JP2005345332A - 質量分析方法及び質量分析システム - Google Patents

質量分析方法及び質量分析システム Download PDF

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Abstract

【課題】タンデム型質量分析計を用いて同位体化された試料を測定する方法における測定スループットの向上。
【解決手段】本発明ではタンデム型質量分析計を用いた同位体ラベリング試料の分析技術において、1段階目の測定(MS)スペクトルを測定セッション内でリアルタイムに解析して2段階目以降の解離・スペクトル測定(MS)に用いるイオンを決定する。
【選択図】 図2

Description

本発明は、質量分析方法及び質量分析システムに関し、特に質量分析計および質量分析スペクトルの解析システムに係わり、タンパク質、ポリペプチド、糖、核酸などの生体高分子を精度よくかつ高いスループットで同定・定量する質量分析方法及び質量分析システムに関する。
質量分析計(以下MSと略記する)を用いたタンパク質の同定・定量法として近年注目されている技術に同位体ラベリングを用いる方法がある。この技術では二つの検体から試料をサンプリングし、一方には”重い”試薬を、もう一方には軽い”試薬”を結合させる。”重い”試薬と”軽い”試薬の化学構造は同一であるが、含まれる元素の質量数が異なるために分子量が相違している。
このようにして作成した分子量が異なる二つの試料を混合しMSで測定すると、二つの試薬の分子量の差(Δm)だけ離れたピークのペアが現れる。元の二つのタンパク試料が同じ検体に由来し、使用した試料の濃度と量が同一であればそれぞれの検体に由来する二つのピークはほぼ同じ強度となるはずである。しかし、もし二つの検体のうち一つが特定の病気の個体に由来する検体であり、もう一方が健康な個体に由来する検体である場合、ピーク強度の異なるピークのペアが現れることがある。
このようなピークを詳細に分析することにより、病気のマーカーとなっているタンパク質を特定することができる。また、病気に限らず様々なタンパク機能の解明に役立つと期待されている。
上記のような同位体ラベリングを用いる技術に関連して多くの公知例が存在する。代表的なものとして、特許文献1及び特許文献2が挙げられる。本公知例では同位体で標識された試薬を測定サンプルに添加し、多段解離・計測が可能なタンデム型MSを使って分析する方法について述べられている。また、1段階目の測定(以下MSと略記する)で検出したピーク対の強度比を用いて2段階目の測定(以下MSと略記する)を実施してタンパク配列を決定する方法についても述べられている。
特開2003−107066号公報
特許第3345401号明細書
従来法における課題について以下に述べる。タンデム型MSは1回の測定セッションで多段階の解離と計測を実施できる。通常、MSで測定したピークの中から特にアミノ酸配列同定に必要なピークを選び出してMSを実施し、データベース検索によって測定したMSスペクトルに対応するアミノ酸配列を決定する。現在の測定装置では、前記“必要なピーク”の質量数が判明している場合、あらかじめ測定装置にMSで選定するピークを登録することができ、MSまでの解離と計測を自動的に1セッションで実施することができる。
しかし、前記“必要なピーク”の質量数が判明していない場合には一旦MSを実施してMS測定するピークを選定した後、2セッション目の測定でMSスペクトルを取得する。通常、MSの前段には液体クロマトグラフィー(以下LCと略記)が設置され、LCから流出した成分をMSの試料としている。LCによる分離では測定したい成分が流出するまで場合によっては数時間オーダーの時間がかかり、また前記成分がLCカラムから流出している時間は10秒〜20秒程度でしかない。従って10秒〜20秒以内の時間でMS測定結果を解析し、MS測定ピークを判定しない限り、再度時間のかかるLCによる分離を実施しなくてはならない。また測定したい成分が流出し始めた時刻と流出が終わりに近づいた時刻では流出成分の組成が異なる可能性があるため、できれば0.1〜1秒以内で測定ピークの選定をすることが望ましい。
