WO2009043953A1 - Empleo de inhibidores de ppar alfa truncado en el tratamiento de la insuficiencia cardiaca en sujetos con cardiopatía hipertensiva - Google Patents

Empleo de inhibidores de ppar alfa truncado en el tratamiento de la insuficiencia cardiaca en sujetos con cardiopatía hipertensiva Download PDF

Info

Publication number
WO2009043953A1
WO2009043953A1 PCT/ES2008/000620 ES2008000620W WO2009043953A1 WO 2009043953 A1 WO2009043953 A1 WO 2009043953A1 ES 2008000620 W ES2008000620 W ES 2008000620W WO 2009043953 A1 WO2009043953 A1 WO 2009043953A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
truncated
pparα
cells
heart failure
ppar
Prior art date
Application number
PCT/ES2008/000620
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Javier Beaumont Ezcurra
Domingo Francisco Javier Diez Martinez
María José GOIKOETXEA LAPRESA
Original Assignee
Proyecto De Biomedicina Cima, S.L.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. filed Critical Proyecto De Biomedicina Cima, S.L.
Publication of WO2009043953A1 publication Critical patent/WO2009043953A1/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70567—Nuclear receptors, e.g. retinoic acid receptor [RAR], RXR, nuclear orphan receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds

Definitions

  • the present invention relates, in general, to the use of a truncated isoform inhibitor of the receptor activated by peroxisome proliferators of alpha (PPAR ⁇ ) in the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of heart failure in subjects with hypertensive heart disease.
  • PPAR ⁇ peroxisome proliferators of alpha
  • Hypertension a disease characterized by high blood pressure, affects a substantial number of the human population.
  • the consequences of persistent hypertension include vascular damage to the ocular, renal, cardiac and cerebral systems, and the risk of these complications increases with increasing blood pressure.
  • the basic factors that control blood pressure are cardiac output and peripheral vascular resistance.
  • the sympathetic nervous system regulates peripheral vascular resistance through direct effects on alpha and beta adrenergic receptors, as well as through indirect effects on the release of renin.
  • pharmacological treatment for hypertension is aimed at specific components of blood pressure regulating systems, with different mechanisms of action that define the different classes of drugs, including diuretics, beta-adrenergic receptor antagonists (beta blockers), inhibitors of angiotensin converting enzyme (ACEI) and calcium channel antagonists, angiotensin II AT1 receptor antagonists and aldosterone inhibitors.
  • diuretics beta-adrenergic receptor antagonists (beta blockers)
  • ACEI angiotensin converting enzyme
  • calcium channel antagonists angiotensin II AT1 receptor antagonists
  • aldosterone inhibitors aldosterone inhibitors.
  • Thiazide-type diuretics are used in hypertension to reduce peripheral vascular resistance through their effects on the excretion of sodium and water.
  • This class of drugs includes hydrochlorothiazide, chlorothiazide, methyl thiazide and cyclothiazide, as well as related agents indapamide, metolazone and chlorthalidone.
  • beta blocking action is to block the subtype of the beta-1 adrenergic receptor of the heart to reduce heart rate and expenditure cardiac.
  • Adverse effects of beta blockers include asymptomatic bradycardia, exacerbation of congestive heart failure, gastrointestinal disturbances, increased airway resistance, masked symptoms of hypoglycemia and depression. They can cause elevated serum triglycerides and may lower high density lipoprotein cholesterol.
  • ACEIs decrease peripheral vascular resistance, as well as sodium and water retention.
  • ACEIs increase the levels of bradykinin and prostaglandins, endogenous vasodilators.
  • Adverse effects of ACE inhibitors include hypotension, worsening renal function, potassium retention, cough and angioedema.
  • Calcium channel antagonists reduce the entry of calcium into vascular smooth muscle cells and produce systemic vasodilation, which results in its antihypertensive effect. Calcium channel antagonists do not have the adverse metabolic and pharmacological effects of thiazides or beta blockers, and can therefore be useful in patients with diabetes, peripheral vascular disease or chronic obstructive pulmonary disease.
  • Two calcium channel antagonists, Verapamil and Diltiazem have serious adverse cardiovascular effects on atrioventricular cardiac conduction in patients with preexisting conduction abnormalities, and can worsen bradycardia, heart block and congestive heart failure. Other minor adverse effects of calcium channel antagonists include peripheral edema, vertigo, dizziness, headache, nausea and flushing, especially with nifedipine and nicardipine.
  • Angiotensin II receptor (ARA) antagonists block the actions of angiotensin II that develop through its ATl receptors, such as activation of the sympathetic nervous system, increased vasoconstriction, increased aldosterone and activation of growth factors
  • ARA angiotensin II receptor
  • Aldosterone inhibitors inhibit the actions derived from chronic elevation of aldosterone, such as an increase in the production of vascular and cardiac collagen, and a decrease in plasma and tissue levels of potassium and magnesium.
  • the main adverse effects of aldosterone inhibitors are gynecomastia and sexual impotence, and hyperkalemia.
  • Many other agents are available to treat essential hypertension. These agents include prazosin and terazocine, alpha 1 and alpha 2 adrenergic receptor antagonists, clonidine, methyldopa, guanabenz, guanfacine, reserpine, guanadrel and direct acting vasodilators such as hydralazine and minoxidil.
  • These agents although effective, produce appreciable symptomatic side effects, which include reflex sympathetic stimulation and fluid retention, orthostatic hypotension and impotence.
  • antihypertensive agents activate compensatory vasotensive mechanisms, such as increased renin release, elevated aldosterone secretion and increased sympathetic vasoconstrictor tone, which are designed to return blood pressure to pretreatment levels, and which can lead to salt and water retention. , edema and finally to tolerance to the antihypertensive actions of the agent.
  • Hypertensive heart disease is defined as the cardiac involvement caused by the sustained increase in blood pressure. It is characterized by an excessive increase in the mass of the left ventricle (left ventricular hypertrophy, LVH) in the absence of another cause other than arterial hypertension. It has been postulated that the development of hypertensive LVH could be an adaptive response to normalize ventricular wall stress and to maintain cardiac function; With the passage of time, however, LVH is maladaptive, leading to thickening and / or dysfunction of the left ventricle. Frequently, the heart with left ventricular hypertrophy evolves into systolic and / or diastolic dysfunction that manifests clinically as heart failure (HF).
  • HF heart failure
  • HF is a syndrome characterized in that the heart is unable to pump enough blood to meet the metabolic requirements of the tissues or only achieves it at the cost of maintaining high filling pressures.
  • HF can be manifested by the presence of symptoms that indicate poor tissue perfusion (fatigue, poor tolerance to exercise, etc.) and / or congestion of vascular beds (dyspnea, pleural effusion, pulmonary edema, jugular vein distension, edema peripheral, etc.).
  • vascular beds dispnea, pleural effusion, pulmonary edema, jugular vein distension, edema peripheral, etc.
  • HF The main pharmacological treatments of HF include: 1) Angiotensin-converting Enzyme Inhibitors (ACEI) whose main beneficial effects are a decrease in peripheral vasoconstriction and decrease in post-loading of the left ventricle, slowing of progressive left ventricular dilation which contributes to the appearance and progression of HF, prevention of the appearance of ischemic events due to their beneficial actions at the level of vascular endothelium and prevention of sudden death, probably by a multifactorial mechanism.
  • ACEI treatment has several adverse effects, such as hypotension, worsening renal function, potassium retention, cough and angioedema.
  • beta blockers produce an improvement in systolic function, contractility and the mechanics of cardiac contraction, which is greater than that obtained by ACEIs.
  • the main adverse effects of beta blockers are a worsening of functional capacity, fluid retention / overload, hypotension, bradycardia, bronchospasm, cold extremities, worsening of claudication, sexual dysfunction, and nightmares.
  • Angiotensin II receptor (ARA) antagonists block the actions of angiotensin II that develop through its ATl receptors, such as activation of the sympathetic nervous system, increased vasoconstriction, increased aldosterone and growth factor activation, among others.
  • the ARA's main adverse effects are hypotension, renal dysfunction and potassium retention.
  • Aldosterone inhibitors inhibit the actions derived from chronic elevation of aldosterone, such as an induction of both vascular and cardiac collagen generation, a decrease in plasma and tissue levels of potassium and magnesium, among others.
  • the main adverse effects of these drugs are gynecomastia and sexual impotence, and hyperkalemia.
  • Diuretics which act at the renal level interfering with the retention of sodium and water that occurs as a compensation mechanism in the presence of a situation of reduction of cardiac output. In this way, they are able to alleviate the symptoms of pulmonary congestion and reduce peripheral edema in a matter of hours or days, unlike other drugs, whose beneficial effects usually manifest themselves later.
  • the main adverse effects of diuretics are those related to the loss of potassium and magnesium (which predisposes to the appearance of cardiac arrhythmias), as well as the occurrence of hypotension and renal failure.
  • the optimal treatment available for HF which includes ACEI, ARA, diuretics, beta blockers and aldosterone inhibitors, is not able to decrease the annual hospitalization rate (maintaining HF as one of the main causes of hospitalization) nor the death rate due to cardiovascular events below 13.6%, which means unacceptable figures and leads to the need to find new therapeutic targets that reduce these values.
  • PP ARa peroxisome proliferators alpha
  • Peroxisome proliferator-activated receptors are ligand-dependent transcription factors belonging to the nuclear receptor superfamily.
  • the PPAR family consists of three members encoded by three distinct genes: alpha ( ⁇ ), beta ( ⁇ ) / delta ( ⁇ ) and gamma ( ⁇ ).
  • the PPAR ⁇ was the first member of the PPAR family to be identified.
  • the expression of PPAR ⁇ is high in organs and tissues with a great capacity for oxidation of fatty acids, as is the case of the heart.
  • human PPAR ⁇ is a transcription factor activated by fatty acids that regulates the balance between the incorporation of lipids into the cardiomyocyte and its use.
  • Various indications suggest that PPAR ⁇ may be involved in the regulation of other processes in the heart.
  • some PPAR ⁇ activators inhibit the expression of the TNF ⁇ and NF- ⁇ B proinflammatory genes and increase the expression of IL-10 anti-inflammatory cytokine in the heart.
  • PPAR ⁇ regulates the expression of its target genes by binding to the peroxisome proliferator response elements (PPRE) of the DNA of these genes. This binding requires the formation of a heterodimer composed of PPAR ⁇ and the X retinoid alpha receptor (RXR ⁇ ).
  • RXR ⁇ X retinoid alpha receptor
  • the activity of the PPAR ⁇ / RXR ⁇ complex is regulated by the availability of ligands for the two members of the complex.
