JP2005501548A5 - - Google Patents

Description

本発明の詳細な説明
方法及び組成物、及び当該方法及び組成物を使用したシステムは、細胞の状況、例えば、興味のタンパク質の状態などを決定するために提供される。方法は、融合タンパク質を、細胞の状況と関連する興味のタンパク質と同等とみなして反映させて、細胞の状況の代理として融合タンパク質の状態を決定することを可能とする。この方法は、ED(又はPL)及びEAの複合体が、並列に断片を保持する他の実在物の不存在下、活性酵素を提供する場合、酵素ドナー（ED）又はプロラベル（PL）として言及される酵素小断片の使用、酵素アクセプターとして言及される融合タンパク質及びより大きい酵素断片の一部としての使用に依存する。サンプルにおける酵素活性は、EAと複合体を形成し、活性酵素を形成する際のEDの活性によって反映されるように細胞における細胞状況の代理として機能する。（１）融合タンパク質の発現又は（２）EAと複合体を形成する際又は複合体を形成したときのED(又はPL)の活性における変化により融合タンパク質を改変する結果を生じる状況は、細胞の変化の指標として測定することができる。小酵素断片はこの出願を通じてED又はPLという。

β-ガラクトシターゼは、主要発明において使用されるペプチドの典型的なものであり、
複合体を非共有的に結合させて活性酵素を形成した際に、この酵素が、分類の実例として、異なる酵素を独立して考慮しなければならない状況を除いて、以後しばしば言及される2つのペプチドを有するための基準を明らかにするものである。

本方法は、どのような変化が生じた後でも、酵素活性が測定される場合、評価されるべき環境において、もしあれば、検出可能な基質の存在下酵素アクセプターとともに融合タンパク質を提供することからなる。生産される酵素産物の量は、EAへ結合する際のEDの活性へ関連する。酵素活性は、融合タンパク質の興味のタンパク質と複合体を形成する化合物への結合、融合タンパク質の分解、融合タンパク質の修飾、融合タンパク質の運搬などによって影響されるであろう。また、融合タンパク質の形成及び分解の割合の結果として、プロテアーゼ安定融合タンパク質及びタンパク質の発現レベルを有することによって、プロモータから生じる発現、転写、翻訳のレベルを測定することもできる。

本システムとそのサブコンポーネントは、発現、分解、転座、及び他の細胞成分との結合など細胞内活動の細胞モニター、通常、内部細胞モニターを提供する。この目的に向って、哺乳類細胞において機能的な転写調節領域と調節領域の転写調節下の酵素のEA断片と無関係に結合し活性酵素を形成することが可能な不活性ED酵素をコード化する配列とを有する発現構築物を含む哺乳類宿主細胞の中への遺伝子構築物の導入を可能とする成分が提供される。構築物に含まれるのは、タンパク質としてのEA断片、発現構築物、又は特に、細胞のゲノムへ組み込まれた細胞における細胞構築物である。したがって、機能的酵素に必要な2つの部分が、活性タンパク質として直接的にか細胞における発現によって間接的にかいずれかの第2断片を備える。このシステムに含まれるものは、酵素的触媒反応、例えば、加水分解によって検出可能な産物を遊離する酵素基質である。転写構築物が、機能的であり、融合タンパク質を生産する細胞も含まれる。

βガラクトシターゼ酵素及びその断片（米国特許番号第4,708,929号参照）は、多くの特性を有するように要求される。断片は、実質的に個別に不活性であり、基質存在下で1つの断片が存在するのみという背景でもしあっても少しである。第二に、断片は互いに十分な親和性を有し、例えば、断片へ融合した存在物によるなどの、他の結合の不存在下、断片が活性酵素を提供するのに結合するであろう。小断片（“ED”又は“PL”）は、それが融合した遺伝子の生物学的活動、生じた融合タンパク質の適格な折り畳み、酵素機能を含めた活動の活性部位の保持、他のタンパク質への結合機能、転座能力などを妨害しないであろう。EDは、一般に少なくとも約37、通常少なくとも約40アミノ酸で、かつ、一般的に約110を越えず、より一般的には、約90を越えないであろう。