しかし、従来法では上記のような短時間(10秒〜20秒)でMSスペクトルの解析とMSで測定すべきピークの選定をするシステムについては言及されていない。従って、従来法ではどの質量数で強度比の異なるピーク対が出現するか既知の試料に対しては最低1回の測定セッションでタンパクのアミノ酸配列を同定可能だが、未知の試料に対しては最低2回の測定セッションが必要となる。上記に述べたようにLCのスループットは一般的に遅い(数時間程度)ため、測定セッションの回数が増えると同定までのスループットが著しく低下する。今後、診断医療への応用等、迅速な同定・定量のニーズは増大すると考えられ、スループットの低下要因を排除する必要がある。
以上の課題を解決するため、本発明は以下の解決手段を提供する。
まず、分子量の異なる試薬によってラベリングされた複数の検体を含む試料を準備するステップ、該試料をクロマトグラフィーにより分離するステップ、分離された該試料を多段解離計測が可能なタンデム型質量分析計により質量分析するステップ、質量分析結果を実時間で解析するステップ、及び少なくとも1つの検体の解析結果を他の検体の質量分析に実時間で利用するステップを含む質量分析方法が提供される。
さらに、複数のラベリング試薬によってラベルされた複数の検体を含む試料を展開するクロマトグラフィー装置と、該クロマトグラフィー装置に接続され、試料を多段解離計測が可能なタンデム型質量分析計と、該試料を上記タンデム型質量分析計の分析領域に位置させ又は移動させる手段と、上記タンデム型質量分析計の分析結果を実時間で解析する情報処理装置と、上記クロマトグラフィー装置及びタンデム型質量分析計を制御する制御装置と、該制御装置に必要な情報を入力し及び/又は出力する入出力装置とを備えた質量分析システムが提供される。
上記において、クロマトグラフィー装置は液体クロマトグラフィー(LC)及びガスクロマトグラフィー(GC)のいずれでも良い。また、上記において、実時間でのデータ解析及びそれを反映した質量分析条件の変更、修正などは、データ処理との時間差が最長でも1秒以内、特に0.1秒以内に実行するのが好ましい。
本発明によれば、タンデム型質量分析計を利用してスループットの高い生体高分子の同定・定量が可能となる。
まず、本発明を実施するための形態の概略について説明する。本発明により、分子量の異なる試薬によってそれぞれラベリングされた複数の検体を混合した試料をタンデム型質量分析計で測定するシステムであって、少なくとも多段解離計測が可能なタンデム型質量分析計と、情報処理装置と、入出力装置を含む質量分析方法及びシステムが提供される。これにより、同位体化した試料を迅速に同定・定量することが可能となる。
好ましくは上記解決手段において、多段解離計測が可能なタンデム型質量分析計で測定した1段階目のスペクトル測定結果を情報処理装置によって解析し、この解析結果に基づいてリアルタイムに2段階目以降の測定で解離させるイオンを選定する質量分析方法及びシステムが提供される。
通常のタンデム型MSでは、試料を同定する上で必要なピークはMS測定で決定し、MSもしくはそれ以降の解離・計測(MS,n>2)で得たスペクトルをもとに測定対象の構造を明らかにする。測定に必要なピークがあらかじめ判明している場合にはタンデム型MSの機能により1セッションでMS(もしくはMS、n>2)の計測が可能だが、判明していない場合にはMSスペクトルを解析した後、更にもう1回追加の測定セッションを実施する必要がある。一方、本発明では測定セッション中に実時間でMSスペクトル中の測定すべきピークを抽出してMSを実施する。これにより未知の試料であっても最低1回の測定セッションで試料の分析・同定・定量が可能となり測定スループットが大幅に向上する。
また、好ましくは上記解決手段において、分子量が異なり化学構造が同一の二つの同位体試薬を用い、その分子量が異なる同位体試薬によってそれぞれラベリングされた二つの検体を混合したものを試料とする質量分析方法及びシステムが提供される。これにより、二つの同位体によりラベリングされた試料の比較・定量を迅速に実行できる。
また、好ましくは上記解決手段において、二つの同位体試薬の分子量の差をΔmとした時、1段階目の計測で得られたスペクトル中においてn×Δm/z(z:イオンの電荷、n:正の整数)だけ離れたピークのペアを抽出し、抽出したピークのペアのスペクトル強度の相互関係に基づいて、2段階目以降に測定するピークを選択する質量分析方法及びシステムが提供される。これにより、ピークのペア選定を迅速に実施できる。
