JP5580505B2 - 遺伝子構築細胞モニターシステム - Google Patents
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Description
米国特許番号6,037,133号明細書は、IKB分解を測定するためにIKBと融合したグリーン蛍光タンパク質の使用を開示する。Li,など、J.Biol.Chem.,1999、274:21244-50.Douglas等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1984、81:3983-7は、ATP-2及びlacZの融合タンパク質を開示する。WO92/03559は、プロテイナーゼを測定するためにβ―ガラクトシダーゼのβ―相補性を使用する融合タンパク質が記載されている。WO01/0214は、融合タンパク質としてβ―ガラクトシターゼのα―ペプチドを使用する構造相補性により評価されたタンパク質の折り畳み及び/又は溶解性が記載されている。WO01/60840は、タンパク質の折り畳み及び溶解性を測定するために酵素ドナーβ―ガラクトシターゼからなる融合タンパク質を含む融合タンパク質が記載されている。Homma等、Biochem. Biophys.Res.Commun.、1995、215、452-8は、融合タンパク質の溶解性におけるβ―ガラクトシターゼのβ―断片の影響が記載されている。Abbas-Terki
等、Eur.J.Biochem.1999,266,517-23は、酵母における分子シャペロン熱―ショックタンパク質への生体内モデル基質としてのα相補性β―ガラクトシターゼが記載されている。Miller等、Gene,1984、29,247-50は、ヒトインスリンβ―鎖ペプチドを含む融合タンパク質用の定量的なβ―ガラクトシターゼα―相補性測定が記載されている。Thomas and Kunkel, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
1993. 90.7744-8 は、突然変異体率を測定するためのプラスミド含有EDが記載されている。
方法及び組成物、及び当該方法及び組成物を使用したシステムは、細胞の状況、例えば、興味のタンパク質の状態などを決定するために提供される。方法は、融合タンパク質を、細胞の状況と関連する興味のタンパク質と同等とみなして反映させて、細胞の状況の代理として融合タンパク質の状態を決定することを可能とする。この方法は、ED(又はPL)及びEAの複合体が、並列に断片を保持する他の実在物の不存在下、活性酵素を提供する場合、酵素ドナー(ED)又はプロラベル(PL)として言及される酵素小断片の使用、酵素アクセプターとして言及される融合タンパク質及びより大きい酵素断片の一部としての使用に依存する。サンプルにおける酵素活性は、EAと複合体を形成し、活性酵素を形成する際のEDの活性によって反映されるように細胞における細胞状況の代理として機能する。(1)融合タンパク質の発現又は(2)EAと複合体を形成する際又は複合体を形成したときのED(又はPL)の活性における変化により融合タンパク質を改変する結果を生じる状況は、細胞の変化の指標として測定することができる。小酵素断片はこの出願を通じてED又はPLという。
複合体を非共有的に結合させて活性酵素を形成した際に、この酵素が、分類の実例として、異なる酵素を独立して考慮しなければならない状況を除いて、以後しばしば言及される2つのペプチドを有するための基準を明らかにするものである。
84:7413-7417 ; see Mackey, et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,
85:8027-8031)。陽イオンリピッドの使用は、マイナスに荷電した核酸のカプセル封入を促進することができ、マイナスに荷電した細胞膜との融合を促進することもできる(Felgner and Ringold, 1989, Science, 337:387-388).生体内における神経系へのリポフェクションが最近達成された(Holt,et.al., 1990 , Neuron, 4:203-214)。生体内における神経系の中へ外因性遺伝子を導入するためのリポフェクションの使用は、特定の実行上の利点を有する。リピッドは、ターゲッティングの目的用に他の分子へ化学的に結合することモ可能である(Mackey, et al., 1988, supra参照)。標的ペプチド又は非ペプチド分子を化学的にリポソームへ結合することができる。
