JP2005213221A - 二糖類分解酵素阻害物質の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 ニ糖類分解酵素阻害物質を、エンサイ中から効率よく得る方法およびこの方法により得たニ糖類分解酵素阻害物質を含有する飲食物ないし医薬を提供すること。
【解決手段】 エンサイを２０ないし１００容量％の低級アルコールを含む低級アルコール−水混液で抽出後、この抽出液を芳香族系合成吸着剤に吸着させ、次いで、当該芳香族系合成吸着剤からの２０ないし４０％低級アルコール−水混液による溶出成分を採取することを特徴とする二糖分解酵素阻害物質の製造方法並びに上記方法で得られる溶出成分を更に逆相高速液体クロマトグラフィーに付して精製することを特徴とする二糖分解酵素阻害物質の製造方法。
【選択図】 図１

Description

本発明は、糖類分解酵素阻害物質の製造方法に関し、更に詳細には、糖尿病および肥満などの治療・予防に有用であるニ糖類分解酵素阻害物質を、沖縄特産の野菜であるエンサイから効率よく得る方法に関する。

近年、糖尿病患者や、その予備軍と呼ばれる人が増加している。このような人々に対しては、インスリン需要を軽減し、また合併症に至るリスクを予防するという見地から、食後高血糖を回避するような食事療法の重要性が指摘されている。

一方、ニ糖類分解酵素阻害物質がショ糖や麦芽糖の消化・吸収を阻害することにより血糖値やインスリンの上昇を抑制することが知られており、このような機構を利用した、アルカボースやボグリボース等の、ニ糖類分解酵素阻害活性を示す薬剤が臨床的に使用されている。また、これらニ糖類分解酵素阻害物質は過食や運動不足による肥満の防止にも効果があるとされている。

しかしながら、これら薬剤は強力な阻害作用や副作用等を有するので医師の管理下で使用する必要があり、通常の生活において日常的に摂取することは難しく、通常の食品や栄養補助食品および特定保険用食品等の利用は困難である。

現代日本社会は高齢化社会を迎えており、肥満、糖尿病をはじめとする生活習慣病の増加、医療費の増大などの問題がクローズアップされている。このため、病気を治すことを目的とする薬の開発よりも、病気を予防する機能性食品素材を開発することは今後の日本社会に大きく貢献すると考えられるようになってきた。血糖値が健常者と比較して高い、いわゆる糖尿予備軍は約１３００万人ほど存在すると考えられており、これら糖尿予備軍の健康を維持・補助することは非常に重要である。

本発明者らは、先に、沖縄県の伝統的な食材についてその薬理作用の検討を行った結果、沖縄特産の野菜であるエンサイはニ糖類分解酵素阻害活性を有することを見いだした（特許文献１参照）。

しかし、このエンサイ中のニ糖類分解酵素阻害活性物質を、食品や栄養補助食品の添加成分や、特定保健用食品あるいは医薬として利用するには、これを高濃度とすることが必要であるが、そのような手段については全く知られておらず、利用の隘路となっていた。
特願２００１−２１６１８３

従って本発明は、ニ糖類分解酵素阻害物質を、エンサイ中から効率よく得る方法およびこの方法により得たニ糖類分解酵素阻害物質を含有する飲食物ないし医薬を提供することをその課題とするものである。

本発明者は、エンサイ中から二糖類分解酵素阻害物質を効率的に取得する方法に関し、種々検討を行っていたところ、低級アルコール−水混液による抽出と芳香族系合成吸着剤処理を併用することにより、高濃度の二糖類分解酵素阻害物質を得ることができることを見いだし本発明を完成した。

すなわち本発明は、エンサイを２０ないし１００容量％の低級アルコールを含む低級アルコール−水混液で抽出後、この抽出液を芳香族系合成吸着剤に吸着させ、次いで、当該芳香族系合成吸着剤からの２０ないし４０％低級アルコール−水混液による溶出成分を採取することを特徴とする二糖類分解酵素阻害物質の製造方法を提供するものである。

