JP2005065563A - マンノースの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】受託番号FERM P−19466として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されているアスペルギルス・アクレアータス(Aspergillus aculeatus)β−マンノシダーゼ高生産株、ならびに前記菌株由来のβ−マンノシダーゼをマンノース多糖体に作用させることを特徴とするマンノースの製造方法。
【選択図】なし
Description
(1)アスペルギルス・アクレアータス(Aspergillus aculeatus)(FERM P−19466)、および
(2)上の(1)に記載のアスペルギルス・アクレアータス株由来のβ−マンノシダーゼをマンノース多糖体に作用させることを特徴とするマンノースの製造方法
を提供するものである。
本発明者らは、今回、薬剤耐性およびウリジン要求性をマーカーとして、以下のようにアルペルギルス・アクレアータスの安定な形質転換法を確立した。
このようにして得られたβ−マンノシダーゼ高生産菌株は、平成15年8月5日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM P−19466の下に寄託してある。
かかるβ−マンノシダーゼとしては上記菌株の培養液を使用することができ、また、常法により酵素を精製・単離してもよい。培養は液体培地でも、固体培地でも行なうことができる。培地組成、培養温度、培養時間、pH、撹拌あるいは通気等の条件は当業者が適宜選択して培養を行なうことができる。液体培地としては、例えば、スターチ、グルコース、麦芽エキス、酵母エキス等の天然成分を配合した培地、デキストリン・ペプトン培地、あるいは合成培地などを用いることができる。液体培養の場合は菌体を除去してから培養液を酵素として使用するのが一般的である。固体培地としては、小麦フスマ培地、蒸し米などを用いることができる。固体培養の場合には、菌体が十分に生育してから水あるいは適当な緩衝液にて抽出し、その抽出液を酵素として使用することができる。得られた培養液あるいは抽出液をそのまま用いてもよいが、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等の公知の手法により精製したものを酵素として用いてもよい。
また、培養で得られた菌体を磨砕等に付して、菌体内に生産されるβ−マンノシダーゼを抽出して使用してもよい。
さらに、菌体の培養時にマンノース多糖体を適量添加してβ−マンノシダーゼ酵素を誘導してさらに著量の酵素を得てもよい。
マンノース多糖体である脱脂ヤシ残渣を細かく切って砕き、ソックスレー抽出器を用いてベンゼン−エタノール混液(2 : 1)で24時間抽出し、続いてエタノールで24時間同様に抽出したのち室温で風乾した。この乾燥物10 gに対して水500 ml加えよく撹拌し、水浴で75℃に保った。これに氷酢酸(0.6 ml)と亜塩素酸ナトリウム(7.5 g)をこの順序に加えて撹拌を続けた。1時間毎に両試薬を初回と同量加えることを繰り返し3時間処理すると混液のpHは4.2〜4.7になった。すばやく25℃にまで冷却し、布で濾過し酸がなくなるまで水洗した。次にエタノールで洗い風乾した。
脱リグニンヤシを1%になるよう50 mM酢酸緩衝液(pH 5.0)に懸濁したものを基質とした。基質懸濁液10 mlに酵素液0.1 mlを加え、37℃でゆっくりと振盪し反応させ、一定時間毎にサンプリングし還元糖量および分解産物の経時変化をそれぞれSomogyi-Nelson法とTLC(展開溶媒組成:n-BuOH:EtOH:水=5:5:3)で分析した。
図2に示すように、アスペルギルス・アクレアータスのβ−マンノシダーゼ高生産株の培養6日目の菌体外に分泌する粗酵素液は、37℃で4日間反応させることにより、分解率がほぼ100%となった。一方、親株単独の同じ条件下での分解率は、40%程度であった。また、両粗酵素液による分解産物はTLCで分析すると全てマンノースのみからなっていた。
従って、遺伝子組換えにより育種したアスペルギルス・アクレアータスのβ−マンノシダーゼ高生産株は、共存するマンナナーゼ活性とβ−マンノシダーゼ高活性により、マンノース多糖体から効率よくマンノースを製造できることが分かった。
Claims (2)
- アスペルギルス・アクレアータス(Aspergillus aculeatus)(FERM P−19466)。
- 請求項1記載のアスペルギルス・アクレアータス株由来のβ−マンノシダーゼをマンノース多糖体に作用させることを特徴とするマンノースの製造方法。
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