JP2004537995A - バイオリアクタ - Google Patents

Abstract

細胞の培養のためのバイオリアクタであって、培養容器、少なくとも１つの気体供給および／または液体供給源、加えて、気体および／または液体のための供給装置からなり、該供給装置によって気体および／または液体が培養容器へと加えられる機能が付与される。供給装置と気体供給または液体供給の間に、気体供給または液体供給からの気体および／または液体を混合するために、混合装置、特にはベンチュリ・ノズルが設けられている。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、投与しようとする成分を所定のやり方で搬送用媒体へと供給することにより、気体／気体、気体／液体、または液体／液体の混合物を計量下で生成することができ、したがって、ある成分やある混合物を、生物学的または（生）化学的反応のための培養容器に、正確な計量で投与することのできる方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、生物学的あるいは（生）化学的反応のための培養容器は、それらが１，０００ｍｌよりも大きい規模の培養システムでない限り、通常、曝気されることはなく、適当な投与装置を備えることもない。これは、現状の技術によるこれらのための管理システムが、技術的手間および経済的費用が極めて大であり、培養容器の小型化の進展と共に技術的に困難になるためである。実践から知られている本発明の先行技術を、定量的な投与のための様々なモジュールについて、ここに説明する。
【０００３】
気体の投与：
定量的な気体の投与は、機械的流量計により、一定の入り口圧力のもとでニードル弁を所望の気体流へと調節することにより行われる。さらに、レギュレータ・ユニットおよび電気的に調整されるオリフィスによって気体流を自動的に調節する電気式の質量流量制御装置がある。このようにして調節された気体の流れは、おそらく毎時１ｍｌ〜毎時１ｍ^３（ｍｌ ｇａｓ／ｈ〜ｍ^３ ｇａｓ／ｈ）程度のオーダである。生物学的あるいは（生）化学的培養容器への供給は、それぞれの用途にあわせ、特有の気体投与部によって行われる。培養容器へと向けられた出口開口には、小粒タイプのエジェクタを設けることができる（ブラウン・バイオテック・インターナショナル社（Ｂｒａｕｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＧｍｂＨ）の一連のバイオリアクタ、バイオスター（ＢＩＯＳＴＡＲ） Ａ，Ｂ，ＭＤ，Ｑ，Ｄ，Ｕ）。これらの場合のいずれも、気体の流れを、液体あるいは他の気体のための搬送媒体として用いてはいない。さらに、反応液との混合を強化して通気の効果を上げるために、出口開口にベンチュリ・ノズルを用いることもしていない。
【０００４】
液体の投与：
ａ）ポンプ
標準的には、液体を計量しつつ投与するために、あらゆる設計のポンプが使用できる。ポンプは、一緒に用いられるレギュレータの設定に応じた取り分を貯留容器から取り出し、供給管を通して反応容器へと送り込む。ここでは、液体輸送のための力は、ポンプの能力である。生物学的あるいは（生）化学的培養容器には、酸、アルカリ液、消泡剤、および１つまたは２つの基質溶液のための投与ポンプが通常であり、これらのポンプが、単純に液体を反応液へと送り込む（ブラウン・バイオテック・インターナショナル社の一連のバイオリアクタ、バイオスター Ａ，Ｂ，ＭＤ，Ｑ，Ｄ，Ｕ）。これらの場合のいずれにおいても、液体が気体の流れに触れてエアロゾルとなることはなく、すなわち均一な混合および気体のより効果的な利用はない。
【０００５】
ｂ）圧力による供給
大型の培養容器（おおむね５０リットルよりも大）においては、培養容器に対して陽圧を有しており、クロック・バルブが組み込まれた供給管で培養容器へと接続されている液体供給容器が使用される。今まさに液体の投与を行う場合、レギュレータがクロック・バルブを或る時間開放し、陽圧によって液体が培養容器に押し込まれる。開放時間、供給管の断面積、陽圧、および液体の粘度といったパラメータにより、投与を量的に較正できる（ブラウン・バイオテック・インターナショナル社の一連のバイオリアクタ、顧客対応の生産システム）。生物学的または（生）化学的培養容器には、酸、アルカリ液、消泡剤、および１つまたは２つの基質溶液のための供給容器が通常であり、これら供給容器が、単純に液体を反応液中へと「押し込む」。これらの場合のいずれにおいても、液体が気体の流れに触れてエアロゾルとなることはなく、すなわち気体をより効果的に利用する均一な混合はない。
【０００６】
ｃ）ベンチュリ・ノズルを備えた混合設備
