またはリポソーム担体などの非水性ベヒクルを使用してもよい。ベヒクルには、等張性や化学的安定性を高めるまたは他の形で治療の可能性を高める緩衝剤や保存料など少量の添加剤が含まれ得る。このようなベヒクル中の抗体濃度は、通常約1mg/ml〜約10mg/mlである。免疫療法的な方法は文献にさらに記載されている(米国特許第5,859,206号;国際公開公報WO0073469号)。
【0053】
特定の生物療法
好ましい実施形態では、SLC7相互作用タンパク質は生物療法に適用できる。製薬的に許容可能な担体中に処方された生物療法剤と用量は、シグナル伝達経路を活性化または阻害するために使用できる。この調節は、リガンドを結合させ、よって経路の活性を阻害するか;または受容体を結合させ、受容体の活性化を阻害するかまたは受容体を活性化することにより達成することができる。あるいは、生物療法剤自体が、受容体を活性化または阻害可能なリガンドであってもよい。生物療法剤とその製造方法は、米国特許第6,146,628号に詳述されている。
【0054】
SLC7リガンド、リガンドの抗体、またはSLC7自体を生物療法剤として使用して、p53経路のSLC7の活性を調節してもよい。
【0055】
核酸モジュレーター
他の好ましいSLC7調節剤としては、一般的にSLC7活性を阻害するアンチセンスオリゴマーや二本鎖RNA(dsRNA)などの核酸分子が含まれる。好ましい核酸モジュレーターは、DNAの複製、転写、タンパク質翻訳部位へのSLC7 RNAの転位、SLC7 RNAからのタンパク質の翻訳、SLC7 RNAをスプライシングして1つまたは複数のmRNA種を得ること、またはSLC7 RNAに関与しまたはそれによって促進され得る触媒活性など、SLC7核酸の機能を妨げる。
【0056】
一実施形態では、このアンチセンスオリゴマーは、好ましくは5’非翻訳領域に結合することによってSLC7 mRNAと結合して、翻訳を阻止するのに十分相補的なオリゴヌクレオチドである。SLC7に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも6〜約200個の範囲のヌクレオチドである。一部の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも10、15、または20ヌクレオチド長である。他の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、好ましくは50未満、40、または30ヌクレオチド長である。このオリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のDNAまたはRNA、あるいはそのキメラ混合物や誘導体またはそれを改変した変形であり得る。このオリゴヌクレオチドの塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格を改変してもよい。このオリゴヌクレオチドは、ペプチド、細胞膜を横切る輸送を促進する作用剤、ハイブリダイゼーションによってトリガーされる切断剤、インターカレーション剤など他の付属基を含んでいてもよい。
【0057】
別の実施形態では、このアンチセンスオリゴマーはホスホチオエートモルホリノオリゴマー(PMO)である。PMOは、それぞれがモルフォリンの六員環に結合している4種の遺伝子塩基(A、C、G、またはT)のうちの1つを含む、4種の異なるモルフォリノサブユニットから組み立てられている。これらサブユニットのポリマーは、非イオン性のホスホジアミデートサブユニット間の連結によって結合されている。PMOおよび他のアンチセンスオリゴマーの詳細な作成方法および使用方法は、当分野で周知である(たとえば、国際公開公報WO99/18193号;Probst JC、Antisense Oligodeoxynucleotide and Ribozyme Design, Methods.、2000年、22(3):271〜281;Summerton JおよびWeller D.、1997年、Antisense Nucleic Acid Drug Dev.、7:187〜95;米国特許第5,235,033号;米国特許第5,378,841号参照)。
【0058】
好ましい代替SLC7核酸モジュレーターは、RNA干渉(RNAi)を媒介する二本鎖RNA種である。RNAiは、動物および植物における配列特異的な翻訳後の遺伝子サイレンシングプロセスであり、サイレンシングされる遺伝子と相同の配列をもつ二本鎖RNA(dsRNA)によって開始される。線虫、ショウジョウバエ、植物、およびヒトで遺伝子をサイレンシングするためのRNAiの使用に関する方法は、当分野で周知である(Fire A他、1998年、Nature、391:806〜811;Fire, A.、Trends Genet.、15、358〜363、1999年;Sharp, P.A.、RNA interference 2001.、Genes Dev.、15、485〜490、2001年;Hammond, S.M.他、Nature Rev.Genet.、2、110〜1119、2001年;Tuschl, T.、Chem.Biochem.、2、239〜245、2001年;Hamilton, A.他、Science、286、950〜952、1999年;Hammond, S.M.他、Nature、404、293〜296、2000年;Zamore, P.D.他、Cell、101、25〜33、2000年;Bernstein, E.他、Nature、409、363〜366、2001;Elbashir, S.M.他、Genes Dev.、15、188〜200、2001年;国際公開公報WO0129058号;国際公開公報WO9932619号;Elbashir SM他、2001年、Nature、411:494〜498)。
【0059】
核酸モジュレーターは一般的に、探索試薬、診断薬、治療薬として使用される。たとえば、遺伝子の発現を厳密な特異性で阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、しばしば特定の遺伝子の機能を解明するのに使用される(たとえば、米国特許第6,165,790号参照)。また、核酸モジュレーターは、たとえば生体経路の様々なメンバーの機能を識別するためにも使用される。たとえば、アンチセンスオリゴマーは、病態の動物および人の処置における治療的部分として利用されてきており、安全かつ効果的であることが数々の臨床治験で実証されてきた(Milligan JF他、Current Concepts in Antisense Drug Design、J Med、Chem.、1993年、36:1923〜1937;Tonkinson JL他、Antisense Oligodeoxynucleotides as Clinical Therapeutic Agents、Cancer Invest.、1996年、14:54〜65)。したがって、本発明の一態様では、p53経路におけるSLC7の役割、および/またはSLC7とこの経路の他のメンバーとの関係をさらに解明するためのアッセイで、SLC7に特異的な核酸モジュレーターを使用する。本発明の別の態様では、p53に関連する病態を処置する治療剤として、SLC7に特異的なアンチセンスオリゴマーを使用する。
【0060】
アッセイ系
本発明は、SLC7活性の特異的なモジュレーターを同定するアッセイ系およびスクリーニング方法を提供する。本明細書中で使用する「アッセイ系」とは、具体的な事象を検出かつ/または測定するアッセイを実施してその結果を分析するのに必要なすべての構成要素を包含する。一般的に、一次アッセイを使用して、SLC7核酸またはタンパク質に関するモジュレーターの特異的な生化学的効果または分子効果を同定または確認する。一般的に、二次アッセイでは、一次アッセイによって同定されたSLC7調節剤の活性がさらに評価され、この調節剤がp53経路に関連する方式でSLC7に影響を与えることが確認されることもある。場合によっては、SLC7モジュレーターを直接二次アッセイで試験する。
【0061】
好ましい実施形態では、スクリーニング方法は、候補剤が存在しなければスクリーニング方法で検出される特定の分子事象に基づく対照活性(たとえばトランスポーター活性)が系によってもたらされる条件下で、SLC7ポリペプチドまたは核酸を含む適切なアッセイ系を候補剤と接触させることを含む。作用剤の影響を受ける活性と対照活性との統計的に有意な差により、この候補剤がSLC7活性を、したがってp53経路を調節することが示される。このアッセイで使用されるSLC7ポリペプチドまたは核酸は、前記核酸またはポリペプチド(たとえば配列番号1−54)のいずれを含んでもよい。好ましい一実施形態では、SLC7は配列番号1−6、および51のいずれか1つから選択される核酸配列、または配列番号37、38および54のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含むSLC7A5である。さらに好ましい実施形態では、SLC7A5核酸は配列番号51を含み、タンパク質は配列番号54を含む。別の好ましい実施形態では、SLC7は、配列番号29−34、52、および53のいずれか1つから選択される核酸配列、または配列番号48または49から選択されるアミノ酸配列を含むSLC7A11である。さらに好ましい実施形態では、SLC7A11核酸は配列番号52またはそのスプライスバリアントである配列番号53を含む。
【0062】
一次アッセイ
一般的に、試験するモジュレーターの種類によって一次アッセイの種類が決まる。
【0063】
小分子モジュレーター用の一次アッセイ
小分子モジュレーターには、候補モジュレーターを同定するためにスクリーニングアッセイを使用する。スクリーニングアッセイは、細胞に基づくものでもよく、またこの標的タンパク質に関連する生化学的反応を再度引き起こさせるまたは保持する無細胞系を使用してもよい(Sittampalam GS他、Curr Opin Chem Biol、1997年、1:384〜91および付随の参考文献に総説がある)。本明細書中で使用する用語「細胞に基づく」とは、生細胞、死滅細胞、または膜分画、小胞体分画、ミトコンドリア分画など特定の細胞分画を使用したアッセイを言う。用語「無細胞」とは、実質的に精製されたタンパク質(内因性または組換えによって生成された)、部分的に精製したまたは粗細胞抽出物を使用したアッセイを包含する。スクリーニングアッセイでは、タンパク質−DNA相互作用、タンパク質−タンパク質相互作用(たとえば受容体−リガンド結合)、転写活性(たとえばレポーター遺伝子)、酵素活性(たとえば基質の特徴を介するもの)、セカンドメッセンジャーの活性、免疫原性、および細胞形態や他の細胞性特徴の変化を含めた様々な分子事象を検出することができる。適切なスクリーニングアッセイでは、蛍光、放射活性、比色、分光光度、および電流滴定を含めた広範囲の検出方法を使用して、検出する具体的な分子事象の読出しを行うことができる。
【0064】
通常、細胞に基づくスクリーニングアッセイには、SLC7を組換えによって発現する系および個々のアッセイで要求される任意の補助タンパク質が必要である。組換えタンパク質を生じさせる適切な方法では、関連する生物活性を保持しており、活性を最適化してアッセイの再現性を保証するのに十分な純度のタンパク質が、十分な量で生成される。酵母2ハイブリッドスクリーニング、変異体スクリーニングおよび質量分析は、タンパク質−タンパク質相互作用を決定し、タンパク質複合体を解明する好ましい方法を提供する。ある種の用途では、小分子モジュレーターを同定するスクリーニングにSLC7相互作用タンパク質を使用する場合、SLC7タンパク質に対する相互作用タンパク質の結合特異性を、基質による処理(たとえば候補SLC7に特異的に結合する作用剤の、SLC7発現性細胞におけるネガティブエフェクターとして機能する能力)、結合平衡定数(通常少なくとも約107M−1、好ましくは少なくとも約108M−1、より好ましくは少なくとも約109M−1)、免疫原性(たとえばマウス、ラット、ヤギまたはウサギなどの異種宿主中でSLC7に特異的な抗体を誘発する能力)など様々な周知の方法によってアッセイすることができる。酵素および受容体について、結合はそれぞれ基質およびリガンドによる処理によってアッセイすることができる。
【0065】
スクリーニングアッセイでは、SLC7ポリペプチド、その融合タンパク質、またはこのポリペプチドもしくは融合タンパク質を含む細胞または膜に特異的に結合する、あるいはその活性を調節する、候補剤の能力を測定することができる。SLC7ポリペプチドは、完全長のものでも、また機能的なSLC7活性を保持しているその断片でもよい。SLC7ポリペプチドは、検出または固定用のペプチドタグあるいは別のタグなど別のポリペプチドに融合させてもよい。SLC7ポリペプチドは、好ましくはヒトSLC7、あるいは上記のようなそのオルソログまたは誘導体である。好ましい実施形態では、スクリーニングアッセイで、SLC7と内因性タンパク質、外因性タンパク質、またはSLC7に特異的な結合活性を有する他の基質などの結合標的との相互作用の候補剤に基づく変調を検出し、これを使用して正常なSLC7遺伝子機能を評価することができる。