融合構築物を含む宿主細胞は、多くの用途を見出す。融合タンパク質は、宿主細胞においてED（又はPL）配列へ融合した遺伝子によって発現したタンパク質の安定性、タンパク質が宿主細胞において結合した程度、宿主細胞の特定の区画への融合タンパク質の転座、細胞の性質及び/又は細胞の環境において変化するための融合タンパク質の応答を決定するのに使用することができる。効果において、融合タンパク質は、通常のタンパク質の代理として機能する。いくつかの例において、ヒトが効果に関心を持った宿主細胞は、タンパク質を発現しないかもしれず、タンパク質は、宿主において1又はそれ以上の経路を有する可能性がある。宿主細胞において存在する融合タンパク質の量を知ることによって、融合タンパク質の宿主細胞への応答、その環境、推定により天然タンパク質を決定することができる。天然タンパク質の代理として融合タンパク質の量を測定することができるので、薬の影響又はタンパク質上の宿主細胞環境における変化を決定することができる。このようにして、タンパク質上、当該タンパク質が影響を及ぼす経路上、どのように薬物が他のタンパク質とのタンパク質相互作用へ影響を与えるかなどそれらの効果に対する薬物を選別することができる。加えて、分化、腫瘍形成、異常増殖、環境における物理変化など、興味のタンパク質の状況における影響を決定することができる。

本システムの使用者は、興味の遺伝子を本システムに提供される遺伝子の構築物の中へ導入する。多数のクローニング部位を有することによって、遺伝子が操作され、正しい方向において及びED(又はPL)配列を有するリーディングフレームにおいて複数のクローニング部位へ挿入される。ED配列と興味の遺伝子との間に残存する複数のクローニング部位にヌクレオチドが存在する結果として、一般に、３コドンより多くないリンカー、好ましくは約２コドンより多くないであろう。示したように、提供されるベクターは、転写及び/又は翻訳末端配列、ポリアデニル化配列、又は、キレート化、アミノ基転位、プレニル化、ファルネシル化、ゲラニル化などの機能をコード化する他の配列を含むことができる。一度、融合タンパク質構築物が完成されれば、その後構築物を宿主細胞の中へ導入することができる。宿主細胞は、EAを発現する構築物を有するか、又はそうでなければ、当該構築物は、ゲノム又は安定な発現物の中へ一時的発現又は組み込み用に加えることができる。あるいは、溶解物を調製し、必要に応じてEAを加えることができる。選択された基質は、細胞膜を透過することができ、その結果、基質は、細胞に比率を限定しない量で存在するであろう。あるいは、上述したように、溶解物を調整し、基質を溶解物へ加えることができる。

宿主細胞の必要な修飾が完成した後、人は、宿主細胞を使用することができる。例えば、どのような変化が起こって後でも、もしあれば、宿主細胞の環境において評価されるべきであり、人は、検出可能な基質の存在下、融合タンパク質とEAを接触させて、そこでは、酵素の活動が測定される。生産された酵素産物の量は、EAへ結合する際のEDの活性に関係する。酵素活性は、融合タンパク質の分解、興味のタンパク質と複合体を形成する化合物への融合タンパク質の結合、融合タンパク質の修飾、融合タンパク質の運搬など、に影響を受けるであろう。人は、また、プロモーターから生じる発現、転写及び翻訳の割合を、プロテアーゼ安定融合タンパク質を有し、融合タンパク質の発現レベル、その結果として融合タンパク質の形成及び分解割合を測定することによって、測定することもできる。

主要な本発明によって使用される工程は、（１）本システムの一部として提供される遺伝子構築物の多数のクローニング部位へ興味の遺伝子を挿入することによって、融合タンパク質遺伝子及び発現構築物を調製し、（２）融合タンパク質を含む発現構築物をシステムによって提供されるか使用者によって選択された選択細胞宿主の中へ導入し、（３）あるいは、本システムに提供された宿主細胞の一部として以前にもし存在しないなら、EAをコード化する発現構築物も導入し、（４）発現及び細胞の生存を可能とする条件下トランスフォームされた細胞宿主をインキュベートし、（５）(i)内部基質を加えるか、(ii)細胞宿主を溶解し、EA及び基質を加え、（６）細胞環境の測定として、通常興味のタンパク質の状況の指標として、生産物の生産代謝回転率を測定する、ことからなる。無傷の細胞を使用するとき、検出可能な産物は、区画について、カメラ、マイクロスコープ、又は視覚検出用の他の装置を使用して、検出することができる。EA発現を提供するとき、人は、一般に高い活性プロモーターを使用し、存在する実質的にすべてのEDと複合体を形成するのに十分な量のEAが細胞内にあることを確実にし、それゆえ、EAプロモーターは、EDプロモーターの少なくとも約2倍活性があるべきである。EAを溶解物へ加えたとき、同じ考えが存在し、その結果、EDに対するEAのより過剰量、一般に少なくとも約2倍過剰量、しばしば、少なくとも約5倍過剰量が加えられ、当該過剰量は、20倍又はそれを越えるものとすることができる。