ベンチュリ・ノズルそれ自体は、バイオリアクタとは別の分野で公知である。ベンチュリ・ノズルは、その流れの特徴ゆえ、側面の入り口に負圧を作り出し、その結果、流れている媒体１（気体または液体）に向かって別の媒体２（気体または液体）を吸い込むことができる。ノズルの出口部分において、２つの媒体の均一な混合が生じる。ノズルの断面、両媒体の粘度、およびノズルの入り口圧力がわかっていれば、計量された混合物が得られる。媒体１は、陽圧であるがゆえ、ノズルの後方において搬送用媒体として機能しつづけることができる。ベンチュリ・ノズルは、曝気用として（ウォータ・ジェット・ポンプ）、流量計において（差圧）、あるいは、例えば濃縮物の第２の媒体での希釈など種々の媒体の混合用として、様々な用途に用いられる。微小規模においては、ベンチュリ・ノズルを、媒体を計量しつつ取り出す目的に使用できる（米国、０７８０１、ニュージャージ州、ドーヴァ、ハミットン・ビジネス・パークのフォクス・バルブ・デベロップメント社（Ｆｏｘ Ｖａｌｖｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｐ．）、Ｉｎｔｅｍｅｔｆｏｘｖａｌｖｅ．ｃｏｍ）。日常用途において投与および混合のためにベンチュリ・ノズルを用いた応用例は数多く知られており（例えばジャグジー）、可動の消耗部品を全く有しておらず理想的な投与装置であるが、このようなノズルを、搬送用媒体によって気体または液体を投与するため、生物学的および（生）化学的培養容器の分野へ適用することについては、今までに開示されていない。さらに、生物学的および（生）化学的培養容器のための本発明による投与システムは、搬送用媒体を投与しようとするいくつかの媒体（気体または液体）と組み合わせることができ、計量下での投与が可能で、さらに、反応液とのよりよい混合または投与された液体のより効果的な利用を確保するために、可能であれば出口に微粒化ノズルや混合用ノズルを備えることができるが、そのような投与システムは全く開示されていない。
【０００７】
要約すると、生物学的および（生）化学的培養容器に関して、培養容器のための従来技術には次の欠点がある。
・容積１，０００ｍｌを下回るような培養容器の小型化に適していない。
・並行システムにとって高価であり、干渉を受けやすく、経済的でなく、用途が限られている。
・コストが高い。
【０００８】
生物学的および（生）化学的反応のための培養容器への液体、気体およびこれらの混合物の投与は、莫大な経済的および物理的努力を必要とし、並行して動作する多数の培養容器にとって理にかなったものとはいえない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の目的は、効率的であり、経済的であって、小型化に適している流体投与方法およびそのための装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記の目的は、同時に培養容器の曝気にも使用することができる搬送用媒体を生成するための方法および装置によって達成される。
【００１１】
搬送用媒体に、投与しようとする流体を、定量的かつ所定のとおりに混合することができる。このようにして、ポンプその他の複雑な機械的部品を用いることなく、培養容器の反応液および容器内雰囲気に所定の条件を確立でき、同時に、投与された流体の特性を最適なやり方で利用できる。
【００１２】
本発明は、いくつかの培養容器を並行して運転する場合に特に適している。本発明は、培養容器内で生物学的および生化学的反応が行われるあらゆる分野で使用でき、特にバイオテクノロジ、食品技術および環境保護の分野で使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の方法に関し、前記の目的は、投与される１つあるいは複数の流体が、１つあるいはいくつかの搬送および輸送用流体（搬送用流体）に、規定の濃度で混合され、この搬送用流体あるいはこれらの搬送用流体が、それぞれ規定量および／または規定の単位時間、培養容器の反応媒体または上部空間へと供給されることにより実現される。
【００１４】
本発明の装置に関し、前記の目的は、以下の実施例および特許請求の範囲に記載するように、投与される１つあるいはいくつかの流体を、１つあるいはいくつかの搬送用流体に混合し、１つあるいはいくつかの培養容器へと供給する装置によって実現される。
【００１５】
以下に一例として、液体体積が５００ｍｌである１，０００ｍｌの培養容器について、本発明の各モジュールおよび特性を説明する。なお、数（詳しくは関連する記載を参照）は容積１ｍｌ〜５０ｍ^３の培養容器にあわせて調節することができ、ノズルの断面積および投与部もそれぞれ調節できることを、特に強調しておく。
【００１６】
ａ）気体が装置の輸送用媒体である場合
本発明の装置の気体供給モジュールは、下記の主要な構成要素からなる（図１）。
・加圧気体導入口
・三方弁ＤＶ１、または導入弁と排出弁
・気体容器Ｂ１
・ガス・フィルタＦ１
・圧力補償ダクトＤＧ１
【００１７】