IKB-ED融合タンパク質の生産
IKB及びEDをコード化するcDNA(図1)をPfuDNAポリメラーゼで増幅した(Stratagene,CA)。IKBα及びIKB Mをフォワードプライマー:5‘CCGAAGCTTATGTTCCAGGCGGCCGAG-3’(SEQ ID NO:1)及びリバースプライマー5‘-ATAGGATCCTAACGTCAGACGCTGGCC−3’(SEQ ID NO:2)を使用して増幅した。これらのプライマーは、PCR産物の5‘末端でHindIIIを、3’末端でBamHIを組み込んだ。また、IKBの停止コドンを、EDを有するオープンリーディングフレームを提供するために除去した。pCMV-IKB及びpCMV-IKBM(CLONETECH, CA)をPCR鋳型として使用した。IKB Mは、アミノ酸残基32及び36でのセリンのアラニンへの変異を含む。これら2つの部位は、IKBのホスホリル化へ重要であり、変異は、IKBの分解に対する耐性を生じさせる(Brown、Gerstbergger,Carlson,Franzoso, Science,1995 Mar 10; 267(5203): 1485-8)。他方、EDをフォワードプライマー:5‘-ATAGGATCCATGAGCTCCAATTCACTGGCCG-3’{SEQ ID NO:3}及びリバースプライマー5‘ATAAGAATGCGGCCGGCCTATTCGCCATTCAGGCTGCGC-3’{SEQ ID NO:4}。フォワードプライマーは、Bam HI部位EDへ組み込み、リバースプライマーNotI部位をEDへ停止コドンと共に組み込んだ。増幅を92℃で1分間DNAを変性させ、52℃で1分間アニ-ルし、その後、72℃で2分間伸長し、その後全部で29回繰り返すPCRプログラムを使用した。増幅したPCR産物はBam HI部位でライゲートし、生じた融合構築物をHind III及びNotIの部位で哺乳類発現ベクターpCMVの中へサブクローン化し、構築物設計pCMV-IKB−EDを生じた。pCMVベクターは、IKBαがPCMV−IKB−ED融合構築物によって置換されるPCMV-IKBα(CLONTECH、CA)由来とした。pCMV-ED構築物は、分子生物学法のスタンダードに従って(Maniatis et al)、EDPCR産物をBam HI部位及びNot I部位へ挿入することによって得ることができた。
Hela細胞は、10%胎児ウシ血清及び2mMグルタミン(GIBCO、CA)で補完したDMEM媒体(GIBCO、CA)において培養しつづけた。一時的感染のために、細胞を実験前1日6ウエルプレートに播種した。各ウエルに対して、3μlのFugene 6を100μlの無血清培地へ希釈し、その後、プラスミドDNA1μgを加えた。ウエルへの滴下を加える前に、混合物を室温で15分間インキュベートした。プレートをその後、測定まで37℃でインキュベートした。
EGTA, 0.005 % Tween, 150 mM NaOH, 10 mM Mg アセテート、 14.6mM NaN3, pH69))10μlが加えられる384ウエルプレートの中へ感染させた。30分間室温でインキュベーションした後、15μlのケミルミネッセンス物質(EAコア緩衝液における4%のGalacton Star(登録商標)及び20%のEmerald(登録商標)(Tropix))を加えた。シグナルを、ウエル当たり1秒間の組み込み時間でLumicount(Packard)又はFluoroskan(Labsystem)上で解読した。