【0066】
SLC7モジュレーターを探すためのスクリーニングに適合させることのできる適切なアッセイ様式は、当分野で周知である。好ましいスクリーニングアッセイは高スループットまたは超高スループットであり、したがって、リード化合物用の化合物ライブラリをスクリーニングする、自動化された費用効果の高い手段を提供する(Fernandes PB、Curr Opin Chem Biol、1998年、2:597〜603;Sundberg SA、Curr Opin Biotechnol、2000年、11:47〜53)。好ましい一実施形態では、スクリーニングアッセイで、蛍光偏光、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動を含めた蛍光技術を使用する。これらの系は、色素で標識した分子から放出されたシグナルの強度がそのパートナー分子との相互作用に依存する、タンパク質−タンパク質またはDNA−タンパク質相互作用をモニターする手段を提供する(たとえば、Selvin PR、Nat Struct Biol、2000年、7:730〜4;Fernandes PB、上掲;Hertzberg RPおよびPope AJ、Curr Opin Chem Biol、2000年、4:445〜451)。
【0067】
候補SLC7およびp53経路モジュレーターを同定するために様々な適切なアッセイ系を使用することができる(たとえば、米国特許第6,020,135号(p53の変調)、米国特許第5,550,019号および第6,133,437号(アポトーシスアッセイ))。特定の好ましいアッセイを以下に詳述する。
【0068】
トランスポーターアッセイ。トランスポータータンパク質は、栄養素、イオン、アミノ酸および薬剤を含むある範囲の基質を細胞を越えて運ぶ。トランスポーターのモジュレーターのアッセイは標識基質を使用することができる。たとえば、異なるペプチドと相互作用する化合物を同定するための例示的ハイスループットスクリーニングおよびアニオントランスポーターは双方とも蛍光標識基質を使用する;これに加えて、ペプチド輸送のアッセイは、多重スクリーンろ過プレートを使用する(Blevitt JM他、J Biomol Screen、1999年、4:87-91; Cihlar TおよびHo ES、Anal Biochem、2000年、283:49-55)。
【0069】
アポトーシスアッセイ。アポトーシス用のアッセイは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼに媒介されたジゴキシゲニン−11−dUTPニックエンド標識(TUNEL)アッセイによって実施することができる。TUNELアッセイは、フルオレセイン−dUTPの取り込み(Yonehara他、1989、J.Exp.Med.、169、1747)を追跡することによってアポトーシスに特徴的な核DNAの断片化を測定すること(Lazebnik他、1994、Nature、371、346)に使用される。組織培養細胞のアクリジンオレンジ染色によってアポトーシスをさらにアッセイすることができる(Lucas, R.他、1998、Blood、15:4730〜41)。アポトーシスアッセイ系は、SLC7を発現する細胞、および任意選択で欠陥p53機能を有する(たとえば、野生型細胞に比べてp53が過剰発現または過少発現されている)ものを含むことができる。このアポトーシスアッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較したアポトーシスの誘発における変化により、候補p53調節剤が同定される。本発明の一部の実施形態では、無細胞系を使用して最初に同定された候補p53調節剤を試験する二次アッセイとして、アポトーシスアッセイを使用することができる。また、SLC7機能がアポトーシスにおいて直接役割を果たすかどうかを試験するためにアポトーシスアッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてSLC7を過剰発現または過少発現する細胞でアポトーシスアッセイを実施することができる。野生型細胞と比較したアポトーシス応答の差により、SLC7がアポトーシス応答において直接役割を果たすことが示唆される。アポトーシスアッセイは、米国特許第6,133,437号にさらに記載されている。
【0070】
細胞増殖および細胞周期アッセイ。細胞増殖は、ブロモデオキシウリジン(BRDU)の取り込みを介してアッセイすることができる。このアッセイでは、新しく合成されたDNAにBRDUが取り込まれることにより、DNAが合成されている細胞集団が同定される。その後、抗BRDU抗体を用いて(Hoshino他、1986年、Int.J.Cancer、38、369;Campana他、1988年、J.Immunol.Meth.、107、79)、または他の手段によって、新しく合成されたDNAを検出することができる。
【0071】
また、[3H]−チミジンの取り込みを使用して細胞増殖を検査することもできる(Chen, J.、1996年、Oncogene、13:1395〜403;Jeoung, J.、1995年、J.Biol.Chem.、270:18367〜73)。このアッセイにより、S期のDNA合成の定量的な特徴づけが可能になる。このアッセイでは、DNAを合成している細胞が新しく合成されるDNA中に[3H]−チミジンを取り込む。その後、シンチレーション計数器(たとえば、Beckman LS 3800液体シンチレーション計数器)による放射性同位元素の計数など標準の技術によって取り込みを測定することができる。
【0072】
また、軟寒天中のコロニー形成によって細胞増殖をアッセイすることもできる(Sambrook他、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor、1989年)。たとえば、SLC7で形質転換させた細胞を軟寒天プレートに播種し、2週間インキュベートした後コロニーを測定して計数する。
【0073】
フローサイトメトリーによって細胞周期における遺伝子の関与をアッセイすることができる(Gray JW他、1986年、Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med、49:237〜55)。SLC7で形質移入させた細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリー(Beckton Dickinsonから入手可能)で評価することができる。
【0074】
したがって、細胞増殖または細胞周期アッセイ系は、SLC7を発現する細胞、および任意選択で欠陥p53機能を有する(たとえば、野生型細胞に比べてp53が過剰発現または過少発現されている)ものを含むことができる。このアッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較した細胞増殖または細胞周期の変化により候補p53調節剤が同定される。本発明の一部の実施形態では、無細胞キナーゼアッセイ系など別のアッセイ系を使用して最初に同定された候補p53調節剤を試験する二次アッセイとして、細胞増殖または細胞周期アッセイを使用することができる。また、SLC7機能が細胞増殖または細胞周期において直接役割を果たすかどうかを試験するために細胞増殖アッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてSLC7を過剰発現または過少発現する細胞で細胞増殖または細胞周期アッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した増殖または細胞周期の差により、SLC7が細胞増殖または細胞周期において直接役割を果たすことが示唆される。
【0075】
血管形成。臍帯、冠動脈、または真皮細胞など様々なヒト内皮細胞系を用いて血管形成をアッセイすることができる。適切なアッセイには、増殖を測定するアラマーブルーに基づいたアッセイ(Biosource Internationalから入手可能);血管形成エンハンサーまたはサプレッサーが存在するまたは存在しない場合の細胞が膜を通り抜ける遊走を測定するBecton Dickinson Falcon HTS FluoroBlockセルカルチャーインサートの使用など蛍光分子を用いた遊走アッセイ;Matrigel(登録商標)(Beckton Dickinson)上の内皮細胞による管状構造の形成に基づいた細管形成アッセイが含まれる。したがって、血管形成アッセイ系は、SLC7を発現する細胞、および任意選択で欠陥p53機能を有する(たとえば、野生型細胞に比べてp53が過剰発現または過少発現されている)ものを含むことができる。この血管形成アッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較した血管形成の変化により候補p53調節剤が同定される。本発明の一部の実施形態では、別のアッセイ系を使用して最初に同定された候補p53調節剤を試験する二次アッセイとして、血管形成アッセイを使用することができる。また、SLC7機能が細胞増殖において直接役割を果たすかどうかを試験するために血管形成アッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてSLC7を過剰発現または過少発現する細胞で血管形成アッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した血管形成の差により、SLC7が血管形成において直接役割を果たすことが示唆される。
【0076】
低酸素誘発。転写因子である低酸素誘発性因子−1(HIF−1)のαサブユニットは、in vitroで低酸素に曝した後に腫瘍細胞中で上方制御される。低酸素条件下では、HIF−1は、糖分解酵素やVEGFをコードする遺伝子など腫瘍細胞の生存に重要であることで知られている遺伝子の発現を刺激する。低酸素条件によるこのような遺伝子の誘発は、SLC7で形質移入させた細胞を(たとえばNapco7001インキュベーター(Precision Scientific)で発生させた0.1%のO2、5%のCO2、および残りはN2を用いた)低酸素条件下および正常酸素(normoxic)条件下で増殖させ、その後Taqman(登録商標)によって遺伝子の活性または発現を評価することによってアッセイすることができる。たとえば、低酸素誘発アッセイ系は、SLC7を発現する細胞、および任意選択で変異したp53を有する(たとえば、野生型細胞に比べてp53が過剰発現または過少発現されている)ものを含むことができる。この低酸素誘発アッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較した低酸素応答の変化により候補p53調節剤が同定される。本発明の一部の実施形態では、別のアッセイ系を使用して最初に同定された候補p53調節剤を試験する二次アッセイとして、低酸素誘発アッセイを使用することができる。また、SLC7機能が低酸素応答において直接役割を果たすかどうかを試験するために低酸素誘発アッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてSLC7を過剰発現または過少発現する細胞で低酸素誘発アッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した低酸素応答の差により、SLC7が低酸素誘発において直接役割を果たすことが示唆される。
【0077】
細胞接着。細胞接着アッセイでは、候補調節剤が存在するまたは存在しない場合の、細胞と精製した接着タンパク質との接着、または細胞の相互接着を測定する。細胞−タンパク質接着アッセイでは、細胞が精製したタンパク質に接着することを調節する作用剤の能力を測定する。たとえば、組換えタンパク質を生成し、PBSで2.5g/mLまで希釈し、マイクロタイタープレートのウェルをコーティングするのに使用する。陰性対照で使用するウェルはコーティングしない。その後、コーティングしたウェルを洗浄し、1%のBSAで遮断し、再度洗浄する。化合物を2×最終試験濃度まで希釈し、ブロッキングした、コーティングしたウェルに加える。その後、細胞をウェルに加え、結合しなかった細胞を洗い流す。カルセイン−AMなど膜透過性蛍光色素を加えることによって保持された細胞をプレート上で直接標識し、蛍光マイクロプレート読取装置でシグナルを定量する。
