JP2005084048A - sHSPsを含むタンパク質分解防止用組成物およびこれを用いた2次元ゲル電気泳動法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 有効量のsHSPsを含むことを特徴とするタンパク質分解防止用組成物を提供し、また、有効量のsHSPsを含むことを特徴とする2次元ゲル電気泳動用組成物を提供し、さらに、タンパク質の混合物に対する2次元ゲル電気泳動法において、前記タンパク質の混合物に、タンパク質の分解を防止してより多くのスポットを有するゲルを得るためにsHSPsを加えた後、電気泳動を行うことを特徴とする2次元ゲル電気泳動法を提供し、しかも、前記組成物を用いることを特徴とする2次元ゲル電気泳動によるプロテオームの分析方法を提供する。
【選択図】図6
Description
(項目1) 有効量のsHSPsを含むことを特徴とする、タンパク質分解防止用組成物。
大腸菌W3110(ATCC 39936)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)KT2440(ATCC 47054)、およびサッカロマイセス・セレヴィシエの染色体DNAを、Sambrookらの方法により分離精製した(Sambrooket al.Molecular Cloning,2nd ed,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY,1989)。
配列番号2:5’-cccaagcttttaatggtgatgatggtgatggttgatttcgatacggcgcgg-3’
配列番号3:5’-ggaattcatgcgtaacttcgatttatccccactg-3’
配列番号4:5’-cccaagcttttaatggtgatgatggtgatggctatttaacgcgggacgttcgct-3’
配列番号5:5’-ggaattcatgaccatgactactgctttc-3’
配列番号6:5’-cccaagcttttaatggtgatgatggtgatggttcagcgctggttttt-3’
配列番号7:5’-ggaattcatgtcatttaacagtccatttt-3’
配列番号8:5’-cccaagcttttaatggtgatgatggtgatggttaccccacgattcttgaga-3’。
前記実施例1によって製作されたIbpA、IbpB、またはHSP26タンパク質をコードする遺伝子を含む組換えプラスミドである、pTac99IbpAH、pTac99IbpBH、pTac99PPIbpAHまたはpTac99HSP26Hによって形質転換された組換え大腸菌XL1−Blue(Stratagene,USA)を、抗生剤であるアンピシリン(50mg/L)の添加されたLB培地(酵母抽出物5g/L,トリプトファン10g/L,塩化ナトリウム10g/L)で培養した。
目的タンパク質は細胞の溶解溶液(lysis solution)の中でプロテアーゼに攻撃されやすいから損失が多かった。本発明では同量の目的タンパク質のヒト血清アルブミンを溶解溶液に希釈した後2時間常温で多様な濃度のトリプシンと共に反応させた。プロテアーゼの濃度は基質(目的タンパク質)に対して0,1/10、1/20、1/30または1/50で変化させた。sHSPsは大腸菌由来のIbpAおよびIbpB、サッカロマイセス・セレヴィシエ由来のHSP26を使用した(図6)。
既存のIbpAおよび/またはIbpB発現プラスミドである、pACTacIbpA、pACTacIbpBまたはpACTacIbpABと、対照群のプラスミドp184△Cmとを、IbpAB遺伝子の除去された突然変異大腸菌WIB101(PCT/KR03/01371)にそれぞれ導入した後、前記実施例2と同様の方法で細胞培養を行った。IbpAおよび/またはIbpBタンパク質の発現は培養液を分光光度計(波長:600nm)で測定した光学密度(O.D.)が0.7であるとき、1mMのIPTGを添加して誘導した。誘導発現の後、4時間経過してから培養液を1mLずつとり、4℃、6000rpmで5分間遠心分離して沈殿物を得た後、−20℃で保管した。
前記実施例4と同様の方法で大腸菌W3110に対する2次元ゲル電気泳動を行った。まず、精製されたIbpAまたはIbpBタンパク質10μgに対する純度を確認するために、2次元ゲル電気泳動を行った(図9)。
前記実施例4と同様の方法でシュードモナス・プチダKT2440に対する2次元ゲル電気泳動を行った。IbpA効果を確認するために、定量化されたシュードモナス・プチダKT2440タンパク質200μgにIbpAタンパク質10μgを加え、2次元ゲル電気泳動を行った(図12)。対照群として、定量化されたシュードモナス・プチダKT2440タンパク質200μgを用いた。
前記実施例4と同様の方法でヒト由来の血清に対する2次元ゲル電気泳動を行った。IbpAおよびIbpBの効果を確認するために、定量化されたヒト由来の血清タンパク質200μgにIbpAタンパク質およびIbpBタンパク質を各々10μgを添加し、2次元ゲル電気泳動を行った。対照群として、定量化されたヒト由来の血清タンパク質200μgを用いた(図13)。
Claims (17)
- 有効量のsHSPsを含むことを特徴とする、タンパク質分解防止用組成物。
- 前記sHSPsは、表1に記載されたタンパク質から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項1に記載のタンパク質分解防止用組成物。
- 前記sHSPsは、IbpA、IbpB、IbpABおよびHSP26でなる群から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項2に記載のタンパク質分解防止用組成物。
- 有効量のsHSPsを含むことを特徴とする、2次元ゲル電気泳動用組成物。
- 前記sHSPsは、表1に記載されたタンパク質から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項4に記載の2次元ゲル電気泳動用組成物。
- 前記sHSPsは、IbpA、IbpB、IbpABおよびHSP26でなる群から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項5に記載の2次元ゲル電気泳動用組成物。
- タンパク質の混合物に対する2次元ゲル電気泳動法において、前記タンパク質の混合物に、タンパク質の分解を防止してより多くのスポットを有するゲルを得るためにsHSPsを加えた後、電気泳動を行うことを特徴とする、2次元ゲル電気泳動法。
- 前記sHSPsは、表1に記載されたタンパク質から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項7に記載の2次元ゲル電気泳動法。
- 前記sHSPsは、大腸菌由来のIbpA、IbpB及びIbpABとシュードモナス由来のIbpA、およびサッカロマイセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)由来のHSP26でなる群から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項8に記載の2次元ゲル電気泳動法。
- 前記sHSPsの量は、タンパク質の混合物100重量部に対し、0.1ないし50重量部であることを特徴とする、請求項7に記載の2次元ゲル電気泳動法。
- 前記sHSPsの量は、タンパク質の混合物100重量部に対し、0.5ないし20重量部であることを特徴とする、請求項10に記載の2次元ゲル電気泳動法。
- 前記タンパク質の混合物は特定の細胞の全体タンパク質であることを特徴とする、請求項7に記載の2次元ゲル電気泳動法。
- 前記特定の細胞は、原核細胞または真核細胞であることを特徴とする、請求項12に記載の2次元ゲル電気泳動法。
- 前記特定の細胞は、大腸菌またはシュードモナス(Pseudomonas)属の微生物で真核細胞はヒト由来の細胞であることを特徴とする、請求項13に記載の2次元ゲル電気泳動法。
- 2次元ゲル電気泳動によるプロテオームの分析方法において、請求項1〜6のいずれかに記載の組成物を用いることを特徴とする方法。
- プロテアーゼによる目的タンパク質の分解を阻害する阻害剤としてsHSPsを用いる方法。
- 請求項16に記載の方法であって、、前記sHSPsは、表1に記載されたタンパク質から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、方法。
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