  • the PPAR ⁇ / RXR ⁇ complex is bound to correpressor proteins. Once the ligands are bound, the PPAR ⁇ / RXR ⁇ complex dissociates from the co-receptors and recruits coactivators.
  • Coactivators among which are the CREB-binding protein together with the protein associated with adenovirus ElA (CBP / p300), steroid receptor coactivator (SRCl), PPAR binding protein (PBP) and PPAR ⁇ coactivator l ⁇ (PGC-l ⁇ ), are proteins that culminate the assembly of the PPAR ⁇ system (PPAR ⁇ , RXR ⁇ , ligands and coactivators) enabling it to develop its transcriptional regulatory activity.
  • CBP adenovirus ElA
  • SRCl steroid receptor coactivator
  • PBP PPAR binding protein
  • PPC-l ⁇ PPAR ⁇ coactivator l ⁇
  • mRNA messenger RNA
  • mRNA messenger RNA
  • the native PPAR ⁇ mRNA results in an active PPAR ⁇ protein (53 kD)
  • the PPAR ⁇ mRNA without exon 6 results in a truncated isoform of the PPAR ⁇ (30 kD) that lacks the ligand binding domain.
  • recent studies suggest that, after translocation to the nucleus, the truncated isoform represses the activity of native PPAR ⁇ , probably through competition for essential coactivators.
  • truncated PPAR ⁇ may constitute a new mechanism by which subjects with hypertensive heart disease develop heart failure.
  • the inventors have shown that truncated PPAR ⁇ induces apoptosis in said cardiac cells.
  • truncated PPAR ⁇ has been transfected into cardiomyocytes in vitro and different indicator parameters of cardiomyocyte apoptosis have been analyzed, observing that truncated PPAR ⁇ is a new pro-apoptotic molecule, since it induces phosphatidylserine exposure in the plasma membrane, it alters the potential of the mitochondrial membrane and activates caspase-3 (Example 1). The involvement of these 3 pathways on which truncated PPAR ⁇ acts with cardiomyocyte apoptosis is widely demonstrated.
  • the present invention relates to the use of a truncated PPAR ⁇ inhibitor in the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of heart failure in subjects with hypertensive heart disease.
  • the invention in another aspect, relates to a method for the identification of potentially useful compounds for the treatment of heart failure in subjects with hypertensive heart disease.
  • Figures 1 to 3 show the anti-apoptotic effects produced by transfection in truncated PP ARa HL-I cells, in transfections performed with increasing amounts of truncated PP ARa [0 ng (BC), 60 ng, 200 ng, and 400 ng respectively].
  • FIG. 1 Induction test for phosphatidylserine exposure. Histograms show the percentage of cells with a positive tide for Annexin V (% A5 + Cells), which is an indicator of the exposure of phosphatidylserine in the plasma membrane of cells to different amounts of transfected truncated PPAR ⁇ . The graph shows that truncated PPAR ⁇ induces phosphatidylserine exposure in the cell membrane, which is dose dependent.
  • Figure 2 Test of alteration of the mitochondrial membrane potential. The percentage of cells (% Altered mitochondrial potential cells) showing an alteration of the mitochondrial membrane potential is shown, analyzed as the ratio between monomers and aggregates of the JCl reagent (JCl monomer / aggregates). Truncated PPAR ⁇ causes an alteration of the mitochondrial membrane potential that is dose dependent.
  • Figure 3 Caspase-3 activity test. The histogram shows the activation of caspase-3, analyzed as the ratio between the expression of the protein of active fragments of caspase-3, of a size between 17 and 21 kDa, and inactive fragments of caspase-3 , 35 kDa in size [17-21 kDa / 35 kDa].
  • UDA Arbitrary densitometric units. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
  • the invention relates to the use of a truncated PPAR ⁇ inhibitor in the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of heart failure in a subject with hypertensive heart disease.
  • said truncated PPAR ⁇ is human truncated PPAR ⁇ , a 30 kD human PPAR ⁇ isoform that lacks the ligand binding domain of PPAR ⁇ , native isoform (53 KDa).
  • said truncated PPAR ⁇ is a human truncated PPAR ⁇ having the amino acid sequence identified as SEQ ID NO: 1.
  • hypertensive heart disease refers to a cardiac involvement caused by the sustained increase in blood pressure and characterized by an excessive increase in the mass of the left ventricle (left ventricular hypertrophy, LVH) in the absence of another cause other than arterial hypertension. It has been postulated that the development of hypertensive LVH could be an adaptive response to normalize ventricular wall stress and to maintain cardiac function; With the passage of time, however, LVH is maladaptive, leading to thickening and / or dysfunction of the left ventricle. Frequently, the heart with left ventricular hypertrophy evolves into systolic and / or diastolic dysfunction that manifests clinically as heart failure.
  • HF heart failure
  • HF refers to a syndrome characterized in that the heart is unable to pump enough blood to meet the metabolic requirements of the tissues or only achieves it at the cost of maintaining filling pressures.
  • high. HF can be manifested by the presence of symptoms that indicate poor tissue perfusion (fatigue, poor tolerance to exercise, etc.) and / or congestion of vascular beds (dyspnea, pleural effusion, pulmonary edema, jugular vein distension, edema peripheral, etc.).
  • truncated PPAR ⁇ inhibitor refers to a compound capable of inhibiting or repressing the action of truncated PPAR ⁇ .
  • truncated PPAR ⁇ can be inhibited at different levels (eg, transcriptional, post-transcriptional, translational or post-translational), as mentioned below: 1. At the transcriptional level
  • the inhibitor of the transtracted PP PPa at transcriptional level is a compound that prevents the transcription of the mRNA from the blocked PPAR ⁇ .
  • said inhibitor is a compound that acts on factors involved in the modification of chromatin (for example, methylation) and histones, (for example in deacetylation, methylation, etc.) and which leads to transcription silencing of the mRNA of the blocked PPAR ⁇ .
  • Said inhibitor can also be a compound that acts on transcription factors, enhancers and silencers of mRNA expression of the blocked PPAR ⁇ .
  • the truncated PPAR ⁇ inhibitor at the post-transcriptional level is a compound that lowers mRNA levels of the blocked PPAR ⁇ .
  • the maturation of mRNA involves the removal of introns by a protein complex called spliceosome.
  • the spliceosome is composed of molecules responsible for making the cut of the intron-exon junction and the splicing between exons (splicing), such as U snRNPs, in addition to a large number of splicing regulatory molecules, such as the factors of the SR family, the auxiliary factor U2AF, etc.
  • a PPAR ⁇ inhibitor blocked at the post-transcriptional level refers to a compound that alters or inhibits said alternative splicing process, acting on the spliceosome molecules or on the binding sites recognized by these molecules in the immature RNA, preventing them from being produce said alternative splicing and as a consequence the expression of the blocked PPAR ⁇ .
  • this group also includes compounds that prevent the transport of mRNA from PPAR ⁇ blocked from the nucleus to the cytoplasm, acting on the factors involved in said transport, and molecules or compounds that bind to mRNA of blocked PPAR ⁇ and induce its degradation, such such as specific interference RNA.
  • the interference RNAs bind to the mRNA forming double stranded RNA structures, generating a signal for the Dicer cell nuclease to degrade this mRNA.
  • said interference RNA is an RNA that binds to the region of the mRNA comprising the last nucleotides of exon 5 followed by the first of exon 7, specific to the truncated PP ARa.
  • the truncated PP ARa inhibitor at the translational level is a compound that inhibits the expression of truncated PP ARa, such as, for example, a compound that inhibits the initiation of transcription by preventing the binding of ribosomes to the AUG codon of mRNA or a compound capable of altering the secondary structure of the truncated PPAR ⁇ mRNA or preventing the interaction of certain components of the translation initiation machinery (7-methylguanosine and eIF4E) to hinder the translation of the truncated PPAR ⁇ .
  • a compound that inhibits the initiation of transcription by preventing the binding of ribosomes to the AUG codon of mRNA or a compound capable of altering the secondary structure of the truncated PPAR ⁇ mRNA or preventing the interaction of certain components of the translation initiation machinery (7-methylguanosine and eIF4E) to hinder the translation of the truncated PPAR ⁇ .
  • the truncated PPAR ⁇ inhibitor at the post-translational level is a compound capable of modifying the conformation of the truncated PPAR ⁇ by direct interaction or by modifying residues of the truncated PPAR ⁇ protein (e.g., phosphorylations).
  • this group also includes compounds that induce an increase in the degradation of the protein of the truncated PPAR ⁇ by the proteasome, as well as antibodies that are directed against the truncated PPAR ⁇ .
  • the pharmaceutical composition provided by this invention may contain one or more different truncated PPAR ⁇ inhibitor compounds together with one or more pharmaceutically acceptable carriers or excipients.
  • said pharmaceutical composition comprises a single truncated PPAR ⁇ inhibitor compound.
  • said pharmaceutical composition comprises two or more truncated PPAR ⁇ inhibitor compounds that act at the same level or, alternatively, at different levels of regulation of the truncated PPAR ⁇ action.
  • Said pharmaceutical composition is useful for the treatment of heart failure in subjects with hypertensive heart disease.
  • subject refers to a member of a mammalian species, and includes, but is not limited to, animals. domestic, primates and humans; preferably, the subject is a human being, male or female, of any age or race.
  • compositions provided by this invention which contain at least one truncated PPAR ⁇ inhibitor, may be presented in any appropriate form of administration, depending on the nature of the inhibitor compound, for example, solid or liquid, and may be administered by any appropriate route, for example, orally, parenterally, etc., for which they will include the pharmaceutically acceptable excipients necessary for the formulation of the desired administration form.
  • the pharmaceutical form of administration of the truncated PPAR ⁇ inhibitor [active ingredient] may vary within a wide range of possibilities known to those skilled in the art, depending on the nature of said active ingredient (peptide, polynucleotide, etc.).
  • the excipients, vehicles and auxiliary substances must be pharmaceutically and pharmacologically tolerable and must be able to be combined with other components of the formulation and not have any adverse effect on the treated subject.
  • a review of the different pharmaceutical forms of drug administration and of the excipients necessary to obtain them can be found, for example, in the "Galician Pharmacy Treaty", C. Faul ⁇ i Trillo, 1993, Luzán 5, SA Ediations , Madrid.
  • the pharmaceutical composition provided by this invention will be formulated in a pharmaceutical form of solid (eg, tablets, capsules, granules, etc.) or liquid (eg, solutions, suspensions, emulsions, etc.) administration for administration.
  • the pharmaceutical composition provided by this invention can be formulated in the form of a composition intended for use in gene therapy; by way of illustration, not limitation, in this case, the pharmaceutical composition provided by this invention may contain a vector, viral or non-viral, comprising said polynucleotide.
  • said vectors may be viral vectors, for example, based on retroviruses, adenoviruses, etc., or non-viral such as DNA-liposome, DNA-polymer, DNA-polymer-liposome complexes, etc.
