JP2005502722A - 学習及び記憶の亢進ならびに健忘症の治療 - Google Patents

Abstract

学習及び記憶の促進または健忘症の治療方法。本方法は、このような必要のある患者に式（Ｉ）の化合物を投与することを含む：Ａｒ_１、Ａｒ_２、及びＡｒ_３のそれぞれは、独立して、フェニル、チエニル、フリル、またはピロリルであり；Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、及びＲ_６のそれぞれは、独立して、Ｈ、ニトロ、ハロゲン、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｃ（Ｏ）ＳＨ、Ｃ（Ｏ）ＳＲ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’、ＲＯＨ、ＲＯＲ’、ＲＳＨ、ＲＳＲ’、ＲＯＣ（Ｏ）Ｒ’ＯＨ、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＲＮＨＲ’、若しくはＲＮＲ’Ｒ”であり；またはＲ_１及びＲ_２が一緒に、Ｒ_３及びＲ_４が一緒に、若しくはＲ_５及びＲ_６が一緒にＯＲＯであり；この際、Ｒ、Ｒ’、及びＲ”のそれぞれは、独立して、炭素原子数１〜６のアルキルであり；ならびにｎは、１、２、または３である。本化合物は、学習及び記憶を促進するまたは健忘症を治療するのに有効な量である。

Description

【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００１年９月１４日に提出された米国仮特許出願第６０／３２２，３８９号の優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
背景
長期増強（ＬＴＰ）は、ある型の学習及び記憶に寄与するシナプス可塑性の長期継続する形態である。レビューとして、例えば、Bliss & Collingridge (1993) Nature 361: 31-39を参照。海馬のＣＡ１領域では、ＬＴＰの誘発は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体の活性化によって引き起こされるシナプス後ニューロンへのＣａ^２＋の侵入に依存する。例えば、Tsien et al. (1996) Cell 87: 1327-1338を参照。Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体は、広範な中枢神経系の疾患にかかわりがあると考えられるので、特に興味のあるものである。例えば、Foster et al. (1987) Nature 329: 395-396；およびMayer et al. (1990) Trends in Pharmacol. Sci. 11: 254-260を参照。
【０００３】
酸化窒素は、脳内の新規な型の細胞間伝達物質として作用でき、ＬＴＰ中で逆行性伝達物質として作用する可能性のある拡散性分子である。例えば、Son et al. (1996) Cell 87: 1015-1023；およびWilson et al. (1997) Nature 386: 338を参照。酸化窒素産生のための酵素である、酸化窒素合成酵素の阻害剤は、ＬＴＰの誘発を防止しうる。酸化窒素のダウンストリームエフェクター(downstream effecter)の一つがｃＧＭＰであり、これはまたＬＴＰの誘発にかかわりがある。ｃＧＭＰは、可溶性グアニリルシクラーゼによって生じる。可溶性グアニリルシクラーゼの阻害剤はＬＴＰを抑制する。例えば、Zhuo et al. (1994) Nature368: 635-639；およびBoulton et al. (1995) Neuroscience 69: 699-703を参照。加えて、ｃＧＭＰは、ＬＴＰの誘発に役割を果たす、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼＧ等の、多くのタンパク質の活性を制御する。プロテインキナーゼＧの阻害剤はＬＴＰの誘発を遮断し、プロテインキナーゼＧのアクチベーターは弱いテタヌス刺激に応答するＬＴＰの誘発を亢進する。例えば、Zhuo et al. (1994) Nature368: 635-639を参照。Zhuo et al. (1994) Nature 368: 635-639。したがって、酸化窒素、ｃＧＭＰ、及びプロテインキナーゼＧを含むシグナル伝達経路は、ＬＴＰの誘発にかかわりがある。シグナル伝達経路を調節する化合物の同定により、学習及び記憶を促進するのに有用な新規な治療が得られうる。
【発明の開示】
【０００４】
要約
一態様においては、本発明は、学習および記憶の亢進方法を特徴とするものである。本方法は、このような必要のある患者に、下記式（Ｉ）：
【０００５】
【化１】