培養容器に比べ０．１〜１０ｂａｒ、好ましくは０．２〜１ｂａｒ、特に好ましくは０．５ｂａｒの陽圧が入力されている加圧気体導入口が、内径が０．５〜８ｍｍ、好ましくは０．５〜２ｍｍ、特に好ましくは１ｍｍの耐圧ホースで、三方弁ＤＶ１へと接続されている（図１参照）。三方弁ＤＶ１は、培養容器の液体体積の１〜４０％、好ましくは１〜１０％、特に好ましくは５％の容器容積を有する気体容器Ｂ１が、加圧された空気やその他の気体で満たされるように配置されている。内蔵されているピストンにより、気体容器の注入体積を、容器容積の０％から１００％まで変化させることができる。気体容器への圧力補給が終わった後、弁ＤＶ１は、もう一方の位置、すなわち気体容器−培養容器へと切り替えられる。補給された圧力によって培養容器へと向かう気体流が作り出され、任意設置のガス・フィルタの後方へと導かれ、後述のモジュールを通って、最終的に培養容器の上方空間または反応液中へと流出する。三方弁ＤＶ１の後方で分岐している圧力補償細管が、気体供給モジュールと液体供給モジュールの圧力を同じにする。気体供給モジュールの出口に、運搬用媒体の濾過のためのフィルタを設けてもよい。本発明によるこの装置は、培養容器に、設定され、従って定量可能である「気体部分」を、簡単なやり方で断続的に供給する。容器の容積が小さくなり、弁のクロック速度が速くなるにつれ、この断続的な気体流は連続的な気体流により近くなる。以下の表は、容器の容積が反応液の液体体積の５％（容器容積が２５ｍｌ、反応液体積が５００ｍｌの例）であり、曝気速度ＶＦは、１時間当たりの気体体積（ｖｏｌｕｍｅ／ｈ）を反応液の体積で割った商である。
【００１８】
【表１】

【００１９】
好気性の生物学的および（生）化学的反応において、ＶＦ値は通常５〜６０（ｌ／ｈ）の間である。これは、本発明によるこのモジュールにより、ほぼ「連続的」な気体流で容易に実現でき、複雑な機械的または電気的な流量測定および制御が不要である。ガス交換は、気泡と液体との境界面で拡散によって生じるため、気体を最適に利用しつつ微生物の培養に最適かつ連続的な気体供給を行うためには、いわゆる「気体の持続（ｇａｓ ｈｏｌｄ−ｕｐ）」、すなわち反応液中の気泡の持続時間が重要である。「気体の持続」が弁ＤＶ１のクロック速度と等しいとき、気体の最適な利用と最適な曝気速度が、同時に実現される。液体から気泡が消えたときに、常に気体が投与される。通過する気体の量は、可変である気体容器の容積を変化させることにより、変えることができる。さらに、本発明によるモジュールの構造によれば、培養液への最適な供給に必要である量のみの気体が常に投与されるため、発泡の傾向を抑制できる。
【００２０】
ｂ）液体が輸送用媒体である場合
気体供給モジュールの代わりに、液体を輸送用媒体として使用することもできる。この場合、気体供給モジュールは、制御つきの液体ポンプで置き換えられ、該液体ポンプが、吸入管で培養容器の反応液に接続され、反応液を循環させる、あるいは液体ポンプ用の貯留容器から液体を吸い上げる（図２）。駆動ポンプ・モジュールは、以下の主要な構成要素からなる。
・液体ポンプ
・吸入管
・培養容器へと向かう圧力管
・フィルタ（任意）
【００２１】
液体を輸送用媒体として用いると、例えば細胞培養培地へのＣＯ_２の投与や最小限の量の物質の投与など、気体による培養液の気泡を避けつつ高濃度にすると効率的である場合に、特に有用である、例えば、触媒の投与や生物活性成分の投与がここに挙げられる。活性成分は、多くの場合、きわめて高価であり、濃縮された状態でのみ長期にわたって安定である。本発明によれば、これらを液体モジュール（後述）により、最も少ない量かつ任意の組み合わせで投与できる。
【００２２】
ｃ）液体供給モジュール
液体供給モジュールは、以下の主要な構成要素からなる（図１）。
・液体貯留容器
・圧力補償細管から分岐した圧力補償管
・クロック・バルブおよびベンチュリ・ノズルへの供給管
・クロック・バルブ
・ベンチュリ・ノズル
【００２３】
液体供給源は、培養容器内の反応液へと投与される液体で満たされているが、供給源に少なくとも２％の気体容積が、圧力補償のために残されている必要がある。輸送用媒体が液体である場合、気体による残り空間および細管による圧力補償は必要がない（図２）。その代わり、負圧を防止するため、供給源は外部の大気圧力で通気される。液体供給源は、装置に対してあらゆる位置に、吊り下げ、立てて、横にして取り付けでき、圧力補償管の端部は、液体供給源に存在する気体容積内になければならない。液体供給源の容積は、反応液の液体体積に比べ０．５〜５０％、好ましくは５％である。液体供給源は、管でクロック・バルブＶ１へと接続され、クロック・バルブＶ１はベンチュリ・ノズルＶＤ１へと接続される。気体供給モジュールまたは駆動ポンプにより、ベンチュリ・ノズルを通る輸送用媒体の流れが供給されると、ベンチュリ・ノズルの側方導入口に、他の圧力補償された系に比べ、負圧が作り出される。同時にクロック・バルブＶ１を開放することにより、液体が液体供給源からノズル内のガス流に向かって吸い込まれる。液体が吸い込まれる量は、次のパラメータに関係する。
【００２４】
表２
・ノズル寸法
・圧力およびノズルを通過する気体流
・供給管およびクロック・バルブの断面積
・液体の粘度
・温度
【００２５】