  • Said vectors containing said polynucleotide, can be administered directly to the human or animal body by conventional methods.
  • said vectors can be used to transform, transfect or infect cells, for example, mammalian cells, including man, ex vivo, and then implant them in the human or animal body to obtain the desired therapeutic effect.
  • said cells will be formulated in a suitable medium that does not adversely affect their viability.
  • the pharmaceutical composition of the invention comprises at least one truncated PPAR ⁇ inhibitor (active ingredient), in a therapeutically efficient amount.
  • therapeutically efficient amount refers to the amount of product (active ingredient) calculated to produce the desired effect and, in general, will be determined, among other causes, by the characteristics of protein and the therapeutic effect to be achieved.
  • the dose of active ingredient to be administered to a subject will be a therapeutically efficient amount and may vary within a wide range.
  • the pharmaceutical compositions provided by this invention may be single dose or multi dose.
  • the pharmaceutical composition provided by this invention can be administered one or more times a day for preventive or therapeutic purposes.
  • the dose of active ingredient to be administered will depend on numerous factors, including the characteristics of the product to be administered, such as, for example, its activity and biological half-life, the concentration of the product in the pharmaceutical composition, the clinical situation of the subject, the severity of the pathology, the pharmaceutical form of administration chosen, etc. For this reason, the doses mentioned in this invention should be considered only as guidelines for the person skilled in the art, and he must adjust the doses according to the variables mentioned above.
  • the pharmaceutical composition provided by this invention can be used together with other drugs, for example, drugs useful in the treatment of heart failure and / or hypertensive heart disease (eg, diuretics, beta blockers, ACEI, channel antagonists of calcium, ARA, aldosterone inhibitors, etc.), in order to increase the efficiency of the pharmaceutical composition provided by this invention, thereby generating a combination therapy.
  • drugs useful in the treatment of heart failure and / or hypertensive heart disease eg, diuretics, beta blockers, ACEI, channel antagonists of calcium, ARA, aldosterone inhibitors, etc.
  • additional drugs may be part of the same pharmaceutical composition or, alternatively, may be provided as a separate pharmaceutical composition for administration at the same time (simultaneous administration) as the pharmaceutical composition of the invention or at different times (sequential administration) with respect to the administration of the pharmaceutical composition provided by this invention.
  • truncated PPAR ⁇ protein levels are elevated.
  • truncated PPAR ⁇ mRNA levels are similar to the expression levels of the native form in hypertensive patients.
  • the invention relates to a method for the identification of potentially useful compounds for the treatment of heart failure in subjects with hypertensive heart disease comprising:
  • said cells expressing truncated PPAR ⁇ are cells that express said protein natively (e.g., cardiomyocytes of subjects with hypertensive heart disease, etc.).
  • said cells expressing truncated PPAR ⁇ are genetically modified cells.
  • said cells are cells to which the gene sequence encoding truncated PPAR ⁇ has been transfected.
  • said cells are cells to which the coding gene sequence has been transfected.
  • the method of the invention comprises quantifying the level of expression of truncated PPAR ⁇ and selecting those compounds that produce a decrease in the expression of truncated PPAR ⁇ with respect to a control.
  • the method of the invention comprises quantifying the level of truncated PPAR ⁇ (protein).
  • the level (concentration) of said protein can be quantified by any conventional method that allows to detect and quantify the levels of said protein in a sample.
  • the method of the invention includes carrying out an extraction step in order to obtain a protein extract containing said protein, which can be done by conventional techniques.
  • Virtually any conventional method can be used within the scope of the invention to detect and quantify truncated PPAR ⁇ protein levels.
  • the levels of said protein can be quantified by the use of conventional methods, for example, by the use of antibodies capable of binding to truncated PPAR ⁇ (or fragments thereof containing antigenic determinants) and later.
  • markers include radioactive isotopes, enzymes, fluorinated forums, chemiluminescent reagents, enzyme substrates or cofactors, enzyme inhibitors, particles, dyes, etc.
  • the method of the invention also comprises the step of comparing said level with that of a control sample so that if the expression of said protein (truncated PPAR ⁇ ) decreases, the compound tested is a compound potentially useful for the treatment of heart failure in subjects with hypertensive heart disease.
  • said control sample may be a control cell culture to which no candidate inhibitor compound has been added.
  • the expression levels of truncated PPAR ⁇ in said control cell culture can be determined by the previously mentioned techniques.
  • the method of the invention also comprises analyzing the level of expression of the gene encoding truncated PPAR ⁇ .
  • the expression level of a gene can be quantified by quantifying the level of messenger RNA (mRNA) of said gene, resulting from the transcription of said gene, or, alternatively, from the level of complementary DNA (cDNA) to said mRNA.
  • the method of the invention includes performing an extraction step in order to obtain the total RNA, which can be done by conventional techniques. Virtually any conventional method can be used within the scope of the invention to detect and quantify the levels of truncated PPAR ⁇ mRNA or its corresponding cDNA.
  • mRNA levels can be quantified by the use of conventional methods, for example, methods comprising Northern blot and use of specific mRNA probes of interest, mapping with Sl nuclease, RT-LCR, hybridization , microarrays, etc.
  • the levels of the cDNAs corresponding to said truncated PPAR ⁇ mRNA also they can be quantified by using conventional techniques; in this case, the method of the invention includes a step of cDNA synthesis by reverse transcription (RT) of the corresponding mRNA followed by amplification and quantification of the amplification product of said cDNA;
  • amplification is carried out qualitatively or quantitatively, by PCR (eg, quantitative PCR, real-time quantitative PCR using an appropriate marker, etc.) using primer oligonucleotides that specifically amplify regions of truncated PPAR ⁇ .
  • the method of the invention also comprises analyzing the apoptosis levels of said cells in culture and selecting those compounds that produce a decrease in the apoptosis levels of said cells.
  • any conventional method can be used within the framework of the invention to determine the levels of cell apoptosis.
  • the levels of cell apoptosis are determined by the analysis of different apoptotic parameters, such as the measurement of phosphatidylserine exposure, the analysis of the alteration of the mitochondrial membrane potential, measurement of activation. of caspase-3, etc., which can be determined by conventional methods known to those skilled in the art.
  • HL-I a cell line obtained from an atrial subcutaneous tumor induced in a transgenic mouse by the expression of the SV40 T antigen, described and characterized in US patent US 6316207).
  • a recombinant vector was constructed with the human truncated PP ARa and an eukaryotic expression vector.
  • a retrotranscription reaction was carried out from 5 ⁇ g of total human heart RNA belonging to a human heart RNA library (Ref. AM7966, Ambion).
  • PCR polymerase chain reaction
  • the primers used were the following: i) 5'-CACCATGGTGGACACGGAAAGCCCACT-S '(SEQ ID NO: 2) corresponding to the nucleotide sequence 1 to 23 of the truncated PPARq cDNA, and ii) 5'-TCATGTATGACAAAAGGCGTTGTGTGACAT-S' (SQ) ID
  • the PCR products were separated by molecular weight by electrophoresis on an agarose gel to verify the success of the amplification.
  • the gel was prepared with 0.8% D-I agarose (Pronadisa) and electrophoresis was carried out at 40 V constant voltage.
  • the amplified fragments were stained with ethidium bromide, which is sandwiched into the double helix of DNA emitting visible salmon light when irradiated with ultraviolet light at 312 nm. They were displayed on a U. V illuminator.
  • PCR products were estimated by comparison with a molecular weight marker (IKb DNALadder, Invitrogen).
  • the PCR products were purified by a Qiagen kit (Qiaquick PCR purification Kit, Qiagen) This system employs columns with silica gel membranes to which DNA is bound and washing solutions to remove impurities. After washing, the DNA was eluted in a buffer solution (10 mM Tris-Cl, pH 8.5) and sequenced to the sequencing service of the Center for Applied Medical Research (CIMA) to verify that the PPAR was specifically amplified ⁇ truncated.
  • a buffer solution (10 mM Tris-Cl, pH 8.5
  • CIMA Center for Applied Medical Research
  • truncated PP ARa 60 ng-200 ng-400 ng
  • Lipofectin Invitrogen; Ref. 18292-037
  • the transfection mixture After 5 hours of transfection, the transfection mixture has been removed and The cells have been incubated for 24 hours with Claycomb medium (SIGMA, Ref. 51800C, specific for this cell type) in the incubator at 37 ° C and 5% CO 2 . After 24 hours, the cells were trypsinized and divided to analyze the different apoptotic parameters explained below.
  • phosphatidylserine is translocated from the inner face to the outer face of the plasma membrane, which serves as an apoptotic signal to phagocytic cells.
  • the "Annexin V-FITC” Kit (Spallarossa et al. J Mol CeIl Cardiol, 2004 .; 37: 837-846) from Pharmatarget (Ref. A-700) has been used.
  • annexin V labeled with the FITC fluorochrome binds to the phosphatidylserine exposed in the plasma membrane of the cells. After incubating the cells 15 minutes with Annexin-FITC, the fluorochrome emission is measured by flow cytometry. The test was performed according to the manufacturer's instructions.
  • the JC-I product when the potential is not altered, the JC-I product is forming aggregates, which emit a red fluorescence (590 nm), while when the potential is altered, the JC-I is in the form of monomers , emitting green fluorescence (527 nm).
  • the cells are incubated for 30 minutes with JC-I at 37 0 C, and then measured in the cytometer. The ratio between absorbance at 590 nm and 527 nm will indicate how the mitochondrial membrane potential is. 1.4 Measurement of activation of caspase-3
  • caspase-3 exists as an inactive dimer, and is activated by a proteolytic cut that takes place in specific regions of this molecule, and as a consequence of this cut the inactive procaspase (35 kDa) gives rise to active fragments (17-21 kDa ). Caspase-3 activation is measured by analyzing the relationship between active fragments and inactive procaspase.
  • the 17-21 kDa and 35 kDa bands of caspase-3 have been analyzed by Western blot.
  • a primary rabbit antibody against caspase-3 (Ref. 9662, CeIl Signaling), and a secondary donkey anti-rabbit oxidized antibody (Ref. NA934, Amersham) have been used.
  • the analysis of the bands was performed densitometrically with the "Molecular Imager” spectrophotometer from Bio-Rad, using the Quantity One program.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • High Energy & Nuclear Physics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)