【0078】
細胞−細胞接着アッセイでは、ネイティブリガンドとの細胞接着タンパク質の結合を調節する作用剤の能力を測定する。これらのアッセイには、自然にまたは組換えによって選択した接着タンパク質を発現する細胞を使用する。例示的なアッセイでは、細胞接着タンパク質を発現している細胞をマルチウェルプレートのウェル内に植え付ける。リガンドを発現している細胞をBCECFなど膜透過性蛍光色素で標識し、候補剤の存在下で単層に接着させる。結合しなかった細胞を洗い流し、蛍光プレート読取装置を使用して結合した細胞を検出する。
【0079】
ハイスループット細胞接着アッセイも記載されている。このようなアッセイの1つでは、マイクロアレイスポッターを使用して小分子リガンドおよびペプチドを顕微鏡スライドの表面に結合させ、その後、未処置の細胞をスライドと接触させ、結合しなかった細胞を洗い流す。このアッセイでは、細胞系に対するペプチドおよびモジュレーターの結合特異性が決定されるだけでなく、付着した細胞の機能的細胞シグナル伝達も、マイクロチップ上で免疫蛍光技術をin situで使用して測定される(Falsey JR他、Bioconjug Chem.、2001年5-6月、12(3):346〜53)。
【0080】
抗体モジュレーターの一次アッセイ
抗体モジュレーターでは、適切な一次アッセイ試験は、SLC7タンパク質に対する抗体の親和性および特異性を試験する結合アッセイである。抗体の親和性および特異性を試験する方法は当分野で周知である(HarlowおよびLane、1988年、1999年、上掲)。SLC7に特異的な抗体を検出する好ましい方法は酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)である。他の方法には、FACSアッセイ、ラジオイムノアッセイ、および蛍光アッセイが含まれる。
【0081】
核酸モジュレーターの一次アッセイ
核酸モジュレーターでは、一次アッセイにより核酸モジュレーターがSLC7遺伝子の発現、好ましくはmRNAの発現を阻害または増強する能力を試験し得る。一般的に、発現分析には、核酸モジュレーター存在下または非存在下の細胞の類似集団(たとえば、内因的にまたは組換えによってSLC7を発現する2種の細胞プール)中のSLC7発現を比較することが含まれる。mRNAおよびタンパク質の発現を分析する方法は当分野で周知である。たとえば、ノーザンブロッティング、スロットブロッティング、RNA分解酵素保護、定量的RT−PCR(たとえばTaqMan(登録商標)、PE Applied Biosystemsを使用)、またはマイクロアレイ分析を使用して、核酸モジュレーターで処置した細胞中でSLC7 mRNAの発現が低減していることを確認することができる(たとえば、Current Protocols in Molecular Biology、1994年、Ausubel FM他編、John Wiley&Sons, Inc.、第4章;Freeman WM他、Biotechniques、1999年、26:112〜125;Kallioniemi OP、Ann Med、2001年、33:142〜147;Blohm DHおよびGuiseppi-Elie、A Curr Opin Biotechnol、2001年、12:41〜47)。タンパク質の発現をモニターすることもできる。タンパク質は、最も一般的にはSLC7タンパク質または特異的なペプチドのどちらかに対する特異的な抗体または抗血清を用いて検出される。ウエスタンブロッティング、ELISA、in situ検出を含めた様々な手段が利用可能である(Harlow EおよびLane D、1988年および1999年、上掲)。
【0082】
二次アッセイ
調節剤がp53経路に関連する様式でSLC7に影響を与えることを確認するために、二次アッセイを使用して上記の任意の方法によって同定したSLC7調節剤の活性をさらに評価することができる。本明細書中で使用するSLC7調節剤は、以前に同定した調節剤から誘導した候補臨床化合物または他の作用剤を包含する。また、二次アッセイを使用して、特定の遺伝的または生化学的経路における調節剤の活性を試験するために、あるいは調節剤がSLC7と相互作用する特異性を試験することもできる。
【0083】
二次アッセイでは一般的に、候補モジュレーター存在下または非存在下において、細胞や動物の類似集団(たとえば、内因的にまたは組換えによってSLC7を発現する2種の細胞プール)を比較する。一般的に、このようなアッセイでは、候補SLC7調節剤を用いて細胞や動物を処置することにより、処置しない(あるいはモック処置または偽薬で処置した)細胞や動物と比較してp53経路に変化がもたらされるかどうかを試験する。特定のアッセイでは、「感作させた遺伝的バックグラウンド」を使用する。本明細書中で使用する「感作させた遺伝的バックグラウンド」とは、p53または相互作用する経路における遺伝子の発現が変化するように操作した細胞や動物を表す。
【0084】
細胞に基づいたアッセイ
細胞に基づいたアッセイでは、欠陥p53機能を有することで知られている様々な哺乳動物細胞系(たとえば、とりわけアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)、バージニア州マナサスから入手可能であるSAOS−2骨芽細胞、H1299肺癌細胞、C33AおよびHT3子宮頚癌細胞、HT−29およびDLD−1大腸癌細胞)を使用してもよい。細胞に基づいたアッセイでは内因性p53経路活性を検出するか、あるいはこれはp53経路構成要素の組換えによる発現に依存し得る。前述の任意のアッセイをこの細胞に基づいた形式で使用することができる。候補モジュレーターは、通常は細胞培地に加えるが、細胞に注入するまたは任意の他の有効な手段によって送達してもよい。
【0085】
動物アッセイ
候補SLC7モジュレーターを試験するために、正常または欠陥のあるp53経路の様々な非ヒト動物のモデルを使用することができる。通常、欠陥p53経路のモデルでは、p53経路に関与する遺伝子がミスエクスプレスされる(たとえば過剰発現または発現が欠けている)ように操作された遺伝子改変動物を使用する。一般的に、アッセイには、経口投与、注入などによって候補モジュレーターを全身に送達する必要がある。
【0086】
好ましい実施形態では、新血管新生および血管形成をモニターすることによってp53経路の活性を評価する。Matrigel(登録商標)アッセイにおける、SLC7に対する候補モジュレーターの影響を試験するために、欠陥のあるp53および正常なp53を有する動物モデルを使用する。Matrigel(登録商標)は基底膜タンパク質の抽出物であり、主にラミニン、コラーゲンIV、およびヘパリン硫酸プロテオグリカンから構成される。これは、4℃の無菌的な液体として提供されるが、37℃で迅速にゲルを形成する。液体のMatrigel(登録商標)を、bFGFおよびVEGFなど様々な血管形成剤、またはSLC7を過剰発現するヒト腫瘍細胞と混合する。その後、激しい血管性応答をサポートするためにこの混合物を雌の無胸腺ヌードマウス(Taconic、ニューヨーク州ジャーマンタウン)に皮下注入(SC)する。Matrigel(登録商標)ペレットを有するマウスに、経口(PO)、腹腔内(IP)、または静脈内(IV)経路で候補モジュレーターを投薬してもよい。注入後5〜12日にマウスを安楽死させ、ヘモグロビン分析のためにMatrigel(登録商標)ペレットを回収する(Sigma plasma hemoglobin kit)。ゲルのヘモグロビン含有量は、ゲル中の新血管新生の程度と相関していることが判明した。
【0087】
別の好ましい実施形態では、SLC7における候補モジュレーターの効果を腫瘍形成アッセイによって評価する。一例では、異種移植ヒト腫瘍をSCで、既存の腫瘍由来またはin vitro培養物由来のいずれかの単一細胞懸濁液として、6〜7週齢の雌の無胸腺マウスに移植する。内因的にSLC7を発現する腫瘍を、マウス1匹あたり1×105〜1×107個の細胞を100μLの体積で、27ゲージの針を用いて脇腹に注入する。その後、マウスの耳に札をつけ、週2回腫瘍を測定した。平均腫瘍重量が100mgに達した日に候補モジュレーターによる処置を開始した。候補モジュレーターは、ボーラス投与によってIV、SC、IP、またはPOで送達される。それぞれの独特な候補モジュレーターの薬理動態に応じて、1日に複数回投薬を行うことができる。腫瘍の重量を、カリパーを用いて垂直直径を測定することによって評価し、2つの次元の直径の測定値を掛け合わせることによって計算した。実験の最後に、切除した腫瘍をさらなる分析用のバイオマーカーの同定に利用することができる。免疫組織化学染色では、異種移植腫瘍を4%のパラホルムアルデヒド、0.1Mのリン酸、pH7.2で6時間、4℃に固定し、PBS中30%のショ糖に浸し、液体窒素で冷却したイソペンタン中で迅速に凍結させる。
【0088】
診断および治療上の使用
特異的なSLC7調節剤は、疾病または疾病予後が血管形成、アポトーシス、または増殖疾患などp53経路の欠陥に関連している様々な診断および治療用途に有用である。したがって、本発明は、SLC7活性を特異的に調節する作用剤を細胞に投与するステップを含む、細胞、好ましくは(たとえば、p53の過剰過剰、過小発現、またはミスエクスプレッション、あるいは遺伝子突然変異に起因する)欠陥p53機能を有することが事前に確定されている細胞におけるp53経路を調節する方法も提供する。好ましくは、調節剤は細胞中に検出可能な表現型の変化を生じさせ、これにより、p53機能が修復されたことが示される。「機能が修復された」という語句、および等価な表現は、本明細書では、所望の表現型が達成されたこと、または処理されていない細胞と比較して正常に近い状態になったことを意味する。たとえば、p53機能が修復されると、細胞増殖および/または細胞周期の進行が正常化するか、または未処理細胞と比較して正常に近い状態になる。本発明はまた、p53経路を調節するSLC7調節剤を治療上有効な量で投与することによる、損傷したp53機能に関連する疾患および疾病の治療方法を提供する。本発明は、さらに、細胞、好ましくは欠陥または損傷SLC7機能を持つと予め判断された細胞において、SLC7調節剤を投与することにより、SLC7機能を調節する方法を提供する。加えて、本発明は、SLC7調節剤を治療上有効な量で投与することにより、損傷SLC7機能に関する疾患または疾病の治療する方法を提供する。ある実施形態では、損傷したSLC7機能が損傷したSLC7A5またはSLC7A11に起因するものである。
【0089】
SLC7がp53経路に関係しているという発見により、p53経路の欠陥に関与する疾病および疾患の診断および予後評価、ならびにこのような疾病および疾患の素因を有する対象の同定に使用可能な様々な方法が提供される。
【0090】
特定の試料でSLC7が発現されるかどうかを診断するために、ノーザンブロッティング、スロットブロッティング、RNA分解酵素保護、定量的RT−PCR、およびマイクロアレイ分析など様々な発現分析方法を使用することができる(たとえば、Current Protocols in Molecular Biology、1994年、Ausubel FM他編、John Wiley&Sons, Inc.、第4章;Freeman WM他、Biotechniques、1999年、26:112〜125;Kallioniemi OP、Ann Med、2001年、33:142〜147;BlohmおよびGuiseppi-Elie、Curr Opin Biotechnol、2001年、12:41〜47)。SLC7を発現する欠陥p53シグナル伝達に関係づけられている疾病または疾患を有する組織は、SLC7調節剤を用いた処置を受け入れることが同定されている。好ましい用途では、p53欠陥組織は正常組織に比べてSLC7を過剰発現する。たとえば、完全または部分SLC7 cDNA配列をプローブとして使用した、腫瘍および正常細胞系由来、または腫瘍および同一患者からの対応する正常組織試料由来のmRNAのノーザンブロット分析により、具体的な腫瘍がSLC7を発現または過剰発現するかどうかを決定することができる。あるいは、細胞系、正常組織および腫瘍試料中のSLC7発現の定量的RT−PCR分析のために、TaqMan(登録商標)を使用する(PE Applied Biosystems)。
【0091】
たとえばSLC7オリゴヌクレオチドなどの試薬、およびSLC7に対する抗体を利用して、上に記載した(1)SLC7遺伝子変異の存在の検出、または疾患でない状態と比較したSLC7 mRNAの過剰発現または過少発現のいずれかの検出、(2)疾患でない状態と比較したSLC7遺伝子産物の過剰存在または過少存在のいずれかの検出、ならびに(3)SLC7に媒介されたシグナル伝達経路における摂動または異常の検出のために、様々な他の診断方法を実施することができる。