融合タンパク質遺伝子挿入物を含む発現ベクターは、４つの一般的方法、すなわち、(a)所望のプラスミドDNA又は特異的ｍRNAのPCR増幅、(b)核酸加水分解、(c)マーカー遺伝子機能の存在又は不存在、及び(d)挿入した配列の発現、によって同定することができる。最初の方法において、核酸を、放射性核酸を組み込むか、エチジウムブロマイドで染色させたPCR増幅によって、増幅産物の検出を提供することができる。第二の方法において、発現ベクターに挿入した融合タンパク質遺伝子の存在を、融合タンパク質遺伝子に相同な配列からなるプローブを使用する核酸ハイブリダイゼーションによって検出することができる。第三の方法において、リコンビナントベクター/宿主系を、ベクターにおける外来遺伝子の挿入によって引き起こされたあるマーカー遺伝子機能(例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける占有体形成等)の存在又は不存在に基づいて、同定し、選別することができる。第四の方法において、組み換え発現ベクターは、組み換え発現ベクターによって発現した融合タンパク質遺伝子産物の活性を測定することによって同定することができる。

例えば、次のタンパク質をコード化するDNAを含むベクターが、ロックビルのアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）に寄託されている。MD:因子VIII（ｐSP64−VIII、ATCC No. 39812）；581アミノ酸を欠く因子VIIIアナログ、“LA”(pDGR-2、ATCC No. 53100); t-PA 及びそのアナログ（共に係属中の米国出願明細書No.882,051）;VWF(pMT2-VMF,ATCC No. 67122)； EPO(pRK1-4, ATCC No. 39940; pdBPVMMTneo 342-12(BPV-Type vector) ATCC No. 37224) ;及びGM-CSF（ｐCSF-1，ATCC No. 39754）。

宿主細胞は、融合タンパク質の発現用の必要な転写因子、及び決定目的の他の成分を提供するように選別されるであろう。宿主細胞は、シミュレートされる環境と類似する環境を提供するように選択されるであろう。いくつかのケースにおいて、主要細胞を、培地内で維持されたもの及び親株から直接的に得られるものの両方を使用することができるが、通常、腫瘍形成又は非腫瘍形成の細胞株を使用するであろう。細胞株は、所望の環境を提供し、比較が、患者からの主要な細胞を使用することが利用できない研究間の直接的な比較を可能とすることができる。以前に示したように、宿主細胞を修飾し、興味のタンパク質が関連する経路と関連させることによって、興味のタンパク質に影響を与えるタンパク質を発現させることができる。いくつかの例において、特定のタンパク質、例えば、レセプターなどを欠く宿主細胞が選択されるので、レセプターに対する発現構築物を導入することによって、特定のタンパク質の発現を制御することができる。これら遺伝子の修飾は、融合タンパク質を発現する構築物の導入に付随して、又はその後に行なうことができる。遺伝子の修飾は、一時的又は実質的に永続的なもととすることができ、発現の所望のレベル及び発現の制御を提供するように細胞が選択されるべきである。

主要なシステムは、家庭内の動物細胞、ネズミ、ウシ、犬、ネコ、ブタ、ウサギなど、より好ましくは、モンキー、サル、ヒトなどの霊長類の細胞を含む。確立された細胞株は、形質転換された細胞株を含め、宿主として適当である。通常二倍体細胞、主要組織及び主要な外植体の培地から生体外において誘導された細胞株は(造血幹細胞などの相対的に未分化細胞を含め)、適当であろう。胚細胞を、及び幹細胞、例えば、造血幹細胞、神経幹細胞、筋肉幹細胞などを使用することができる。候補細胞は、選択遺伝子が著しく作用する限り、選択遺伝子において遺伝子型的に不完全なもので必要はない。宿主細胞は、哺乳類細胞株を確立するであろう。ベクターDNAの染色体DNAの中への安定な組み込みのために、及び組み込まれたベクターDNAの次の増幅のために、従来技術によって両方とも、CHO細胞(Chinese Hamster Ovary)は好都合である。あるいは、ベクターDNAは、ウシ乳頭腫ウイルスゲノム(Lusky et al., 1984, Cell 36: 391-401)の全て又は一部を含むことができ、安定なエピソーム因子としてC127マウス細胞などの細胞株において実行することができる。他の使用可能な哺乳類細胞株は、Hela、COS-1モンキー細胞、Bow細胞、マウスl-929細胞、マウス乳腺腫瘍細胞、などの黒色腫細胞株、Swiss、Balb-c又はNIHマウスから引き出された３T3株、BHK又はHAKハムスター細胞株などを含む。