Abstract

La isoforma truncada del receptor activado por proliferadores de peroxisomas alfa (PPAR induce la apoptosis en cardiomiocitos. Inhibidores de dicho PPAR truncado pueden reprimir su acción y, por tanto, ser utilizados en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca en sujetos con cardiopatía hipertensiva. La acción de PPAR truncado puede ser inhibida a distintos niveles (e.g., transcripcional, postranscripcional, traduccional o postraduccional).

Description

EMPLEO DE INHIBIDORES DE PPAR ALFA TRUNCADO EN EL TRATAMIENTO DE LA INSUFICIENCIA CARDIACA EN SUJETOS CON
CARDIOPATÍA HIPERTENSIVA
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona, en general, con el empleo de un inhibidor de la isoforma truncada del receptor activado por proliferadores de peroxisomas alfa (PPARα) en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca en sujetos con cardiopatía hipertensiva.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Hipertensión
La hipertensión, enfermedad caracterizada por una tensión arterial elevada, afecta a un número sustancial de la población humana. Las consecuencias de la hipertensión persistente incluyen daño vascular a los sistemas ocular, renal, cardiaco y cerebral, y el riesgo de estas complicaciones se incrementa al incrementarse la tensión arterial. Los factores básicos que controlan la tensión arterial son el gasto cardiaco y la resistencia vascular periférica. El sistema nervioso simpático regula la resistencia vascular periférica por medio de efectos directos sobre los receptores alfa y beta adrenérgicos, así como por medio de efectos indirectos sobre la liberación de renina.
Actualmente, el tratamiento farmacológico para la hipertensión se dirige a componentes específicos de los sistemas reguladores de la tensión arterial, con diferentes mecanismos de acción que definen las distintas clases de fármacos, que incluyen diuréticos, antagonistas de receptores beta adrenérgicos (beta bloqueantes), inhibidores de la enzima conversora de angiotensina (IECA) y antagonistas de canales de calcio, antagonistas de los receptores ATl de la Angiotensina II e inhibidores de la aldosterona.
Los diuréticos tipo tiazida se usan en la hipertensión para reducir la resistencia vascular periférica por medio de sus efectos sobre la excreción de sodio y agua. Esta clase de fármacos incluye hidroclorotiazida, clorotiazida, metilcloro tiazida y ciclotiazida, así como los agentes relacionados indapamida, metolazona y clortalidona.
El mecanismo de acción beta bloqueante consiste en bloquear el subtipo de receptor beta-1 adrenérgico del corazón para reducir la frecuencia cardiaca y el gasto cardiaco. Los efectos adversos de los beta bloqueantes incluyen bradicardia asintomática, exacerbación de la insuficiencia cardiaca congestiva, alteraciones gastrointestinales, resistencia de las vías respiratorias incrementada, síntomas enmascarados de hipoglucemia y depresión. Pueden causar la elevación de los triglicéridos séricos y pueden disminuir el colesterol de lipoproteínas de alta densidad.
Los IECA disminuyen la resistencia vascular periférica, así como la retención de sodio y agua. Además, los IECA incrementan los niveles de bradiquinina y prostaglandinas, vasodilatadores endógenos. Los efectos adversos de los IECA incluyen hipotensión, emperoramiento de la función renal, retención de potasio, tos y angioedema.
Los antagonistas de canales de calcio reducen la entrada de calcio en las células musculares lisas vasculares y producen vasodilatación sistémica, que da como resultado su efecto antihipertensor. Los antagonistas de canales de calcio no tienen los efectos metabólicos y farmacológicos adversos de las tiazidas o los beta bloqueantes, y pueden ser útiles por ello en pacientes con diabetes, enfermedad vascular periférica o enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Dos antagonistas de canales de calcio, Verapamil y Diltiazem, tienen serios efectos cardiovasculares adversos sobre la conducción cardiaca auriculoventricular en pacientes con anormalidades de conducción preexistentes, y pueden empeorar la bradicardia, bloqueo cardiaco e insuficiencia cardiaca congestiva. Otros efectos adversos menores de los antagonistas de canales de calcio incluyen edema periférico, vértigo, mareo, cefalea, náuseas y rubefacción, especialmente con nifedipina y nicardipina.
Los antagonistas del receptor de la Angiotensina II (ARA) bloquean las acciones de la angiotensina II que se desarrollan a través de sus receptores ATl, tales como la activación del sistema nervioso simpático, el aumento de vasoconstricción, el aumento de aldosterona y la activación de factores de crecimiento. Los principales efectos adversos de los ARA son la hipotensión, disfunción renal y retención de potasio.
Los inhibidores de la aldosterona inhiben las acciones derivadas de la elevación crónica de la aldosterona, tales como un aumento de la producción de colágeno vascular y cardíaco, y una disminución de los niveles plasmáticos y tisulares de potasio y magnesio. Los principales efectos adversos de los inhibidores de la aldosterona son la ginecomastia e impotencia sexual, y la hiperpotasemia. Están disponibles otros muchos agentes para tratar la hipertensión esencial. Estos agentes incluyen prazosina y terazocina, antagonistas de receptores alfa 1 y alfa 2 adrenérgicos, clonidina, metildopa, guanabenz, guanfacina, reserpina, guanadrel y vasodilatadores de acción directa tales como hidralazina y minoxidil. Estos agentes, aunque efectivos, producen efectos secundarios sintomáticos apreciables, que incluyen estimulación simpática refleja y retención de líquidos, hipotensión ortostática e impotencia.
Muchos agentes antihipertensores activan mecanismos vasotensores compensadores, tales como la liberación incrementada de renina, secreción elevada de aldosterona y tono vasoconstrictor simpático incrementado, que están diseñados para devolver la tensión arterial a los niveles pretratamiento, y que pueden llevar a la retención de sales y agua, edema y finalmente a tolerancia a las acciones antihipertensoras del agente.
Insuficiencia cardiaca (IC)
La cardiopatía hipertensiva (CH) se define como la afectación cardiaca provocada por el aumento sostenido de la presión arterial. Se caracteriza por un aumento excesivo en la masa del ventrículo izquierdo (hipertrofia ventricular izquierda, HVI) en ausencia de otra causa diferente de la hipertensión arterial. Se ha postulado que el desarrollo de HVI hipertensiva podría ser una respuesta adaptativa para normalizar el estrés de la pared ventricular y para mantener la función cardiaca; con el paso del tiempo, sin embargo, la HVI se inadapta, llevando a un engrosamiento y/o disfunción del ventrículo izquierdo. Frecuentemente, el corazón que presenta hipertrofia ventricular izquierda evoluciona hacia la disfunción sistólica y/o diastólica que se manifiesta clínicamente como insuficiencia cardiaca (IC).
La IC es un síndrome caracterizado porque el corazón es incapaz de bombear sangre suficiente para satisfacer los requerimientos metabólicos de los tejidos o que sólo lo logra a costa de mantener unas presiones de llenado elevadas. La IC puede manifestarse por la presencia de síntomas que indican una pobre perfusión tisular (fatiga, escasa tolerancia al ejercicio, etc.) y/o congestión de los lechos vasculares (disnea, efusión pleural, edema pulmonar, distensión de la vena yugular, edema periférico, etc.). En cualquier caso, la IC es un problema de salud importante de proporciones mundiales. La incidencia de la IC sintomática ha aumentado de forma constante durante las últimas décadas.
Estudios recientes han señalado una relación entre la HVI y una alteración en el metabolismo de los ácidos grasos en el miocardio. De hecho, niños con defectos mitocondriales en las enzimas de la β-oxidación de los ácidos grasos (FAO) presentan hipertrofia cardiaca y/o insuficiencia cardiaca y tienen alto riesgo de muerte súbita cardiaca. Un estudio reciente en humanos ha mostrado que ciertas variaciones en el gen del receptor activado por proliferadores de peroxisomas alfa (PPARα), un factor transcripcional clave en la expresión de genes de las rutas de FAO, induce el crecimiento hipertrófico en respuesta a ambos, ejercicio e hipertensión. Esta observación, junto con otros estudios en modelos animales, provee evidencias de que la utilización del sustrato de energía en el miocardio juega un papel importante en la patogénesis y/o modulación del fenotipo hipertrófico.
Los principales tratamientos farmacológicos de la IC incluyen: 1) Inhibidores de la Enzima Convertidora de Angiotensina (IECA) cuyos principales efectos beneficiosos son una disminución de la vasoconstricción periférica y descenso en la post-carga del ventrículo izquierdo, enlentecimiento de la dilatación ventricular izquierda progresiva que contribuye a la aparición y progresión de la IC, prevención de la aparición de eventos isquémicos por sus acciones beneficiosas a nivel de endotelio vascular y prevención de la muerte súbita, probablemente por un mecanismo multifactorial. El tratamiento con IECA tiene varios efectos adversos, como son la hipotensión, empeoramiento de la función renal, retención de potasio, tos y angioedema.
2) Los betabloqueantes producen a largo plazo una mejora de la función sistólica, de la contractilidad y de la mecánica de la contracción cardiaca, que es mayor que la obtenida por los IECA. Los principales efectos adversos de los betabloqueantes son un empeoramiento de la capacidad funcional, retención/sobrecarga de fluidos, hipotensión, bradicardia, broncoespasmo, frialdad de extremidades, empeoramiento de la claudicación, disfunción sexual, y pesadillas. 3) Los antagonistas del receptor de la Angiotensina II (ARA) bloquean las acciones de la angiotensina II que se desarrollan a través de sus receptores ATl, tales como la activación del sistema nervioso simpático, el aumento de vasoconstricción, el aumento de aldosterona y la activación de factores de crecimiento, entre otros. Los principales efectos adversos de los ARA son la hipotensión, disfunción renal y retención de potasio.
4) Los inhibidores de la aldosterona inhiben las acciones derivadas de la elevación crónica de la aldosterona, como una inducción de la generación de colágeno tanto vascular como cardiaco, una disminución de los niveles plasmáticos y tisulares de potasio y magnesio, entre otros. Los principales efectos adversos de estos fármacos son la ginecomastia e impotencia sexual, y la hiperpotasemia.
5) Los diuréticos, que actúan a nivel renal interfiriendo con la retención de sodio y agua que ocurre como mecanismo de compensación en presencia de una situación de reducción del gasto cardiaco. De esta forma, son capaces de aliviar los síntomas de congestión pulmonar y de reducir los edemas periféricos en cuestión de horas o días, al contrario que otros fármacos, cuyos efectos beneficiosos suelen manifestarse de forma más tardía. Los principales efectos adversos de los diuréticos son los relacionados con la pérdida de potasio y magnesio (lo que predispone a la aparición de arritmias cardiacas), así como la aparición de hipotensión e insuficiencia renal.
En la actualidad, el tratamiento óptimo disponible para la IC, que incluye IECA, ARA, diuréticos, betabloqueantes e inhibidores de la aldosterona, no es capaz de disminuir la tasa anual de hospitalización (manteniendo la IC como una de las principales causas de hospitalización) ni la tasa de muerte por eventos cardiovasculares por debajo del 13,6%, lo que supone unas cifras inaceptables y lleva a la necesidad de encontrar nuevas dianas terapéuticas que consigan reducir estos valores.
Entre dichas posibles dianas terapéuticas se encuentra el receptor activado por proliferadores de peroxisomas alfa (PP ARa). Un estudio muestra que, en sujetos hipertensos que presentan HVI, tanto con IC como sin IC, la expresión de PPARα en miocardio es similar; sin embargo, en sujetos hipertensos con IC, la forma truncada de PPARα se encuentra sobreexpresada con respecto a la de los pacientes hipertensos sin IC [Goikoetxea MJ et al., 10a Reunión Nacional Sociedad Español de Hipertensión - Liga Española para la lucha contra la Hipertensión arterial, Barcelona, 15-18 de marzo de 2005 (póster)]. Un estudio posterior [Goikoetxea MJ et al., 2006, Cardiovascular Research 69:899-907] pone de manifiesto la presencia de PPARα nativo y truncado en el corazón humano y que, mientras que una disminución del PPARα nativo se asociaba con el desarrollo de HVI, la sobreexpresión del PPARα truncado se asociaba con el desarrollo de IC, observándose, además, que la expresión miocárdica del PP ARa truncado se asociaba con la dilatación del ventrículo izquierdo y con la disminución de la fracción de eyección en todos los hipertensos. Asimismo, en dicho estudio se observó que la expresión miocárdica del PP ARa truncado se asociaba con una estimulación de la apoptosis de los cardiomiocitos.