したがって、液体が吸い込まれる量を定量的かつ再現性よく較正できる。このため、表２の変化することのないパラメータのもとで、バルブＶ１のサイクル時間のみを変化させることにより、液体を取り分けて輸送用媒体に定量的に投与することができる。ノズルの出口において、吸い込まれた液体と輸送用媒体は均一に混合されている。気体供給モジュールまたは駆動モジュール（図１および２）と培養容器モジュールの間に、いくつかの液体供給モジュール、好ましくは４つのモジュールを配置することができる。配置は、並列（好ましい）でもよく直列でもよい。このようにして、いかなる液体も投与しない場合から、数種の異なる液体を同時に投与する場合まで、輸送用媒体にこれら液体を定量的に投与することが可能であり、これら液体を任意の量で組み合わせ、培養容器への入り口までに均一に混合することができる。生物学的培養において、酸およびアルカリによるｐＨ値の滴定、および気泡低減手段の添加の他、特にいわゆる「流加」法がよく行われる。ここでは、例えば炭素や窒素源など、１つあるいはいくつかの基質が培養液に制御されたやり方で投与される。本発明の装置によれば、きわめて簡単な方法で、投与する液体の組成を変化させることができる。例えば、サイクル時間を変えるだけで、時間または各培養に特有の制御パラメータに応じて、基質に時間的変化を与えることができ、あるいはさらなる液体モジュールから、成長因子、ミネラル、ビタミンなど、追加の栄養素を混ぜることができる。
【００２６】
ｄ）気体投与供給モジュール
気体投与供給モジュール（図３および４）は、以下の主要な構成要素からなる。
・注入容積がピストンによって調節可能な気体容器Ｂ２
・気体導入口
・三方弁
【００２７】
三方弁は、気体導入口と気体容器Ｂ２の間に取り付けられる。容器は気体で満たされ、注入容積は内蔵されたピストンによって変化できるが、その容積は定量的に知ることができる。気体の投与を行なおうとするとき、三方弁がベンチュリ・ノズルへと規定のサイクル時間切り換えられるが、このとき、ベンチュリ・ノズルに輸送用媒体によって作り出された負圧が存在することを思い出していただきたい。気体導入口の導入圧力、気体容器の注入容積および三方弁のサイクル時間が既知であり、したがって、定量的な気体の投与が実現できる。気体供給モジュールまたは駆動モジュール（図１および２）と培養容器モジュールとの間に、いくつかの気体投与モジュール、好ましくは２つのモジュールを配置することができる。配置は、並列（好ましい）でもよく直列でもよい。このようにして、いかなる気体も投与しない場合から、数種の異なる気体を同時に投与する場合まで、輸送用媒体にこれら気体を定量的に投与することが可能であり、これら気体を任意の量で組み合わせ、培養容器への入り口までに均一に混合することができる。気体モジュールを液体モジュールの代わりに、あるいは液体モジュールと任意に組み合わせて用いることができる。生物学的細胞培養において、ｐＨ値の調整のためにしばしばＣＯ_２が用いられるが、このモジュールによれば、反応液中に気泡を避けつつ容易かつ定量的に投与することができる。さらに、気体の投与によって、培養容器内に人工の雰囲気を作り出し、かつ制御することができ、生物学的培養に都合がよい。例えば、（基質として）より高いＣＯ_２濃度を好む植物細胞の培養や、窒素または硫黄雰囲気での嫌気生物の育成が挙げられる。
【００２８】
ｅ）培養容器モジュール
培養容器モジュールは、以下の主要な構成要素からなる。
・注入された反応液、反応液上方の気体空間（上部空間）およびカバーを有する培養容器ＫＧ１
・輸送用媒体の供給管
・培養容器の上部空間への供給管を有する入り口弁ＥＶ１
・反応液への供給管を有する入り口弁ＥＶ２
・反応液中の通気ノズルＢＤ１
・培養容器上部空間のエジェクタ・ノズルＡＤ１
【００２９】
培養容器のカバーに設けた入り口弁によって、輸送用媒体を培養容器の空気空間（上部空間）に投与するのか、反応液中に投与するのかを選択できる。上部空間への入り口弁ＥＶ１は、空気空間に取り付けられた微粒化ノズルＡＤ１へと続いており、輸送用媒体を再び微粒化する。微粒化された輸送用媒体および投与物一式は、反応液の液面へと均一に降りていく。この微細な分配により、輸送用媒体および投与物と反応液との速やかな混合が引き起こされ、投与された液体のより効率的な使用につながる。このようなやり方で投与すると、消泡剤の効率は１０倍も向上し、これに対応して消泡剤の消費を少なくできる。さらに、気泡軽減のための液体の投与なしで、気体流のみを使用することもできる。気泡は単純に、ガス流によって「吹き降ろされ」る。これによる効果は大抵、気泡軽減にすでに充分であり、前述のように引き続いて消泡剤を投与する必要がない。消泡剤は、培養そのものに、また後の精製プロセスに悪い影響を与える可能性があり、生物学的分解性に乏しく容易に処分することができないので、消泡剤を避けることは、生物学的プロセスにおいて最も大きな目的である。
【００３０】