細胞株は、特異的遺伝子、例えば，タンパク質などの発現を促進するか又は弱めるEAコード化遺伝子を導入して、特異的遺伝子をノックアウトすることによって修飾することができる。修飾は、アンチセンスDNA又はRNAiを導入する場合において、一時的とすることができ、また、遺伝子を削除し、標的タンパク質のアンチセンスｍRNAをコード化する遺伝子を導入し、優勢劣性遺伝子などを加えることによって永久的なものとすることができる。研究動物は、株が自然に変態を生じ、生じた遺伝的に修飾した宿主を有する胎児又は他の細胞の遺伝的修飾を繁殖又は使用した結果物である種々の株を使用することができる。ノックアウトマウスは、文献に広範に記載されている。本発明の目的のために、無傷の宿主、無傷の宿主からの組織、又は無傷の宿主からの細胞を使用することができる。ノックアウト及びノックインマウスの開発の説明は、Nozawa, et al., Blood, 2001 98: 525-32; Kotani, et al., Biochem. J., 2001, 357: 827-34; Zhou, et al., Int. J. Radiat. Biol., 2001, 77: 763-72; and Chang, et al., Mol. Cell. Endocrinol.,2001, 180 :39-46 及びここで引用した参照文献であり、遺伝的に修飾されたマウスに関する多量の刊行物のみを提供する。加えて、ハイブリドーマを使用し、所望の遺伝子を有する最初の細胞は、最初の細胞からの染色体が安定に維持される条件下、不死化細胞と融合されるハイブリッドーマを使用することができる。遺伝子は、転写因子、興味のタンパク質、例えば、非ヒト宿主細胞におけるヒトタンパク質とすることができ、また、タンパク質の向上した発現を提供する。

全ての細胞タンパク質、特に内部細胞タンパク質の状況は、融合タンパク質が興味のタンパク質の代理として利用することができる限度において本発明によって決定することができる。なぜなら、すべてのタンパク質は、幾分の修飾、例えば、分解を受けるからである。タンパク質の性質は、例えば、位置、量、他のタンパク質との複合体形成、例えば、リン酸化反応又は脱リン酸化反応等の修飾などの状態によって意図される。測定の条件下、生物学的に活性な融合タンパク質のED活性を変化させるいずれの修飾も検出に適用させることができる。これらの修飾は、1又はそれ以上のタンパク質との複合体形成、例えば、アセチル基、リン酸基、メチル基、硫酸塩、脂肪酸エステル、アルコキシル化などの基を除去又は追加する化学修飾、区間において活性の違いを検出することができる転座などを含む。大部分に対して、興味のタンパク質は、感染性の病気、遺伝子欠陥、突然変異体、薬剤への応答、腫瘍形成、炎症反応など、健康機能に関するであろう。したがって、融合タンパク質のEDの活性における変化は、診断における生理学的機能及び哺乳類宿主の治療に関係し、新生物、分化、ストレスなどの細胞の状態を指標することができる。

分解は、追加の測定による他の修飾から容易に区別することができる。融合タンパク質のEAとの活性を知るために、融合タンパク質を解離するための抗体又は他の結合化合物を使用し、融合タンパク質の数を決定し、融合タンパク質を単離することができる。溶解物に存在する全融合タンパク質からの活性と、観察された活性との間の違いは、融合タンパク質の分解以外の相互作用の指標である。観察されるシグナルが、分解以外の現象に関係するように、細胞内で細胞サイクル中の融合タンパク質の量を把握しなければならない。全細胞量は、上述した溶解物、及び測定での結果を比較用に使用するためにグラフ化した修飾の存在不存在における融合タンパク質の異なる量で観察されるシグナルを使用して決定することができる。

主要構築物を含む細胞は、興味の経路に関連するタンパク質、興味のタンパク質の生産の薬剤又は薬剤候補の存在下など環境における変化の影響、発現調節における変化、タンパク質の発現を阻害する効果、細胞経路及びその周辺を阻害する経路、レセプターによるシグナルの形質導入の影響、形成及び分解などの割合に関連するタンパク質の発現レベルなどを同定するのに使用することができる。転写を誘導する特異的経路に興味がある場合、遺伝子構築物は、興味の遺伝子に関係する興味の調節領域を有するであろう。

