JP2005058123A - カルボキサミド化合物の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 カルボキサミド化合物の新規な製造方法を提供すること。
【解決手段】 以下の式：
【化１】

（式中、Ｒ^１は、置換基を有していてもよいアリール基または置換基を有していてもよいヘテロアリール基を表す）で表されるカルボキサミド化合物（II）を製造する方法であって、
以下の式：
【化２】

（式中、Ｒ^１は該化合物（II）で定義したものと同じであり、Ｒ^２は水素原子またはメチル基を表す）で表されるアミドカルボン酸化合物（Ｉ）と、該化合物（Ｉ）を該化合物（II）に変換する能力を有する微生物とを接触させる工程を含む方法が提供される。
【選択図】 なし

Description

本発明は、カルボキサミド化合物の製造方法に関する。

Ｃ末端アミド構造を有する化合物（カルボキサミド化合物）は、生体内で重要な役割を有し、そのＣ末端アミド構造は、生理作用発現に不可欠の構造と考えられている。このような構造を有する生体内物質としては、例えば、生理活性ペプチドと呼ばれているペプチドホルモン、例えば、カルシトニン、バソブレッシン、ガストリン、α−メラニン細胞刺激ホルモン等が挙げられる。これらのペプチドホルモンは、脳下垂体に存在する酵素の働きによって合成され、生理作用を発揮すると考えられている。

また、Ｃ末端アミド構造を有する他の生体内物質としては、ニコチンアミドが挙げられる。このニコチンアミドは、生体内で酸化還元反応に関与する補酵素であるニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）あるいはニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）の構成成分として重要な働きをする。

このような、生体内で重要な働きをするＣ末端アミド構造を有するカルボキサミド化合物の製造は、種々試みられているが、生物学的な方法で、カルボキサミド化合物を製造する例は、未だ知られていない。

カルボキサミド化合物の原料物質となり得る化合物としては、例えば、馬尿酸が挙げられ、馬尿酸からＣ末端アミド構造を有するベンズアミドとグリオキシル酸とが生じる可能性がある。この馬尿酸は、哺乳動物尿の常成分であり、微生物によって、安息香酸とグリシンに代謝されることが知られている（非特許文献１）。しかし、微生物を用いて、馬尿酸を始めとするカルボキシル基がグリシンアミド化あるいはアラニンアミド化されている化合物から、カルボキサミド化合物が生成された報告はない。

Ｍｉｙａｇａｗａら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem）、４９巻（１９８５）、２８８１−２８８６

本発明は、生体内で重要な役割を有するカルボキサミド化合物を、微生物を用いて、効率よく製造するための方法を提供することを目的とする。

本発明は、以下の式：

（式中、Ｒ^１は、置換基を有していてもよいアリール基または置換基を有していてもよいヘテロアリール基を表す）で表されるカルボキサミド化合物（II）を製造する方法であって、
以下の式：

（式中、Ｒ^１は該化合物（II）で定義したものと同じであり、Ｒ^２は水素原子またはメチル基を表す）で表されるアミド酢酸誘導体（Ｉ）と、該化合物（Ｉ）を該化合物（II）に変換する能力を有する微生物とを接触させる工程を含む方法を提供する。

好ましい実施態様においては、前記化合物（Ｉ）および（II）のＲ^１がフェニル基またはピリジル基である。

好ましい実施態様においては、前記微生物がストレプトマイセス属に属する微生物である。

別の好ましい実施態様においては、前記微生物がストレプトマイセス Ａ６株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９４２７）である。

また、別の好ましい実施態様においては、前記化合物（Ｉ）が馬尿酸またはベンゾイルアラニンであり、前記化合物（II）がベンズアミドである。

さらに、別の好ましい実施態様においては、前記化合物（Ｉ）がニコチン酸グリシンアミドまたはニコチン酸アラニンアミドであり、前記化合物（II）がニコチンアミドである。

また、本発明は、カルボキサミド化合物を生成し得るストレプトマイセス Ａ６株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９４２７）を提供する。

本発明により、生体内で重要な役割を有するＣ末端アミド構造を有するカルボキサミド化合物が、安価に、かつ効率よく製造される。

本発明者らは、ペプチドホルモン前駆体のＣ末端のカルボキシル基がグリシンアミド化されていることに着目し、カルボキシル基のグリシンアミド化物の代表的化合物である馬尿酸をベンズアミドに変換することができれば、ペプチドホルモンあるいはニコチンアミドなど生体内で有用な化合物を効率よく合成し得ると考え、実際に馬尿酸からベンズアミドを生成し得る微生物を得ることに成功し、本発明を完成させた。