Hela細胞を、感染前24時間24個のウエルプレートへ播種した。0.25μgのDNAをFugene 6(Roche)を使用して製造者のプロトコールに従って各ウエルの中へ感染させた。感染後24時間、細胞をTNFα(Sigma)の処理へ種々の高度で30分間さらした。その後、培地を除去し、細胞を90μlの細胞溶解緩衝液において溶解した。30μlの細胞溶解物を、10μl EA試薬が加えられた384個のウエルプレートへ移した。測定を3回繰り返して行なった。15μlのケミルミネッセンス物質の添加前に、プレートを室温で30分間インキュベートした。物質添加後、プレートを30分間判読した。未処理の細胞を100%活性化へ標準化した。図3に示すように、TNFαはED活性を用量依存的に減少させることができ、このことは、野生型IKBの分解を示す。対照的に、突然変異体型は、予想されたように、TNFα処理による用量依存的なED活性の減少を示さなかった。この結果は、融合タグとしてのEDは、IKB生物学的機能を変化させず、生体内でIKB分解をモニターすることが出来ることを証明した。加えて、IKB-ED分解は、上流のコンポーネント活性化に特異的に関連した。IKB-ED分解は、標識されていないIKBと同様に32及び36残基でIKBホスホリル化に依存した。
細胞のIL-1活性が誘導されたIKBの分解を通じてNE-KB経路活性を生じた。細胞におけるED標識したIkBが、IL-1経路活性をモニターできることを確認するために、HeLa細胞を上述したように24ウエルプレートにおいて同様に、pCMV- IKB -EDまたはpCMV−IKB M-Edで一時的に感染させた。細胞をその後、IL-1(Sigma)で種々の濃度で30分間処理し、その後、ED活性を測定した。図4に示したように、IKB-ED活性は、用量依存的にIL-1処理で減少する一方、IKB、IKB M-EDの突然変異型はIL-1誘導分解に対して耐性であった。この結果は、HeLa細胞において発現したIKB−EDは、内因性神経芽細胞IL-1レセプター活性をモニターするのに使用することできることを証明した。
Gq結合GPCRレセプター活性がNF-KB経路活性を生じることが報告された。IKB-ED融合タンパク質がGPCR活性をモニターするための機能的マーカーとして使用することができることを証明するために、神経芽細胞腫細胞株SK-N-SHを使用した。この細胞株は内生的にM3レセプターを発現することを報告した。このレセプターは、Gαq結合する。カルバコールは、M3レセプターを活性化するための非選択的アゴニストとして知られる。SK-N−SH細胞(ATCC)を10%胎児ウシ血清及び2mMグルタミンで補完したMEM培地(Gibco)において培養した。細胞を、実験一日前に24ウエルプレートの中へ播種した。その後、ウエル当たり0.25μgDNAを細胞をFugene6と感染させるのに使用した。感染24時間後、細胞をカルバコールで、20分間37℃で処理した。その後、細胞を溶解し、ED活性を上述したように測定した。図5に示すように、M3活性を誘導するカルバコールをIKB-EDの分解によって指示し、減少したRLUリーディングを生じた。未処理の細胞を100%活性へ標準化した。カルバコールの30μM処理において、ED活性の50%のみを保持した。RLUの減少は、IKB−ED融合タンパク質の誘導された分解を指示した。これに対して、IKB M-EDは、活性における劇的な減少を示さなかった。ED活性の92%以上は、IKB M-ED発現細胞において30μMカルバコール処理後も維持された。この結果は、IKB標識EDは、GPCR活性をモニターすることにも使用することが出来ることを証明した。
ヒトM1ムスカリンレセプターを安定的に発現するCHO-K1細胞は、Euroscreen(Belgium)から得られた。細胞を10%胎児ウシ血清、ペニシリン、ストレプトマイシン及び400μg/mlG418を含むF-12培地で成長させた。細胞を感染1日前、24ウエルプレート上に播種した。製造者の指示にしたがって、PCMV-IKB-PLをFugene6を使用してCHOM1細胞の中へ一時的に感染させた。感染24時間後、培地を取り替え、細胞を異なる濃度の範囲で30分間カルバコールで処理した。培地を誘発後取り除き、補填的測定をケミルミネッセント読み出しで行なった。(図14)
ヒトMC4メラノコルチン4レセプターを安定的に発現するCHO−K1細胞は、Euroscreenから得た。細胞を10%胎児ウシ血清、ペニシリン、ストレプトマイシン及び400μg/ml G418を含むF-12培地で成長させた。細胞を感染1日前、6ウエルプレート上に播種した。製造者の指示にしたがって、PCMV-IKB-PLをFugene6を使用してCHO MC4細胞の中へ一時的に感染させた。感染24時間後、培地を取り替え、細胞を指示した濃度で30分間NDP-α-MSHで処理した。培地を誘発後取り除き、補填的測定をケミルミネッセント読み出しで行なった。(図15)