例えば、嫌気培養など反応液の表面のみの曝気が必要な場合、あるいは反応液に速やかに効果を発揮する液体が投与される場合、前述したような上部空間への投与が主に使用される。一例として、酸またはアルカリによるｐＨ値の滴定、および上述の方法での泡の軽減がここに挙げられる。入り口弁ＥＶ２は、反応液中に配置されたベンチュリ・ノズルＢＤ１へと続いている。輸送用媒体（および投与物）は、通気ノズルＢＤ１を通って反応液へと流れる。作り出された負圧によって反応液がノズルの側方の入り口に吸い込まれ、反応液がノズルの出口部において効率的に混合される。微生物（例えば組織細胞）をノズル中のせん断力にさらしたくない場合、側方の入り口開口は、フィルタ膜で封止できる。反応液の混合時間を劇的に短縮する混合効果、および明らかに速くなったガス交換速度に加え、従来技術による曝気に比べ極めて微細な気泡が（輸送用媒体である気体で）作られる。このより微細な気泡が、気泡と反応液との間のガス交換のための境界面積、すなわちガス交換速度を増加させ、かつ大きな気泡よりも長い時間反応液中に残るので、「気体の持続」を増進し、したがって、やはりガス交換速度を向上させる。気体をより効率的に利用することができ、培養の種類により、妥当であれば、培養容器の振盪または攪拌を不要にできる。さらに、微小な気泡によって発泡の傾向を最小にできる。例えば気体流中の基質など、この方法でエアロゾルを投与する場合、速やかな混合により、反応液へのより速く均一な分配が得られる。乏しい混合に起因する基質の勾配を防ぐことができ、培養液に所望のやり方で均一に供給できる。
【００３１】
本発明は、機能モジュールを、全く新しい分野への適用のために適したやり方で結合し、従来の高価で複雑な技術を簡潔かつコンパクトな装置に結実するという利点を有する。本発明の装置を、無菌条件下でのバイオテクノロジ関連のプロセスのために用いることが可能になる。これにより、各部門が従来技術の装置では今まで不可能であった制御機能を利用できるようになる。一例として、生物学的手法における培地およびプロセスの最適化に用いられる複数の培養容器、通常は最大１６個の容器の、新規な並行培養を説明する（デー・アー・エス ゲー・イー・ぺー社（Ｄａｓ ＧＩＰ ＧｍｂＨ）、ｗｗｗ．ｄａｓｇｉｐ．ｄｅ）。ここでは、種々のパラメータが培養結果にもたらす影響を、生産条件に近い条件下で調査すること、および測定および制御に関し、可能な限りすでに望まれている生産設備の条件、すなわち効果的な曝気および種々の液体の投与となることを意図している。すでに述べたように、このような並行培養は、９６台のポンプ、９６個のレギュレータ、および１６個の制御された供給部を必要とし、それ故、技術的に、経済的に、実際上実現不可能であり、それにもかかわらず、培養容器として気泡塔を用いた場合でさえも、生産設備の測定および制御条件と合致しない。より短時間で多くの結果を再現性があり定量化可能な形（記録可能）で得るため、培養容器のさらなる小型化および数の増加が現在の傾向である。これはもはや従来の技術の装置では実現不可能であるが、本発明によれば実現可能である。各機能モジュールはあらゆるサイズで製造でき、したがって培養容器のサイズに適合させることができ、培養容器の容積は１ｍｌ〜５０立方メートルの間とすることができる。液体体積が１ｍｌ〜５００ｍｌである培養容器では、液体および気体供給ならびに弁の制御装置を含む装置一式を、培養容器の首部に取り付けることができる。制御用電子データ処理（ＥＤＰ）システムとのデータ交換は、赤外線のインターフェイスで行われる。したがって、培養容器へと向かう供給管はただ１つでよく、該供給管は、気体供給管および動力供給からなる。さらなる装置の小型化は、機能部品および供給管を、例えば鋼やプラスチック材料などの対応する材料上にエッチングする、切る、成形することによって行なうことができ、バルブの機能は、挿入されたシールをピストンで動かすことにより、あるいは他の任意の小型バルブにより実現される。本発明による装置は、培養容器内の構造物、例えば、「振盪または攪拌３相系の最適化された曝気および投与のための培養容器のための構造としての装置」（出願番号は追って提出）と組み合わせこともできる。この組み合わせによって、高性能な培養容器が作り出され、高性能培養設備の測定および制御技術全体およびプロセス・パラメータを、簡潔なやり方で、ほぼ任意の規模で再現し模擬することができる。
【実施例】
【００３２】

三方弁 ＤＶ１：リー社（Ｔｈｅ Ｌｅｅ Ｃｏｍｐａｎｙ）、型式ＬＨＤＡ１２３１１１１５Ｈ
クロック・バルブ Ｖ１、Ｖ２：リー社、型式ＬＦＶＡ１２３０２１ ０Ｈ
入り口弁 ＥＶ１、ＥＶ２：リー社、型式ＬＦＶＡ１２３０２１ ０Ｈ
ベンチュリ・ノズル ＶＤ１、ＶＤ２：スプレーイング・システムス社（Ｓｐｒａｙｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、型式
通気ノズル ＢＤ１：スプレーイング・システムス社、型式
エジェクタ・ノズル ＡＤ１：スプレーイング・システムス社、型式