【0092】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、(a)患者から生体試料を得ること、(b)試料をSLC7発現用のプローブと接触させること、(c)ステップ(b)からの結果を対照と比較すること、および(d)ステップ(c)が疾病または疾患の可能性を示しているかどうかを決定することを含む、SLC7発現の変化に起因する患者の疾病または疾患を診断する方法を対象としている。好ましくは、この疾病は癌であり、最も好ましくは表1に示す癌である。プローブは、DNAまたは抗体を含めたタンパク質のどちらであってもよい。
【実施例】
【0093】
以下の実験セクションおよび実施例は、限定ではなく例示のために提供するものである。
【0094】
I.ショウジョウバエp53のスクリーニング
痕跡翅マージンクアドラントエンハンサー(vestigial margin quadrant enhancer)を用いて、ショウジョウバエのp53遺伝子を翅中に特異的に過剰発現させた。ショウジョウバエのp53の量を増加させることにより(様々な強度のトランスジェニックインサートを1または2コピー使用して力価を測定)、翅毛のパターンおよび極性が破壊されること、翅脈が短縮および肥厚されること、翅に進行的なしわが寄ること、翅翼(wing blade)に暗色の「死」の封入体が現れることを含む表現型を伴う、正常な翅形態の中程度から強度の劣化が引き起こされた。ショウジョウバエのp53のエンハンサーおよびサプレッサーを同定するために設計されたスクリーニングでは、p53を2コピー保有しているホモ接合性の雌を、piggyBacトランスポゾンの無作為なインサートを含む5633雄と交配させた(Fraser M他、Virology、1985年、145:356〜361)。p53表現型の亢進または抑制について、インサートを含む子孫をインサートを含まない兄弟子孫(sibling progeny)と比較した。piggyBac挿入部位の周囲の配列情報を使用してモディファイヤー遺伝子を同定した。翅の表現型のモディファイヤーはp53経路のメンバーとして同定された。CG1607は翅の表現型のエンハンサーであった。このモディファイヤーのヒトにおけるオルソログを、本明細書中ではSLC7と呼ぶ。
【0095】
BLAST分析(Altschul他、上掲)を行ってショウジョウバエのモディファイヤーのターゲットを同定した。例えば、SLC7Aの代表的配列GI#4519803、4507053、4507055、14751168、7657591、9790235、7657683および13654280(それぞれ配列番号38、40、42、44、46、47、49および50)は、ショウジョウバエCG1607と、それぞれ49%、48%、47%、49%、42%、43%、44%および57%のアミノ酸同一性を共有している。
【0096】
タンパク質の様々なドメイン、シグナル、および機能的サブユニットを、PSORT(Nakai K.およびHorton P.、Trends Biochem Sci、1999年、24:34-6; Kenta Nakai、Protein sorting signals and prediction of subcellular localization, Adv. Protein Chem. 54, 277-344、2000年)、PFAM(Bateman A.他、Nucleic Acids Res、1999年、27:260-2; http://pfam.wustl.edu)、SMART(Ponting CP他、SMART: identification and annotation of domains from signaling and extracellular protein sequences. Nucleic Acids Res.、1999年1月 1;27(1):229-32)、TM−HMM(Erik L.L. Sonnhammer, Gunnar von Heijne、およびAnders Krogh: A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences. In Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, P175-182 Ed J. Glasgow, T. Littlejohn, F. Major, R. Lathrop, D. Sankoff, and C. Sensen Menlo Park, CA: AAAI Press、1998年)、およびクラスト(clust)(Remm MおよびSonnhammer E. Classification of transmembrane protein families in the Caenorhabditis elegans genome and identification of human orthologs. Genome Res. 2000年11月;10(11):1679-89)プログラムを使用して分析した。例えば、PFAMを使用して、SLC7の代表的な配列(GI#4519803、配列番号38)、(GI#4507053、配列番号40)、(GI#4507055、配列番号42)、(GI#14751168、配列番号44)、(GI#7657591、配列番号46)、(GI#9790235、配列番号47)および(GI#7657683、配列番号49)のパーミアーゼドメインは、それぞれアミノ酸46−481、41−467、33−468、36−474、26−462、36−471および40−475に位置している。
【0097】
II.ハイスループットのIn Vitro蛍光偏光アッセイ
蛍光標識したSLC7ペプチド/基質を、試験緩衝液(10mMのHEPES、10mMのNaCl、6mMの塩化マグネシウム、pH7.6)中の試験剤と共に96ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。Fluorolite FPM−2 Fluorescence Polarization Microtiter System(Dynatech Laboratories,Inc)を用いて決定した蛍光偏光の対照値に対する変化により、試験化合物がSLC7活性の候補モディファイヤーであることが示される。
【0098】
III.ハイスループットのIn Vitro結合アッセイ
33P標識のSLC7ペプチドを、試験剤と共にアッセイ緩衝液(100mMのKCl、20mMのHEPES pH7.6、1mMのMgCl2、1%のグリセロール、0.5%のNP−40、50mMのβ−メルカプトエタノール、1mg/mlのBSA、プロテアーゼ阻害剤の反応混液)中で、Neutralite−アビジンでコーティングしたアッセイプレートに加え、25℃で1時間インキュベートした。その後、ビオチン標識した基質を各ウェルに加え、1時間インキュベートした。PBSで洗浄することによって反応を停止させ、シンチレーション計数器で計数した。試験剤を用いない対照に比べて活性に変化を引き起こさせる試験剤が、候補p53調節剤として同定された。
【0099】
IV.免疫沈降および免疫ブロッティング
形質移入させたタンパク質の共沈では、SLC7タンパク質を含む3×106個の適切な組換え細胞を10cmのディッシュに植え付け、発現用コンストラクトを用いて次の日に形質移入させた。空ベクターを加えることによって、それぞれの形質移入で総DNA量を一定に保った。24時間後、細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水で1回洗浄し、50mMのHepes、pH7.9、250mMのNaCl、20mMのグリセロホスフェート、1mMのオルトバナジン酸ナトリウム、5mMのp−ニトロフェニルリン酸、2mMのジチオスレイトール、プロテアーゼ阻害剤(complete、Roche Molecular Biochemicals)、および1%のノニデットP−40を含む溶解緩衝液1ml中、氷上で20分間溶解させた。15,000×g、15分間の遠心分離2回によって、細胞細片を取り除いた。細胞溶解物を25μlのM2ビーズ(Sigma)と共に2時間、4℃で緩やかに揺り動かしながらインキュベートした。
【0100】
溶解緩衝液でよく洗浄した後、SDS試料緩衝液中で煮沸することによってビーズに結合したタンパク質を溶解させ、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画し、ポリ二フッ化ビニリデン膜に移し、標識した抗体を用いてブロットした。適切な二次抗体に結合した西洋わさびペルオキシダーゼおよび高感度化学発光(ECL)ウエスタンブロッティング検出システム(Amersham Pharmacia Biotech)によって、反応性のあるバンドを可視化させた。
【0101】
V.発現分析
以下の実験で使用したすべての細胞系はNCI(米国立癌センター)の系であり、ATCC(アメリカンタイプカルチャーコレクション、バージニア州マナサス、20110−2209)から入手可能である。正常組織および腫瘍組織は、Impath、UC Davis、Clontech、Stratagene、およびAmbionから得た。
【0102】
様々な試料中における開示した遺伝子の発現レベルを評価するために、TaqMan分析を使用した。
【0103】
Qiagen(カリフォルニア州バレンシア)のRNeasy kitを使用し、製造者のプロトコルに従って各組織試料からRNAを抽出して最終濃度50ng/μlにした。その後、ランダムの六量体および各反応500ngの全RNAを使用して、Applied Biosystems(カリフォルニア州フォスターシティー、http://www.appliedbiosystems.com/)のプロトコル4304965に従ってRNA試料を逆転写させることによって一本鎖cDNAを合成した。
【0104】
TaqManプロトコルならびに以下の基準に従って、TaqManアッセイ(Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティー)を使用した発現分析用のプライマーを調製した。その基準は、a)ゲノムの混入を排除するために、イントロンにまたがるようにプライマーの対を設計すること、およびb)各プライマーの対が1つの産物のみを生成することである。
【0105】
製造者のプロトコルに従って、300nMのプライマーおよび250nMのプローブならびに約25ngのcDNAを、96ウェルプレートでは25μlの全体積、384ウェルプレートでは10μlの全体積で使用して、Taqman反応を実施した。標的が大量に存在する可能性が高くなるように広範囲の組織由来のcDNAを含む混合物である、ヒトcDNA試料のユニバーサルプール(universal pool)を使用して結果分析用の標準曲線を作成した。18SのrRNA(すべての組織および細胞中で普遍的に発現される)を使用して生データを正規化した。
【0106】
それぞれの発現分析について、腫瘍組織試料を、同一患者からの対応する正常組織と比較した。対応する正常試料と比べて腫瘍中の遺伝子発現レベルが2倍以上高い場合に、ある遺伝子は腫瘍中で過剰発現されているとみなされる。正常組織が入手可能でない場合は、cDNA試料のユニバーサルプールを代わりに使用する。これらの場合では、腫瘍試料と同じ組織タイプからのすべての正常試料の平均との発現レベルの差が、すべての正常試料の標準偏差(すなわち、腫瘍−平均(すべての正常試料)>2×STDEV(すべての試料))の2倍を超える場合に、遺伝子は腫瘍試料中で過剰発現されているとみなされる。
【0107】
結果を表1に示す。太字で表したデータは、第1列に示した組織タイプの試験した腫瘍試料のうち50%を超えるものが正常試料に比べて列1に記載した遺伝子を過剰発現したことを示す。下線を引いたデータは、試験した腫瘍試料のうち25%〜49%が過剰発現を示したことを示す。遺伝子が過剰発現されている腫瘍に投与することによって、本明細書中に記載したアッセイによって同定されたモジュレーターの治療上の効果をさらに検証することができる。腫瘍増殖の低下により、モジュレーターの治療上の有用性が確認される。患者から腫瘍試料を得、モジュレーターが標的としている遺伝子の発現をアッセイすることによって、モジュレーターを用いて患者を処置する前に患者が処置に応答する可能性を診断することができる。この遺伝子(または複数の遺伝子)の発現データも、疾病の進行を診断する上でのマーカーとして使用することができる。このアッセイは、上記の発現分析によって、遺伝子標的に対する抗体によって、または任意の他の利用可能な検出方法によって実施することができる。