【０００６】
の融合ピラゾリル化合物を投与することを有する。
【０００７】
Ａは、Ｈ、Ｒ、または下記式：
【０００８】
【化２】

【０００９】
であり（以降、「（ＣＨ_２）_ｎＡｒ_３（Ｒ_５）（Ｒ_６）」と称する）；Ａｒ_１、Ａｒ_２、及びＡｒ_３のそれぞれは、独立して、フェニル、チエニル、フリル、またはピロリルであり；Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、及びＲ_６のそれぞれは、独立して、Ｈ、ニトロ、ハロゲン、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｃ（Ｏ）ＳＨ、Ｃ（Ｏ）ＳＲ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’、ＲＯＨ、ＲＯＲ’、ＲＳＨ、ＲＳＲ’、ＲＯＣ（Ｏ）Ｒ’ＯＨ、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＲＮＨＲ’、若しくはＲＮＲ’Ｒ”であり；またはＲ_１及びＲ_２が一緒に、Ｒ_３及びＲ_４が一緒に、若しくはＲ_５及びＲ_６が一緒にＯＲＯである。Ｒ、Ｒ’、及びＲ”のそれぞれは、独立して、炭素原子数１〜６のアルキルであり；およびｎは、１、２、または３である。当該化合物は、学習及び記憶の亢進に有効な量である。
【００１０】
式（Ｉ）は、ピラゾリル核及び少なくとも２個のアリール基、即ち、Ａｒ_１及びＡｒ_２を含む。式（Ｉ）の化合物のサブセットは、Ａが（ＣＨ_２）_ｎＡｒ_３（Ｒ_５）（Ｒ_６）であることを特徴とする。例えば、Ａｒ_１がフェニルであり、ならびにＲ_１及びＲ_２が、それぞれ、フェニル基の４及び５位で置換される。Ａｒ_２は５’−フリルであってもよく、この際、Ｒ_３及びＲ_４の一方が、５’−フリル基の２位で置換され、例えば、１−ベンジル−３−（５’−ヒドロキシメチル−２’−フリル）−インダゾール（化合物１）がある。Ａｒ_２はフェニルであってもよく、この際、Ｒ_３及びＲ_４の一方がフェニル基の４位で置換され、例えば、１−（３−クロロ−ベンジル）−３−（４’−トリル）−インダゾール（化合物９）または１−（４−ニトロ−ベンジル）−３−（４’−トリル）−インダゾール（化合物１０）がある。ある実施態様においては、Ａｒ_３はフェニルであり、およびｎは１である。
【００１１】
式（Ｉ）の化合物の他のサブセットは、ＡがＨであることを特徴とする。例えば、Ａｒ_１がフェニルであり、ならびにＲ_１及びＲ_２が、それぞれ、フェニル基の４及び５位で置換される。他の例としては、Ａｒ_２が５’−フリルであり、この際、Ｒ_３及びＲ_４の一方が、５’−フリル基の２位で置換される。
【００１２】
本明細書中で使用される、「アリール」ということばは、フェニル、チエニル、フリル、またはピロリルを含み、それぞれ、必要であれば一以上の置換部分を有する。置換部分は、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、若しくはＲ_６が同一であってもあるいは異なるものであってもよい。置換部分は、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシル、メルカプト、シアノ、ニトロ、炭素原子数１〜６のアルキル、炭素原子数１〜６のアルケニル、炭素原子数１〜６のアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであってもよく、この際、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、及びヘテロシクリルは必要であれば炭素原子数１〜６のアルキル、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシル、メルカプト、シアノ、またはニトロで置換されてもよい。「アルキル」ということばは、直鎖アルキル及び分岐鎖アルキル双方を意味する。
【００１３】
本発明の方法を実施するにあたって使用できるある特定の融合ピラゾリル化合物の具体例を以下に列挙する。
【００１４】
【化３】