また本発明は、２０ないし１００容量％の低級アルコールを含む低級アルコール−水混液で抽出後、この抽出液を芳香族系合成吸着剤に吸着させ、次いで、当該芳香族系合成吸着剤からの２０ないし４０％低級アルコール−水混液による溶出成分を採取し、更にこれを逆相高速液体クロマトグラフィーに付して精製することを特徴とする二糖類分解酵素阻害物質の製造方法を提供するものである。

更に本発明は、上記方法により得られた飲食物ないしは医薬を提供するものである。

本発明によれば、エンサイ中に含まれる二糖類分解酵素阻害物質が効率よく得られるので、このものを飲食品あるいは医薬として使用することが可能となる。

本発明において、二糖類分解酵素阻害物質を得るための原料となるエンサイ（Ipomoea aquatica Forsk.）は、ヒルガオ科の植物である。このものは、沖縄県の伝統的食材であり、代表的野菜であるキャベツに比べ、植物繊維が４.６倍、カロチンが２３８倍も含まれていて非常に優れた野菜である。

本発明方法の原料としてエンサイは、その可食部である葉茎部が使用される。このエンサイの葉茎部は、一般的には細断後燥し、更に粉砕して抽出操作に付される。

この乾燥は、５０ないし８０℃、特に５０ないし６０℃の温度により、９ないし４８時間、特に２４から４８時間程度乾熱乾燥として行うことが好ましい。

次に、エンサイの抽出処理は、上記のようにして得られたエンサイ粉末を４０から１００容量％（以下、単に「％」で示す）の、低級アルコール水混液に浸漬することにより行われる。低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール等が使用されるが、安全性や取り扱い性の面からエタノールが好ましい。また、ろ過等の作業性を考慮すると、５０〜６０％のエタノール−水混液を使用することが好ましい。

上記抽出処理は、３０から８０℃程度、特に６０〜８０℃程度の温度で、１５分から９時間程度抽出することが好ましい。

更に、上記のようにして得られた抽出物は、芳香族系合成吸着剤に吸着させられた後、低級アルコール−水混液により溶出される。

抽出液を芳香族系合成吸着剤に吸着させるに先立ち、抽出液の低級アルコールの濃度が高い場合は、この濃度を低下させるために水を加え希釈することが好ましい。例えば、抽出溶媒として、５０％エタノール水溶液を使用した場合は、エタノール濃度が１０％以下となるよう、５倍程度に希釈することが望ましい。また、必要により、混入する固形分を除去するため、適当なろ過手段、例えば珪藻土ろ過などを行うことも好ましい。

上記の樹脂吸着に使用される芳香族系合成吸着剤は、架橋スチレン系の多孔質重合体であり、微細な連続孔が粒子内部まで発達しており、活性炭に匹敵する表面積を有する粒状物である。具体的な芳香族系合成吸着剤の例としては、ダイヤイオンＨＰ２０、同ＨＰ２１、セパビーズＳＰ８２５、同ＳＰ８５０等（いずれも三菱化学社製）が使用される。この芳香族系合成吸着剤に対する希釈後の抽出液の量は、１０から１５倍程度が好ましく、その流速は、２Ｌ／ｈｒないし４Ｌ／ｈｒ程度とすることが好ましい。

上記のようにして、芳香族系合成吸着剤に抽出液を吸着させた後、溶媒を変えながら目的成分である二糖類分解酵素阻害物質を溶出させる。すなわち、まず、水でカラムを洗浄した後、徐々に低級アルコール濃度を高めた低級アルコール−水混液を加えてゆく。

目的物である二糖類分解酵素阻害物質は、エタノール−水混液を用いた場合、エタノールが２０ないし４０％であるエタノール水溶液により溶出画分中に多く含まれるので、この溶液による溶出物を二糖類分解酵素阻害物質画分として採取すればよい。なお、二糖類分解酵素阻害物質は、６０％程度のエタノール水溶液によっても溶出されるが、この中には余分な不純物が含まれることが多いので、その利用はあまり勧められない。

以上のようにして得られる二糖類分解酵素阻害物質や、更にこれを逆相高速液体クロマトグラフィーに付して精製された二糖類分解酵素阻害物質は、そのままで、あるいは常法により乾燥粉末化して飲食品や、食品添加物等として使用することができるが、必要により更にこれを逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）に付して精製することもできる。