【0108】
【表1】
Claims (43)
- (a)精製したSLC7ポリペプチドまたは核酸、あるいは機能的に活性のあるその断片または誘導体を含むアッセイ系を提供するステップと、
(b)試験剤が存在しない場合に系により対照活性がもたらされる条件下で、アッセイ系を試験剤と接触させるステップと、
(c)試験剤の影響を受けたアッセイ系の活性を検出し、試験剤の影響を受けた活性と対照活性との差により試験剤をSLC7調節剤として同定するステップと
を含む、SLC7調節剤を同定する方法。 - SLC7ポリペプチドまたは核酸がSLC7A5である、請求項1に記載の方法。
- SLC7ポリペプチドまたは核酸がSLC7A11である、請求項1に記載の方法。
- アッセイ系がSLC7ポリペプチドを発現する培養細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 培養細胞がさらに欠陥p53機能を有する、請求項4に記載の方法。
- アッセイ系が、SLC7ポリペプチドを備えるスクリーニングアッセイを含み、候補試薬が小分子モジュレーターである、請求項1に記載の方法。
- アッセイがトランスポーターアッセイである、請求項6に記載の方法。
- アッセイ系が、アポトーシスアッセイ系、細胞増殖アッセイ系、血管形成アッセイ系、および低酸素誘発アッセイ系からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- アッセイ系がSLC7ポリペプチドを含む結合アッセイを含み、候補試験剤が抗体である、請求項1に記載の方法。
- アッセイ系がSLC7核酸を含む発現アッセイを含み、候補試験剤が核酸モジュレーターである、請求項1に記載の方法。
- 核酸モジュレーターがアンチセンスオリゴマーである、請求項10に記載の方法。
- 核酸モジュレーターがPMOである、請求項10に記載の方法。
- (d)(c)で同定されたSLC7調節剤を、p53機能に欠陥がある細胞を含むモデル系に投与し、p53機能が修復されたことを示すモデル系における表現型の変化を検出するステップであって、p53機能の修復がp53調節剤としてSLC7調節剤を同定するステップ
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - モデル系が欠陥p53機能を有するマウスモデルである、請求項13に記載の方法。
- 細胞をSLC7調節剤に接触させることを含む、哺乳類細胞におけるSLC7機能の調節方法。
- SLC7調節剤がSLC7A5ポリペプチドまたは核酸を調節する、請求項15に記載の方法。
- SLC7調節剤がSLC7A11ポリペプチドまたは核酸を調節する、請求項15に記載の方法。
- 前記細胞が欠陥p53機能を有し、前記SLC7調節剤がp53機能を修復する、請求項15に記載の方法。
- SLC7調節剤が、配列番号37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50および54からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むSLC7ポリペプチドを特異的に調節する、請求項15に記載の方法。
- SLC7調節剤を、p53機能の欠陥に起因する疾病または疾患を有すると予見される脊椎動物に投与する、請求項15に記載の方法。
- SLC7調節剤が抗体および小分子からなる群から選択される、請求項15に記載の方法。
- (d)p53機能の変化を測定する二次アッセイ系を提供するステップであって、該二次アッセイ系がSLC7を発現している非ヒト動物または培養細胞を含むステップと、
(e)二次アッセイ系を(b)の試験剤またはそれから誘導した作用剤と、試験剤またはそれから誘導した作用剤が存在しない場合に系によりp53機能の指標となる対照活性がもたらされる条件下で接触させるステップと、
(f)作用剤の影響を受けた二次アッセイ系の活性を検出するステップと
をさらに含み、作用剤の影響を受けた二次アッセイ系の活性と対照活性との差により試験剤またはそれから誘導した作用剤が候補p53経路調節剤であることが同定される、
請求項1に記載の方法。 - 二次アッセイ系が培養細胞を含む、請求項22に記載の方法。
- 二次アッセイ系が非ヒト動物を含む、請求項22に記載の方法。
- 非ヒト動物がp53経路の遺伝子をミスエクスプレスする、請求項24に記載の方法。
- 哺乳動物の細胞を、p53経路を調節するSLC7調節剤と接触させることを含む、哺乳動物細胞内のp53経路を調節する方法。
- p53経路に関連する病状を有することが事前に確定されている哺乳動物に作用剤を投与する、請求項24に記載の方法。
- SLC7調節剤が小分子モジュレーター、核酸モジュレーター、および抗体モジュレーターからなる群から選択される、請求項24に記載の方法。
- (a)患者から生体試料を得ること、
(b)試料をSLC7発現用のプローブと接触させること、
(c)ステップ(b)からの結果を対照と比較すること、および
(d)ステップ(c)が疾病または疾患の可能性を示しているかどうかを決定すること
を含む、患者のSLC7発現の変化に関連する疾病または疾患を診断する方法。 - 前記疾病または疾患が癌である、請求項27に記載の方法。
- 前記癌が、表1に>25%の発現レベルを有するとして示されている癌である、請求項28に記載の方法。
- ブローブがSLC7A5の発現に特異的である、請求項27に記載の方法。
- ブローブがSLC7A11の発現に特異的である、請求項27に記載の方法。
- 治療上有効な量のSLC7調節剤を投与することを含み、それによってSLC7機能が修復される、損傷したSLC7機能に関与する疾患の治療方法。
- 損傷したSLC7機能がSLC7の過剰発現に起因している、請求項32に記載の方法。
- 損傷したSLC7機能がSLC7の過小発現に起因している、請求項32に記載の方法。
- 損傷したSLC7機能が損傷したSLC7A5に起因している、請求項32に記載の方法。
- 損傷したSLC7機能が損傷したSLC7A11に起因している、請求項32に記載の方法。
- 治療上有効な量のSLC7調節剤を投与することを含み、それによりp53機能が修復される、損傷したp53機能に関係する疾患の治療方法。
- 損傷したp53機能がp53の過剰発現に起因している、請求項37に記載の方法。
- 損傷したp53機能がp53の過小発現に起因している、請求項37に記載の方法。
- SLC7調節剤がSLC7A5を特異的に調節する、請求項37に記載の方法。
- SLC7調節剤がSLC7A11を特異的に調節する、請求項37に記載の方法。
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US29607601P | 2001-06-05 | 2001-06-05 | |
US32860501P | 2001-10-10 | 2001-10-10 | |
US33873301P | 2001-10-22 | 2001-10-22 | |
US35760002P | 2002-02-15 | 2002-02-15 | |
US35725302P | 2002-02-15 | 2002-02-15 | |
PCT/US2002/017874 WO2002099074A2 (en) | 2001-06-05 | 2002-06-05 | Slc7s as modifiers of the p53 pathway and methods of use |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005504519A true JP2005504519A (ja) | 2005-02-17 |
Family
ID=27540805
Family Applications (5)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003502019A Withdrawn JP2004528043A (ja) | 2001-06-05 | 2002-06-03 | p53経路のモディファイヤーとしてのCHDsおよび使用方法 |
JP2003502170A Pending JP2004528046A (ja) | 2001-06-05 | 2002-06-03 | p53経路のモディファイヤーとしてのDGKsおよび使用方法 |
JP2003502150A Withdrawn JP2005505257A (ja) | 2001-06-05 | 2002-06-03 | p53経路のモディファイヤーとしてのIGsおよび使用方法 |
JP2003502184A Withdrawn JP2005504519A (ja) | 2001-06-05 | 2002-06-05 | p53経路のモディファイヤーとしてのSLC7sおよび使用方法 |
JP2003502185A Withdrawn JP2004528047A (ja) | 2001-06-05 | 2002-06-05 | p53経路のモディファイヤーとしてのPRMTsおよび使用方法 |
Family Applications Before (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003502019A Withdrawn JP2004528043A (ja) | 2001-06-05 | 2002-06-03 | p53経路のモディファイヤーとしてのCHDsおよび使用方法 |
JP2003502170A Pending JP2004528046A (ja) | 2001-06-05 | 2002-06-03 | p53経路のモディファイヤーとしてのDGKsおよび使用方法 |
JP2003502150A Withdrawn JP2005505257A (ja) | 2001-06-05 | 2002-06-03 | p53経路のモディファイヤーとしてのIGsおよび使用方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003502185A Withdrawn JP2004528047A (ja) | 2001-06-05 | 2002-06-05 | p53経路のモディファイヤーとしてのPRMTsおよび使用方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US20050112568A1 (ja) |
EP (5) | EP1402058A4 (ja) |
JP (5) | JP2004528043A (ja) |
AU (1) | AU2002310256A1 (ja) |
CA (5) | CA2449275A1 (ja) |
WO (6) | WO2002099040A2 (ja) |
Families Citing this family (88)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2440618A1 (en) * | 2001-03-12 | 2002-09-19 | Incyte Genomics, Inc. | Immunoglobulin superfamily proteins |
US7271240B2 (en) | 2001-03-14 | 2007-09-18 | Agensys, Inc. | 125P5C8: a tissue specific protein highly expressed in various cancers |
WO2002100431A1 (fr) * | 2001-06-08 | 2002-12-19 | The Forth Military Medical University | Kit pharmaceutique comprenant une proteine de fusion carboxypeptidase humaine dirigee contre un anticorps a chaine simple de proteine plasmatique seminale et promedicament |
US20090297531A1 (en) * | 2001-06-20 | 2009-12-03 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor |
US7803915B2 (en) * | 2001-06-20 | 2010-09-28 | Genentech, Inc. | Antibody compositions for the diagnosis and treatment of tumor |