本発明において、目的とするカルボキサミド化合物は、以下の式：

で表される。式中、Ｒ^１は、置換基を有していてもよいアリール基または置換基を有していてもよいヘテロアリール基を示す。

このカルボキサミド化合物（以下、カルボキサミド化合物（II）あるいは化合物（II）という場合がある）は、以下の式：

（式中、Ｒ^１は上記化合物（II）で定義したものと同じであり、Ｒ^２は水素原子またはメチル基を表す）で表されるアミド酢酸誘導体（以下、アミド酢酸誘導体（Ｉ）あるいは化合物（Ｉ）という場合がある。）と、該化合物（Ｉ）を該化合物（II）に変換する能力を有する微生物とを接触させることにより、得られる。

上記化合物（Ｉ）および（II）において、Ｒ^１がアリール基である場合、アリール基は置換されていてもよい。アリール基としては、フェニル基、ナフチル基などが好ましい。

上記化合物（Ｉ）および（II）において、Ｒ^１がヘテロアリール基である場合、ヘテロアリール基は置換されていてもよい。ヘテロアリール基としては、ピリジル基、ピリミジル基、ピラジル基、インドリル基、キノリル基、ピロリル基、フリル基、チアゾリル基、チオフェニル基、イソキノリル基などが好ましい。

アリール基およびヘテロアリール基の置換基としては、アルキル基、アルコキシル基、ハロゲン、水酸基等が挙げられる。アルキル基としては、炭素数１〜５の低級アルキル基が好ましい。アルコキシル基としては、炭素数１〜５の低級アルコキシル基が好ましい。ハロゲンとしては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、およびヨウ素原子が好ましい。置換基の位置、数などは特に制限がない。

出発物質である化合物（Ｉ）としては、Ｒ^１がフェニル基または置換フェニル基の場合、安息香酸のグリシン誘導体および安息香酸のアラニン誘導体などが用いられる。具体的には、例えば、馬尿酸（安息香酸グリシンアミド）、２−メチル安息香酸アラニンアミド、３−メチル安息香酸アラニンアミド、４−メチル安息香酸アラニンアミドなどが用いられる。また、Ｒ^１がピリジル基の場合、出発物質である化合物（Ｉ）としては、ニコチン酸グリシンアミド、ニコチン酸アラニンアミドなどが用いられる。

本発明に用いられる微生物としては、上記化合物（Ｉ）を化合物（II）に変換する能力を有する微生物であれば、制限なく使用できる。このような微生物としては、ストレプトマイセス属に属する微生物が挙げられる。中でも、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、ストレプトマイセス Ａ６株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９４２７）として寄託されている微生物が好ましく用いられる。このストレプトマイセス Ａ６株は、広島県福山市の土壌から選択された微生物である。

上記化合物（Ｉ）を化合物（II）に変換する能力を有する微生物（以下、本発明の微生物ということがある）は、例えば、以下のような方法で選択することができる。土壌サンプルを滅菌水に懸濁し、その一部を、馬尿酸を唯一の炭素源として含有し、無機アンモニウム塩（例えば、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなど）を窒素源とし、必要に応じて、燐酸、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、鉄などの無機化合物を含む培地に植菌し、２０〜３７℃で培養する。生育が見られた培養液を採取し、培養液中に、ベンズアミドが生成しているか否かを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析により確認する。ベンズアミドが生成している培養液から、当業者が通常行う方法により微生物のコロニーを得、個々のコロニーについて、ベンズアミドの生成をＨＰＬＣにより確認することにより、目的とする能力を有する微生物が選択される。

なお、本発明の微生物というときには、化合物（Ｉ）を化合物（II）に変換する能力を有する微生物の他、この能力を有する培養液、あるいはこの微生物に破砕、磨砕などの処理を行って得られる細胞抽出液、あるいはこれらの粗精製物、あるいは精製物（酵素）を含むことがある。

本発明の微生物の培養条件には特に制限が無い。培地成分としては、例えば、麦芽エキス、酵母エキス、肉汁エキス、ペプトン、グルコース、フルクトース、ショ糖等、通常微生物の培養に使用される材料を、微生物に応じて適宜組み合わせて用いることができる。培地には、必要に応じて無機化合物（例えば、上記燐酸第一カリウム、燐酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、硫酸鉄、硝酸ナトリウムなど）を添加し、培地のｐＨをその微生物の最適ｐＨに調整し、その微生物に適した温度（一般には、２５〜３７℃、高温菌の場合はそれ以上の温度）で培養する。例えば、ストレプトマイセスの場合、一般に、ｐＨ６〜７．５、温度２５〜３５℃で、好気条件下、培養（振盪培養、あるいは通気攪拌培養）を行う。

化合物（Ｉ）と本発明の微生物とを接触させて、目的の化合物（II）を得るための反応に条件に特に制限はない。基質である化合物（Ｉ）を炭素源として培地に添加して、本発明の微生物とともに培養し、化合物（II）を得てもよい。あるいは、まず、本発明の微生物を通常用いる培地で培養し、ついで、得られた微生物（細胞抽出物、粗精製物、精製物などを含む）と化合物（Ｉ）とを接触させて、化合物(II)を得てもよい。