精製のための逆相ＨＰＬＣの例としては、オクタデシルシリル基（Ｃ１８、ＯＤＳ）、オクチルシリル基（Ｃ８、Octyl）、フェニル基（Ｐh、Phenyl）等の樹脂を充填したカラムを使用し、メタノール、アセトニトリル等を溶媒とする方法が挙げられる。より具体的には、ＹＭＣ ＯＤＳ−Ａ（２５０×２０ｍｍ ＩＤ Ｓ−５μｍ）のカラムを使い、これに溶媒として２５〜６０％メタノール、１％酢酸 直線グラジエントで流量を１０ｍｌ／ｍｉｎとして流した場合、２３から３１分の位置に現れるピークに強い二糖類分解酵素阻害活性が認められるので、この部分を分取することにより、更に強い二糖類分解酵素阻害を有する物質が得られる。

なお、上記の画分を更に、リクロマトグラフィーを行い各成分の主成分を分析したところ、下記式で表されるイソクロロゲン酸ａ、イソクロロゲン酸ｂおよびイソクロロゲン酸ｃであると同定された。このうち、特にイソクロロゲン酸ｃに特に強い二糖類分解酵素阻害活性があることが認められた。従って、上記イソクロロゲン酸ａ、イソクロロゲン酸ｂおよびイソクロロゲン酸ｃは、糖尿病治療・予防剤等の二糖類分解酵素阻害剤としてあるいは肥満予防等のための抗肥満剤として有用であることがわかった。

以上のようにして得られる本発明のニ糖類分解酵素阻害物質は、定法にしたがって、糖尿病や肥満症の予防、治療のための飲食物、食品添加物として利用することができる。本発明のニ糖類分解酵素阻害物質を食品添加物として使用する場合、その食品の種類は特に限定されないが、その具体例として、アイスクリーム、クッキー、スープ、麺類、清涼飲料、納豆、ホットケーキ、ドレッシング、シリアル、ソース類、スナック類、ふりかけ等が挙げられる。

これらの食品に添加される二糖類分解酵素阻害物質の割合は、食品の種類によって添加最適量が変動し、特に限定されるものではないが、例えば清涼飲料の場合、飲料の総重量当たり、０.１〜５.０質量％、好ましくは０.１−１.０質量％とすることができる。

以下、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制約されるものでない。なお、実施例においてニ糖類分解酵素阻害活性の測定は、以下のとおり行なった。

すなわち、粗酵素液としてラット腸管アセトンパウダーを１０倍量の０.１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６.０）に懸濁し、１５,０００ｒｐｍで４５分間遠心分離した上清を粗酵素液とした。粗酵素液２０μｌにサンプル溶液を１０μｌ添加し、３７℃で５分間保持し、２％マルトース、あるいは２％スクロース溶液２０μｌを添加して、３７℃で３０分間酵素反応を行い、１００℃で１５分間保持して酵素を熱失活させ反応を停止した。９,０００ｒｐｍで５分間遠心した上清中のグルコース濃度をグルコテストＣ−ＩＩ（和光純薬工業）を用いて測定し、阻害活性を次式により算出した。

阻害活性（％） ＝ １００ ×（１− Ａ₁／Ａ₂ ）。
Ａ₁ ； サンプル添加時のグルコース生成量
Ａ₂ ； 対照生成グルコース量

実 施 例 １
（１）エンサイ乾燥条件の検討：
抽出・精製工程の前処理として、エンサイを部位に分け、その乾燥条件を検討した。
乾燥温度を５０℃、６０℃および８０℃に設定し、３時間ごとに重量を測定した。また２４時間乾燥後における粉末の色合いについても検討した。乾燥終了後、高速溶媒抽出機にて抽出溶媒として５０％エタノール水溶液、抽出温度８０℃、抽出時間１０ｍｉｎで２回抽出を行なった。得られた、抽出液を遠心濃縮にて乾燥後、濃度を５０ｍｇ／ｍｌに調整して二糖類分解酵素阻害活性を測定した。