【００１５】
【化４】

【００１６】
【化５】

【００１７】
【化６】

【００１８】
【化７】

【００１９】
上記融合ピラゾリル化合物は、当該化合物自体、ならびに適用できる場合には、これらの塩及びこれらのプロドラッグを含む。このような塩は、例えば、融合ピラゾリル化合物の負に荷電した置換基（例えば、カルボキシレート）及びカチオン間の相互作用によって形成されてもよい。適当なカチオンとしては、以下に制限されないが、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、及びテトラメチルアンモニウムイオン等のアンモニウムカチオンが挙げられる。同様にして、正に荷電した置換基（例えば、アミノ）が負に荷電した対イオンと塩を形成してもよい。適当な対イオンとしては、以下に制限されないが、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、または酢酸塩が挙げられる。プロドラッグの例としては、患者に投与されると、上記融合ピラゾリル化合物を形成できる、エステル及び他の製薬上許容できる誘導体が挙げられる。
【００２０】
本発明はまた、健忘症の治療方法を特徴とするものである。本方法は、このような必要のある患者に上記一以上の融合ピラゾリル化合物を有効量投与することを有する。本明細書中で使用される、「健忘症(amnesia)」は、記憶の喪失を意味する。これは、神経心理的な疾患(neuropsychological disorder)により生じることもある。「神経心理的な疾患」としては、以下に制限されないが、認識、学習、及び記憶の不足、神経変性疾患（例えば、ハンチントン病、パーキンソン病、またはアルツハイマー病）から派生する疾患、感情障害（例えば、双極性感情障害、気分変調性障害、または季節性気分障害）、及び鬱病が挙げられる。
【００２１】
他の態様においては、本発明は、包装製品(packaged product)を特徴とするものである。本包装製品は、容器、容器に入っている一以上の融合ピラゾリル化合物、及び容器に付随し、学習及び記憶を亢進するためのまたは健忘症を治療するためのピラゾリル化合物の投与を示す説明文（例えば、ラベルまたはインサート）を含む。
【００２２】
また、学習及び記憶を亢進するための、または健忘症を治療するための薬剤の製造を目的とする上記化合物の使用もまた本発明の範囲に包含される。
【００２３】
本発明の他の態様、目的、及び利点は、詳細な説明から及び特許請求の範囲から明らかであろう。
【００２４】
詳細な説明
本発明の方法を実施するにあたり使用される融合ピラゾリル化合物は、当業者に既知の方法（例えば、米国特許第５，５７４，１６８号を参照）によって調製できる。当該方法は、以下の合成経路を含む：アリールアリールケトンをまず、アリールカルボニルクロライドを他のアリール化合物とカップリングすることによって調製する。いずれかのアリール化合物は必要であれば一または多置換されていてもよい。次に、このケトンを、アリール基が必要であれば一または多置換されていてもよい、アリールアルキルヒドラジンと反応させて、３個のアリール基を含むヒドラゾンを形成する。ヒドラゾン基をアルキレンリンカーを介して融合ピラゾリル核に変換し、他のアリール基をピラゾリル核の４−Ｃ及び５−Ｃで融合して、さらに３番目のアリール基を直接ピラゾリル核の３−Ｃに連結する。融合ピラゾリル化合物の誘導体を、いずれかのアリール基の置換基を修飾することによって得てもよい。
【００２５】
上記合成経路で使用される化学物質としては、例えば、溶剤、試薬、触媒、保護基及び脱保護基試薬がある。上記方法はまた、本明細書中で詳細に記載される段階の前後に、融合ピラゾリル化合物を最終的に合成するために適当な保護基を付加するまたは除去する段階をさらに有していてもよい。加えて、様々な合成段階を別の配列(sequence)または順番(order)で行なって、所望の化合物を得てもよい。適当な融合ピラゾリル化合物を合成するのに有用な合成化学変換及び保護基方法（保護及び脱保護）は当該分野において知られており、これらとしては、例えば、R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed., John Wiley and Sons (1991); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994)；およびL. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)ならびにこれらの後の出版物に記載されるものがある。
【００２６】
このようにして合成された融合ピラゾリル化合物は、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または再結晶化等の方法によってさらに精製されてもよい。
【００２７】
本発明の一態様としては、学習及び記憶の亢進方法または神経心理的な疾患から派生する健忘症の治療方法がある。当該方法は、このような必要のある患者に、有効量の一以上の融合ピラゾリル化合物及び製薬上許容できる担体を投与することを有する。本明細書中で使用される、「記憶」ということばは、意識プロセスを蓄積し、後にある程度忠実にこれらを再生する知力を意味する。心理学的なプロセスとしては、記憶は、保持、再生、及び認識を包含する。記憶の理論的なモデルとしては、感覚登録機構、短期記憶、作動記憶、及び長期記憶（意味記憶、手続き記憶、及びエピソード記憶を含む）がある。他の記憶の概念化としては、音声記憶、視性記憶(visual memory)、運動記憶(motor memory)、及び認識記憶(recognition memory)がある。「治療」ということばは、健忘症、健忘症の症状または健忘症の素質を治癒させる(cure)、治す(heal)、緩和する(alleviate)、軽くする(relieve)、変える、治療する(remedy)、改善する(ameliorate)、向上させる(improve)、または影響を与えることを目的として、神経心理的な疾患から派生する健忘症、健忘症の症状または健忘症の素質を有する、患者への融合ピラゾリル化合物を含む組成物の塗布(application)または投与として規定される。「有効量」は、このような必要のある患者に投与されると、患者に治療効果を与えるのに必要な融合ピラゾリル化合物の量として規定される。融合ピラゾリル化合物の有効量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。有効量はまた、当業者には認識されるように、投与経路、賦形剤の使用、ならびに学習及び記憶を亢進するための他の薬剤との、あるいは健忘症を治療するための他の薬剤との併用の可能性によって異なる。