また、好ましくは上記解決手段において、ピークのペア抽出において、質量分析計の質量数測定誤差をδとしたとき、注目したピークのm/zの値から±δの範囲にある全てのピークと注目したピークのm/zの値から−n×Δm/z+δ〜−n×Δm/z−δの範囲に存在するピークとをピークのペアとして扱う質量分析方法及びシステムが提供される。これにより、質量分析計の質量分析誤差を考慮した分析が可能となる。
更に好ましくは上記におけるピークのペア抽出において、測定したスペクトルのうちm/zが最大のピークからペア抽出を開始し、順次m/zの低いピークのペア抽出する質量分析システムが提供される。
また、好ましくは上記におけるピークのペアにおいて、質量数の高い同位体でラベリングされたピークの強度をP1、質量数の低い同位体でラベリングされたピークの強度をP2とし、rを測定者が設定した値としたとき、判定式P1/P2>rもしくはP1/P2<rを満たすピークのペアのうち片方一つもしくは両方を2段階目以降の測定で解離させる質量分析システムが提供される。これにより、判定式による機械的なピーク判定が可能となり、情報処理機器を用いて2段階目以降で測定すべきピークを迅速に判定できる。
また、好ましくは、注目した質量数の高い同位体でラベリングされたピークのm/zの値から±δの範囲にあるピークの強度全てを積算したものをP1とし、ピークとペアとなる質量数の低い同位体でラベリングされたピークのm/zの値から±δの範囲に存在するピークの強度全てを積算したものをP2とする質量分析方法及びシステムが提供される。これにより、MSの質量分析誤差を考慮した分析が可能となる。
また、好ましくは上記における判定式がP1−P2>r2もしくはP1−P2<r2であり、r2を測定者が設定した値としたとき、判定式を満たすピークのペアのうち片方一つもしくは両方を2段階目以降の測定で解離させる質量分析方法及びシステムが提供される。これにより、判定式による機械的なピーク判定が可能となり、情報処理機器を用いて2段階目以降で測定すべきピークを迅速に判定できる。
また、好ましくは上記における判定式がP1×P2>r3もしくはP1×P2<r3であり、r3を測定者が設定した値としたとき、判定式を満たすピークのペアのうち片方一つもしくは両方を2段階目以降の測定で解離させる質量分析方法及びシステムが提供される。これにより、判定式による機械的なピーク判定が可能となり、情報処理機器を用いて2段階目以降で測定すべきピークを迅速に判定できる。
また、好ましくは上記における判定式がr4<P1/P2<r5であり、r4、r5を測定者が設定した値としたとき、判定式を満たすピークのペアのうち片方一つもしくは両方を2段階目以降の測定で解離させる質量分析方法及びシステムが提供される。これにより、判定式による機械的なピーク判定が可能となり、情報処理機器を用いて2段階目以降で測定すべきピークを迅速に判定できる。
また好ましくは判定式として測定者が任意の判定式を設定し、この判定式を満たすピークのペアのうち片方一つもしくは両方を2段階目以降の測定で解離させる質量分析システムが提供される。これにより、判定式による機械的なピーク判定が可能となり、情報処理機器を用いて2段階目以降で測定すべきピークを迅速に判定できる。
また、好ましくは測定対照とする検体がタンパク質、あるいはタンパク質を分解したペプチド、化学修飾されたペプチド、糖類または核酸である質量分析システムが提供される。これにより、一般的な生体高分子の同定・定量を高いスループットで実行できる。
また、好ましくは上記におけるタンパク質、あるいはタンパク質を分解したペプチド、化学修飾されたペプチドを同位体ラベリングする際、前記タンパク質、あるいはタンパク質を分解したペプチド、化学修飾されたペプチドに含まれるシステインもしくはトリプトファンに特異的に結合する同位体試薬を用いる質量分析方法及びシステムが提供される。
これにより、存在量の低いアミノ酸残基に特異的に結合する試薬を用いることにより、スペクトル解析を容易化できスループットと同定精度を向上させることができる。また、好ましくは上記における同位体試薬が水素の同位体、酸素の同位体、炭素の同位体、窒素の同位体、リンの同位体あるいはこれらの組み合わせを含む質量分析方法及びシステムが提供される。これにより、測定対象に応じて最適な同位体化試薬を選択することができる。