その結果、水分含量は８０℃では９時間、５０℃および６０℃では１５時間で各乾燥温度ともに定常状態に達した。色合いは、８０℃で褐変が見られた。部位では葉抽出物の阻害活性で高い傾向が認められた。阻害活性は、乾燥温度が高くなるほど阻害活性が有意（ｐ＞０.０５）に低下した。この結果より、５０℃での乾燥が最適と判断した。

（２）抽出条件の検討：
（２-ａ）抽出溶媒の検討；
抽出溶媒は０％〜１００％のエタノール水溶液（以下、「ＥｔＯＨ」ということがある）で抽出を行ない、抽出溶媒を検討した。抽出液を乾固後、２５ｍｇ／ｍｌの濃度に調整して二糖類分解酵素阻害活性を測定した。この結果を表１に示す。

チューキーの全群比較にて検定を行なった結果、４０％〜８０％のＥｔＯＨの抽出条件間には有意な差は認められなかった。ただし、４０％抽出液は粘性が高いためにろ過しづらく、作業性を考慮して、５０％ＥｔＯＨでの抽出が適当と判断した。

（２−ｂ）抽出時間および温度の検討：
溶媒として５０％ＥｔＯＨを使用し、３０℃〜８０℃の温度で、３時間ごとにサンプリングを行ない、抽出液の二糖類分解酵素阻害活性を測定し、適切な抽出時間および抽出温度を検討した。この結果を表２に示す。

分散分析の結果、抽出時間による差は認められなかった。抽出温度に関しては、６０℃と８０℃で阻害活性がもっとも高くなり、両者間には有意差が認められなかった。その他の組み合わせはＰ＞０.０５で有意差が認められた。抽出時間３時間おきの実験では差が認められなかった為、再度検討を行なった。溶媒は５０％エタノールを使い、温度６０℃にて１５分ごとにサンプリングを行い、抽出液の二糖類分解酵阻害活性を測定し、最適時間を検討した。その結果を表３に示す。

その結果、抽出時間では、抽出時間が増すほど阻害活性が高くなる傾向は示したが、時間による有意差は認められなかった。

実 施 例 ２
二糖類分解酵素阻害物質画分の取得：
５０℃で乾燥したエンサイを粉砕した後、５０％ＥｔＯＨを溶媒とし、６０℃の温度で３時間抽出を行った。

得られた抽出液を、含まれるエタノールの濃度が１０％以下になるように水で５倍希釈し、芳香族系合成吸着剤ＨＰ２０を充填したオープンカラムに負荷し、０〜８０％のＥｔＯＨにて溶出させ、各溶出画分を採取した（図１のＡ）。各溶出画分についてその一部を遠心濃縮機で乾燥後、回収率を求めた。また、濃度を２５ｍｇ／ｍｌにそろえて二糖類分解酵素阻害活性を測定した。その結果、２０％ＥｔＯＨ溶出画分がもっとも強い阻害活性を示した（表４）。

次に最も活性と回収率の高かった２０％ＥｔＯＨ溶出画分を、逆相系のカラムＹＭＣ
ＯＤＳ−Ａ（２５０×２０ｍｍ ＩＤ Ｓ−５μｍ）（溶出液：ＭｅＯＨ２５％〜６０％、１％酢酸（４０分）、流量：１０ｍｌ／ｍｉｎ：図１のＢ）を用いて、活性成分の分離を行った。そのクロマトグラムを図２に示す。

図２に示すように、５分〜７分の溶出画分をフラクションｉ、２３分〜２６分の溶出画分をフラクションii、２６分〜３１分の溶出画分をフラクションiiiとして回収した。各フラクションを乾固し、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で二糖類分解酵素阻害活性を測定した。その結果、表５に示すようにフラクションii、iiiに強い阻害活性が見られた。