【００２８】
本発明の方法を実施するのに、融合ピラゾリル化合物は、経口で、非経口で、吸入スプレーによってまたは移植用リザーバー(implanted reservoir)を介して投与できる。本明細書中で使用される、「非経口」ということばは、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液包内、胸骨内、包膜内、病変内及び頭蓋内注入または輸液技術を包含する。
【００２９】
経口投与用の組成物は、以下に制限されないが、カプセル、錠剤、エマルジョンならびに水性懸濁液、分散液及び溶液などの経口で許容できる投与形態であってもよい。経口で使用される錠剤の場合には、一般的に使用される担体としては、ラクトース及びコーンスターチがある。ステアリン酸マグネシウム等の、潤滑剤もまた一般的に添加される。カプセル形態での経口投与では、使用できる希釈剤としては、ラクトース及び乾燥コーンスターチがある。水性懸濁液またはエマルジョンを経口で投与する場合には、活性成分を乳化または懸濁化剤と合わせた油相中に懸濁または溶解してもよい。必要であれば、適当な甘味、芳香、または着色剤を添加してもよい。吸入組成物は、製剤の分野において既知の技術に従って調製でき、当該分野において既知の、ベンジルアルコールまたは他の適当な保存剤、バイオアベイラビリティを促進するための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または他の可溶化若しくは分散剤を用いて、生理食塩水における溶液として調製されてもよい。
【００３０】
滅菌注射用組成物、例えば、滅菌注射用水性または油性懸濁液は、適当な分散または湿潤化剤（例えば、ツィーン８０など）及び懸濁化剤を用いて当該分野において既知の技術に従って配合されてもよい。滅菌注射用製剤はまた、無毒な、非経口で許容できる希釈剤または溶剤における滅菌注射溶液または懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオールにおける溶液であってもよい。使用されうる許容できるベヒクルや溶剤の中には、マンニトール、水、リンガー液及び等張食塩液がある。加えて、滅菌した不揮発性油が、従来、溶剤または懸濁媒体として使用される（例えば、合成モノ−またはジグリセリド）。オレイン酸及びそのグリセリド誘導体等の、脂肪酸が、特にポリオキシエチレン化形態の、オリーブ油またはヒマシ油等の、天然の薬学的に許容できる油と同様、注射剤の調製に使用できる。これらの油溶液または懸濁液はまた、長鎖アルコールの希釈剤若しくは分散剤、またはカルボキシメチルセルロースまたは同様の分散剤を含んでもよい。
【００３１】
薬剤組成物における担体は、製剤の活性成分と適合でき（および好ましくは、これを安定化でき）、さらに治療を受ける患者に害のないという意味で「許容できる」ものでなければならない。例えば、融合ピラゾリル化合物との特定の、より可溶性の複合体を形成する、シクロデキストリン等の可溶化剤、または一以上の可溶化剤を、融合ピラゾリル化合物のデリバリー用の薬剤賦形剤として使用してもよい。他の担体の例としては、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、及びＤ＆Ｃ イエロー＃１０(D&C Yellow # 10)がある。
【００３２】
適当なin vitroアッセイを用いて、融合ピラゾリル化合物の長期増強誘発能を予め評価してもよい。また、当該分野において既知の方法に従ってin vivoスクリーニングを行なってもよい。下記の具体的な実施例を参照のこと。
【００３３】
さらに詳述しなくとも、上記説明は本発明を適度に実施できると考えられる。したがって、下記の具体的な実施態様は、単に詳細に説明することを意図するものであり、いずれの残りの開示を限定するものではないと解される。本明細書に列挙されたすべての公報は完全に参考のために引用される。
【００３４】
１−ベンジル−３−（５’−ヒドロキシメチル−２’−フリル）−インダゾール（化合物１）の合成
無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）中で無水塩化カルシウム（８８．８ｍｇ、０．８ミリモル）を硼水素ナトリウム(sodium borohydride)（６０ｍｇ、１．６ミリモル）と４時間攪拌することによって、硼水素カルシウム(calcium borohydride)をまず調製した。次に、８８．０ｍｇの１−ベンジル−３−（５’−メトキシカルボニル−２’−フリル）−インダゾール（０．２７ミリモル）を含むＴＨＦ溶液３０ｍＬを、３０±２℃で硼水素カルシウム溶液に滴下した。この混合物を還流しながら６時間加熱し、冷却し、クラッシュアイス中で急冷し、減圧下において、ＴＨＦを除去し、さらに濾過することによって、固体生成物を得た。この固体をジクロロメタンで抽出した。抽出物を５０ｍＬまで濃縮し、固体を石油エーテルを添加した後沈殿させた。この沈殿物を集めて、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル−ベンゼン）によって精製して、７０．０ｍｇの１−ベンジル−３−（５’−ヒドロキシメチル−２’−フリル）−インダゾールを８７％の収率で得た。
【００３５】
融点：１０８〜１０９℃。
【００３６】
【化８】