CA2633171C (en) * | 2001-06-20 | 2012-11-20 | Genentech, Inc. | Antibodies against tumor-associated antigenic target (tat) polypeptides |
JP2003116562A (ja) * | 2001-10-11 | 2003-04-22 | National Cancer Center-Japan | Tsll2遺伝子 |
KR20040101502A (ko) * | 2002-04-16 | 2004-12-02 | 제넨테크, 인크. | 종양의 진단 및 치료 방법 및 이를 위한 조성물 |
US20050276812A1 (en) | 2004-06-01 | 2005-12-15 | Genentech, Inc. | Antibody-drug conjugates and methods |
US20050196753A1 (en) * | 2002-05-30 | 2005-09-08 | Lata Jayaraman | Human coactivator-associated arginine methyltransferase 1 (hCARM1) |
WO2003106650A2 (en) * | 2002-06-14 | 2003-12-24 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Chd5 encoding nucleic acids, polypeptides, antibodies and methods of use thereof |
WO2004098634A2 (en) * | 2003-04-30 | 2004-11-18 | Government Of The United States Of America As Represented By The Sercretary Of The Department Of Health And Human Services National Institutes Of Health | Protein arginine n-methyltransferase 2 (prmt-2) |
BR122018071968B8 (pt) | 2003-11-06 | 2021-07-27 | Seattle Genetics Inc | conjugado de anticorpo-droga, composição farmacêutica, artigo de manufatura e uso de um conjugado de anticorpo-droga |
US20080260742A1 (en) * | 2004-04-09 | 2008-10-23 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Preventives/Remedies for Cancer |
US20090214517A1 (en) * | 2004-07-27 | 2009-08-27 | Justin Wong | Compositions and methods of use for modulators of nectin 4, semaphorin 4b, igsf9, and kiaa0152 in treating disease |
NZ580115A (en) | 2004-09-23 | 2010-10-29 | Genentech Inc | Cysteine engineered antibody light chains and conjugates |
US20100111856A1 (en) | 2004-09-23 | 2010-05-06 | Herman Gill | Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates |
JPWO2007069423A1 (ja) * | 2005-12-12 | 2009-05-21 | 独立行政法人理化学研究所 | アレルギー診断用マーカー |
CA2660448A1 (en) * | 2006-08-16 | 2008-07-10 | Cold Spring Harbor Laboratory | Chd5 is a novel tumor suppressor gene |
CN101541834A (zh) | 2006-10-06 | 2009-09-23 | 武田药品工业株式会社 | 癌症的预防和/或治疗剂 |
ES2322422B1 (es) * | 2007-06-05 | 2010-04-06 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas | Procedimiento de diagnostico de enfermedades del sistema inmune. |
JP6067222B2 (ja) | 2008-07-15 | 2017-01-25 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | アントラサイクリン誘導体コンジュゲート、その調製方法及び抗腫瘍化合物としてのその用途 |
AU2010292172A1 (en) | 2009-09-09 | 2012-05-03 | Centrose, Llc | Extracellular targeted drug conjugates |
PE20130342A1 (es) | 2010-04-15 | 2013-04-20 | Spirogen Sarl | Pirrolobenzodiacepinas y conjugados de las mismas |
GB201105584D0 (en) | 2011-04-01 | 2011-05-18 | Imp Innovations Ltd | Cancer methods |
CN114246952A (zh) | 2010-06-08 | 2022-03-29 | 基因泰克公司 | 半胱氨酸改造的抗体和偶联物 |
LT2621526T (lt) | 2010-09-29 | 2018-09-25 | Agensys, Inc. | Antikūno-vaisto konjugatai (adc), kurie jungiasi prie 191p4d12 baltymų |
JP5889912B2 (ja) | 2010-11-17 | 2016-03-22 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | アラニニルメイタンシノール抗体コンジュゲート |
JP5987053B2 (ja) | 2011-05-12 | 2016-09-06 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | フレームワークシグネチャーペプチドを用いて動物サンプルにおける治療抗体を検出するための多重反応モニタリングlc−ms/ms法 |
PT2750713E (pt) | 2011-10-14 | 2016-01-20 | Genentech Inc | Pirrolobenzodiazepinas e conjugados das mesmas |
WO2013130093A1 (en) | 2012-03-02 | 2013-09-06 | Genentech, Inc. | Biomarkers for treatment with anti-tubulin chemotherapeutic compounds |
JP6270859B2 (ja) | 2012-10-12 | 2018-01-31 | エイディーシー・セラピューティクス・エス・アー・エール・エルAdc Therapeutics Sarl | ピロロベンゾジアゼピン−抗体結合体 |
CA2887895C (en) | 2012-10-12 | 2019-10-29 | Adc Therapeutics Sarl | Pyrrolobenzodiazepine-anti-cd19 antibody conjugates |
PT2906296T (pt) | 2012-10-12 | 2018-06-01 | Medimmune Ltd | Conjugados de pirrolobenzodiazepina-anticorpo |
RS53818B1 (en) | 2012-10-12 | 2015-06-30 | Spirogen Sàrl | PIROLOBENZODIAZEPINI I NJIHOVI conjugated |
KR101995621B1 (ko) | 2012-10-12 | 2019-07-03 | 에이디씨 테라퓨틱스 에스에이 | 피롤로벤조디아제핀-항-cd22 항체 컨주게이트 |
ES2680153T3 (es) | 2012-10-12 | 2018-09-04 | Adc Therapeutics Sa | Conjugados de anticuerpos anti-PSMA-pirrolobenzodiazepinas |
WO2014057120A1 (en) | 2012-10-12 | 2014-04-17 | Adc Therapeutics Sàrl | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
CN105246894A (zh) | 2012-12-21 | 2016-01-13 | 斯皮罗根有限公司 | 用于治疗增殖性和自身免疫疾病的非对称吡咯并苯并二氮杂卓二聚物 |
CN110452242A (zh) | 2012-12-21 | 2019-11-15 | 麦迪穆有限责任公司 | 吡咯并苯并二氮杂卓及其结合物 |
CA2905181C (en) | 2013-03-13 | 2020-06-02 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof for providing targeted therapy |
KR102057755B1 (ko) | 2013-03-13 | 2019-12-19 | 메디뮨 리미티드 | 피롤로벤조디아제핀 및 그의 컨쥬게이트 |
JP6340019B2 (ja) | 2013-03-13 | 2018-06-06 | メドイミューン・リミテッドMedImmune Limited | ピロロベンゾジアゼピン及びそのコンジュゲート |
KR20160042080A (ko) | 2013-08-12 | 2016-04-18 | 제넨테크, 인크. | 1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌 이량체 항체-약물 접합체 화합물, 및 사용 및 치료 방법 |
US9956299B2 (en) | 2013-10-11 | 2018-05-01 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine—antibody conjugates |
US9950078B2 (en) | 2013-10-11 | 2018-04-24 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
GB201317982D0 (en) | 2013-10-11 | 2013-11-27 | Spirogen Sarl | Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof |
EP3054983B1 (en) | 2013-10-11 | 2019-03-20 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
WO2015095212A1 (en) | 2013-12-16 | 2015-06-25 | Genentech, Inc. | 1-(chloromethyl)-2,3-dihydro-1h-benzo[e]indole dimer antibody-drug conjugate compounds, and methods of use and treatment |
MX2016007826A (es) | 2013-12-16 | 2017-03-31 | Genentech Inc | Compuestos peptidomimeticos y sus conjugados de anticuerpo-farmaco. |