Receptor activado por proliferadores de peroxisomas isoforma α (PPARα)
Los receptores activados por proliferadores de peroxisomas (PPAR) son factores de transcripción dependientes de ligando pertenecientes a la superfamilia de los receptores nucleares. La familia de los PPAR se compone de tres miembros codificados por tres genes distintos: alfa (α), beta (β)/delta (δ) y gamma (γ).
El PPARα fue el primer miembro de la familia de PPAR en ser identificado. La expresión del PPARα es alta en órganos y tejidos con una gran capacidad de oxidación de ácidos grasos, como es el caso del corazón. Así, el PPARα humano es un factor de transcripción activado por ácidos grasos que regula el balance entre la incorporación de lípidos al interior del cardiomiocito y su utilización. Diversos indicios sugieren que el PPARα puede estar implicado en la regulación de otros procesos en el corazón. Así, se ha observado que algunos activadores del PPARα inhiben la expresión de los genes proinflamatorios TNFα y NF-κB y aumentan la expresión de citoquina anti-infiamatoria IL-10 en el corazón. Además, se ha demostrado la implicación del PPARα cardiaco en la regulación de la matriz extracelular, a través de un efecto inhibidor de la expresión del colágeno tipo I y III. Estudios realizados "in vivo" e "in vitro" sugieren que el PPARα puede inhibir la hipertrofia miocárdica en respuesta a diferentes estímulos.
El PPARα regula la expresión de sus genes diana mediante la unión a los elementos de respuesta a proliferadores de peroxisomas (PPRE) del ADN de estos genes. Esta unión requiere la formación de un heterodímero compuesto por el PPARα y el receptor X retinoide alfa (RXRα). La actividad del complejo PPARα/RXRα está regulada por la disponibilidad de ligandos para los dos miembros del complejo.
En estado inactivo, el complejo PPARα/RXRα se encuentra unido a proteínas correpresoras. Una vez unidos los ligandos, el complejo PPARα/RXRα se disocia de los correpresores y recluta coactivadores. Los coactivadores, entre los que se encuentran la pro teína de unión a CREB junto con la pro teína asociada al adenovirus ElA (CBP/p300), el coactivador 1 del receptor esteroide (SRCl), la proteína de unión a PPAR (PBP) y el coactivador lα de PPARγ (PGC- lα), son proteínas que culminan el ensamblaje del sistema PPARα (PPARα, RXRα, ligandos y coactivadores) capacitándolo para desarrollar su actividad reguladora transcripcional. Existen dos variantes del PPARα humano. Palmer et al. (Mol. Pharmac. 1998;
53: 14-22) describieron el ARN mensajero (ARNm) correspondiente a una isoforma del PPARα que carece del exón 6 en hígado humano. Posteriormente, esta isoforma fue hallada en otros tejidos, incluido el corazón. Mientras que el ARNm del PPARα nativo da lugar a una proteína PPARα activa (53 kD), el ARNm del PPARα sin el exón 6 da lugar a una isoforma truncada del PPARα (30 kD) que carece del dominio de unión al ligando. Además, estudios recientes sugieren que, tras la traslocación al núcleo, la isoforma truncada reprime la actividad del PPARα nativo, probablemente mediante la competición por coactivadores esenciales.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
Diversos estudios llevados a cabo por los inventores han puesto de manifiesto que la sobreexpresión del PPARα truncado puede constituir un nuevo mecanismo por el que los sujetos con cardiopatía hipertensiva desarrollan insuficiencia cardiaca. De hecho, mediante el análisis de diferentes parámetros indicadores de la apoptosis de cardiomiocitos, los inventores han demostrado que el PPARα truncado induce la apoptosis en dichas células cardiacas. Brevemente, se ha transfectado PPARα truncado humano en cardiomiocitos in vitro y se han analizado diferentes parámetros indicadores de la apoptosis de cardiomiocitos, observándose que el PPARα truncado es una nueva molécula pro-apoptótica, ya que induce la exposición de fosfatidilserina en la membrana plasmática, altera el potencial de la membrana mitocondrial y activa la caspasa-3 (Ejemplo 1). Está ampliamente demostrada la implicación de estas 3 vías sobre las que actúa el PPARα truncado, con la apoptosis de los cardiomiocitos.
Por tanto, el empleo de un inhibidor específico del PPARα truncado podría bloquear esta nueva vía por la que sujetos con cardiopatía hipertensiva pueden desarrollar insuficiencia cardiaca, y, en consecuencia, producir efectos beneficiosos en dichos sujetos con cardiopatía hipertensiva Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención se refiere al empleo de un inhibidor de PPAR α truncado en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca en sujetos con cardiopatía hipertensiva.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la identificación de compuestos potencialmente útiles para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca en sujetos con cardiopatía hipertensiva.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
En las Figuras 1 a 3 se muestran los efectos anti-apoptóticos producidos por la transfección en células HL-I de PP ARa truncado, en transfecciones realizadas con cantidades crecientes de PP ARa truncado [0 ng (BC), 60 ng, 200 ng, y 400 ng respectivamente] .
Figura 1 : Ensayo de inducción de la exposición de fosfatidilserina. Los histogramas muestran el porcentaje de células con un mareaje positivo para la Anexina V (% Células A5+), lo que es un indicador de la exposición de fosfatidilserina en la membrana plasmática de las células a diferentes cantidades de PPARα truncado transfectadas. En la gráfica se puede observar que el PPARα truncado induce una exposición de fosfatidilserina en la membrana de las células, que es dependiente de la dosis. Figura 2: Ensayo de alteración del potencial de la membrana mitocondrial. Se muestra el porcentaje de células (% Células potencial mitocondrial alterado) que presentan una alteración del potencial de la membrana mitocondrial, analizado éste como la relación existente entre monómeros y agregados del reactivo JCl (JCl monómero / agregados). El PPARα truncado provoca una alteración del potencial de la membrana mitocondrial que es dependiente de la dosis.
Figura 3: Ensayo de actividad de la caspasa-3. El histograma muestra la activación de la caspasa-3, analizada como la relación entre la expresión de la pro teína de los fragmentos activos de la caspasa-3, de un tamaño entre 17 y 21 kDa, y los fragmentos inactivos de la caspasa-3, de 35 kDa de tamaño [17-21 kDa / 35 kDa]. U.D.A.: Unidades densitométricas arbitrarias. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En un aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un inhibidor de PPARα truncado en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca en un sujeto con cardiopatía hipertensiva. En una realización particular y preferida, dicho PPARα truncado es el PPARα truncado humano, una isoforma del PPARα humano de 30 kD que carece del dominio de unión a ligando del PPARα, isoforma nativa (53 KDa). En una realización particular, dicho PPARα truncado es un PPARα truncado humano que tiene la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID NO: 1. El término cardiopatía hipertensiva (CH), tal como aquí se utiliza, se refiere a una afectación cardiaca provocada por el aumento sostenido de la presión arterial y que se caracteriza por un aumento excesivo en la masa del ventrículo izquierdo (hipertrofia ventricular izquierda, HVI) en ausencia de otra causa diferente de la hipertensión arterial. Se ha postulado que el desarrollo de HVI hipertensiva podría ser una respuesta adaptativa para normalizar el estrés de la pared ventricular y para mantener la función cardiaca; con el paso del tiempo, sin embargo, la HVI se inadapta, llevando a un engrosamiento y/o disfunción del ventrículo izquierdo. Frecuentemente, el corazón que presenta hipertrofia ventricular izquierda evoluciona hacia la disfunción sistólica y/o diastólica que se manifiesta clínicamente como insuficiencia cardiaca. El término insuficiencia cardiaca (IC), tal como aquí se utiliza, se refiere a un síndrome caracterizado porque el corazón es incapaz de bombear sangre suficiente para satisfacer los requerimientos metabólicos de los tejidos o que sólo lo logra a costa de mantener unas presiones de llenado elevadas. La IC puede manifestarse por la presencia de síntomas que indican una pobre perfusión tisular (fatiga, escasa tolerancia al ejercicio, etc.) y/o congestión de los lechos vasculares (disnea, efusión pleural, edema pulmonar, distensión de la vena yugular, edema periférico, etc.).
El término "inhibidor de PPARα truncado", según aquí se utiliza, se refiere a un compuesto capaz de inhibir o reprimir la acción de PPARα truncado.
La acción de PPARα truncado puede ser inhibida a distintos niveles (e.g., transcripcional, postranscripcional, traduccional o postraduccional), tal como se menciona a continuación: 1. A nivel transcrípcional
El inhibidor del PP ARa trancado a nivel transcripcional es un compuesto que impide la transcripción del ARNm del PPARα trancado. Así, a este nivel, dicho inhibidor es un compuesto que actúa sobre factores implicados en la modificación de la cromatina (por ejemplo, la metilación) y de las histonas, (por ejemplo en la desacetilación, metilación, etc.) y que lleva al silenciamiento de la transcripción del ARNm del PPARα trancado. Dicho inhibidor también puede ser un compuesto que actúa sobre factores de transcripción, enhancers y silenciadores de la expresión del ARNm del PPARα trancado.
2. A nivel postranscripcional
El inhibidor del PPARα truncado a nivel postranscripcional es un compuesto que diminuye los niveles de ARNm del PPARα trancado. La maduración del ARNm implica la eliminación de los intrones por parte de un complejo de proteínas denominado spliceosoma. El spliceosoma está compuesto por unas moléculas encargadas de realizar el corte de la unión intrón-exón y el empalme entre exones (splicing), como son las proteínas U snRNPs, además de un gran número de moléculas reguladoras del splicing, como los factores de la familia SR, el factor auxiliar U2AF, etc. El hecho de que en el procesamiento del ARNm del PPARα trancado se produzca la deleción del exón 6 parece indicar que se ha producido una alteración en las moléculas que determinan los puntos de corte y empalme del PPARα nativo, o bien una alteración en los sitios del ARNm a los que se unen estas moléculas. Por tanto, un inhibidor de PPARα trancado a nivel postranscripcional se refiere a un compuesto que altera o inhibe dicho proceso de splicing alternativo, actuando sobre las moléculas del spliceosoma o sobre los sitios de unión que reconocen estas moléculas en el ARN inmaduro, impidiendo que se produzca dicho splicing alternativo y como consecuencia la expresión del PPARα trancado.
Asimismo, en este grupo también se incluyen compuestos que impiden el transporte del ARNm del PPARα trancado del núcleo al citoplasma, actuando sobre los factores implicados en dicho transporte, y moléculas o compuestos que se unen al ARNm de PPARα trancado e inducen su degradación, tal como, por ejemplo ARN de interferencia específicos. Los ARN de interferencia se unen al ARNm formando estructuras de ARN de doble hebra, generando una señal para que la nucleasa celular Dicer degrade este ARNm. En particular, dicho ARN de interferencia es un ARN que se une a la región del ARNm que comprende los últimos nucleótidos del exón 5 seguidos de los primeros del exón 7, específica del PP ARa truncado.
3. A nivel traduccional
El inhibidor del PP ARa truncado a nivel traduccional es un compuesto que inhibe la expresión del PP ARa truncado, tal como, por ejemplo, un compuesto que inhibe el inicio de la transcripción impidiendo la unión de los ribosomas al codon AUG del ARNm o un compuesto capaz de alterar la estructura secundaria del ARNm del PPARα truncado o de impedir la interacción de determinados componentes de la maquinaria de inicio de la traducción (7-metilguanosina y eIF4E) para dificultar la traducción del PPARα truncado.
4. A nivel postraduccional
El inhibidor del PPARα truncado a nivel postraduccional es un compuesto capaz de modificar la conformación del PPARα truncado por interacción directa o por modificación de residuos de la proteína del PPARα truncado (e.g., fosforilaciones).
Asimismo, en este grupo también se incluyen compuestos que inducen un aumento de la degradación de la proteína del PPARα truncado por el proteasoma, así como anticuerpos que vayan dirigidos frente al PPARα truncado.