記載すべき最も簡単な手順は、培養における細胞の使用、溶解物の分析である。この場合、細胞が培地において成長する。必要に応じて、融合タンパク質及び他の構築物をゲノムの中へ組み込まれた細胞へ存在させることができ、DNAを細胞へ機能的な翻訳用に導入する種々の方法によって一次的に加えることもできる。細胞は培地又は生体内とすることができる。これらの方法は、前述したように、十分に文献において例示されている。例えば，抗生物質耐性、検出可能なシグナルの開発物など構築物からなる細胞の選択用の融合タンパク質を有するマーカーを使用することによって、融合タンパク質からなる培地において細胞を構築物が存在しない細胞から分離することができる。一度、融合タンパク質が発現すると、細胞の環境は、所望により改変することができる。候補の成分、レセプター用リガンド、表面膜、又は核などへのリガンドを加え、これらの二つを組み合わせて使用することができる。培養媒体における変化を作ることができ、他の細胞を因子の分泌用に又はトランスフォームされた細胞に結合するために加えることができ、ウイルスなども加えることができる。環境に対して、異なる時間間隔で、影響を記録し、培養の部分標本を採取するための十分か時間が与えられるれば、細胞をEA、酵素基質，及び読まれた産物からのシグナルからなる溶解混合物で溶解することができる。その後、溶解物が、融合タンパク質の異なる量で混合し、融合タンパク質の量が決定されるスタンダードを使用することによって、この結果を、融合タンパク質が存在しテ要る量と関連させることができる。その後、シグナルが溶解物における活性融合タンパク質の量と関連するグラフを有するであろう。

便宜上、システムは、測定の主要な構成要素のすべて又はいくつかを含むことが可能なキットとして提供する。例えば,キットはベクターの一部、例えば、通常弱めらたプラスミド、ウイルス、などの発現構築物を含み、前記発現構築物は、マーカー、組み込み用タンパク質をコード化する遺伝子、複製開始部位などを含むことができる。発現構築物に加えて、キットは、EA又は同等物、例えばEA用の発現構築物、β―ガラクトシターゼ用の基質、を含み、加えて、一又はそれ以上の細胞株、又は主要細胞、ED存在量に関連する対応のグラフ、緩衝液などを含む。いくつかの例において、細胞は、所望の環境、例えば、興味の経路に伴うタンパク質の発現の高いレベル、表面膜レセプター、GPCR,核レセプター、例えば、ステロイドレセプター、転写因子などを提供するのに設計することができ、又は変異させることができ、それによって、融合タンパク質の天然タンパク質の発現に影響する発現のレベルを減少させる。人は、発現のレベルを向上させることに関心がある。

試験
IKB-ED融合タンパク質の生産
IKB及びEDをコード化するｃDNA(図1)をPfuDNAポリメラーゼで増幅した（Stratagene,CA）。IKBα及びIKB Mをフォワードプライマー：５‘CCGAAGCTTATGTTCCAGGCGGCCGAG-３’（SEQ ID NO:１）及びリバースプライマー５‘-ATAGGATCCTAACGTCAGACGCTGGCC−３’(SEQ ID NO:２)を使用して増幅した。これらのプライマーは、PCR産物の５‘末端でHindIIIを、３’末端でBamHIを組み込んだ。また、IKBの停止コドンを、EDを有するオープンリーディングフレームを提供するために除去した。ｐCMV-IKB及びｐCMV-IKBM（CLONETECH, CA）をPCR鋳型として使用した。IKB Mは、アミノ酸残基３２及び３６でのセリンのアラニンへの変異を含む。これら2つの部位は、IKBのホスホリル化へ重要であり、変異は、IKBの分解に対する耐性を生じさせる(Brown、Gerstbergger,Carlson,Franzoso, Science,1995 Mar 10; 267(5203): 1485-8)。他方、EDをフォワードプライマー：５‘-ATAGGATCCATGAGCTCCAATTCACTGGCCG-３’｛SEQ ID NO:3｝及びリバースプライマー５‘ATAAGAATGCGGCCGGCCTATTCGCCATTCAGGCTGCGC-３’｛SEQ ID NO:４｝。フォワードプライマーは、Bam HI部位EDへ組み込み、リバースプライマーNotI部位をEDへ停止コドンと共に組み込んだ。増幅を92℃で1分間DNAを変性させ、52℃で1分間アニ-ルし、その後、72℃で2分間伸長し、その後全部で29回繰り返すPCRプログラムを使用した。増幅したPCR産物はBam HI部位でライゲートし、生じた融合構築物をHind III及びNotIの部位で哺乳類発現ベクターpCMVの中へサブクローン化し、構築物設計pCMV-IKB−EDを生じた。ｐCMVベクターは、IKBαがPCMV−IKB−ED融合構築物によって置換されるPCMV-IKBα（CLONTECH、CA）由来とした。ｐCMV-ED構築物は、分子生物学法のスタンダードに従って(Maniatis et al)、EDPCR産物をBam HI部位及びNot I部位へ挿入することによって得ることができた。