JP6671292B2 (ja) | 2013-12-16 | 2020-03-25 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | ペプチド模倣化合物及びその抗体−薬物コンジュゲート |
WO2016037644A1 (en) | 2014-09-10 | 2016-03-17 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof |
GB201416112D0 (en) | 2014-09-12 | 2014-10-29 | Medimmune Ltd | Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof |
KR20170052600A (ko) | 2014-09-12 | 2017-05-12 | 제넨테크, 인크. | 시스테인 가공된 항체 및 콘주게이트 |
EP3191134B1 (en) | 2014-09-12 | 2019-11-20 | Genentech, Inc. | Anthracycline disulfide intermediates, antibody-drug conjugates and methods |
CA2959689A1 (en) | 2014-09-17 | 2016-03-24 | Genentech, Inc. | Pyrrolobenzodiazepines and antibody disulfide conjugates thereof |
EP3223854A1 (en) | 2014-11-25 | 2017-10-04 | ADC Therapeutics SA | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
CN107206101B (zh) | 2014-12-03 | 2021-06-25 | 基因泰克公司 | 季铵化合物及其抗体-药物缀合物 |
GB201506402D0 (en) | 2015-04-15 | 2015-05-27 | Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W | Site-specific antibody-drug conjugates |
GB201506411D0 (en) | 2015-04-15 | 2015-05-27 | Bergenbio As | Humanized anti-axl antibodies |
MA43345A (fr) | 2015-10-02 | 2018-08-08 | Hoffmann La Roche | Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation |
MA43354A (fr) | 2015-10-16 | 2018-08-22 | Genentech Inc | Conjugués médicamenteux à pont disulfure encombré |
MA45326A (fr) | 2015-10-20 | 2018-08-29 | Genentech Inc | Conjugués calichéamicine-anticorps-médicament et procédés d'utilisation |
GB201601431D0 (en) | 2016-01-26 | 2016-03-09 | Medimmune Ltd | Pyrrolobenzodiazepines |
GB201602359D0 (en) | 2016-02-10 | 2016-03-23 | Medimmune Ltd | Pyrrolobenzodiazepine Conjugates |
GB201602356D0 (en) | 2016-02-10 | 2016-03-23 | Medimmune Ltd | Pyrrolobenzodiazepine Conjugates |
JP6943872B2 (ja) | 2016-03-25 | 2021-10-06 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 多重全抗体及び抗体複合体化薬物定量化アッセイ |
GB201607478D0 (en) | 2016-04-29 | 2016-06-15 | Medimmune Ltd | Pyrrolobenzodiazepine Conjugates |
PL3458101T3 (pl) | 2016-05-20 | 2021-05-31 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Koniugaty PROTAC-przeciwciało i sposoby ich stosowania |
US20170370906A1 (en) | 2016-05-27 | 2017-12-28 | Genentech, Inc. | Bioanalytical analysis of site-specific antibody drug conjugates |
US10639378B2 (en) | 2016-06-06 | 2020-05-05 | Genentech, Inc. | Silvestrol antibody-drug conjugates and methods of use |
CN109689111B (zh) | 2016-08-11 | 2024-04-05 | 基因泰克公司 | 吡咯并苯并二氮杂䓬前药及其抗体缀合物 |
CN110139674B (zh) | 2016-10-05 | 2023-05-16 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 制备抗体药物缀合物的方法 |
GB201617466D0 (en) | 2016-10-14 | 2016-11-30 | Medimmune Ltd | Pyrrolobenzodiazepine conjugates |
GB201702031D0 (en) | 2017-02-08 | 2017-03-22 | Medlmmune Ltd | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
US11160872B2 (en) | 2017-02-08 | 2021-11-02 | Adc Therapeutics Sa | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
CN110582505B (zh) | 2017-04-18 | 2021-04-02 | 免疫医疗有限公司 | 吡咯并苯并二氮杂*缀合物 |
CN110536703A (zh) | 2017-04-20 | 2019-12-03 | Adc治疗有限公司 | 使用抗axl抗体-药物缀合物的组合疗法 |
US11318211B2 (en) | 2017-06-14 | 2022-05-03 | Adc Therapeutics Sa | Dosage regimes for the administration of an anti-CD19 ADC |
SI3668874T1 (sl) | 2017-08-18 | 2022-04-29 | Medimmune Limited | Pirolobenzodiazepinski konjugati |
RU2020113749A (ru) | 2017-09-20 | 2021-10-20 | пиЭйч ФАРМА Ко., ЛТД. | Аналоги таиланстатина |
GB201803342D0 (en) | 2018-03-01 | 2018-04-18 | Medimmune Ltd | Methods |
GB201806022D0 (en) | 2018-04-12 | 2018-05-30 | Medimmune Ltd | Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof |
GB201814281D0 (en) | 2018-09-03 | 2018-10-17 | Femtogenix Ltd | Cytotoxic agents |
AU2019365238A1 (en) | 2018-10-24 | 2021-05-13 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Conjugated chemical inducers of degradation and methods of use |
EP3894427A1 (en) | 2018-12-10 | 2021-10-20 | Genentech, Inc. | Photocrosslinking peptides for site specific conjugation to fc-containing proteins |
GB201901197D0 (en) | 2019-01-29 | 2019-03-20 | Femtogenix Ltd | G-A Crosslinking cytotoxic agents |
GB2597532A (en) | 2020-07-28 | 2022-02-02 | Femtogenix Ltd | Cytotoxic compounds |
Family Cites Families (29)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5979875A (en) * | 1997-08-21 | 1999-11-09 | Yocum; David C. | Mechanical jack transmission |
AU1627299A (en) * | 1997-12-05 | 1999-06-28 | Chiron Corporation | Human kismet protein ((hkis)) acts as an oncogene |
WO1999046294A1 (en) * | 1998-03-12 | 1999-09-16 | Shanghai Second Medical University | A human chd-1 like gene |
US5942399A (en) * | 1998-05-06 | 1999-08-24 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Amino acid permease homolog |
US6060250A (en) * | 1998-06-30 | 2000-05-09 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Human transferases |
JP4689781B2 (ja) * | 1998-09-03 | 2011-05-25 | 独立行政法人科学技術振興機構 | アミノ酸輸送蛋白及びその遺伝子 |
EP1165592A4 (en) * | 1999-03-16 | 2005-03-09 | Exelixis Inc | GENES AND PROTEINS OF THE TUMOR UPPRESSOR p53 FROM INSECTS |
EP1074617A3 (en) * | 1999-07-29 | 2004-04-21 | Research Association for Biotechnology | Primers for synthesising full-length cDNA and their use |
WO2001009316A1 (fr) * | 1999-07-29 | 2001-02-08 | Helix Research Institute | Nouveaux genes codant la proteine kinase / proteine phosphatase |
AU1462801A (en) * | 1999-11-04 | 2001-05-14 | Incyte Genomics, Inc. | Tissue specific genes of diagnostic import |
AU2001243142A1 (en) * | 2000-02-03 | 2001-08-14 | Hyseq, Inc. | Novel nucleic acids and polypeptides |
CA2407460C (en) * | 2000-04-28 | 2013-06-25 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted modification of chromatin structure |