【００３７】
電気生理試験
断頭後、成体（長期増強の誘発を目的とした、１５０〜２５０ｍｇ）または幼体（長期抑圧の誘発を目的とした、２〜３週齢）のウィスター系ラットの脳をすばやく除き、海馬を解剖して取り出した。横方向の海馬スライス(transverse hippocampal slice)（４５０μｍ厚）を、１２４ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣ１、１．０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、０．５ｍＭ ＣａＣｌ_２、５．０ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１０ｍＭ グルコースを含む氷冷切断用緩衝液中に即座に置き、９５％Ｏ_２及び５％ＣＯ_２で飽和した。次に、これらのスライスを、室温でインタフェースチャンバー中に維持し、人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）で１〜２ｍＬ／分の流速で灌流した。ＡＣＳＦの組成は、１２４ｍＭ ＮａＣｌ、４．４ｍＭ ＫＣ１、１．０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、２．０ｍＭまたは２．５ｍＭ ＣａＣｌ_２、１．０ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１０ｍＭ グルコースを含み、９５％Ｏ_２及び５％ＣＯ_２のガスを流した(gassed)。興奮性シナプス後電位(fieldExcitatory Postsynaptic Potentials)（ｆＥＰＳＰ）を、Schaffer側枝／交連経路(commissural pathway)上に置かれた双極刺激電極による試験パルスによって誘発し、２Ｍ ＮａＣｌで満たされたガラス製マイクロピペット電極（５〜１０ＭΩ）を用いてＣＡ１の放射状層から記録した。試験パルス期間は１００μｓｅｃであり、試験応答は０．０２Ｈｚで誘発した。皮質−扁桃体経路(cortico-amygdala pathway)の電位を記録するために、刺激電極を、聴覚皮質から側扁桃体(lateral amygdala)までの線維を含む、外包中に置いた。ビククリン（１０μＭ）が、扁桃体のｆＥＰＳＰを記録する際に灌流溶液中に存在した。灌流系で投与される融合ピラゾリル化合物の有効性を高めるために、記録チャンバー中のＡＣＳＦレベルは、海馬スライスを浮かべるのではなく覆うのに十分高いものであった。すべての融合ピラゾリル化合物をＡＣＳＦ中で灌流した。
【００３８】
誘発されたｆＥＰＳＰを記録し、データを分析した。ｆＥＰＳＰの初期勾配を算出し、データをｆＥＰＳＰのベースライン勾配の平均のパーセントとして表わした。
【００３９】
化合物１によって亢進した長期増強（ＬＴＰ）：ＬＴＰは、学習及び記憶に関する最も普及している神経生理学的モデルである。ラットの海馬スライスのSchaffer側枝−ＣＡ１経路におけるＬＴＰを、２０秒間隔で１００Ｈｚ、１秒の操作(train)２回を与えることからなる、強いテタヌス刺激によって誘導した。強いテタヌス刺激によって、テタヌス刺激後５０分でｆＥＰＳＰ １６３．４±７．０％（ｎ＝６）の勾配でＬＴＰが誘発された。ＬＴＰは、６分間（テタヌス刺激前に３分及びテタヌス刺激後に３分）、化合物１（１．６μＭ）で灌流することによって顕著に亢進した。ｆＥＰＳＰの勾配は、テタヌス刺激後５０分で４０４．７±３４．９％（ｎ＝５）であった。
【００４０】
ＬＴＰを誘発しない弱いテタヌス刺激は、２０Ｈｚ、０．５秒の操作１回から構成された。予想しないことに、６分間（テタヌス刺激前に３分及びテタヌス刺激後に３分）の化合物１（１．６μＭ）による灌流は、ＬＴＰを誘発した。ｆＥＰＳＰの勾配は、１時間で１７２．９±１０．７％（ｎ＝７）であった。３回の操作（３分間隔の１００Ｈｚ、１秒）の刺激では、扁桃体で３０分以内にベースラインに減衰する一時的な増強が誘発された。しかしながら、同様の刺激操作でも、化合物１が存在すると、少なくとも１時間は安定して継続する連続(enduring)ＬＴＰが誘発された（ｎ＝４）。
【００４１】
ＬＴＰ亢進に関する化合物１のメカニズム：酸化窒素の役割を調べた。化合物１及びＮ^Ｇ−ニトロ−Ｌ−アルギニン−メチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ、ＲＢＩから購入）（３００μＭ）、酸化窒素合成酵素阻害剤を同時に灌流することによって、化合物１によって誘発されるＬＴＰが有意に弱まった。これに対して、ヘムオキシゲナーゼ阻害剤である、亜鉛プロトポルフィリン（１μＭ）は、化合物１によって誘導されるＬＴＰに影響を及ぼさなかった。これらの結果から、一酸化炭素ではなく酸化窒素が化合物１によって亢進されるＬＴＰの誘発にかかわりがあることが示される。
【００４２】
化合物１を、可溶性グアニリルシクラーゼの特異的な阻害剤である、１Ｈ−［１，２，４］ジアゾロ［４，３，−ａ］キノキサリン−１−オン{1 H-[1,2,4]diazolo[4,3,-a]quinoxalin-1-one}（ＯＤＱ、ＴＯＣＲＩＳから購入）と共に同時に灌流した。ＯＤＱがないと、ＬＴＰは、弱いテタヌス（５０Ｈｚ／０．５ｓ）で化合物１によって誘発された。ＯＤＱ（５μＭ）があると、ＬＴＰは化合物１によって誘発されなかった。ｆＥＰＳＰの勾配は、１０７．８±３．９％（ｎ＝５）であった。これらの結果から、可溶性グアニリルシクラーゼは化合物１によって亢進されるＬＴＰの誘発にかかわりがあることが示される。
【００４３】
また、化合物１を、プロテインキナーゼＧの特異的な阻害剤である、ＫＴ５８２３（Calbiochem製）と共に同時に灌流した。ＫＴ５８２３がないと、ＬＴＰは、弱いテタヌス（５０Ｈｚ／０．５ｓ）で化合物１によって誘発された。ＫＴ５８２３（２μＭ）があると、化合物１によって誘発されるＬＴＰは阻害された。ｆＥＰＳＰの勾配は、１１２．９±５．４％（ｎ＝４）であった。これらの結果から、酸化窒素−ｃＧＭＰ−プロテインキナーゼＧ−シグナル伝達経路は化合物１によって亢進されるＬＴＰの誘発にかかわりがあることが示唆される。
【００４４】
さらに、化合物１を、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体のアンタゴニストである、２−アミノ−５−ホスホノペンタン酸(2-amino-5-phosphonopentanoic acid)（ＡＰ５、ＲＢＩから購入）と共に同時に灌流した。ＡＰ５がないと、ＬＴＰは、弱いテタヌス（５０Ｈｚ／０．５ｓ）で化合物１によって誘発された。ＡＰ５（１００μＭ）があると、化合物１によって誘発されるＬＴＰは遅延した。ｆＥＰＳＰの勾配は、１４２．１±１３．５％（ｎ＝５）であった。これらの結果から、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体からのＣａ^２＋の流入は化合物１によって亢進されるＬＴＰの誘発にかかわりがあることが示唆される。
【００４５】
加えて、化合物１を、代謝型受容体(metabotropic receptor)である、ＭＣＰＧ（（±）−α−メチル−（４−カルボキシフェニル）グリシン[(±)-α-methyl-(4-carboxyphenyl)glycine]；Sigma/RBI製）と共に同時に灌流した。ＭＣＰＧ（１００μＭ）があると、化合物によって誘発されるＬＴＰは抑制された。ＡＰ−５及びＭＣＧＰの同時適用は、化合物１によって誘発されるＬＴＰを阻害した。ｆＥＰＳＰの勾配は、１１１．５±１２．３％（ｎ＝３）であった。
【００４６】
化合物１を強いテタヌス（１００Ｈｚ／１ｓｅｃ）を２回操作してから１０分後にＡＣＳＦに（１．６μＭで）添加しても、ＬＴＰは化合物１によってさらに増強しなかったことから、酸化窒素が高周波による刺激時に放出され、化合物１により亢進するＬＴＰの誘発はテタヌス刺激から数分以内でのみ起こることが示唆される。
【００４７】
低周波による刺激（ＬＦＳ）によって誘発される可塑性に関する化合物１：ＬＦＳ（１Ｈｚで９００パルス）を、幼いラット（７〜１４日齢）から採取した海馬スライスにデリバリーして、長期抑圧（ＬＴＤ）を誘発した。１Ｈｚで海馬スライスを３分間刺激することによって、シナプス伝達のＬＴＤは生じなかった。しかしながら、この短期のＬＦＳは、化合物１の存在下で有意にＬＴＤを誘発した（８３．４±１０．９％、ｎ＝３）。ＬＦＳ中１５分間、化合物１（１．６μＭ）を灌流すると、ＬＴＤ可塑性はＬＴＰに逆転した。０．０２Ｈｚでのより弱い電気刺激を、酸化窒素ドナーニトロプルシド（３００μＭ）及び化合物１（１．６μＭ）双方の存在下でデリバリーした。酸化窒素ドナーニトロプルシド（３０μＭ）及び化合物１（１．６μＭ）を同時に灌流することによって、ＬＴＤが誘発された。これらのデータから、酸化窒素ドナーは化合物１の存在下でテタヌス刺激の作用を模倣できることが示唆される。化合物１またはニトロプルシド単独では、０．０２Ｈｚの刺激でのｆＥＰＳＰに増強を生じなかった。
【００４８】
ピラゾリル化合物によるＬＴＰの促進：化合物１〜８についても、海馬スライスでのＬＴＰ誘発の促進を試験した。結果を表１に示す。テタヌス刺激（５０Ｈｚ、０．５ｓ）してから６０分後のｆＥＰＳＰの勾配を示す。各化合物（１．６μＭ）を、弱いテタヌス刺激の３分前及び３分後に灌流した。
【００４９】
【表１】