また好ましくは上記における質量分析システムの構成に、データベース検索のための情報処理装置およびネットワーク接続装置およびデータストレージのうちいずれかもしくは両者を加える質量分析方法及びシステムが提供される。これにより、データベース検索の高速化が実現し測定中にリアルタイムに測定対象の同定・定量化が可能となる。
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。
実施例1
本発明にかかる質量分析システムの実施例について図1〜図5を用いて以下に説明する。図1に示す質量分析システムは試料導入系101、液体クロマトグラフィー装置(LC)102、タンデム型MS103、制御装置104、コンピュータ201、出力装置としてのディスプレイ装置202、入力装置としてのキーボード203、およびこれらを接続する信号線で構成される。本実施例で用いるタンデム型MS103はイオントラップ型の装置であり、イオン化方法はエレクトロスプレーイオン化を用いる。また、本実施例における使用条件では、タンデム型MS103の質量測定誤差δは約0.5Daである。ここでDaは原子量単位で、1Da=1原子質量である。
本実施例の図1に示したシステムは図2のフローに従って動作する。以下、システムの動作について説明する。ここでは2つの検体A,Bについてタンパク同定および定量を実施する。A,Bそれぞれの検体は同じ種類の動物の同じ組織から抽出したものであり、濃度および量も同一とする。ただし、抽出した個体はA,B別のものであり、分析の目的は個体によるタンパクの発現量の違いと、そのタンパクの同定であるとする。
まず検体A,Bを、それぞれ2つの同位体試薬aおよびbでラベリングする。a,bの化学構造は同一であるが、含まれる炭素の同位体(C12およびC13)の数が異なる。aはC13を8つ構造中に持ち、一方でbはC12しか持たないのでaはbに比較して分子量が8だけ大きい。a,bの試薬はタンパク質中のシステイン残基にのみ結合する性質を持っている。
次に消化酵素によってA,Bの検体をそれぞれ分解する。分解して得られたA,Bの検体に由来する試料を等量混合し試料導入系101にセットする。試料導入系101の試料はLC102によって分離されタンデム型MS103に導入される。LC102およびタンデム型MS103の動作は制御装置104によりコントロールされる。また制御装置104はコンピュータ201によりコントロールされる。コンピュータ201はあらかじめ測定者がキーボード203で入力した測定条件に従って制御装置104に指示を与える。また、コンピュータ201はLC102およびタンデム型MS103で得られたMSスペクトルデータを記録する。
次に得られたMSスペクトルデータを解析し、検体AおよびBに由来するピークペアの判定を実施する。システイン残基がLC流出成分中のペプチドに含まれる場合にはm/zが8だけ離れた位置に二つのピークが出現するのでピークペアの判定が可能となる。また、ここでは測定対象としているペプチド中に1つだけシステイン残基が含まれる場合だけを想定しn=1とする。
図3を用いてこれを説明する。図3は測定したMSスペクトルにおける検体A由来のピークと検体B由来のピークを模式的に示した図である。図3のピークはスペクトル解析の結果全て1価のイオンに由来すること(z=1)が分かっている。また、図3のスペクトルにおける主要なピークは21〜25のピークであり、21と22および24と25のピークの間隔は8.2Daおよび7.8Daである。
ここで、タンデム型MS103の質量測定誤差δと試薬a,bの質量差Δmを用いてコンピュータ201はスペクトルのペアリングを実行する。ペアリングの手順は一般的には図4に示したフローに従って実行する。以下図4のフローに従い、図3のスペクトルからピークペアを抽出する手順を説明する。ペアリングは測定者が特に指定しない限り、最も高いm/zのピークから実施する。図3の場合ではピーク21がこれに相当する。
ピーク21の質量数は1510.1であり、まず、ピーク21から−δの範囲にあるピーク、すなわち1509.6〜1510.1までのm/zを検索し、全てピーク21に属するピークとして記録する。また、ピーク21に属するピークの強度を全て積算し、ピーク21のP1の値として記憶する。次にペアとなるピークを見つけるため1510.1−n×Δm/z―δ〜1510.1−n×Δm/z+δの領域を探索する。