反応終了後、培養液（反応液）から、反応生成物である化合物（II）を回収する。化合物（II）の回収には、当業者が通常行う方法が適用される。例えば、培養液（反応液）から、濾過、遠心分離などの処理により菌体を除き、濾液または上清液を得る。濾液または上清液のｐＨを調整するなど、化合物（II）の性質に応じた採取条件を整えた後、溶媒抽出、カラムクロマトグラフィーなどにより、化合物（II）が回収される。化合物（II）の精製工程に用いられる溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、酢酸エチル、ジクロロメタン、ジクロロエタン等が挙げられる。

以下、実施例を挙げて、本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこの実施例により制限を受けるものではない。

（実施例１：微生物のスクリーニング）
以下の組成を有する培地を調製した。

この培地５ｍｌに土壌サンプルを一白金耳入れ、３０℃で４８〜９６時間振盪培養し、培養液１００μｌをエッペンドルフチューブに移し、水で１０倍希釈した後、４℃で５分間、遠心分離（１２０００×ｇ）した。上清２００μｌを取り、日立高速液体クロマトグラフィーＬ７３００において、ＣＯＳＭＯＳＩＬ−ＰＡＫＥＤ ＣＯＬＵＭＮ：１５Ｃ_１８−ＭＳ−II；４．６×１５０ｍｍ（ナカライテスク社製）を使用し、２５ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）−メタノール（８５：１５（ｖ／ｖ））を溶離液として、１．０ｍｌ／分の流速で溶出させた。馬尿酸およびベンズアミドを吸収波長２５４ｎｍで検出した。標準ベンズアミドと同じ保持時間を示す代謝物の生成が認められたＡ６株並びにＡ２４株を得た。

（実施例２）
得られた微生物のうち、Ａ６株およびＡ２４株の同定を行った。安息香酸、ベンズアミド、ベンゾニトリル、ピロカテコール、ベンゾイルアラニンおよびグリシンをそれぞれ炭素源とする寒天培地を作成し、この寒天培地上で、Ａ６株およびＡ２４株を、３０℃、７日間培養した。安息香酸およびピロカテコールではほとんど生育せず、ベンゾニトリルで生育した。ベンズアミドは、ベンゾニトリルよりもよく生育し、ベンゾイルアラニンおよびグリシンは、最もよく生育した。また、Ａ６株およびＡ２４株は、いずれも気菌糸に螺旋状の長い胞子鎖を形成した。また、これらの株の細胞壁には、ＬＬ型ジアミノピメリン酸が含有されていた。以上の結果から、Ａ６株およびＡ２４株は、共にストレプトマイセス属に属する微生物と判定した。このうちＡ６株を独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、ストレプトマイセス Ａ６株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９４２７）として寄託した。

（実施例３：馬尿酸からのベンズアミドの製造）
以下の培地を準備した。

この培地４０ｍｌにストレプトマイセス Ａ６株を接種し、３０℃で４８時間前培養した。培養後、遠心分離して微生物を集め、滅菌水で洗浄した後、表１の培地に酵母エキス０．３W/V％を加えた培地５００ｍｌに植菌し、３０℃で１２０時間培養した。培養液を４℃で１０分間、遠心分離（６５００×ｇ）して、上清を回収した。得られた上清に３Ｎ ＨＣｌを加え、ｐＨを３付近に調整した。この上清をダイヤイオンカラムにロードして代謝物を吸着させ、等量の水で洗浄した後、１０００ｍｌのメタノールで溶出した。メタノール溶出画分を濃縮し、ジクロロメタンで抽出し、さらに濃縮した。得られた濃縮物をヘキサンで予め平衡化したシリカゲルカラムにロードして、シリカゲルに代謝物を吸着させた。シリカゲルをヘキサンで洗浄後、酢酸エチルで溶出し、ヘキサンを含まない溶出画分を回収し、得られた酢酸エチル画分を濃縮し、代謝物を回収した。得られた代謝物について、構造の確認を行った。

図１ａに標品のＨＰＬＣ溶出プロファイルを示す。図中、１は原料の馬尿酸、２は安息香酸、３はベンズアミドである。図１ｂに示す代謝物の溶出プロファイルからわかるように、ベンズアルデヒドと同じ保持時間にピークが見られ、ストレプトマイセス・Ａ６株とともに培養した馬尿酸から、ベンズアミドが生産されていた。

次いで、代謝物をシリカゲル薄層クロマトグラフィー（展開溶媒として、酢酸エチル：ヘキサン＝２：１を使用）に付し、波長２５４ｎｍに吸収が認められるスポットを観察し、Ｒｆを測定した。図２に示すように、代謝物のＲｆ値は０．４５であった。このＲｆ値は、標品として用いたベンズアミドのＲｆ値と一致した。