【００５０】
行動負荷試験 (Behavioral Task Test)
モーリスの水迷路(Morris water maze)：モーリスの水迷路を、目で識別できるようなキューのついた(with distinctive visual cues)部屋にある丸いプール（２２４ｃｍ直径、４６ｃｍ高さ）で行なった。水を３６ｃｍの深さになるまでいれ、透明なプラスチック製のプラットホーム（２５×２５ｃｍ、３２ｃｍ高さ）を固定した４分円の中央部に置いた。ラットを以下の負荷環境中で２日間訓練した：透明なプラスチック製のプラットホームなしでプールの中を自由に水泳。各訓練のセッションは２分であり、ラットを実験者がプールから引き上げた。次に、ラットに、次の６日間、連続した毎日の訓練トライアルを４回行った。各訓練トライアルでは、各ラットを４分円の一つからランダムに水の中に置いた。ラットは、水面下に沈められたプラスチック製のプラットホーム上に登るまで泳ぎ続けなければならなかった。水中に置かれてからプラスチック製のプラットホームに登るまでの時間を記録し、脱出潜伏時間(escape latency)として規定した。ラットが１２０秒たってもプラスチック製のプラットホームを見つけられなかった際には、実験者がラットを引き上げて、プラスチック製のプラットホームに置いた。各ラットを６０秒間プラットホーム上に置き、この時間をトライアルの間隔とした。化合物１（１ｍｇ／ｋｇ）またはベヒクルを最初の訓練トライアルの１０分前に各ラットに毎日注射した。それぞれの日の最後の訓練トライアル後、各ラットをタオルで乾燥させ、電気加熱器を収容ケージ(home cage)に置いた。
【００５１】
実質証拠は空間的な情報の習得及び保持において海馬が関連のあることを示す。例えば、Ohon et al. (1979) Behav. Brain Sci. 2: 316-365；およびBarnes (1988) Trend Neurosci. 11: 163-169を参照。モーリスの水迷路における空間的な記憶の習得に関する化合物１の効果を試験した。ラットに、毎日、４回連続して訓練トライアルを行なった。化合物１（１ｍｇ／ｋｇ）を、最初の訓練トライアルの１０分前に毎日注射した（腹腔内、１ｍｇ／ｋｇ）。データから、化合物１は最初の訓練日に２〜４訓練の脱出潜伏期間を短縮したことが示され、これから化合物１は短期間記憶を促進することが示唆される。２〜４訓練の脱出潜伏期間は、それぞれ、コントロール群では９３．８±８．７秒、７９．３±１２／３秒及び５７．６±１２．５秒、ならびに化合物１群（ｎ＝１０）では５０．４±１０．２秒、４７．３±６．８秒及び３０．３±１０．３秒であった。次の３訓練日での最初の訓練の脱出潜伏期間もまた、化合物１群で顕著に短縮された。脱出潜伏期間は、それぞれ、コントロール群では９１．１±９．８秒、４７．１±３．９秒及び３５．３±６．１秒、ならびに化合物１群（ｎ＝１０）では５５．４±１２．８秒、１５．３±２．１秒、及び１３．４±１．７秒であった。これらの結果から、化合物１は長期間記憶をも促進することが示唆される。脱出潜伏期間は、化合物１は４日間日に１回投与したのみであるにもかかわらず、２１日までの全実験期間をとおして化合物１群でより短かった。２１日目の平均脱出潜伏期間は、コントロール群及び化合物１群で、それぞれ、１３．５±１．８秒及び６．０±０．５秒（それぞれｎ＝１０）であった。上記結果から、化合物１は、学習及び記憶を改善するための有望な薬剤である。化合物１を、１．２５％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）と混ぜて、連続した６日間、最初の訓練の３０分前に直接胃に経口デリバリーした（１０ｍｇ／ｋｇ）。注射による投与と同様、化合物１の経口投与によっても、短期間及び長期間記憶が促進した。
【００５２】
Ｌ−ＮＡＭＥが海馬スライスの化合物１によって誘発されたＬＴＰの促進を中和したので、in vivo実験を行ない、化合物１によって刺激された学習及び記憶の改善に関するＬ−ＮＡＭＥの効果を試験した。これらの実験において、カニューレを長期にわたって移植したラットに、化合物１の腹腔内注射（１ｍｇ／ｋｇ）を行うと共に、毎日の訓練の最初のトライアルの１０分前に、Ｌ−ＮＡＭＥ（１ｍｍｏｌｅ／１０ｍＬ）または生理食塩水を脳室内に注射した。データから、Ｌ−ＮＡＭＥが仕事の顕著な記憶喪失を引き起こし、化合物１によって誘発される学習及び記憶の促進を有意に遮断したことが示される。ＫＴ５８２３の脳室内投与もまた、化合物１により誘発される促進を損なった。
【００５３】
受動回避(passive Avoidance)および能動回避(active avoidance)負荷：ラットを、Liang et al. (1998, Chin. J. Physiol. 41: 33-44)に記載されるのと同様の方法で１訓練段階スルー受動阻害回避負荷(one-trial step-through passive inhibitory avoidance task)について、訓練及び試験した。簡単にいうと、装置は、良く光があたる安全なコンパートメント及び暗いショックコンパートメントにスライドするドアによって分けられたスルー形状のアレイ(trough-shape alley)であった。ドアに面した形で光のあたる側にラットを置いた。ラットを回転させると、ドアが開いた。ラットが暗いコンパートメントの中に入ったら、タイマーで制御された定電流ショック器(Lafayette Instruments, Model 80240 and Model 58010, Indiana, USA)により避けられないショックを足に与えた。足にショックを与えた後、ラットをアレイから取り出し、収容ケージに戻した。２４時間または１０日後に行なった保持試験では、ラットを再度アレイに入れ、４本の足すべてがショックコンパートメントに入る潜伏期間を保持スコアとして採った。ラットが５または１０分にわたって入らなかった場合には、試験トライアルを終了して、３００秒または６００秒の天井スコア(ceiling score)を与えた。
【００５４】
扁桃体も学習及び記憶に関連がある。この脳構造が特に感情的な情報を処理するのに関連があるということが研究により示された。例えば、Cahill and McGaugh (1990) Behav. Neurosci. 104: 532-543；およびGilbert et al. (1991) Behav. Neurosci. 105: 533-561を参照。酸化窒素もまた扁桃核における能動的に依存するシナプス可塑性(activity-dependent synaptic plasticity)及び受動的な回避学習にかかわりがあることが報告された。例えば、Bernabeu et al. (1995) NeuroReport 6: 1498-1500；Watanabe et al. (1995) Brain Res. 688: 233-236；およびTeledgy and Kokavszky (1997) Neuropharmacology 36: 1583-1587を参照。受動的な回避学習に関する化合物１の効果を研究した。化合物１を、足ショック訓練の１０分前に注射した（腹腔内、１ｍｇ／ｋｇ）。結果から、化合物１は光のあたるコンパートメントでの保持潜伏期間を顕著に延ばしたことが示される。記憶は数日間続く。保持スコアは、１０日目に調べても非常に高かった。１日目及び１０日目双方で試験した化合物１処置ラットで５分以上の長い保持潜伏期間を有するラットが非常により多かった（それぞれ、コントロール群では１５匹中２匹および化合物１処置群では１２匹中１１匹）。化合物１を１．２５％ＣＭＣと混ぜて、足にショックを与える前に直接胃にデリバリーした（１０ｍｇ／ｋｇ）。保持試験を、それぞれ、１日及び１０日後に行なった。化合物１は、受動的な回避学習を非常に改善した（表２）。表３に示されるように、化合物１（腹腔内、１ｍｇ／ｋｇ）は、効果がより若いラットよりかなり顕著ではないものの、年齢のいったラットで学習行動を改善した。１年齢のラットをこの実験に選んだ。化合物１（１ｍｇ／ｋｇ）を足にショックを与える１０分前に腹腔内注射した。保持試験を、それぞれ、１日及び１０日後に行った。
【００５５】
【表２】