ここで、n=1、Δm=8、δ=0.5またz=1なので、1501.6〜1502.6の質量範囲を探索することになる。図3ではピーク22がこの条件に該当し21と22のピークがペアとして登録される。また、ピーク22に属するピークの強度を全て積算しピーク22のP2として記憶する。さらにm/zの低い領域に探索を広げていくとピーク23が検出される。ピーク23付近にはペアリングできるピークが存在しないので、ピーク23はペアリングせず、更にm/zの低い領域に探索を進める。次に検出されるピークはピーク24である(m/z=1146.6)。
ここで、ピーク24のm/z±δの領域にあるピークをまとめてピーク24に属するものとする。また、ピーク21と同様にピーク24に属するピーク全ての強度を積算しピーク24のP1として記憶する。次に1146.6―n×Δm/z−δ〜1146.6−n×Δm/z+δの領域を探索する。これにより新たに25のピークが検出され、24と25のピークがペアとして登録される。また、ピーク25に属するピーク全ての強度を積算しピーク25のP2として記録する。ピーク25より更に低いm/zの領域にピークが存在する場合には上記の探索を続行する。本実施例ではピーク25より低いm/zのピークは存在しないのでここまでで探索を終了する。探索終了までにピークのペアが検出されなかった場合にはMSスペクトルの測定を実施せず、次のLC流出成分が流出してから再びその流出成分についてMSスペクトルの取得を実行する。
上記までの操作はバックグランドノイズの影響を回避するため、あらかじめ閾値を設けて閾値以下の強度のピークに関してはピークペアの探索から除外するなどの処置が望ましい。
次に、ペアリングされたピークについて、A由来のピークの強度P1、B由来のピークの強度P2の関係から測定すべきMSのピークを選択する。ここでは判定式としてP1/P2<rを採用し、判定値r=0.7とする。この判定式が成り立つかどうか全てのピークペアに対して判定を実施する。本実施例ではピーク21と22のペアについてはP1/P2=1.1となり判定式を満たさないがピーク24とピーク25はP1/P2=0.6となり判定式を満たす。そこでピーク24とピーク25をMSで測定すべきピーク(以下選定ピークと呼ぶ)としてm/zの値を記憶する。選定ピークが複数存在する場合は選定ピークすべてのm/zを記憶しておく。ここで、MS測定結果が得られてから選定ピークを決定するまでの時間は一般的に用いられているパーソナルコンピュータを使用した場合でも0.1秒以下である。
次に選定ピークについてMS測定を実施する。選定ピークは一つのペアにつき2つ存在するのでどちらか一方もしくは両方を選んでMS測定を実施する。本実施例では軽い同位体でラベリングした方、ピーク25だけを選んでMS測定を実施する。
測定したMSスペクトル情報はコンピュータ201に内蔵したマススペクトルデータベースを検索し適合するアミノ酸配列を抽出する。検索結果およびその他のデータはコンピュータ201のハードディスクに蓄積されると同時にコンピュータ201のディスプレイ装置202上に表示される。ディスプレイ装置202に表示される情報の例を図5に示す。図5の例では次の情報が表示されている。
(1)MSで測定したピークのLCリテンションタイム。
(2)選定したMSのm/zの値。
(3)選定したMSのP1/P2の値。
(4)データベースサーチの結果:候補アミノ酸配列をランキング順に表示。
(5)上記(4)の候補アミノ酸配列を含むタンパク質の名前。
その他、ディスプレイ装置202上には測定条件、データベースの検索条件などを測定者の操作によって随時表示させることができる。
データベース検索には数分〜数時間の時間がかかる場合もあるため、上記のデータベース検索は測定と並行して実行され、検索を待って次の測定を実施することはない。タンデム型MS103では選定ピーク全て(測定者が指定した場合には選定ピークの一部)についてMS測定を実行した後、次のLC流出成分が流出するのを待って再びMSスペクトルの測定を実行する。
以上までの本実施例により、検体AおよびBに含まれるタンパク質のうち特に個体間の発現量が異なるものを特定することができる。また、本実施例によれば1セッションの測定でMS、MS測定、データベース検索まで実施できるためスループットの高いタンパク同定・定量が可能となる。
実施例2
本発明にかかる質量分析システムの実施例について図6を用いて説明する。図6のシステムは上記実施例1のシステムにクラスター型計算機204、データストレージ205およびネットワークサーバ206を接続したものである。