JP2004509612A (ja) * | 2000-06-05 | 2004-04-02 | アバロン ファーマシューティカルズ | ガン遺伝子決定および特徴的な遺伝子群を用いた治療用スクリーニング |
US6673545B2 (en) * | 2000-07-28 | 2004-01-06 | Incyte Corporation | Prostate cancer markers |
US20040167065A1 (en) * | 2000-09-29 | 2004-08-26 | Lal Preeti G. | Transferases |
WO2002031111A2 (en) * | 2000-10-12 | 2002-04-18 | Hyseq, Inc. | Novel nucleic acids and polypeptides |
AU2002232433A1 (en) * | 2000-11-28 | 2002-06-11 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for diagnosis and treatment of cancer using arginine m ethyltransferase 3 |
AU2002239539A1 (en) * | 2000-12-06 | 2002-06-18 | Deltagen, Inc. | Transgenic mice containing targeted gene disruptions |
WO2002064780A1 (en) * | 2001-02-12 | 2002-08-22 | Bionomics Limited | Dna sequences for human tumour suppressor genes |
WO2002086443A2 (en) * | 2001-04-18 | 2002-10-31 | Protein Design Labs, Inc | Methods of diagnosis of lung cancer, compositions and methods of screening for modulators of lung cancer |
US6794501B2 (en) * | 2001-05-04 | 2004-09-21 | Ludwig Institute For Cancer Research | Colon cancer antigen panel |
JP2005501528A (ja) * | 2001-06-05 | 2005-01-20 | エクセリクシス・インコーポレイテッド | p53経路のモディファイヤーとしてのGFATsおよび使用方法 |
EP1721977A3 (en) * | 2001-09-17 | 2008-10-15 | PDL BioPharma, Inc. | Methods of diagnosis of cancer, compositions and methods of screening for modulators of cancer |
EP1497315A2 (en) * | 2001-10-29 | 2005-01-19 | Incyte Genomics, Inc. | Nucleic acid-associated proteins |
US20070072178A1 (en) * | 2001-11-05 | 2007-03-29 | Torsten Haferlach | Novel genetic markers for leukemias |
FR2836687A1 (fr) * | 2002-03-04 | 2003-09-05 | Gene Signal | Genes impliques dans la regulation de l'angiogenese, preparations pharmaceutiques les contenant et leurs applications |
FR2837391B1 (fr) * | 2002-03-22 | 2007-04-20 | Gene Signal | Genes regulateurs de l'angiogenese, preparations pharmaceutiques les contenant et leurs applications |
US20040101874A1 (en) * | 2002-04-12 | 2004-05-27 | Mitokor Inc. | Targets for therapeutic intervention identified in the mitochondrial proteome |
US20050196753A1 (en) * | 2002-05-30 | 2005-09-08 | Lata Jayaraman | Human coactivator-associated arginine methyltransferase 1 (hCARM1) |
-
2002
- 2002-06-03 EP EP02739643A patent/EP1402058A4/en not_active Withdrawn
- 2002-06-03 WO PCT/US2002/017313 patent/WO2002099040A2/en not_active Application Discontinuation
- 2002-06-03 WO PCT/US2002/017527 patent/WO2002099060A2/en not_active Application Discontinuation
- 2002-06-03 US US10/480,068 patent/US20050112568A1/en not_active Abandoned
- 2002-06-03 US US10/161,572 patent/US20030087266A1/en not_active Abandoned
- 2002-06-03 EP EP02734624A patent/EP1572872A2/en not_active Withdrawn
- 2002-06-03 WO PCT/US2002/017253 patent/WO2002098356A2/en not_active Application Discontinuation
- 2002-06-03 CA CA002449275A patent/CA2449275A1/en not_active Abandoned
- 2002-06-03 CA CA002449482A patent/CA2449482A1/en not_active Abandoned
- 2002-06-03 WO PCT/US2002/017466 patent/WO2002098899A2/en not_active Application Discontinuation
- 2002-06-03 JP JP2003502019A patent/JP2004528043A/ja not_active Withdrawn
- 2002-06-03 JP JP2003502170A patent/JP2004528046A/ja active Pending
- 2002-06-03 AU AU2002310256A patent/AU2002310256A1/en not_active Abandoned
- 2002-06-03 EP EP02749550A patent/EP1402053A4/en not_active Withdrawn
- 2002-06-03 JP JP2003502150A patent/JP2005505257A/ja not_active Withdrawn
- 2002-06-03 CA CA002449136A patent/CA2449136A1/en not_active Abandoned
- 2002-06-03 US US10/479,874 patent/US20050170344A1/en not_active Abandoned
- 2002-06-05 EP EP02776585A patent/EP1572890A4/en not_active Withdrawn
- 2002-06-05 WO PCT/US2002/017879 patent/WO2002099075A2/en not_active Application Discontinuation
- 2002-06-05 JP JP2003502184A patent/JP2005504519A/ja not_active Withdrawn
- 2002-06-05 CA CA002449281A patent/CA2449281A1/en not_active Abandoned
- 2002-06-05 EP EP02753335A patent/EP1401475A4/en not_active Withdrawn
- 2002-06-05 US US10/163,866 patent/US20030027188A1/en not_active Abandoned
- 2002-06-05 CA CA002448282A patent/CA2448282A1/en not_active Abandoned
- 2002-06-05 WO PCT/US2002/017874 patent/WO2002099074A2/en active Search and Examination
- 2002-06-05 JP JP2003502185A patent/JP2004528047A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2005504519A (ja) | p53経路のモディファイヤーとしてのSLC7sおよび使用方法 | |
JP2005501528A (ja) | p53経路のモディファイヤーとしてのGFATsおよび使用方法 | |
JP2004537321A (ja) | p53経路のモディファイヤーとしてのHPRP4sおよび使用方法 | |
JP2009082131A (ja) | p21経路のモディファイヤーとしてのHADHsおよび使用方法 | |
WO2002098468A1 (en) | SLC13As AS MODIFIERS OF THE p53 PATHWAY AND METHODS OF USE | |
JP2006513698A (ja) | p21経路のモディファイヤーとしてのFLJ20647および使用方法 | |
JP2005506844A (ja) | p53経路のモディファイヤーとしてのLRRCAPS及び使用方法 | |
JP2005520485A (ja) | IRRTKおよびp21経路のモディファイヤーとしてのGPCsおよび使用方法 | |
US20110159508A1 (en) | GFATS as Modifiers of the P53 Pathway and Methods of Use | |
US20090068186A1 (en) | MAP3Ks as modifiers of the p53 pathway and methods of use | |
US20060024673A1 (en) | Slc2as as modifiers of the p53 pathway and methods of use | |
JP2005516583A (ja) | p53経路のモディファイヤーとしてのADSLsおよび使用方法 | |
JP2007502119A (ja) | βカテニン経路のモディファイヤーとしてのUPs及び使用方法 | |
JP2006507005A (ja) | RB経路のモディファイヤーとしてのCCT6sおよび使用方法 | |
JP2007525964A (ja) | p53経路のモディファイヤーとしてのSPPLsおよび使用方法 | |
AU2002346246A1 (en) | SLC7s as modifiers of the p53 pathway and methods of use | |
AU2002310273A1 (en) | SLC2As as modifiers of the P53 pathway and methods of use | |
AU2002320051A1 (en) | CHDs as modifiers of the p53 pathway and methods of use |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050526 |
|
A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20071126 |