ヒトケモキンCCR3レセプターを安定的に発現するCHO−K1細胞は、Euroscreenから得た。細胞を10%胎児ウシ血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、5μg/mlピューロマイシン、100μg/mlヒグロマイシン、及び400μg/ml G418を含むF-12培地で成長させた。細胞を感染1日前、6ウエルプレート上に播種した。製造者の指示にしたがって、PCMV-IKB-PLをFugene6を使用してCHO MC4細胞の中へ一時的に感染させた。感染24時間後、培地を取り替え、細胞を指示した濃度で30分間エオタキシンで処理した。培地を誘発後取り除き、補填的測定をケミルミネッセント読み出しで行なった。(図16)
IKB-PLを安定的に発現するHela細胞を使用した。細胞がEGFに対して応答していることを確かめるために、細胞可視可測定を行なった。HeLa-IKB細胞を0.5%FBSを有するDMEMへウエル当たり5000細胞の密度を有する96ウエルプレートに播種し、rHEGFの連続的な投与を行なった。72時間後、細胞可視測定を細胞タイター-Glo ルミネッセンス 細胞可視測定キット(Promega)を使用して行なった。結果は、可視できる細胞数が、用量依存的にEGF誘発へ応答することができることを示した(図17)。
pcDNA3.1-PL-PPAR構築物を使用して、6ウエルプレートにおいて播種したHEK293細胞へ一時的に感染させた。Fugene6を遺伝子移送系として使用した。感染を製造者の指示に従って実施した。1μgのプラスミドDNA及び3μlのFugene6試薬を共に混合し、HEK293細胞の70%密集単一層上へ適用した。感染24時間後、細胞をPBSで洗浄し、その後、穏やかな界面活性剤を含有する溶解物緩衝液(480μl)において溶解した(CHAPS)。全細胞溶解物をEFC(ED及びEAの酵素断片相補部分)活性又はウエスタンブロティング用に調べた。全細胞溶解物30μLを384ウエルプレートに三重に置床した。EA試薬10μlをウエルへ加えた。室温で1時間インキュベーション後、15μLnoケミルミネッセンス物質を加え、βガラクトシターゼ相補活性をケミルミネッセントリーダーを使用して1時間以内に測定した(Packard)。EFC活性ネガティブ対照例を、対照ウエルにおけるEA試薬を置換するのに加えたEA希釈緩衝液の添加のものか、又は非感染細胞の細胞溶解物のいずれかであった。
PL-PPARの発現は、全細胞溶解物又は免疫沈澱物をウエスタンブロティングすることによっても確認した。沈殿用に1μgの抗PPAR抗体(Santa Cruz:sc-7196)をタンパク質A−セファロースビーズ上でPBS緩衝液中で一晩中4℃で固定化した。ビーズをPBS緩衝液で2回洗浄し、室温で1時間細胞溶解物でインキュベートした。その後、ビーズを4回PBS緩衝液で洗浄し、LDSサンプル緩衝液中で100℃で5分間沸騰させた。その後、15μlの全細胞溶解物又は免疫沈澱物を、NuPage 4-12%ビスートリス プレキャスト ポリアクリルアミドゲルにかけ、ニトロセルロース膜上にブロットした。その後、膜を、抗体でPPARγへ精査し、その後、二次抗体がアルカリ性フォスファターゼへ結合した。内因性PPARγ(51kDA)及び組み換え発現したPL−PPARγ(58kDA)に対応するバンドは、アルカリ性フォスファターゼの発色性基質を使用して可視化した。