空気容器 Ｂ１：ブラウン・メルスンゲン社（Ｂｒａｕｎ Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ）、ルアー・ロック（Ｌｕｅｒ Ｌｏｃｋ）を備えた５０ｍｌの使い捨てシリンジ
空気フィルタ Ｆ１：ザルトリウス社（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、使い捨て無菌フィルタ、０．２μｍ
液体供給：フランジ・キャップおよびゴム製シールを備えた２５ｍｌの使い捨てアンプル
ホース：内径１ｍｍのテフロン製ホース
接続具：ルアー・ロック
泡検出：反応液への質量接続を有する絶縁針
弁制御装置：ブラウン・メルスンゲン社のＤＣＵ ３ システム
【００３３】
培地の成分は、普通の専門店で同じ品質のものを手に入れることができる。グルコースおよび塩化マグネシウムは、適当に分けて別個に殺菌し、その後無菌条件下で添加した。培養容器を５００ｍｌの培地で満たし、オートクレーブで殺菌した。上部空間および反応液へと、ノズルを備えた供給管がカバーに設けた穴を通して案内され、封止され、容器と一緒に同様に殺菌された。本発明による装置への分離は、入り口弁の出口で行われた。液体供給として、２４ｍｌのグルコース溶液（１００ｇ／ｌ）および２４ｍｌの消泡剤（ダウ社（Ｄｏｗ）のシリコン・オイル、１０％懸濁液）をそれぞれ別個に殺菌して用いた。本発明による装置を、各構成要素に他の固定手段が設けられていない限り、図１のとおりルアー・ロック接続具およびテフロン製ホースで組み立て、作業板上に固定した。空気フィルタ出口と出口バルブの出口の間の動力部分、および液体供給源の供給および排出管は、１０ｍ苛性ソーダで浄化し（２時間）、無菌の０．１ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７．２で洗浄した。培養容器を殺菌し冷ました後、微生物の純粋菌株をそれぞれ１ミリリットル、無菌条件で接種した。純粋菌株は、ドイツ培養菌コレクション（Ｇｅｒｍａｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＤＳＭ、ハノーバー市）で入手可能な大腸菌Ｋ１２株のチューブから、このチューブの中身を１０ｍｌの標準１培地（メルク社（Ｍｅｒｃｋ）、ダルムシュタッド市）で、３７℃で１２時間にわたって滅菌下で培養して生成した。純粋菌株の光学濃度は、接種の時点において０．９ＯＤ（５４６ｎｍ）であった。装置は、入り口弁で培養容器および気体供給モジュールに接続された。液体供給源１には、グルコース溶液を接続し、第２の液体供給源には消泡剤を接続した。液体供給源は、立てた向きで使用した。圧力付加のための接続として短い使い捨ての注射針、液体取り除きのために長い注射針を使用し、ゴム製のシールを無菌の方法で通した。加圧空気導入口に、０．５ｂａｒの陽圧を有する加圧空気を接続した。気体容器の容積は、２５ｍｌに調節した。装置一式および培養容器を、インキュベータ内で３７℃の温度にした。気体流単独で培養に充分な気体が供給されたので、培養容器の振盪は行わなかった。本発明による装置の弁は、制御ユニットＤＣＵ３に接続され、表３に示すように調節された。
【００３４】
表３
気体供給：
注入および気体流が毎分１５回のクロック速度、ＶＦ値４５すなわち毎時２２．５リットルの空気（ｌ ａｉｒ／ｈ）に相当、入り口弁ＥＶ１を閉じ、ＥＶ２を開き、すなわち気体流は反応液中へ。
液体供給１、基質：
クロック・バルブＶ１、毎分４回、０．２秒間の開放、同時に気体流の培養容器への接続として、ＤＶ１を培養容器に向けて開き、ＥＶ２を開き、毎時１ｍｉのグルコース投与に相当。
液体供給２、消泡剤：
クロック・バルブＶ２を通常は閉じた。トランスデューサ針が、泡の信号を示したとき、次のアルゴリズムを実行する。すなわち、入り口弁ＥＶ２を閉じ、入り口弁ＥＶ１を開き、すなわち上部空間通気の開始。８秒後に、トランスデューサ針の泡信号がなしであれば、入り口弁ＥＶ１を閉じ、入り口弁ＥＶ２を開いて、通常の動作に戻る。泡信号が依然として存在していれば、そのときは、気体供給の各クロック信号と同時に、クロック・バルブＶ２を１秒間開き、消泡剤（１８．７ｍｌ／ｈ）が気体供給の気体流に混ぜられる。さらに１６秒たっても泡信号が存在する場合、培養液に再び気体を供給するため、さらに弁ＥＶ２も開かれる。この条件が、トランスデューサ針の信号がなくなるまで維持される。その後、通常の動作に戻る。
【００３５】
２４時間後、微生物の培養を止め、５４６ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）を光度計で測定した。ＯＤは約９０で、高性能な培養設備において期待される値に相当し、本発明の装置の可能性を証明した。供給した基質は、この時点で完全に消費された。消泡剤については、約２ｍｌの消費が測定され、これは従来の培養設備がこのような結果を得るために必要とする量（制御アルゴリズムにもよるが、約１２ｍｌ）よりも、明らかに少ない。
【００３６】
この実施例の実行において、特に下記の内容を明確に観測することができた。