HeLa細胞におけるTNFα-誘導IKB-ED分解
Hela細胞を、感染前24時間24個のウエルプレートへ播種した。0.2５μgのDNAをFugene 6（Roche）を使用して製造者のプロトコールに従って各ウエルの中へ感染させた。感染後24時間、細胞をTNFα(Sigma)の処理へ種々の高度で30分間さらした。その後、培地を除去し、細胞を90μlの細胞溶解緩衝液において溶解した。30μlの細胞溶解物を、10μl EA試薬が加えられた384個のウエルプレートへ移した。測定を3回繰り返して行なった。15μlのケミルミネッセンス物質の添加前に、プレートを室温で30分間インキュベートした。物質添加後、プレートを30分間判読した。未処理の細胞を100％活性化へ標準化した。図3に示すように、TNFαはED活性を用量依存的に減少させることができ、このことは、野生型IKBの分解を示す。対照的に、突然変異体型は、予想されたように、TNFα処理による用量依存的なED活性の減少を示さなかった。この結果は、融合タグとしてのEDは、IKB生物学的機能を変化させず、生体内でIKB分解をモニターすることが出来ることを証明した。加えて、IKB-ED分解は、上流のコンポーネント活性化に特異的に関連した。IKB-ED分解は、標識されていないIKBと同様に32及び36残基でIKBホスホリル化に依存した。

Hela細胞におけるIL-1-誘導IKB-ED分解
細胞のIL-1活性が誘導されたIKBの分解を通じてNE-KB経路活性を生じた。細胞におけるED標識したIｋBが、IL-１経路活性をモニターできることを確認するために、HeLa細胞を上述したように24ウエルプレートにおいて同様に、ｐCMV- IKB -EDまたはｐCMV−IKB M-Edで一時的に感染させた。細胞をその後、IL-1（Sigma）で種々の濃度で30分間処理し、その後、ED活性を測定した。図４に示したように、IKB-ED活性は、用量依存的にIL-１処理で減少する一方、IKB、IKB M-EDの突然変異型はIL-1誘導分解に対して耐性であった。この結果は、HeLa細胞において発現したIKB−EDは、内因性神経芽細胞IL-1レセプター活性をモニターするのに使用することできることを証明した。

神経芽細胞腫細胞株SK-N-DHにおけるGｑ-結合GPCR活性
Gq結合GPCRレセプター活性がNF-KB経路活性を生じることが報告された。IKB-ED融合タンパク質がGPCR活性をモニターするための機能的マーカーとして使用することができることを証明するために、神経芽細胞腫細胞株SK-N-SHを使用した。この細胞株は内生的にM3レセプターを発現することを報告した。このレセプターは、Gαq結合する。カルバコールは、M3レセプターを活性化するための非選択的アゴニストとして知られる。SK-N−SH細胞（ATCC）を10％胎児ウシ血清及び２ｍMグルタミンで補完したMEM培地(Gibco)において培養した。細胞を、実験一日前に24ウエルプレートの中へ播種した。その後、ウエル当たり0.25μgDNAを細胞をFugene６と感染させるのに使用した。感染24時間後、細胞をカルバコールで、20分間37℃で処理した。その後、細胞を溶解し、ED活性を上述したように測定した。図５に示すように、M3活性を誘導するカルバコールをIKB-EDの分解によって指示し、減少したRLUリーディングを生じた。未処理の細胞を100％活性へ標準化した。カルバコールの30μM処理において、ED活性の50％のみを保持した。RLUの減少は、IKB−ED融合タンパク質の誘導された分解を指示した。これに対して、IKB M-EDは、活性における劇的な減少を示さなかった。ED活性の９２％以上は、IKB M-ED発現細胞において30μMカルバコール処理後も維持された。この結果は、IKB標識EDは、GPCR活性をモニターすることにも使用することが出来ることを証明した。

EGFR活性はIKB-PL分解を導く
IKB-PLを安定的に発現するHela細胞を使用した。細胞がEGFに対して応答していることを確かめるために、細胞可視可測定を行なった。HeLa-IKB細胞を0.5％FBSを有するDMEMへウエル当たり5000細胞の密度を有する96ウエルプレートに播種し、ｒHEGFの連続的な投与を行なった。72時間後、細胞可視測定を細胞タイター-Glo ルミネッセンス 細胞可視測定キット（Promega）を使用して行なった。結果は、可視できる細胞数が、用量依存的にEGF誘発へ応答することができることを示した(図１７)。

Hela細胞のEGFへの応答ををテストするために、IKB-PLを発現するHela細胞をウエル当たり8000個の密度を有する96-ウエルプレートにおいて0.5％FBSを含むDMEM培地において播種した。37℃で５％CO２下インキュベートした後、細胞をシクロヘキシミド(10μg/ml)で30分間予め処理し、その後rhEGFの連続投与に2時間曝した。IKB−PL分解をDiscoveRx 酵素断片相補性（EFC）測定を使用して検出した。結果は、用量依存的なEGF誘発へのIKB分解を証明した(図１８)。