La composición farmacéutica proporcionada por esta invención puede contener uno o más compuestos inhibidores de PPARα truncado diferentes junto con uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. En una realización particular, dicha composición farmacéutica comprende un único compuesto inhibidor de PPARα truncado. En otra realización particular, dicha composición farmacéutica comprende dos o más compuestos inhibidores de PPARα truncado que actúen al mismo nivel o, alternativamente, a distintos niveles de regulación de la acción de PPARα truncado. Dicha composición farmacéutica es útil para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca en sujetos con cardiopatía hipertensiva. El término "sujeto", tal como aquí se utiliza, se refiere a un miembro de una especie de mamífero, e incluye, pero no se limita, animales domésticos, primates y humanos; preferentemente, el sujeto es un ser humano, masculino o femenino, de cualquier edad o raza.
Las composiciones farmacéuticas proporcionadas por esta invención, que contienen al menos un inhibidor de PPARα truncado, pueden presentarse en cualquier forma de administración apropiada, dependiendo de la naturaleza del compuesto inhibidor, por ejemplo, sólida o líquida, y pueden administrarse por cualquier vía apropiada, por ejemplo, por vía oral, parenteral, etc., para lo cual incluirán los excipientes farmacéuticamente aceptables necesarios para la formulación de la forma de administración deseada. Evidentemente, la forma farmacéutica de administración del inhibidor de PPARα truncado [principio activo] puede variar dentro de un amplio intervalo de posibilidades conocidas por los expertos en la materia, dependiendo de la naturaleza de dicho principio activo (péptido, polinucleótido, etc.). Los excipientes, vehículos y sustancias auxiliares deben ser farmacéuticamente y farmacológicamente tolerables y han de poder ser combinados con otros componentes de la formulación y no ejercer ningún efecto adverso sobre el sujeto tratado. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de medicamentos y de los excipientes necesarios para la obtención de las mismas puede encontrarse, por ejemplo, en el "Tratado de Farmacia Galénica", C. Faulí i Trillo, 1993, Luzán 5, S.A. Ediciones, Madrid. En una realización particular, la composición farmacéutica proporcionada por esta invención se formulará en una forma farmacéutica de administración sólida (e.g., comprimidos, cápsulas, granulos, etc.) o líquida (e.g., soluciones, suspensiones, emulsiones, etc.) para su administración por cualquier vía de administración apropiada, por ejemplo, por vía oral, parenteral (e.g., intramuscular, subcutánea, intravenosa, etc.), etc. Esta forma farmacéutica de administración del principio activo resulta especialmente adecuada cuando el principio activo es un compuesto de naturaleza peptídica o proteica, o de naturaleza orgánica y tamaño pequeño). En cada caso, se elegirán los vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables apropiados para la forma farmacéutica de administración y vía de administración elegida. Información sobre dichos vehículos y excipientes, así como sobre dichas formas farmacéuticas de administración de dicho principio activo puede encontrarse en tratados de farmacia galénica (e.g., "Tratado de Farmacia Galénica", C. Faulí i Trillo, 1993, Luzán 5, S.A. Ediciones, Madrid). En otra realización particular, cuando el principio activo es un polinucleótido (e.g., un ARN de interferencia, etc.), la composición farmacéutica proporcionada por esta invención puede formularse en forma de una composición destinada para su empleo en terapia génica; a modo ilustrativo, no limitativo, en este caso, la composición farmacéutica proporcionada por esta invención puede contener un vector, viral o no viral, que comprende dicho polinucleótido. A modo ilustrativo, no limitativo, dichos vectores pueden ser vectores virales, por ejemplo, basados en retrovirus, adenovirus, etc., o no virales tales como los complejos ADN-liposoma, ADN-polímero, ADN-polímero-liposoma, etc. [véase "Nonviral Vectors for Gene Therapy", editado por Huang, Hung y Wagner, Academic Press (1999)]. Dichos vectores, que contienen dicho polinucleótido, pueden ser administrados directamente al cuerpo humano o animal por métodos convencionales. Alternativamente, dichos vectores pueden ser utilizados para transformar, transfectar o infectar células, por ejemplo, células de mamíferos, incluido el hombre, ex vivo, y, posteriormente implantarlas en el cuerpo humano o animal para obtener el efecto terapéutico deseado. Para su administración al sujeto, dichas células se formularán en un medio adecuado que no afecte adversamente a su viabilidad.
La composición farmacéutica de la invención comprende, al menos, un inhibidor de PPARα truncado (principio activo), en una cantidad terapéuticamente eficiente. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente eficiente" se refiere a la cantidad de producto (principio activo) calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de proteína y el efecto terapéutico a conseguir. A modo ilustrativo, la dosis de principio activo a administrar a un sujeto será una cantidad terapéuticamente eficiente y puede variar dentro de un amplio intervalo. Las composiciones farmacéuticas proporcionadas por esta invención pueden ser de una única dosis o de varias dosis. La composición farmacéutica proporcionada por esta invención se puede administrar una o más veces al día con fines preventivos o terapéuticos. La dosis de principio activo a administrar dependerá de numerosos factores, entre los que se incluyen las características del producto a administrar, tales como, por ejemplo, su actividad y vida media biológica, la concentración del producto en la composición farmacéutica, la situación clínica del sujeto, la severidad de la patología, la forma farmacéutica de administración elegida, etc. Por este motivo, las dosis mencionadas en esta invención deben ser consideradas tan solo como guías para el experto en la materia, y éste debe ajustar las dosis en función de las variables citadas anteriormente. La composición farmacéutica proporcionada por esta invención, si se desea, puede usarse junto con otros fármacos, por ejemplo, fármacos útiles en el tratamiento de la insuficiencia cardiaca y/o de cardiopatía hipertensiva (e.g., diuréticos, beta bloqueantes, IECA, antagonistas de canales de calcio, ARA, inhibidores de aldosterona, etc.), con el fin de aumentar la eficiencia de la composición farmacéutica proporcionada por esta invención, generándose de este modo una terapia de combinación. Dichos fármacos adicionales pueden formar parte de la misma composición farmacéutica o, alternativamente, pueden facilitarse como una composición farmacéutica separada para su administración al mismo tiempo (administración simultánea) que la composición farmacéutica de la invención o en momentos diferentes (administración secuencial) respecto a la administración de la composición farmacéutica proporcionada por esta invención.
Los inventores han observado que, en pacientes hipertensos que desarrollan insuficiencia cardiaca, los niveles de proteína de PPARα truncado se encuentran elevados. Sin embargo, los niveles de ARNm de PPARα truncado son similares a los niveles de expresión de la forma nativa en pacientes hipertensos.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la identificación de compuestos potencialmente útiles para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca en sujetos con cardiopatía hipertensiva que comprende:
(i) poner en contacto células que expresan PPARα truncado con un compuesto candidato;
(ii) determinar los niveles de expresión de PPARα truncado en dichas células; y (iii) seleccionar aquellos compuestos que produzcan una disminución en la expresión de PPARα truncado con respecto a un control; o alternativamente,
(i) poner en contacto un células que expresan PPARα truncado con un compuesto candidato; (ii) analizar los niveles de apoptosis de dichas células; y
(iii) seleccionar aquellos compuestos que produzcan una disminución en los niveles de apoptosis de dichas células.
En una realización particular, dichas células que expresan PPARα truncado son células que expresan dicha proteína de forma nativa (e.g., cardiomiocitos de sujetos con cardiopatía hipertensiva, etc.). En otra realización particular de la invención, dichas células que expresan PPARα truncado son células genéticamente modificadas. En una realización más particular, dichas células son células a las que se ha transfectado la secuencia del gen que codifica PPARα truncado. En una realización aún más particular, dichas células son células a las que se ha transfectado la secuencia del gen que codifica
PPARα truncado humano.
Por tanto, en una realización particular, el método de la invención comprende cuantificar el nivel de expresión de PPARα truncado y seleccionar aquellos compuestos que produzcan una disminución en la expresión de PPARα truncado con respecto a un control.
En una realización concreta, el método de la invención comprende cuantificar el nivel de PPARα truncado (proteína). El nivel (concentración) de dicha proteína puede ser cuantificado mediante cualquier método convencional que permita detectar y cuantificar los niveles de dicha proteína en una muestra. Así, el método de la invención incluye la realización de una etapa de extracción con el fin de obtener un extracto proteico que contenga dicha proteína, lo que puede realizarse mediante técnicas convencionales. Prácticamente cualquier método convencional puede ser utilizado dentro del marco de la invención para detectar y cuantificar los niveles de proteína de PPARα truncado. A modo ilustrativo, no limitativo, los niveles de dicha proteína pueden ser cuantificados mediante el empleo de métodos convencionales, por ejemplo, mediante el empleo de anticuerpos con capacidad de unirse a PPARα truncado (o a fragmentos de las mismas que contengan determinantes antigénicos) y posterior cuantificación de los complejos formados. Los anticuerpos que se emplean en estos ensayos pueden estar marcados o no. Ejemplos ilustrativos de marcadores que se pueden utilizar incluyen isótopos radiactivos, enzimas, fluoró foros, reactivos quimioluminiscentes, sustratos enzimáticos o cofactores, inhibidores enzimáticos, partículas, colorantes, etc. Existe una amplia variedad de ensayos conocidos que se pueden utilizar en la presente invención, que utilizan anticuerpos no marcados (anticuerpo primario) y anticuerpos marcados (anticuerpo secundario); entre estas técnicas se incluyen el Western-blot o transferencia Western, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima), RIA (radioinmunoensayo), EIA competitivo (inmunoensayo enzimático competitivo), DAS-ELISA (ELISA sandwich con doble anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el empleo de biochips o microarrays de proteínas que incluyan anticuerpos específicos o ensayos basados en precipitación coloidal en formatos tales como dipsticks. Otras maneras para detectar y cuantificar dicha proteína incluyen técnicas de cromatografía de afinidad, ensayos de unión a ligando, etc.
El método de la invención también comprende la etapa de comparar dicho nivel con el de una muestra control de manera que si la expresión de dicha proteína (PPARα truncado) disminuye, el compuesto ensayado es un compuesto potencialmente útil para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca en sujetos con cardiopatía hipertensiva. A modo ilustrativo, no limitativo, dicha muestra control puede ser un cultivo celular control al que no se le ha añadido ningún compuesto inhibidor candidato. Los niveles de expresión de PPARα truncado en dicho cultivo celular control pueden ser determinados por las técnicas mencionadas previamente.
Alternativamente, el método de la invención también comprende analizar el nivel de expresión del gen que codifica PPARα truncado. El nivel de expresión de un gen puede ser cuantificado mediante la cuantificación del nivel de ARN mensajero (ARNm) de dicho gen, resultado de la transcripción de dicho gen, o, alternativamente, del nivel del ADN complementario (ADNc) a dicho ARNm. En este caso, el método de la invención incluye la realización de una etapa de extracción con el fin de obtener el ARN total, lo que puede realizarse mediante técnicas convencionales. Prácticamente cualquier método convencional puede ser utilizado dentro del marco de la invención para detectar y cuantificar los niveles de ARNm de PPARα truncado o de su ADNc correspondiente. A modo ilustrativo, no limitativo, los niveles de ARNm pueden ser cuantificados mediante el empleo de métodos convencionales, por ejemplo, métodos que comprenden Northern blot y empleo de sondas específicas del ARNm de interés, mapeo con la nucleasa Sl, RT-LCR, hibridación, microarrays, etc. Análogamente, los niveles de los ADNc correspondientes a dicho ARNm de PPARα truncado también pueden ser cuantificados mediante el empleo de técnicas convencionales; en este caso, el método de la invención incluye una etapa de síntesis del ADNc mediante transcripción inversa (RT) del ARNm correspondiente seguida de amplificación y cuantificación del producto de la amplificación de dicho ADNc; en una realización particular, la amplificación se lleva a cabo de manera cualitativa o cuantitativa, mediante PCR (e.g., PCR cuantitativa, PCR cuantitativa a tiempo real usando un marcador apropiado, etc.) usando oligonucleótidos iniciadores que amplifican específicamente regiones de PPARα truncado.