さらに、代謝物の赤外線吸収スペクトル（ＳＩＭＡＺＵ ＦＴＩＲ８１００Ｍ）を測定した。結果を図３に示す。代謝物のスペクトルは、標品ベンズアミドのスペクトルと一致していた。

（実施例４：ニコチニルグリシンからのニコチンアミドの製造）
ニコチニルグリシンを含む以下の組成の培地を調製した。

この培地４０ｍｌにストレプトマイセス Ａ６株を接種し、３０℃、４８時間前培養した。得られた培養液を、全量同じ培地５００ｍｌに加え、３０℃で９６時間培養した。吸引濾過によって、菌体を分離し、培養上清を回収した。この上清のｐＨを、５Ｎ ＮａＯＨを用いて７．０に調整した。この上清をダイヤイオンカラムにロードして代謝物を吸着させた。上清と等量の蒸留水、上清と等量の５０％メタノール、上清の２倍量のメタノールで順次、洗浄した。素通り画分および蒸留水画分を合わせ、濃縮した。濃縮物に酢酸エチルを加え、得られた酢酸エチル層を濃縮し、ジクロロメタンで抽出した。ジクロロメタン抽出液を濃縮後、５％炭酸ソーダ水溶液に加え、再度ジクロロメタン層を得、濃縮し、代謝物を得た。

得られた代謝物について、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを測定（ＢＲＵＫＥＲ ＡＭ−４００）し、ニコチンアミドであることを確認した（図４参照）。

（実施例５〜７：メチル馬尿酸からのメチルベンズアミドの製造）
実施例２において、馬尿酸の代わりに、２−メチル馬尿酸、３−メチル馬尿酸、および４−メチル馬尿酸をそれぞれ用いたこと以外は実施例３と同様に処理し、代謝物を得た。得られた代謝物を実施例３と同様に処理した。得られた各代謝物のＮＭＲスペクトルを図５〜７に示す。それぞれ、２−メチルベンズアミド、３−メチルベンズアミド、および４−メチルベンズアミドであることがわかった。

（実施例８：ベンゾイルアラニンからのベンズアミドの製造）
実施例３において馬尿酸の代わりにベンゾイルアラニンを用いたこと以外は実施例３と同様に処理した。得られた代謝物のＨＰＬＣ溶出プロファイル（図８）から、代謝物がベンズアミドであることがわかった。なお、ＨＰＬＣの条件は、実施例１と同じである。

本発明により、生体内で重要な役割を果たすカルボキサミド化合物を、安価かつ効率的に製造できる。

図１ａは標品のＨＰＬＣの溶出プロファイル、図１ｂは馬尿酸代謝物のＨＰＬＣ溶出プロファイルである。 馬尿酸代謝物のシリカゲル薄層クロマトグラフの写真である。 ベンズアミドおよび馬尿酸代謝物の赤外線吸収スペクトルである。 ニコチニルグリシン代謝物のＮＭＲスペクトルである。 ２−メチル馬尿酸代謝物のＮＭＲスペクトルである。 ３−メチル馬尿酸代謝物のＮＭＲスペクトルである。 ４−メチル馬尿酸代謝物のＮＭＲスペクトルである。 ベンゾイルアラニン代謝物のＨＰＬＣプロファイルである。

Claims (7)

1. 以下の式：
   

   

   （式中、Ｒ^１は、置換基を有していてもよいアリール基または置換基を有していてもよいヘテロアリール基を表す）で表されるカルボキサミド化合物（II）を製造する方法であって、
   以下の式：
   

   

   （式中、Ｒ^１は該化合物（II）で定義したものと同じであり、Ｒ^２は水素原子またはメチル基を表す）で表されるアミド酢酸誘導体（Ｉ）と、該化合物（Ｉ）を該化合物（II）に変換する能力を有する微生物とを接触させる工程を含む、方法。
2. 前記化合物（Ｉ）および（II）のＲ^１がフェニル基またはピリジル基である、請求項１に記載の方法。
3. 前記微生物が、ストレプトマイセス属に属する微生物である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記微生物が、ストレプトマイセス Ａ６株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９４２７）である、請求項１から３のいずれかの項に記載の方法。
5. 前記化合物（Ｉ）が馬尿酸またはベンゾイルアラニンであり、前記化合物（II）がベンズアミドである、請求項１から４のいずれかの項に記載の方法。
6. 前記化合物（Ｉ）がニコチン酸グリシンアミドまたはニコチン酸アラニンアミドであり、前記化合物（II）がニコチンアミドである、請求項１から４のいずれかの項に記載の方法。
7. ストレプトマイセス Ａ６株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９４２７）。

Images