図6のシステムの基本的な動作は図1のシステムと同様であるが、以下の点が異なっている。まず、測定されたMSスペクトルデータをコンピュータ201本体ではなくクラスター型計算機204によって処理する。また、データベースはコンピュータ201の内蔵品ではなくより容量が大きく高速なデータストレージ205に蓄積されたデータベースを使用する。また、ネットワークサーバ206によって外部ネットワーク上のデータベース利用を可能とする。
本実施例のようなシステムを用いることにより、高速なデータベース検索が可能となり、MS測定からアミノ酸配列決定までの時間を大幅に短縮できる。クラスター型計算機204の計算能力が十分な場合、ほぼMSスペクトル測定とほぼ同時(実時間、リアルタイム)に配列の決定が可能となる。
実施例3
実施例1では判定式としてP1/P2<rを用いたが、以下のような判定式を用いてもよい。
(1)P1/P2>r
(2)P1−P2>r2またはP1−P2<r2
(3)P1×P2>r3またはP1×P2<r3
(4)r4>P1/P2>r5
上記(1)はP1>P2となることが明らかな場合に用いる。また(2)はスペクトル強度の差に意味がある場合、例えばP1−P2の値が投薬量に関係している場合などに用いる。また(3)はスペクトル強度の積に意味がある場合に用いる。また、(4)は二つの検体A、Bに含まれるタンパク質が実際に同じタンパク質起源のピークであるかどうか確認する場合に用いる。
以上のような判定式を用いた場合においても実施例1と同様に1回の測定セッションでスループットの高い配列同定・定量が可能である。また、上記判定式の組み合わせを用いても同様の効果を奏する。
実施例4
上記実施例における判定式を複数組み合わせ、あるいは任意の判定式を設定する方法について以下に説明する。本実施例では測定を開始する以前、もしくは測定を開始してMSが実行される以前に図1におけるコンピュータ201、ディスプレイ装置202、キーボード203を用いて判定式の条件を設定する。判定式の設定を指定すると、ディスプレイ装置202には図7に示したような入力画面が表示される。入力画面にはチェックボックス51、判定式52、判定値入力フィールド53、AND/OR設定フィールド54、任意判定式入力フィールド59が用意されている。
以下、本インターフェースを用いて判定式を設定する方法について以下に説明する。測定者は設定したい判定式のチェックボックスにチェックを入れる。また判定値を判定値入力フィールドに入力する。複数の判定式を用いる場合にはAND/OR設定フィールドで判定式が同時に成り立つ条件を設定する場合にはANDを、どちらかが成り立つ条件を設定する場合にはORを選択する。また任意の判定式を使いたい場合には判定式入力フィールドに式を入力する。入力が終了したら決定ボタンを押すことで判定式の設定ができる。判定式の間に矛盾が生じる場合には警告が表示されるので再度判定式を設定する。
以上のように本実施例により複数の判定式を組み合わせたり、自由に判定式を設定することができる。また、これらの判定式を使って上記実施例と同様にスループットの高い同定・定量を実施することができる。
実施例5
上記実施例における検体A、Bがタンパク質、あるいはタンパク質を分解したペプチド、化学修飾されたペプチド、糖類または核酸いずれかであってもよい。検体A、Bが糖類である場合には特定の単糖に特異的に結合する同位体試薬を用いる。また、核酸の場合には特定の塩基もしくは塩基配列に対して特異的に結合する同位体試薬を用いる。
上記実施例と同様に、本実施例により、測定試料が一般的な生体高分子であっても1回の測定セッションでスループットの高い構造同定、定量が可能となる。
実施例6
上記実施例におけるタンパク質、あるいはタンパク質を分解したペプチド、化学修飾されたペプチドに対して、アミノ配列中に含まれるトリプトファンに特異的に結合する同位体試薬を用いてもよい。トリプトファンは生体起源のタンパク質に含まれる頻度が最も低い(存在比1.18%、Swissprot protein knowledge databaseによる)のでスペクトル解析が単純となる利点がある。
図8,図9を用いてこれを説明する。図8は存在量の高いアミノ酸残基に結合する同位体試薬を用いた場合に得られるMSスペクトルの例である。図8で測定したペプチド鎖には複数の同位体試薬が結合したアミノ酸残基を持っている。このため、実施例1のようにペアとなるピークが1つではなく複数現れる。図8においてピーク81、82、83および91、92、93は実施例1における検体Aに由来するもの、ピーク84およびピーク94は検体Bに由来するものである。