【００５６】
【表３】

【００５７】
上記結果から、化合物１は、若い及び年配のラットの双方において受動的な回避の学習を改善できる。これらの負荷では、化合物１は、プロセスがＬＴＰの誘発段階に関連すると考えられる、新たに形成される記憶の習得に特に影響を与える。足へのショックは、ラットにとって大きな刺激であると考えられる。酸化窒素は、この状況下で放出され、即座に代謝されると考えられる。化合物１は、化合物１が足のショックから３０分後に注射されると、ラットに何ら効果を及ぼさなかった。これらの結果から、化合物１は、記憶負荷の前または間に投与されるときのみ学習行動を改善できることが示唆される。
【００５８】
また、これらのデータから、化合物１は、足のショックから３０分後に注射してもラットの回避行動に何ら効果を及ぼさないことが示された。加えて、化合物１によって誘発される促進の効果は、Ｌ−ＮＡＭＥ及びＫＴ５８２３（脳室内、それぞれ、１ｍｍｏｌｅ及び０．２ｎｍｏｌｅ）によって有意に中和された。これらの結果から、化合物１は、記憶の負荷の前または間に投与される場合にのみ学習行動を改善できることが示唆される。さらに、足のショックを与える代わりにコンテキスト訓練(context training)の１０分前に化合物１を投与すると、受動的な阻害回避の保持スコアが延びることから、化合物１は足のショックがなくとも環境の合図に関して記憶の習得を促進することが示唆される。
【００５９】
能動的な回避の試験では、ラットを、ドアに面した状態で暗いコンパートメントに置いた。ドアを半分開けたところ、ラットがドアを超えて光のあたるコンパートメントに折り返すのに１０秒かかった。ラットが１０秒以内に安全な側にいった場合には、ラットをこの実験には選ばなかった。足のショックを１０秒後に入れた。ラットが安全なコンパートメントに逃げたら、ドアを閉めた。暗いショックコンパートメントでの保持時間を４８時間後に測定した。ラットがコンテキスト訓練の日に１０秒以内に光の当たるコンパートメントに入ったら、そのラットを捨てた。足のショックを１日目に暗いコンパートメントに入ってから１０秒後に与えた。記憶の保持を２日目に試験した。足のショックを与える１０分前に、化合物１を注射すると、記憶の保持が顕著に上がり、ショックコンパートメントから安全なコンパートメントへの脱出潜伏期間が短くなる。さらに、化合物１によって誘導される記憶の促進効果は、Ｌ−ＮＡＭＥ及びＫＴ ５８２３（脳室内、それぞれ、１ｍｍｏｌｅ及び０．２ｎｍｏｌｅ）によって効果的に阻害された。ゆえに、化合物１は、ＮＯ−ｃＧＭＰ−ＰＫＧ経路による受動回避及び能動回避試験双方においてラットの学習行動を有意に改善する。
【００６０】
ロトロッド試験(rotorod test)：この実験は、マウス（オス、２０〜２５ｇｍ）で行った。ロトロッド装置(rotorod apparatus)は、プラスチック製の円筒形のロッド（３ｃｍ直径×１３ｃｍ長さ）であった。このロッドの端を２つの壁で支えて、壁の底から２５ｃｍ離した。ロッドの端の壁は、マウスがロッドを降りれ(climb off)ないくらい十分高かった。３回トライアルを各実験で行った。化合物１（１ｍｇ／ｋｇ）またはベヒクルを初めのトライアルの２０分前に腹腔内注射した。ロトロッド試験の各トライアルでは、マウスをロッドの上に置き、ロッドから落ちるまでの時間を計った。最大３分までとした。間隔は１０分であった。ロッドを２８ｒｐｍで電気モーターで回転させた。
【００６１】
小脳の酸化窒素もまた、ＬＴＤ及び運動学習(motor learning)に関連があると報告された。例えば、Li et al. (1995) J. Neurophysiol. 74: 489-494を参照。運動学習を改善する化合物１を研究した。マウスをこの種の実験に選んだ。化合物１（腹腔内、１ｍｇ／ｋｇ）は、回転ロトロッド（２８ｒｐｍ）でのマウスの運動協調(motor coordination)を有意に改善した。コントロールマウスの行動はトライアル数を増やすと改善が得られ、３回目のトライアルでより良好な改善が得られた。しかしながら、化合物１で処置されたマウスは、最初のトライアルの時でさえロッドで良好なバランスを示し、２回目のトライアルでは非常に良好な運動協調を示した。化合物１が小脳で主に作用することによって運動学習をも改善できることは明白である。
【００６２】
他の実施態様
本明細書中で開示された態様はすべていずれの組み合わせで組み合わされてもよい。本明細書中で開示された各態様は、同様の、等価の、または類似の目的を果たす別の態様に置換されてもよい。ゆえに、特記しない限り、開示された各態様は、一般的な一連の等価のまたは類似の態様の例でしかない。
【００６３】
上記から、当業者は、本発明の必須の特徴を容易に認識でき、本発明の精神及び概念を逸脱することなく、様々な用途及び条件に適合させるために本発明の様々な変更や修飾を行なうことができる。例えば、融合ピラゾリル化合物に構造が類似する化合物を本発明を実施するにあたって使用してもよい。ゆえに、他の実施態様もまた特許請求の範囲に含まれる。