これらのフラクションのうち、iiおよびiiiについてリクロマトグラフィーを行い（下図１のＣ、Ｄ）、化合物１、化合物２、化合物３および化合物４を回収した。

これら各化合物の二糖類分解酵素阻害活性（試料濃度 １ｍｇ／ｍｌ）は、表６の通りである。その結果、化合物１が最も強い阻害活性を示した。

また、原料であるエンサイ乾燥物の重量を１００％としたときの、各工程での回収率および回収物のＩＣ₅₀値を表７に示す。

実 施 例 ４
構造解析:
上記各化合物について、化合物ＵＶ、ＮＭＲ、ＭＳ測定を行い、得られたスペクトルについて文献値との照合などの解析を行なった結果、化合物１がイソクロロゲン酸ｃ、化合物２がイソクロロゲン酸ａ、化合物４がイソクロロゲン酸ｂであることが明らかとなった。これらのイソクロロゲン酸類とクロロゲン酸についてＩＣ₅₀値を比較したところ、イソクロロゲン酸ｃが他の化合物の５倍以上の阻害活性を示すことが明らかとなった（表８）。

本発明方法により得られる二糖類分解酵素阻害物質は、薬剤に比べて効き目が穏やかであり、さらに伝統的食材であるエンサイから抽出したものであるため安全性が高い。

従って、この二糖類分解酵素阻害物質は、健常者に比べて血糖値が高い、いわゆる糖尿予備軍と呼ばれる人向けの食品、食品添加物、栄養補助食品の素材として最適である。

また、糖尿病患者向けの医薬として使用できるほか、一般の人が機能性食品、食品添加物として使用することにより、肥満や糖尿病の治療や予防に極めて有効である。

エンサイの５０％エタノール水溶液による抽出物からの各成分の精製工程を示す図面である。 ＨＰ２０カラムからの２０％エタノール溶出画分の逆相クロマトグラムの結果を示す図面である。 以 上

Claims (14)

1. エンサイを２０ないし１００容量％の低級アルコールを含む低級アルコール−水混液で抽出後、この抽出液を芳香族系合成吸着剤に吸着させ、次いで、当該芳香族系合成吸着剤からの２０ないし４０％低級アルコール−水混液による溶出成分を採取することを特徴とする二糖類分解酵素阻害物質の製造方法。
2. 低級アルコールがエタノールである請求項第１項記載の二糖類分解酵素阻害物質の製造方法。
3. 低級アルコール−水混液での抽出に先立ち、エンサイを細断後５０ないし８０℃で、９ないし４８時間乾熱乾燥させる請求項第１項または第２項記載の二糖類分解酵素阻害物質の製造方法。
4. 芳香族系合成吸着剤への吸着に先立ち、エンサイの低級アルコール−水混液抽出物を水で希釈する請求項第１項ないし第３項記載の何れかの項記載の二糖類分解酵素阻害物質の製造方法。
5. エンサイを２０ないし１００容量％の低級アルコールを含む低級アルコール−水混液で抽出後、この抽出液を芳香族系合成吸着剤に吸着させ、次いで、当該芳香族系合成吸着剤からの２０ないし４０％低級アルコール−水混液による溶出成分を採取し、更にこれを逆相高速液体クロマトグラフィーに付して精製することを特徴とする二糖類分解酵素阻害物質の製造方法。
6. 低級アルコールがエタノールである請求項第５項記載の二糖類分解酵素阻害物質の製造方法。
7. 低級アルコール−水混液での抽出に先立ち、エンサイを細断後５０ないし８０℃で、９ないし４８時間乾熱乾燥させる請求項第５項または第６項記載の二糖類分解酵素阻害物質の製造方法。
8. 芳香族系合成吸着剤への吸着に先立ち、エンサイの低級アルコール−水混液抽出物を水で希釈する請求項第５項ないし第７項記載の何れかの項記載の二糖類分解酵素阻害物質の製造方法。
9. 請求項第１項ないし第８項のいずれかに記載の方法により得られる二糖類分解酵素阻害物質を含有する飲食物。
10. 請求項第１項ないし第８項のいずれかに記載の方法により得られる二糖類分解酵素阻害物質を含有する医薬。
11. 飲食物添加用である請求項１０記載の二糖類分解酵素阻害物質を含有する医薬。
12. 次式
    
    
    

    

    で表されるイソクロロゲン酸ａ、イソクロロゲン酸ｂまたはイソクロロゲン酸ｃを有効成分とする二糖類分解酵素阻害剤。
13. 糖尿病治療・予防剤である請求項第１２項記載の二糖類分解酵素阻害剤。
14. 抗肥満剤である請求項第１２項記載の二糖類分解酵素阻害剤。
    
    

Images