ウエスタンブロティングを使用したPL−PPAR融合タンパク質の特性
PL-PPARの発現は、全細胞溶解物又は免疫沈澱物をウエスタンブロティングすることによっても確認した。沈殿用に１μgの抗PPAR抗体（Santa Cruz：sc-７１９６）をタンパク質A−セファロースビーズ上でPBS緩衝液中で一晩中４℃で固定化した。ビーズをPBS緩衝液で２回洗浄し、室温で１時間細胞溶解物でインキュベートした。その後、ビーズを４回PBS緩衝液で洗浄し、LDSサンプル緩衝液中で１００℃で５分間沸騰させた。その後、１５μlの全細胞溶解物又は免疫沈澱物を、NuPage ４-１２％ビスートリス プレキャスト ポリアクリルアミドゲルにかけ、ニトロセルロース膜上にブロットした。その後、膜を、抗体でPPARγへ精査し、その後、二次抗体がアルカリ性フォスファターゼへ結合した。内因性PPARγ(５１ｋDA)及び組み換え発現したPL−PPARγ(５８ｋDA)に対応するバンドは、アルカリ性フォスファターゼの発色性基質を使用して可視化した。

PL−PPARγのMG132用量依存的な増加
PL-PPAR発現レベルを増加した濃度のMG132の存在下でテストした(図１１)。実験を、MG132の表示された濃度を使用する以外、上述したように行った。

PL-PPARγ１の基礎的な分解
PPARγ１タンパク質の分解がいくつかの文献において立証されているが、当方は、それら実験においてPLタグの付着が分解を誘因したかどうか調べた。(文献として、例えば、Floyd et al., 2002 J.Biol.Chem., 277, 4062-8; Waite,et al., 2001 icid, 276, 7062-8; Hauser, et al., 2000 icid, 275, 18257-33; Dennis, et al., 2001 Front. Biosci., 6, D954-9 and Wijayayatne and McDonnell 2001 J. Biol. Chem., 276, 35684-92.)。当方は、長く残存したタンパク質EDへ融合したGFPタンパク質をテストした（GFP-PL）。PL-PPARと異なり、GFP−PLは、いずれの分解も示さず(図１２)、PL-PPAR分解は、PPARタンパク質の特異的性質であった。

主要な発明が、細胞の機能、細胞の機能上の試薬の影響、細胞におけるターゲットの同定、細胞成分間の相互作用の同定を調査するため、また、医薬候補、細胞状態の変化の影響、例えば、細胞経路上での分化、腫瘍形成、有糸分裂、減数分裂などをスクリーニングするための力強いツールを提供することは上述の結果から明白である。この方法は、利用可能な成分を使用する率直的なものである。このシステムは、使用者が、興味の所望の遺伝子を予め設計したベクターの中へ導入することができ、ED(又はPL)を有するリーディングフレームにおいて遺伝子を有することができる場合、好都合な形で提供される。融合タンパク質を容易に調整され、分解が伴われる場合、ED(又はPL)はいずれかの末端で結合することができる。融合タンパク質が生物学的に活性であり、消極的又は積極的な背景において天然の遺伝子の代理として役立つことができる。加えて、融合タンパク質に対して構築物と相互作用するように特異的に修飾される細胞を提供することができ、制御された転写、例えば，融合タンパク質の活性に影響する誘導、発現、過剰発現などを提供する。主要な発明に対する他の用途も、医薬に対する間接的な応答、処理に対する応答、細胞における変化等をモニターする際にもまた利用することができる。

Claims (29)