Como se ha mencionado anteriormente, los estudios llevados a cabo por los inventores ponen de manifiesto la implicación de PPARα truncado con la apoptosis celular, en particular, con la apoptosis de cardiomiocitos (ver Ejemplo 1). Por tanto, alternativamente, el método de la invención también comprende analizar los niveles de apoptosis de dichas células en cultivo y seleccionar aquellos compuestos que producen una disminución en los niveles de apoptosis de dichas células. Prácticamente cualquier método convencional puede ser utilizado dentro del marco de la invención para determinar los niveles de apoptosis celular. Así, a modo ilustrativo, no limitativo, los niveles de apoptosis celular se determinan mediante el análisis de diferentes parámetros apoptóticos, tales como la medida de la exposición de fosfatidilserina, el análisis de la alteración del potencial de la membrana mitocondrial, medida de la activación de la caspasa-3, etc., los cuales pueden ser determinados por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia.
El siguiente ejemplo ilustra la invención y no debe ser considerado limitativo del alcance de la misma.
EJEMPLO 1
Inducción de la apoptosis de cardiomiocitos por PPARα truncado
1. MÉTODOS 1.1 Transfección del PPARα truncado en cardiomiocitos Los experimentos de transfección se han realizado en la línea de cardiomiocitos
HL-I (una línea celular obtenida a partir de un tumor subcutáneo auricular inducido en un ratón transgénico por la expresión del antígeno SV40 T, descrita y caracterizada en la patente norteamericana US 6316207).
En primer lugar, se construyó un vector recombinante con el PP ARa truncado humano y un vector de expresión en eucariotas. Para ello, se realizó una reacción de retrotranscripción a partir de 5 μg de ARN total de corazón humano perteneciente a una librería de ARN de corazón humano (Ref. AM7966, Ambion). Para la reacción de retrotranscripción se empleó una concentración de 10 raM de cada dNTP (Invitrogen), 500 ng de Oligo(dt)i2-i8 (Invitrogen), ditiotreitol a una concentración de 5 mM (Invitrogen), 40 unidades del inhibidor de RNasas SUPERase In RNase inhibitor (Ambion) y 40 unidades de la Retrotranscriptasa Superscript III (Invitrogen) en una solución tampón. Tras una incubación previa de 5 minutos a 65°C, se llevó a cabo la retrotranscripción durante 60 minutos a 500C. Finalmente se incubó durante 15 minutos a 700C para inactivar la enzima.
A continuación, se empleó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar una región específica en el ADNc del PPARα truncado. Con el fin de minimizar la probabilidad de que se produjesen mutaciones en el PPARα truncado, se empleó una enzima con una baja tasa de mutaciones, la Taq Platinum Hi gh Fidelity ADN polimerasa (Invitrogen). Además, se realizaron dos tandas de PCR con 20 ciclos de amplificación cada una, ya que la tasa de mutación de la enzima es inferior a 1 por cada 20 ciclos de amplificación. La PCR se realizó en el termociclador Gene Amp PCR System 9700 (Perkin Elmer-Applied Biosystems) con el perfil de temperaturas señalado en la Tabla 1.
Tabla 1: Condiciones de la PCR Proceso Temperatura Duración N° de ciclos
Activación de la ADN polimerasa 94°C 10 min 1
Etapas cíclicas
Desnaturalización 940C 1 min "1 Emparejamiento y Extensión 680C 2 min r 20 Extensión final 68°C 10 min 1 La Taq Platinum High Fidelity ADN polimerasa se activa únicamente al alcanzar los 94°C, lo que previene la amplificación de productos inespecíficos antes de alcanzar la temperatura de inicio de la reacción.
Los cebadores empleados fueron los siguientes: i) 5'-CACCATGGTGGACACGGAAAGCCCACT-S' (SEQ ID NO: 2) correspondiente a la secuencia del nucleótido 1 al 23 del ADNc del PPARq truncado, y ii) 5'-TCATGTATGACAAAAGGCGTTGTGTGACAT-S' (SEQ ID
NO: 3) que hibrida con la secuencia del nucleótido 500 al 529 del ADNc del PPAR α truncado.
Los productos de PCR se separaron por peso molecular mediante electroforesis en un gel de agarosa para comprobar el éxito de la amplificación. El gel se preparó con agarosa D-I (Pronadisa) al 0,8% y la electroforesis se llevó a cabo a 40 V de voltaje constante. Los fragmentos amplificados se tiñeron con bromuro de etidio, que se intercala en la doble hélice de ADN emitiendo luz visible de color salmón al ser irradiado con luz ultravioleta a 312 nm. Se visualizaron en un iluminador U. V.
(Thriftline Transilluminators, Ultralum Inc.) y se fotografiaron con el equipo Polaroid
DS-34 en películas Polopan 667 de Polaroid. El tamaño de los productos de PCR se estimó por comparación con un marcador de peso molecular (IKb DNALadder, Invitrogen).
Una vez comprobada la amplificación de un fragmento del tamaño esperado para el PPAR α truncado, los productos de PCR se purificaron mediante un kit de Qiagen (Qiaquick PCR purification Kit, Qiagen) Este sistema emplea unas columnas con membranas de gel de sílice a las que se une el ADN y unas soluciones de lavado para eliminar las impurezas. Tras los lavados, se eluyó el ADN en una solución tampón (10 mM Tris-Cl, pH 8,5) y se mandó secuenciar al servicio de secuenciación del Centro de Investigación Médica Aplicada (CIMA) para comprobar que se había amplificado específicamente el PPAR α truncado.
Se han mezclado cantidades crecientes de PP ARa truncado (60 ng-200 ng-400 ng), cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 1, con una misma cantidad de Lipofectina (Invitrogen; Ref. 18292-037) (20 μl) y se han añadido a las células HL-I. Tras 5 horas de transfección, se ha retirado la mezcla de transfección y se han incubado las células durante 24 horas con medio Claycomb (SIGMA, Ref. 51800C, específico de este tipo celular) en el incubador a 37°C y 5% de CO2. A las 24 horas se ha procedido a tripsinar las células y a dividirlas para analizar los diferentes parámetros apoptóticos que se explican a continuación.
1.2 Medida de la exposición de fosfatidilserina
Durante el proceso de apoptosis, la fosfatidilserina es traslocada de la cara interna a la cara externa de la membrana plasmática, lo que sirve de señal apoptótica a las células fagocíticas. Para analizar la exposición de fosfatidilserina de los cardiomiocitos, se ha empleado el Kit "Annexin V-FITC" (Spallarossa et al. J Mol CeIl Cardiol, 2004.; 37: 837-846) de Pharmatarget (Ref. A-700). En este kit, la anexina V marcada con el fluorocromo FITC se une a la fosfatidilserina expuesta en la membrana plasmática de las células. Tras incubar las células 15 minutos con Anexina-FITC, se mide la emisión del fluorocromo mediante citometría de flujo. El ensayo se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
1.3 Análisis de la alteración del potencial de la membrana mitocondrial
En la apoptosis se produce la liberación de una serie de proteínas apoptogénicas de la mitocondria al citosol, que depende de la alteración del potencial de la membrana mitocondrial.
Para analizar el potencial de la membrana mitocondrial de los cardiomiocitos se ha empleado el producto JC-I (cloruro de 5,5', 6,6'-tetracloro-l,l'3,3'-tetraetil- benzimidazolilcarbocianina; Ref. 70011) de Biotium, el cual tiñe la mitocondria de forma dependiente del potencial de la membrana mitocondrial (Smiley et al. Proc Nati Acad Sci, 1991; 88: 3671-3675). De esta forma, cuando el potencial no está alterado, el producto JC-I se encuentra formando agregados, los cuales emiten una fluorescencia roja (590 nm), mientras que cuando el potencial está alterado, el JC-I se encuentra en forma de monómeros, emitiendo fluorescencia verde (527 nm). Así, se incuban las células durante 30 minutos con JC-I a 370C, y posteriormente se miden en el citómetro. La relación entre la absorbancia a 590 nm y a 527 nm indicará cómo está el potencial de la membrana mitocondrial. 1.4 Medida de la activación de Ia caspasa-3
En la apoptosis se produce una activación de las caspasas, las cuales lleva a cabo la destrucción proteolítica de la célula. Una de las caspasas ejecutoras de la apoptosis es la caspasa-3. La caspasa-3 existe como dímero inactivo, y se activa por un corte proteolítico que tiene lugar en unas regiones específicas de esta molécula, y como consecuencia de este corte la procaspasa inactiva (35 kDa) da lugar a fragmentos activos (17-21 kDa). La activación de la caspasa-3 se mide analizando la relación entre los fragmentos activos y la procaspasa inactiva.
Se han analizado, por Western blot, las bandas de 17-21 kDa y 35 kDa de la caspasa-3 (Chandrasekar et al. Biol Chem, 279: 20221-20233). Se ha empleado un anticuerpo primario de conejo frente a caspasa-3 (Ref. 9662, CeIl Signaling), y un anticuerpo secundario de burro anti-conejo peroxidado (Ref. NA934, Amersham). El análisis de las bandas se ha realizado densitométricamente con el espectrofotómetro "Molecular Imager" de Bio-Rad, empleando el programa Quantity One.
2. RESULTADOS
2.1 Exposición de fosfatidilserina
La transfección de PPARα truncado produce un progresivo aumento (p de tendencia<0,05) en la exposición de fosfatidilserina de los cardiomiocitos (Control: 100±3,74; 60 ng de PPARα truncado: 127,21±6,85%; 200ng de PPARα truncado: 134,67±12,38%; 400ng de PPARα truncado: 137,36±13,48%) (Figura 1).
2.2 Potencial de la membrana mitocondrial El potencial de la membrana mitocondrial sufre una progresiva alteración (p de tendencia<0,05) a medida que se aumenta la cantidad de PPARα truncado que se transfecta. (Control: 100±7,87%; 60 ng de PPARα truncado: 116,49±10,40%; 200 ng de PPARα truncado: 133,50±18,46%; 400 ng de PPARα truncado: 147,51±17,43) (Figura 2).
2.3 Activación de la Caspasa-3
A medida que aumenta la cantidad de PPARα truncado en los cardiomiocitos, la activación de la caspasa-3 es mayor (p de tendencia<0,05) (Control: 100±12,83%; 60 ng de PPARα trancado: 125,65±10,31%; 200 ng de PPARα trancado: 139,51±18,12%; 400 ng de PPARα trancado: 165,15±23,14) (Figura 3).
CONCLUSIONES Estos resultados demuestran que el PPARα trancado es una nueva molécula pro- apoptótica, ya que se ha observado que induce la exposición de fosfatidilserina en la membrana plasmática, altera el potencial de la membrana mitocondrial y activa la caspasa-3. Está ampliamente demostrada la implicación de estas 3 vías sobre las que actúa el PPARα trancado, con la apoptosis de los cardiomiocitos.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Empleo de un inhibidor de PPAR α truncado en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca en sujetos con cardiopatía hipertensiva.
2. Método para la identificación de compuestos potencialmente útiles para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca en sujetos con cardiopatía hipertensiva que comprende: (i) poner en contacto células que expresan PP ARa truncado con un compuesto candidato; (ii) determinar los niveles de expresión de PPARα truncado en dichas células; y
(iii) seleccionar aquellos compuestos que produzcan una disminución en la expresión de PPARα truncado con respecto a un control; o alternativamente, (i) poner en contacto un células que expresan PPARα truncado con un compuesto candidato;
(ii) analizar los niveles de apoptosis de dichas células; y (iii) seleccionar aquellos compuestos que produzcan una disminución en los niveles de apoptosis de dichas células.
3. Método según la reivindicación 2, donde dichas células que expresan PPARα truncado son células en las que se ha transfectado la secuencia del gen que codifica PPARα truncado.
4. Método según la reivindicación 2 ó 3, donde dicho PPARα truncado es PPARα truncado humano.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que los niveles de expresión de PPARα truncado se miden a nivel de ARN mensajero.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que los niveles de expresión de PPARα truncado se miden a nivel de proteína.
PCT/ES2008/000620 2007-10-05 2008-10-01 Empleo de inhibidores de ppar alfa truncado en el tratamiento de la insuficiencia cardiaca en sujetos con cardiopatía hipertensiva WO2009043953A1 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES200702625 2007-10-05
ESP200702625 2007-10-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2009043953A1 true WO2009043953A1 (es) 2009-04-09