・本発明による装置の、コンパクトでかつ簡潔な出来映え
・「パルス」による通気システムと通気ノズルとの組み合わせの有効性
・極めて微細な気泡の生成
・本システムの混合時間の短さ
・本発明の構成による泡軽減性能
・液体の正確かつ均一な投与
【００３７】
これらの結果は、高性能な培養設備のそれに相当するが、振盪および攪拌なしで達成されたものであることを、再度強調しておく。挿入物との組み合わせ、あるいは揺動器や攪拌器によって、性能はさらに向上する。
られた流体を、所定の質量流量で培養容器に添加することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】輸送媒体が気体の場合の本発明の各モジュールの構成を示す図である。
【図２】輸送媒体が液体の場合の本発明の各モジュールの構成を示す図である。
【図３】輸送媒体が気体の場合の気体の投与を示す図である。
【図４】輸送媒体が液体の場合の気体の投与を示す図である。

Claims (34)

1. １つまたは複数の流体あるいは流体混合物を、１つまたは複数の培養容器に定量的に供給する方法であって、少なくとも１つの搬送用流体が使用され、該搬送用流体が、所定の内部容積を有する加圧貯留容器から、クロック・バルブを通して定量的かつ不連続的に取り出されることを特徴とする方法。
2. 搬送用気体または搬送用気体混合物を使用することを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 搬送用液体または搬送用液体混合物を使用することを特徴とする請求項１または２記載の方法。
4. 投与しようとする流体が、搬送用流体へと、１つまたは複数のベンチュリ・ノズルを通して定量的なやり方で混合されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 培養容器内の反応培地への供給が、より良い混合のためのベンチュリ・ノズルを通して行なわれることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 反応培地中のベンチュリ・ノズルの側方導入口に設けられたフィルタ等が、該ノズルへの微生物の進入を防止することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 培養容器の上方空間への供給管を特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 上方空間への入り口に、例えばエジェクタ・ノズルなどの微細化装置が設けられていることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 培養容器への供給が、反応培地への供給から上方空間への供給に、およびこの逆に切り換えられることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 搬送用気体または搬送用気体混合物が、気体容器から陽圧の下で取り出されることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. プロセス中の気体容器の圧力が、供給管を通して１回または複数回取り除かれた後に、再び１回または複数回増加することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 複数の流体を投与するためのものであり、該複数の流体が、直列または並列、好ましくは並列に接続された異なるベンチュリ・ノズルを通して、搬送用流体に同時にまたは任意の順序で混合されることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 生物学的および（生）化学的反応のための培養容器に、該培養容器で使用する気体、液体またはそれらの混合物を投与するための装置であって、搬送用流体を作り出すための少なくとも１つの図１の気体供給モジュールまたは図２の駆動ポンプ・モジュール、ベンチュリ・ノズル、および端部が培養容器の反応液中または上部空間にある供給管からなり、ベンチュリ・ノズルが、クロック・バルブ、および圧力補償細管を備えた液体供給源、または投与気体供給源を備えており、気体供給モジュールまたは駆動ポンプ・モジュールが、供給管を通って培養容器へと向かう搬送用媒体の流れを、連続的または断続的に作り出すことを特徴とする装置。
14. 気体容器Ｂ１の容積が、培養容器の容積の１〜４０％であることを特徴とする請求項１３記載の装置。
15. 気体容器の容積が、ピストンによって全容積の０〜１００％の範囲で可変であることを特徴とする請求項１３または１４記載の装置。
16. バルブのクロック速度を、培養容器内の気泡の「気体の持続」にあわせ、好ましくは同じになるように調節でき、通過する気体の量が、請求項３のピストンを調節することにより実行されることを特徴とする請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の装置。