1. 酵素ドナー（ED）として酵素の小断片及び酵素アクセプター（EA）としてより大きな酵素の断片からなる酵素系を使用し、２つの断片が、独立して複合体を形成して活性酵素を形成することを特徴とし、さらに、細胞タンパク質の代理と前記EDの融合タンパク質であって、該融合タンパク質が細胞環境に対して該細胞タンパク質と実質的に同じように応答する融合タンパク質をコード化する遺伝子発現構築物が導入されている細胞を使用する、細胞タンパク質の状況を決定する方法であって、
   前記方法が、前記細胞における融合タンパク質を前記細胞環境において発現させ、
   前記融合タンパク質を、前記EA及び検出可能な産物を形成する基質と結合させ、
   前記検出可能な産物を、前記細胞タンパク質の状況の指標として検出することからなる方法。
2. 前記酵素が、β―ガラクトシダーゼである請求項1記載の方法。
3. 前記結合が、溶解物から生じる前記融合タンパク質を含む請求項1記載の方法。
4. 前記結合が、無傷の細胞内にある請求項1記載の方法。
5. 前記細胞状況が、前記融合タンパク質の分解である請求項1記載の方法。
6. 前記EDは、興味ある前記タンパク質の末端にある請求項1記載の方法。
7. 前記細胞が、候補化合物の存在下で成長する請求項1記載の方法。
8. 前記融合タンパク質が、一時的に発現する請求項1記載の方法。
9. 酵素ドナー（ED）としてβ―ガラクトシターゼの酵素の小断片及び酵素アクセプター（EA）として前記β―ガラクトシターゼのより大きな酵素の断片からなる酵素系を使用し、２つの断片が、独立して複合体を形成して活性酵素を形成することを特徴とし、さらに、細胞タンパク質の代理と前記EDの融合タンパク質であって、該融合タンパク質が細胞環境に対して該細胞タンパク質と実質的に同じように応答する融合タンパク質を含む遺伝子発現構築物が導入されている細胞を使用する、細胞タンパク質の状況を決定する方法であって、
   前記方法が、前記細胞における前記融合タンパク質を前記細胞環境において発現させ、
   前記融合タンパク質を、前記EA及び検出可能な産物を形成する基質と結合させ、
   前記検出可能な産物を、前記細胞タンパク質の状況の指標として検出することからなる方法。
10. 前記EDが前記代理の末端へ融合する請求項９記載の方法。
11. 前記EDが37〜90個のアミノ酸である請求項9記載の方法。
12. 前記細胞タンパク質が、転写を制御する請求項9記載の方法。
13. 前記検出可能な産物が、前記細胞内で観察される請求項９記載の方法。
14. 前記検出可能な産物が、溶解物から得られた前記融合タンパク質によって観察される請求項９記載の方法。
15. 興味ある細胞タンパク質の代理へ融合した酵素ドナー（ED）を含む生物学的に活性な融合タンパク質の哺乳類宿主細胞内の状況を、前記融合タンパク質の前記EDに補完されて機能的活性酵素を形成する能力を有する酵素アクセプター（EA）の存在下、前記融合タンパク質の酵素活性を測定することによって決定するためのシステムであって、
    前記システムが、（１）前記宿主細胞において機能する転写及び翻訳調節領域と、前記転写及び翻訳調節領域の調節下の複数のクローニング部位（mcs）へ結合した前記EDをコード化するED配列を含むベクター、（２）酵素アクセプタータンパク質、（３）前記ED配列を有するリーディングフレームにおいて前記mcsへ挿入したとき、生物学的に活性なタンパク質、及び前記EAを補完する能力を有するEDを発現する遺伝子、（４）前記転写及び翻訳領域が機能的である哺乳類宿主細胞、及び（５）加水分解で検出可能なシグナルを生産する前記βガラクトシターゼ酵素用の基質からなるシステム。
16. 前記転写及び翻訳領域が、誘導可能である請求項15記載のシステム。
17. 前記転写及び翻訳領域が、本質的部分である請求項15記載のシステム。
18. 前記哺乳細胞が、ヒト細胞である請求項１５記載の方法。
19. 前記ベクターが、前記宿主細胞において一時的に発現可能である請求項15記載のシステム。
20. 前記ベクターが前記宿主細胞の中へ組み込まれるようになる請求項15記載のシステム。
21. 前記宿主細胞がEAを発現する請求項15記載のシステム。
22. 前記mcsは、ED配列の３‘末端で結合している請求項15記載のシステム。
23. 細胞のタンパク質へ結合したβ―ガラクトシターゼの小さい酵素ドナー（ED）断片の融合タンパク質を含む真核細胞。
24. 前記細胞が、不死化細胞である請求項23記載の細胞。
25. 前記細胞が、β―ガラクトシターゼの大きい酵素アクセプター（EA）の断片、及び検出可能な産物を生じるβ―ガラクトシターゼに対する基質をさらに含む請求項２３記載の細胞。
26. 細胞タンパク質へ結合したβ―ガラクトシターゼの小酵素ドナー(ED)断片の融合タンパク質からなる細胞溶解物。
27. さらに、β―ガラクトシターゼの大断片酵素アクセプター（EA）及び検出可能な産物を生じるβ―ガラクトシターゼに対する基質からなる請求項26記載の細胞溶解物。
28. IkBへ結合したβ―ガラクトシターゼの小断片酵素ドナー（ED）断片の融合タンパク質。
29. PPARγ１へ結合したβ―ガラクトシターゼの酵素ドナー（ED）断片の融合タンパク質。