一時的発現PL-PPARタンパク質のプロテオソーム分解を、NIH3T3、ECV304、及びHela細胞において検出した。細胞をpcDNA3.1-PL-PPARで感染させて、感染24時間後、培地を取り除き、細胞を担体(DMSO)又はMG132(プロテオソーム阻害剤)のいずれかで処理した。感染を上述したように、6ウエルプレートで実施した。細胞をPBS緩衝液で洗浄し、CHAPS(穏やかな界面活性剤)を含有する溶解物緩衝液480μlに溶解し、三回ED−EA相補性用にテストした。細胞溶解物の30μlを384ウエルプレートのウエルへ設置した。その後、EA溶液10μLを加え、相補性の反応を1時間、室温で行なった。ケミルミネッセント物質15μL(0.4mM Galacton-Star(Applied Biosystems,Bedford,MA)及び2mg.ml Emerald II基質(Applied Biosystems, Bedford, MA)をウエルへ加え、ケミルミネッセントシグナルをケミルミネッセントリーダーを使用して判読した(Packard LumiCount, Packard Biosystems)(図10A,10B及び10C)。
PL-PPAR発現レベルを増加した濃度のMG132の存在下でテストした(図11)。実験を、MG132の表示された濃度を使用する以外、上述したように行った。
PPARγ1タンパク質の分解がいくつかの文献において立証されているが、当方は、それら実験においてPLタグの付着が分解を誘因したかどうか調べた。(文献として、例えば、Floyd et al., 2002 J.Biol.Chem., 277, 4062-8; Waite,et al., 2001 icid, 276, 7062-8; Hauser, et al., 2000 icid, 275, 18257-33; Dennis, et al., 2001 Front. Biosci., 6, D954-9 and Wijayayatne and McDonnell 2001 J. Biol. Chem., 276, 35684-92.)。当方は、長く残存したタンパク質EDへ融合したGFPタンパク質をテストした(GFP-PL)。PL-PPARと異なり、GFP−PLは、いずれの分解も示さず(図12)、PL-PPAR分解は、PPARタンパク質の特異的性質であった。
PL−PPAR構築物及び感染を上述したように行なった。その後細胞を使用し、細胞内のPL-PPARタンパク質の局在を検出した。
Claims (24)
- 候補化合物に応じた細胞タンパク質の分解を定めるための方法であって、前記方法は、酵素ドナー(「ED」)としてのβ−ガラクトシダーゼの小断片および酵素アクセプター(「EA」)としての前記β−ガラクトシダーゼのより一層大きな断片を採用し、2つの断片は、活性な酵素を形成するために独立して複合化することによって特徴付けられ、前記方法はさらに、前記EDと、前記細胞タンパク質または細胞環境に対して細胞タンパク質と実質同じように応答する前記細胞タンパク質の代替物との融合タンパク質をコード化する遺伝子発現構築物が導入されている真核細胞を採用し、融合タンパク質は、細胞環境に対して細胞タンパク質と実質同じように応答し、前記方法は次の
前記細胞において前記融合タンパク質を前記候補化合物の存在下に発現させること、
前記融合タンパク質を、前記EAおよび検出可能な産物を形成する基質と結合させること、および
前記検出可能な産物を、前記細胞タンパク質の分解の指標として検出することであり、前記検出可能な産物のレベルにおける減少は、前記候補化合物に応じた前記細胞タンパク質の前記分解を示すこと
を含む、方法。 - 前記細胞タンパク質はIκBである、請求項1に記載の方法。
- 前記候補化合物は膜受容体のためのリガンドである、請求項1に記載の方法。
- 前記EDはβ−ガラクトシダーゼの37から90個までのアミノ酸を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記EDは、興味ある前記細胞タンパク質のための前記代替物の末端にある、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞は候補化合物の存在下で増殖する、請求項1に記載の方法。
- 前記融合タンパク質は一時的に発現される、請求項1に記載の方法。
- 候補化合物に応じた細胞タンパク質の核に対する転座を定めるための方法であって、前記方法は、酵素ドナー(「ED」)としてのβ−ガラクトシターゼの小断片および酵素アクセプター(「EA」)としての前記β−ガラクトシターゼのより一層大きな断片を含む酵素システムを採用し、2つの断片は、活性酵素を形成するために独立して複合化することによって特徴付けられ、前記方法はさらに、前記EDと、前記細胞タンパク質または細胞環境に対して細胞タンパク質と実質同じように応答する前記細胞タンパク質の代替物との融合タンパク質を含む遺伝子発現構築物が導入されている真核細胞を採用し、融合タンパク質は、細胞環境に対して細胞タンパク質と実質同じように応答し、前記方法は次の