Family

ID=40525845

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2008/000620 WO2009043953A1 (es) 2007-10-05 2008-10-01 Empleo de inhibidores de ppar alfa truncado en el tratamiento de la insuficiencia cardiaca en sujetos con cardiopatía hipertensiva

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2009043953A1 (es)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002094877A2 (en) * 2001-05-23 2002-11-28 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) New nuclear receptor cofactors and related modulators
EP1267171A1 (en) * 2001-06-14 2002-12-18 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Cofactor-based screening method for nuclear receptor modulators
WO2003021265A1 (en) * 2001-08-30 2003-03-13 Discoverx, Inc. Genetic construct intracellular monitoring system

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002094877A2 (en) * 2001-05-23 2002-11-28 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) New nuclear receptor cofactors and related modulators
EP1267171A1 (en) * 2001-06-14 2002-12-18 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Cofactor-based screening method for nuclear receptor modulators
WO2003021265A1 (en) * 2001-08-30 2003-03-13 Discoverx, Inc. Genetic construct intracellular monitoring system

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GOIKOETXEA M.J. ET AL.: "Altered cardiac expresssion of peroxisome proliferator-activated receptor- isoforms in patients with hypertensive heart disease", CARDIOVASCULAR RESEARCH, vol. 69, 2006, pages 899 - 907 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7079761B2 (ja) 心不全の治療のための標的としてのｂａｇ３
Plante et al. Oxytocin treatment prevents the cardiomyopathy observed in obese diabetic male db/db mice
Diep et al. Effect of AT1 receptor blockade on cardiac apoptosis in angiotensin II-induced hypertension
US10329354B2 (en) Modulation of efferocytosis pathways for treatment of atherosclerotic disease
Rocha et al. Anabolic steroids induce cardiac renin-angiotensin system and impair the beneficial effects of aerobic training in rats
JP5649263B2 (ja) 心臓血管障害および薬物応答に関連した遺伝子多型、それらの検出方法および用途
US20220125920A1 (en) Combination therapy for treatment of coronary artery disease
Xiao et al. Impaired sonic hedgehog pathway contributes to cardiac dysfunction in type 1 diabetic mice with myocardial infarction
JP2008515394A (ja) 心臓の圧負荷関連遺伝子
Li et al. ATP6AP2 knockdown in cardiomyocyte deteriorates heart function via compromising autophagic flux and NLRP3 inflammasome activation
WO2011054644A1 (en) A low density lipoprotein-related protein 1 splice variant as cancer marker
JP2019182873A (ja) 膵臓炎、腎損傷および腎臓癌を治療および予防するための組成物および方法
TWI359271B (en) Pharmaceutical composition for insulin resistance
US20170216244A1 (en) Methods for treating diabetic nephropathy
WO2009043953A1 (es) Empleo de inhibidores de ppar alfa truncado en el tratamiento de la insuficiencia cardiaca en sujetos con cardiopatía hipertensiva
Wang et al. Autoantibody against angiotensin II type I receptor induces pancreatic β-cell apoptosis via enhancing autophagy
Rampazzo Genetic bases of arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy
AU2005274377B2 (en) Method of screening for a carnitine transporter agonist or antagonist and its uses
US8101158B1 (en) Methods for treating cerebrovascular disease comprising administering an agent that inhibits prokineticin receptor activity
Kukułowicz et al. The SLC6A15–SLC6A20 Neutral Amino Acid Transporter Subfamily: Functions, Diseases, and Their Therapeutic Relevance
WO2017195901A1 (ja) 肝分泌型代謝制御因子阻害作用による肥満関連疾患治療剤
Manickam et al. Genetic deletion of Kvβ2 (AKR6) causes loss of muscle function and increased inflammation in mice
US20110112032A1 (en) Regulation of Brain Natriuretic Peptide and Catecholamines for the Treatment of Cardiovascular Diseases
US20220288156A1 (en) Treatment
CA2801162A1 (en) Diagnostic, screening and therapeutic applications of ocab-based tools

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 08835740

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 08835740

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1