図8のスペクトル解析を実施するには実施例1におけるnの値を3としてピークペアを抽出する必要がある。更にピーク群81〜84とピーク群91〜94が重なる場合(図9)にはスペクトル解析が非常に困難になる。十分に反応性の高い試薬を用いれば、ピークは複数ではなく1つになる可能性もあるが、検体Aに由来するピークと検体Bに由来するピークの間のm/zの値が離れるので複数のピーク群が重なる可能性は高くなる。一方、トリプトファンは生体タンパク中の存在比が最も低いアミノ酸残基であるため、1つのペプチド中に複数の同位体化試薬が結合する可能性が低い。
このため、スペクトル解析が単純となり解析スループットが高く、高精度なタンパク同定・定量化が可能となる。同様にシステインも生体タンパク中の存在比がトリプトファンに次いで低い(システインの存在比1.6%、SwissProt Protein Knowledgedatabaseによる)ため上記の効果が期待できる。以上のように本実施例によればスペクトル解析を単純化しスループットおよび精度の高い同定・定量が可能となる。
実施例7
上記実施例で用いた一般的な同位体試薬では炭素もしくは水素の同位体を含む試薬を使うが、酸素の同位体、炭素の同位体、窒素の同位体、リンの同位体あるいはこれらの組み合わせを含む試薬であっても上記実施例と同様の効果を得ることができる。
本発明の第1実施例に係る質量分析システムの構成を示す概略図。 本発明の実施例において実施されるに質量分析方法のフロー図。 本発明の実施例によるMSの質量分析スペクトル図。 本発明の実施例に係る質量分析システムのスペクトルのペアリング手順を示すフロー図。 本発明の実施例に係る質量分析システムにおけるディスプレイ表示の例。 本発明の他の実施例に係る質量分析システムの構成を示す概略図。 本発明の実施例に係わる質量分析システムの判定式選定のためのディスプレイ表示例。 本発明の実施例に係る質量分析スペクトルを示し、スペクトル群が重ならない場合を示す図。 本発明の実施例に係る質量分析スペクトルを示し、スペクトル群が重なる場合を示す図。
符号の説明
101…試料導入系、102…LC、103…タンデム型MS、104…制御装置、201…コンピュータ、202…ディスプレイ装置、203…キーボード、204…クラスター型計算機、205…データストレージ、206…ネットワークサーバ、21〜25…質量分析スペクトル中のピーク、51…チェックボックス、52…判定式、56…判定値入力フィールド、54…AND/OR設定フィールド、59…任意判定式入力フィールド、
81〜84…質量分析スペクトルのピーク、91〜94…質量分析スペクトルのピーク。

Claims (20)

  1. 分子量の異なる同位体試薬によってラベリングされた複数の検体を含む試料を準備するステップ、該試料をクロマトグラフィーにより分離するステップ、分離された該試料を多段解離計測が可能なタンデム型質量分析計により質量分析するステップ、質量分析結果を実時間で解析するステップ、及び少なくとも1つの検体の解析結果を他の検体の質量分析に実時間で利用するステップを含むことを特徴とする質量分析方法。
  2. 上記タンデム型質量分析計で測定した1段階目のスペクトル測定結果を情報処理装置によって実時間で解析し、その解析結果に基づいて実時間で2段階目又はそれ以降の測定で解離させるイオンを選定することを特徴とする請求項1に記載の質量分析方法。
  3. ラベリングする上記同位体試薬は、分子量が異なり化学構造が同一の2つの同位体試薬であり、上記試料は上記同位体試薬によってラベリングされた2つの検体を混合したものであることを特徴とする請求項1に記載の質量分析方法。
  4. 上記2つの同位体試薬の分子量の差をΔmとした時、1段階目の計測で得られたスペクトル中においてn×Δm/z(z:イオンの電荷、n:正の整数)だけ離れたピークのペアを抽出し、抽出したピークのペアのスペクトル強度の相互関係に基づいて、2段階目以降に測定するピークを選択することを特徴とする請求項3に記載の質量分析方法。
  5. 上記ピークのペアの抽出に際し、質量分析計の質量数測定誤差をδとしたとき、注目したピークのm/zの値から±δの範囲にある全てのピークと注目したピークの質量数から−n×Δm/z+δ〜−n×Δm/z−δの範囲に存在するピークとをピークのペアとして扱うことを特徴とする請求項4に記載の質量分析方法。