前記細胞において前記融合タンパク質を前記候補化合物の存在下に発現させること、
前記融合タンパク質を、前記EAおよび検出可能な産物を形成する基質と結合させること、および
前記検出可能な産物を、前記細胞タンパク質の転座の指標として検出することであり、前記検出可能な産物のレベルにおける変化は、前記候補化合物に応じた前記細胞タンパク質の転座の指標であること
を含む、方法。 - 前記EDは前記細胞タンパク質のための前記代替物の末端にある、請求項8に記載の方法。
- 前記EDは37から90個までのアミノ酸のものである、請求項8に記載の方法。
- 前記融合タンパク質は一時的に発現される、請求項8に記載の方法。
- 哺乳類宿主細胞において、
分解され、または核に輸送される細胞タンパク質または細胞環境に対して細胞タンパク質と実質同じように応答する前記細胞タンパク質の代替物と酵素ドナー(「ED」)が融合した融合タンパク質、
機能的に活性なβ−ガラクトシダーゼ酵素を形成するために前記融合タンパク質の前記EDによって補完される能力を有する酵素アクセプター(「EA」)の存在下に、
生物学的に活性な前記融合タンパク質が分解され、または輸送されるかどうかを、前記融合タンパク質の酵素活性を測定することによって定めるためのシステムであって、前記システムは次の
(1)前記宿主細胞において機能する転写および翻訳の調節領域と、前記転写および翻訳の調節領域の調節下の複数クローニング部位(「mcs」)に接合した前記EDをコード化するED配列と、前記ED配列を有する読み枠において前記mcsへ挿入したとき、生物学的に活性なタンパク質、および前記EAを補完する能力を有するEDを発現する遺伝子とを含むベクター、
(2)酵素アクセプタータンパク質、
(3)前記転写および翻訳の領域が機能しうる哺乳類宿主細胞、および
(4)加水分解に際して検出可能なシグナルを生成する前記β−ガラクトシターゼ酵素のための基質
を含む、システム。 - 前記転写および翻訳の領域は誘導可能である、請求項12に記載のシステム。
- 前記転写および翻訳の領域は構成的である、請求項12に記載のシステム。
- 前記哺乳細胞はヒト細胞である、請求項12に記載のシステム。
- 前記ベクターは前記宿主細胞において一時的に発現される、請求項12に記載のシステム。
- 前記ベクターは前記宿主細胞中に組み込まれる、請求項12に記載のシステム。
- 前記宿主細胞はEAを発現する、請求項12に記載のシステム。
- 前記mcsは前記ED配列の3′末端で接合している、請求項12に記載のシステム。
- 核に輸送される細胞タンパク質に接合したβ−ガラクトシターゼの小酵素ドナー(ED)断片の融合タンパク質を含む真核細胞であって、融合タンパク質は、活性なβ−ガラクトシダーゼ酵素を生成するために候補化合物の存在下にβ−ガラクトシダーゼ酵素の大酵素アクセプター(EA)断片と組み合わさり、前記酵素は検出可能な産物を生成するために基質に作用し、検出可能な産物のレベルにおける変化は前記真核細胞における前記細胞タンパク質の核に対する転座での変化を示す、細胞。
- 前記細胞は不死化細胞である、請求項20に記載の細胞。
- 分解される細胞タンパク質に接合したβ−ガラクトシターゼの小酵素ドナー(ED)断片の融合タンパク質を含む細胞溶解物であって、融合タンパク質は、活性なβ−ガラクトシダーゼ酵素を生成するために候補化合物の存在下にβ−ガラクトシダーゼの大酵素アクセプター(EA)断片と組み合わさり、前記酵素は検出可能な産物を生成するために基質に作用し、検出可能な産物のレベルにおける変化は前記細胞溶解物における前記細胞タンパク質の分解での変化を示す、細胞溶解物。
- IκBに接合したβ−ガラクトシターゼの小酵素ドナー(ED)断片の融合タンパク質。
- PPARγ1に接合したβ−ガラクトシターゼの小酵素ドナー(ED)断片の融合タンパク質。
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