Claims (41)

1. 学習及び記憶の亢進または健忘症の治療が必要な患者に、有効量の下記式：
   

   

   ただし、Ａは、Ｈ、Ｒ、または下記式：
   

   

   であり；
   Ａｒ_１、Ａｒ_２、及びＡｒ_３のそれぞれは、独立して、フェニル、チエニル、フリル、またはピロリルであり；
   Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、及びＲ_６のそれぞれは、独立して、Ｈ、ニトロ、ハロゲン、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｃ（Ｏ）ＳＨ、Ｃ（Ｏ）ＳＲ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’、ＲＯＨ、ＲＯＲ’、ＲＳＨ、ＲＳＲ’、ＲＯＣ（Ｏ）Ｒ’ＯＨ、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＲＮＨＲ’、若しくはＲＮＲ’Ｒ”であり；またはＲ_１及びＲ_２が一緒に、Ｒ_３及びＲ_４が一緒に、若しくはＲ_５及びＲ_６が一緒にＯＲＯであり；この際、Ｒ、Ｒ’、及びＲ”のそれぞれは、独立して、炭素原子数１〜６のアルキルであり；ならびに
   ｎは、１、２、または３である、
   の化合物を投与することを有する、学習及び記憶の亢進または健忘症の治療方法。
2. Ａは、下記式：
   

   

   である、請求項１に記載の方法。
3. Ａｒ_１はフェニルである、請求項２に記載の方法。
4. Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ、フェニルの４及び５位で置換される、請求項３に記載の方法。
5. Ａｒ_２は５’−フリルである、請求項２に記載の方法。
6. Ｒ_３及びＲ_４の一方が、フリルの２位で置換される、請求項５に記載の方法。
7. Ａｒ_３はフェニルである、請求項２に記載の方法。
8. ｎは１である、請求項７に記載の方法。
9. Ａｒ_１はフェニルである、請求項８に記載の方法。
10. Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ、フェニルの４及び５位で置換される、請求項９に記載の方法。
11. Ａｒ_２は５’−フリルである、請求項１０に記載の方法。
12. Ｒ_５及びＲ_６のそれぞれはＨであり、かつＲ_３及びＲ_４の一方がフリルの２位で置換される、請求項１１に記載の方法。
13. Ｒ_１及びＲ_２のそれぞれはＨである、請求項１２に記載の方法。
14. Ｒ_３及びＲ_４の一方がＨであり、かつ他方がＣＨ_２ＮＣＨ_３である、請求項１３に記載の方法。
15. Ｒ_３及びＲ_４の一方がＨであり、かつ他方がＣＨ_２ＯＨである、請求項１３に記載の方法。
16. Ｒ_３及びＲ_４の一方がＨであり、かつ他方がＣＨ_２ＯＣＨ_３である、請求項１３に記載の方法。
17. Ｒ_３及びＲ_４の一方がＨであり、かつ他方がＣＯＯＣＨ_３である、請求項１３に記載の方法。
18. Ｒ_３及びＲ_４の一方がＨであり、かつ他方がＣＨ_２ＯＨである、請求項１２に記載の方法。
19. Ｒ_１及びＲ_２のそれぞれがＨである、請求項１８に記載の方法。
20. Ｒ_１がＨであり、かつＲ_２がＦである、請求項１８に記載の方法。
21. Ｒ_１がＨであり、かつＲ_２がＯＣＨ_３である、請求項１８に記載の方法。
22. Ｒ_１及びＲ_２が一緒にＯＣＨ_２Ｏである、請求項１８に記載の方法。
23. Ａｒ_１はチエニルである、請求項２に記載の方法。
24. Ａｒ_２はフェニルである、請求項３に記載の方法。
25. Ｒ_３及びＲ_４の一方がフェニルの４位で置換される、請求項２４に記載の方法。
26. Ｒ_３及びＲ_４の一方がＨであり、かつ他方がＣＨ_３である、請求項２５に記載の方法。
27. Ａｒ_３はフェニルである、請求項２４に記載の方法。
28. ｎは１である、請求項２７に記載の方法。
29. Ｒ_３及びＲ_４の一方がフェニルの４位で置換される、請求項２８に記載の方法。
30. Ｒ_３及びＲ_４の一方がＨであり、かつ他方がＣＨ_３である、請求項２９に記載の方法。
31. Ｒ_１及びＲ_２のそれぞれがＨであり、Ｒ_５及びＲ_６の一方がＨであり、かつ他方がフェニルの３位で置換されるＣｌである、請求項３０に記載の方法。
32. Ｒ_１及びＲ_２のそれぞれがＨであり、Ｒ_５及びＲ_６の一方がＨであり、かつ他方がフェニルの４位で置換されるＮＯ_２である、請求項３０に記載の方法。
33. ＡはＨである、請求項１に記載の方法。
34. Ａｒ_１はフェニルである、請求項３３に記載の方法。
35. Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ、フェニルの４及び５位で置換される、請求項３４に記載の方法。
36. Ａｒ_２は５’−フリルである、請求項３５に記載の方法。
37. Ｒ_３及びＲ_４の一方がフリルの２位で置換される、請求項３６に記載の方法。
38. Ｒ_１及びＲ_２のそれぞれがＨである、請求項３７に記載の方法。
39. Ｒ_３及びＲ_４の一方がＨであり、かつ他方がＣＯＯＣＨ_３である、請求項３８に記載の方法。
40. Ａｒ_２は５’−フリルである、請求項３３に記載の方法。
41. Ｒ_３及びＲ_４の一方がフリルの２位で置換される、請求項４０に記載の方法。