  6. 上記ピークのペア抽出において測定したスペクトルのうちm/zが最大のピークからペアの抽出を開始し、順次m/zの低いピークのペアを抽出することを特徴とする請求項5に記載の質量分析方法。
  7. 上記ピークのペアにおいて、質量数の高い同位体でラベリングされたピークの強度をP1、質量数の低い同位体でラベリングされたピークの強度をP2とし、rを測定者が設定した値としたとき、判定式P1/P2>rもしくはP1/P2<rを満たすピークのペアのうち片方もしくは両方を2段階目以降の測定で解離させることを特徴とする請求項4に記載の質量分析方法。
  8. 注目した質量数の高い同位体でラベリングされたピークのm/zの値から±δの範囲にあるピークの強度全てを積算したものをP1とし、ピークとペアとなる質量数の低い同位体でラベリングされたピークのm/zの値から±δの範囲に存在するピークの強度全てを積算したものをP2とすることを特徴とする請求項7に記載の質量分析方法。
  9. 上記判定式がP1−P2>r2もしくはP1−P2<r2であり、r2を測定者が設定した値としたとき、判定式を満たすピークのペアのうち片方もしくは両方を2段階目以降の測定で解離させることを特徴とする請求項7に記載の質量分析方法。
  10. 上記判定式がP1×P2>r3もしくはP1×P2<r3であり、r3を測定者が設定した値としたとき、判定式を満たすピークのペアのうち片方もしくは両方を2段階目以降の測定で解離させることを特徴とする請求項7に記載の質量分析方法。
  11. 上記判定式がr4>P1/P2>r5であり、r4およびr5を測定者が設定した値としたとき、判定式を満たすピークのペアのうち片方もしくは両方を2段階目以降の測定で解離させることを特徴とする請求項7に記載の質量分析方法。
  12. 上記判定式を測定者が任意に設定し、この判定式を満たすピークのペアのうち片方一つもしくは両方を2段階目以降の測定で解離させることを特徴とする請求項7に記載の質量分析方法。
  13. 上記検体がタンパク質、タンパク質を分解したペプチド、化学修飾されたペプチド、糖類及び核酸からなる群から選ばれた1種以上であることを特徴とする請求項1に記載の質量分析方法。
  14. 上記タンパク質、タンパク質を分解したペプチド、化学修飾されたペプチド、糖類及び核酸からなる群から選ばれた1種以上を同位体ラベリングする際、該タンパク質及び/又はタンパク質を分解したペプチド及び/又は化学修飾されたペプチドに含まれるシステイン又はトリプトファンに特異的に結合する同位体試薬を用いることを特徴とする請求項1記載の質量分析方法。
  15. 上記同位体試薬が水素の同位体、酸素の同位体、炭素の同位体、窒素の同位体、リンの同位体からなる群から選ばれた少なくとも1つを含むことを特徴とする請求項1に記載の質量分析方法。
  16. 複数のラベリング試薬によってラベルされた複数の検体を含む試料を展開するクロマトグラフィー装置と、該クロマトグラフィー装置に接続され、試料を多段解離計測が可能なタンデム型質量分析計と、該試料を上記タンデム型質量分析計の分析領域に位置させる手段と、上記タンデム型質量分析計の分析結果を実時間で解析する情報処理装置と、上記クロマトグラフィー装置及びタンデム型質量分析計を制御する制御装置と、該制御装置に必要な情報を入力し及び/又は出力する入出力装置とを備えた質量分析システム。
  17. 更に、データベース検索のための情報処理装置およびネットワーク接続装置およびデータストレージのうちいずれかもしくは両者を備えたことを特徴とする請求項16に記載の質量分析システム。
  18. 上記入出力装置は、データベースに記憶されている情報を引き出すことが可能に接続されていることを特徴とする請求項16に記載の質量分析システム。
  19. 上記入出力装置は、少なくともクロマトグラフィー装置の展開時間と選択すべき質量分析データを表示するインターフェースを含むことを特徴とする請求項16に記載の質量分析システム。
  20. 上記情報処理装置はネットワークサーバに接続されていることを特徴とする請求項16記載の質量分析システム。
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