17. 図１の液体供給モジュールまたは気体供給モジュールが少なくとも１つ、三方弁と培養容器の間に組み込まれている請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の装置。
18. 液体供給モジュールが、少なくとも１つのベンチュリ・ノズルおよび液体容器からなり、気体容器へとつながった圧力補償細管または外気への接続によって圧力補償が可能であることを特徴とする請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の装置。
19. 液体供給が、装置に対して任意の位置に、吊り下げて、立てて、横にして取り付けられ、全容積の少なくとも２％の空気空間を常に有しており、該空気空間へと圧力補償を行なうことができる請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の装置。
20. 気体投与供給が、少なくとも１つの気体導入口、三方弁または２個の弁、および内容積が可変である気体容器（請求項１５に類似）からなり、弁の開口がベンチュリ・ノズルの側方の導入口に接続されることを特徴とする請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の装置。
21. 装置の構成要素の寸法すなわち本発明による特性を、容積１ミリリットル〜５０リットルの培養容器にあわせて調節することができる請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の装置。
22. 装置の方法により、さらに特に請求項８により、反応液とのより良い混合および交換速度が得られ、培養の種類によっては、培養容器の振盪または攪拌が不要であることを特徴とする請求項１３〜２１のいずれか１項に記載の装置。
23. 反応液の発泡の傾向が、一種の不連続な曝気および気体供給によって減じられることを特徴とする請求項１３〜２２のいずれか１項に記載の装置。
24. 気体／液体投与の組み合わせが、投与が培養容器の反応液中へ、あるいは上部空間へのいずれであっても、反応液とのより短い混合時間を実現し、濃度の勾配（例えば基質）を最小化することを特徴とする請求項１３〜２３のいずれか１項に記載の装置。
25. 特に培養容器の上方空間への投与により、投与する液体の特性をより良く利用することを特徴とする請求項１３〜２４のいずれか１項に記載の装置。
26. 装置の使用によって消泡剤の消費を最小化するため、反応液への気体流を短時間で止めて上方空間投与のエジェクタ・ノズルへと切り換え、流れ出る空気が気泡を液面に「吹き」戻し、多くの場合、これによる効果が発泡を低減するのに充分であり、成果が不充分である場合に、請求項２５に記載の投与が行なわれ、本手法との組み合わせにより、消泡剤の消費を従来技術の１０％に減らすことを特徴とする請求項１３〜２５のいずれか１項に記載の装置。
27. このようにして投与された液体、またはそれらのいくつかの組み合わせが、例えば時間に依存したバクテリア菌株へのファージの添加、または細胞培養液への成長因子の添加、あるいはＣＯ_２によるｐＨ調整など、反応液に効果を及ぼすことが可能であることを特徴とする請求項１３〜２６のいずれか１項に記載の装置。
28. このようにして投与された気体が、培養容器の上部空間に、例えば嫌気雰囲気や高ＣＯ_２濃度雰囲気など、所定の組成の人工的環境を作るために使用されることを特徴とする請求項１３〜２７のいずれか１項に記載の装置。
29. 装置が、動力供給源および輸送用媒体の供給源にのみ接続され、全ての測定および制御パラメータが、赤外線インターフェイスを介して制御ＥＤＰシステムと交換されることを特徴とする請求項１３〜２８のいずれか１項に記載の装置。
30. 特に請求項１〜２９のいずれか１項による細胞の培養のためのバイオリアクタであって、培養容器、１つまたは複数の気体供給および／または１つまたは複数の液体供給、ならびに気体および／または液体のための供給装置からなり、該供給装置によって気体および／または液体が培養容器へと加えられ、該供給装置と気体供給または液体供給の間に、気体供給または液体供給からの気体および／または液体を混合するための混合装置、特にはベンチュリ・ノズルが設けられているバイオリアクタ。
31. 気体と液体が混ぜられてエアロゾルとなる請求項３０記載のバイオリアクタ。
32. 混合装置と気体供給または液体供給の間に制御可能な弁、特にはクロック・バルブが設けられている請求項３０または３１記載のバイオリアクタ。
33. 請求項３０〜３３のいずれか１項に記載のバイオリアクタを運転する方法であって、気体または液体が搬送用流体として使用され、気体または液体が混合装置で搬送用流体に混ぜられ、さらに流体の混合比率が所定であり制御および調節される方法。
34. 混合された流体が、所定の質量流量で培養容器へと加えられる請求項３３記載の方法。

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